«Экспериментальные модели тканевых эквивалентов поджелудочной железы» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.24, кандидат наук Баранова Наталья Владимировна

• Баранова Наталья Владимировна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Баранова Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СУЩЕСТВУЮЩИЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ БОЛЬНЫХ

САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1-ГО ТИПА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Поджелудочная железа

1.1.1 Строение и функция поджелудочной железы

1.1.2 Морфология и функция островков Лангерганса

1.1.3 Внеклеточный матрикс поджелудочной железы

1.2 Сравнительный анализ существующих методов лечения больных сахарным диабетом 1-го типа

1.2.1 Инсулинотерапия

1.2.2 Трансплантация поджелудочной железы

1.2.3 Трансплантация островков Лангерганса

1.3 Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины

1.3.1 Тканевые эквиваленты для замещения и восстановления эндокринной функции поджелудочной железы

1.3.2 Клеточные компоненты тканевого эквивалента

1.3.3 Методы выделения (изоляции) островков Лангерганса

1.3.4 Матриксы - носители для тканеинженерных конструкций

1.3.4.1 Биорезорбируемые матриксы

1.3.4.2 Децеллюляризованные тканеспецифические матриксы

1.3.4.3 Естественные компоненты внеклеточного матрикса

1.3.5 Влияние других типов клеток на островки Лангерганса

при их совместной инкубации in vitro

1.3.5.1 Влияние мезенхимальных стволовых клеток на островки Лангерганса при их совместной инкубации in vitro

1.3.5.2 Влияние фибробластов на островки Лангерганса

при их совместной инкубации in vitro

1.4 Основные проблемы создания тканеинженерых конструкций поджелудочной железы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Экспериментальные животные

2.2 Выделение (изоляция) и идентификация островков Лангерганса

2.2.1 Процедура изоляции островков Лангерганса

2.2.2 Идентификация свежевыделенных изолированных

островков Лангерганса

2.3 Биополимерный микрогетерогенный коллагенсодержащий

гидрогель - биополимерный миметик внеклеточного матрикса

2.4 Тканеспецифический матрикс из децеллюляризованной ткани поджелудочной железы крысы

2.4.1 Протокол децеллюляризации поджелудочной железы крысы

2.4.2 Количественное определение ДНК в тканеспецифическом матриксе

2.4.3 Исследование тканеспецифического матрикса на цитотоксичность

2.4.4 Исследование функциональных свойств тканеспецифического матрикса

2.5 Эксперименты по культивированию островков Лангерганса

в различных культуральных системах

2.5.1 Культивирование островков Лангерганса в суспензионной культуре (монокультура островков Лангерганса)

2.5.2 Культивирование островков Лангерганса с биополимерным коллагенсодержащим матриксом

2.5.3 Культивирование островков Лангерганса с биополимерным коллагенсодержащим матриксом и мезенхимальными стромальными клетками костного мозга

2.5.4 Культивирование островков Лангерганса с биополимерным коллагенсодержащим матриксом и тканеспецифическим матриксом

2.6 Определение жизнеспособности клеток и островков Лангерганса

в различных культуральных системах

2.7 Морфологическое исследование

2.8 Исследование инсулинпродуцирующей функции островков Лангерганса в монокультуре и при культивировании с биополимерным коллагенсодержащим матриксом и тканеспецифическим матриксом

2.9 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выделение островков Лангерганса из поджелудочной железы крысы

по модифицированной методике с использованием коллагеназы

3.1.1 Морфологическое исследование исходной поджелудочной

железы крысы

3.1.2 Идентификация, определение жизнеспособности и морфологическое исследование свежевыделенных

островков Лангерганса крысы

3.2 Сравнительный анализ островков Лангерганса крысы, культивированных в монокультуре и с биополимерным

коллагенсодержащим матриксом

3.2.1 Результаты культивирования суспензионной культуры (монокультуры) островков Лангерганса крысы

3.2.2 Результаты культивирования островков Лангерганса крысы

с биополимерным коллагенсодержащим матриксом

3.3 Влияние мезенхимальных стромальных клеток костного мозга

крысы на островки Лангерганса крысы при их сокультивировании на биополимерном коллагенсодержащем матриксе

3.3.1 Культивирование мезенхимальных стромальных клеток

костного мозга на биополимерном коллагенсодержащем матриксе

3.3.2 Сокультивирование монокультуры островков Лангерганса с монодисперсной суспензией и с монослоем мезенхимальных стромальных клеток костного мозга

3.3.3 Сокультивирование островков Лангерганса с мезенхимальными стромальными клетками костного мозга на биополимерном коллагенсодержащем матриксе

3.3.4 Жизнеспособность островков Лангерганса, культивированных

с биополимерным коллагенсодержащим матриксом

3.4 Тканеспецифический матрикс из децеллюляризованной поджелудочной железы крысы

3.4.1 Морфологическое исследование тканеспецифического матрикса

3.4.2 Исследование иммуногенности тканеспецифического матрикса

по содержанию остаточного количества ДНК

3.4.3 Цитотоксичность и функциональные свойства

тканеспецифического матрикса

3.5 Сравнительный анализ жизнеспособности островков Лангерганса при культивировании с биополимерным коллагенсодержащим матриксом

и тканеспецифическим матриксом

3.6 Сравнительный анализ инсулинпродуцирующей функции островков Лангерганса в монокультуре и при культивировании с биополимерным коллагенсодержащим матриксом и тканеспецифическим матриксом

3.7 Экспериментальные модели тканевых эквивалентов

поджелудочной железы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Модифицированная методика выделения островков Лангерганса из поджелудочной железы крысы

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Технология получения тканеспецифического

мелкодисперсного матрикса из децеллюляризованной ткани

поджелудочной железы крысы

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Лабораторный регламент производства

экспериментальных образцов тканевых эквивалентов поджелудочной

железы крысы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Экспериментальные модели тканевых эквивалентов поджелудочной железы»»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

По данным Международной федерации диабета, учитывая диагностические критерии ВОЗ, заболеваемость в мире сахарным диабетом увеличится к 2030 году до 439 млн человек [1, 2], при этом доля пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (СД 1) составит примерно 10 % [3, 4].

Применение традиционного метода лечения - инсулинотерапии не спасает больных от развития тяжелых осложнений сахарного диабета, таких как ангиопатия, нейропатия и других. Самые совершенные способы и схемы введения инсулина не способны обеспечить профилактику и эффективное лечение этих осложнений, что обусловлено тем, что аутоиммунное повреждение Р-клеток приводит не только к снижению и потере секреции эндогенного инсулина, но также и биологически активных эндогенных полипептидов (С-пептид, К-пептид, амилин), в норме секретируемых Р-клетками [5]. Отсутствие этих факторов приводит к формированию поздних диабетических осложнений.

Трансплантация васкуляризованной донорской поджелудочной железы (ПЖ) как заместительная терапия Р-клетками способна полностью восстановить нормогликемию, достичь инсулинонезависимости и отсрочить осложнения диабета [5]. Однако органная пересадка - серьезная инвазивная операция, подвергающая пациентов серьезному риску развития хирургических и инфекционных осложнений. Необходимость применения жестких критериев в отборе донорской поджелудочной железы приводит к значительному уменьшению доступности данного вида трансплантационного лечения сахарного диабета 1-го типа [6].

Аллотрансплантация островков Лангерганса (ОЛ), рассматриваемая в качестве альтернативы пересадки поджелудочной железы для лечения сахарного диабета 1 типа, способна обеспечить инсулинонезависимость больных на определенный срок, не подвергая больных серьезному хирургическому вмешательству. Однако существенным недостатком трансплантации

панкреатических островков является низкая функциональная активность, обусловленная действием ряда повреждающих факторов во время процедуры выделения и культивирования, в частности, нарушением взаимодействия островковых клеток с внеклеточным матриксом (ВКМ), играющим важную роль в функционировании островков Лангерганса [7]. Сохранению структуры и функции панкреатических островков в условиях in vitro и in vivo способствуют искусственные матриксы — биомиметики внеклеточного матрикса, обеспечивающие островкам Лангерганса, необходимое для их жизнедеятельности микроокружение, близкое по свойствам к внеклеточному матриксу.

Современные методы тканевой инженерии и регенеративной медицины позволяют надеяться на перспективность биомедицинских технологий, основанных на создании эквивалента поврежденной ткани (органа), в том числе, тканеинженерной конструкции - тканевого эквивалента эндокринного отдела поджелудочной железы, сформированного на основе островков Лангерганса или других инсулинпродуцирующих клеточных компонентов и биосовместимого матрикса. Несмотря на малочисленность работ, находящихся на стадии экспериментальных разработок, показано, что возможно создание тканевых эквивалентов поджелудочной железы (ТЭ ПЖ), как для стимуляции внутреннего регенеративного потенциала поврежденной поджелудочной железы, так и для частичной или полной замены ее эндокринной функции. Основными задачами при создании тканевых эквивалентов поджелудочной железы являются определение оптимальных условий выделения и культивирования островков Лангеррганса и поиск матрикса, обеспечивающего наилучшие условия для поддержания функциональной активности островков.

Цель исследования

Разработать и исследовать in vitro экспериментальные модели тканевых эквивалентов эндокринного отдела поджелудочной железы, сформированных на основе островков Лангерганса крысы и биомиметиков внеклеточного матрикса.

Задачи исследования

1. Модифицировать ферментативную методику выделения островков Лангерганса из поджелудочной железы крысы с целью повышения качества и количества выделяемых островков.

2. Исследовать влияние биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогелевого матрикса на жизнеспособность островков Лангерганса крысы.

3. Изучить влияние мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крысы на жизнеспособность монокультуры островков Лангерганса крысы и в присутствии биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогелевого матрикса.

4. Разработать способ получения и исследовать морфологические и функциональные свойства образцов тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной поджелудочной железы крысы.

5. Исследовать in vitro морфофункциональное состояние островков Лангерганса крысы в монокультуре и в присутствии биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогелевого матрикса и тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной поджелудочной железы крысы.

6. Провести сравнительный анализ секреторной способности и функциональной (под нагрузкой) активности in vitro монокультуры островков Лангерганса и экспериментальных моделей тканевых эквивалентов поджелудочной железы.

Научная новизна

- разработан модифицированный способ выделения островков Лангерганса из ткани поджелудочной железы крысы, позволяющий получать значительное количество жизнеспособных изолированных островков.

- разработан протокол децеллюляризации поджелудочной железы крысы, дающий возможность получать тканеспецифический матрикс с сохранением основных белков внеклеточного матрикса панкреатической ткани, низкой иммуногенностью и отсутствием цитотоксичности.

- разработаны протоколы получения лабораторных образцов экспериментальных моделей тканевых эквивалентов поджелудочной железы на основе изолированных островков Лангерганса, биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогелевого матрикса и тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной поджелудочной железы крысы.

- проведен сравнительный анализ влияния биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогелевого матрикса и тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной поджелудочной железы крысы на морфофункциональное состояние островков Лангерганса.

- для экспериментальных моделей тканевых эквивалентов поджелудочной железы установлено не только существенное увеличение базальной и стимуляционной (под нагрузкой глюкозой) концентрации инсулина, но и пролонгирование инсулинпродуцирующей функции in vitro по сравнению с изолированными островками Лангерганса в монокультуре.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты являются основой для проведения исследований по созданию тканевого эквивалента/тканеинженерной конструкции поджелудочной железы человека на основе тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной ксеногенной ткани поджелудочной железы и аллогенных островков Лангерганса посмертных доноров.

Методология и методы диссертационного исследования

Объектами для исследования явились поджелудочная железа крысы, островки Лангерганса, выделенные из поджелудочной железы крысы, образцы матриксов (биополимерного коллагенсодержащего и тканеспецифического) и образцы тканевых эквивалентов поджелудочной железы.

Наблюдение за островками Лангерганса в монокультуре и в составе культуральных систем с матриксами осуществляли с помощью инвертированного и

люминесцентного микроскопа. Морфологический анализ образцов исходной поджелудочной железы, тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной ткани поджелудочной железы и островков Лангерганса в монокультуре и в составе культуральных систем с матриксами проводили с использованием как рутинных гистологических, так и специфических иммуногистохимических методов окрашивания. Базальную и стимулированную секрецию инсулина in vitro определяли путем измерения концентрации гормона в культуральной жидкости с помощью иммуноферментного метода.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Модифицированная методика выделения островков Лангерганса позволяет получать значительное количество жизнеспособных изолированных островков менее трудоемким и более простым способом по сравнению с традиционной коллагеназной методикой.

2. Биополимерный микрогетерогенный коллагенсодержащий гидрогелевый матрикс положительно влияет на сохранность морфофункциональных свойств культуры островков Лангерганса in vitro.

3. Разработанный способ получения тканеспецифического матрикса из децеллюляризованной поджелудочной железы дает возможность получать матрикс с сохранением основных белков внеклеточного матрикса панкреатической ткани, свободный от клеток и с максимально низким содержанием ДНК.

4. Показано преимущество применения тканеспецифического матрикса для создания тканевых эквивалентов поджелудочной железы по сравнению с биополимерным микрогетерогенным коллагенсодержащим гидрогелевым матриксом.

5. Разработанные экспериментальные модели тканевых эквивалентов поджелудочной железы, сформированные на основе выделенных островков Лангерганса и матриксов - биомиметиков внеклеточного матрикса обладают секреторной способностью и функциональной (под нагрузкой) активностью in vitro.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность и обоснованность полученных результатов обеспечивается четкой постановкой задач исследования, применением методик, ориентированных на традиционные способы выделения островков Лангерганса из панкреатической ткани и децеллюляризации поджелудочной железы, а также достаточным применением современных и адекватных лабораторных (гистологических, иммуногистохимических и иммуноферментных) методов исследования на лицензированном оборудовании, корректных методов статистической обработки данных и критической оценкой полученных результатов при сравнении с данными современной научной литературы.

Апробация работы состоялась 26 июня 2020 года на совместной конференции научных и клинических подразделений Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Основные положения и результаты диссертации были доложены и обсуждены на III Национальном конгрессе «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 2-4 октября 2017 г.); III Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 15-18 ноября 2017 г.); на IX Всероссийском съезде трансплантологов, 16-19 сентября 2018 года; IV Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 20-23 ноября 2019 г.).

Связь работы с научными программами, планами, темами

Диссертационная работа выполнялась в рамках государственного задания Минздрава России на проведение научных исследований и разработок по теме: «Разработка и экспериментальное исследование тканеинженерных конструкций поджелудочной железы человека» (2015 - 2017 гг.), № государственной регистрации 115102010015; ФЦП «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» ПНИЭР «Разработка технологической платформы и методических рекомендаций по

проведению доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов» (2014 - 2016 гг.), № государственной регистрации 115012930004 и гранта РФФИ № 13-04-12017 офи_м «Инъекционные формы тканеинженерных конструкций хряща и поджелудочной железы» (2013 - 2015 гг.).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в отдел биомедицинских технологий и тканевой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также в образовательный процесс кафедры трансплантологии и искусственных органов лечебного факультета Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет).

Личный вклад автора

Автор принимала непосредственное участие в разработке модифицированной методики выделения островков Лангерганса из поджелудочной железы, самостоятельно осуществляла наблюдение за процессом культивирования изолированных панкреатических островков в монокультуре и разных культуральных системах с помощью инвертированного микроскопа, создавала лабораторные образцы экспериментальных моделей тканевых эквивалентов поджелудочной железы, осуществляла морфологическое исследование и определение инсулинпродуцирующей функции in vitro островков Лангерганса в монокультуре и в составе тканевых эквивалентов поджелудочной железы. Автор самостоятельно осуществляла обобщение и анализ полученных результатов и их статистическую обработку.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, результатам собственных исследований и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций, трех приложений и списка литературы, включающего 188 источника, в том числе 30 отечественных и 158 зарубежных. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками, содержит 6 таблиц.

ГЛАВА 1. СУЩЕСТВУЮЩИЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1-ГО ТИПА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Распространенность сахарного диабета (СД) в мире ежегодно растет, поэтому актуальность этой проблемы не вызывает сомнений [1]. По данным Международной федерации диабета заболеваемость в мире СД в 2010 году достигла среди взрослых 6,4% - 285 млн человек и прогнозируемо увеличится к 2030 году до 7,7% - 439 млн человек [2, 3].

По данным Государственного регистра сахарного диабета [4] распространённость СД в Российской Федерации к 2015 году составила 4,1 млн. человек. Распространенность СД 1 в России составляет 340,5 тысяч человек, с ежегодным приростом около 5 тысяч новых случаев заболевания [5].

СД 1 - это эндокринное заболевание, вызванное метаболическими нарушениями и характеризующееся хроническим гипергликемическим состоянием. Клеточной основой развития СД 1 является аутоиммунное повреждение Р-клеток островков Лангерганса (ОЛ) поджелудочной железы (ПЖ), что ведет к истощению пула этих клеток и постепенно нарастающей, прогрессирующей недостаточности эндогенного инсулина [6]. Сложность контроля уровня глюкозы у больных приводит к развитию осложнений диабета, таких как нефропатия, ретинопатия, нейропатия сердечно-сосудистые и другие заболевания [7].

1.1 Поджелудочная железа 1.1.1 Строение и функция поджелудочной железы

Поджелудочная железа человека представляет собой непарный орган, макроскопически условно разделенный на три основные части: головка, тело и хвост. Экзокринная часть (ацинарная) ПЖ, составляющая 96-99% от общего объема органа, секретирует пищеварительные ферменты, а эндокринная часть (островки Лангерганса), занимающая 1-4% - различные гормоны. В дополнение к

островкам, одиночные эндокринные клетки могут быть разбросаны по ацинарной и протоковой ткани [8].

ПЖ покрыта тонкой фиброзной капсулой, из которой перегородки соединительной ткани проходят в железу, разделяя ее паренхиму на отдельные доли и дольки диаметром 1-10 мм. Каждая долька ПЖ состоит из структур, называемых ацинусами, представляющими собой скопление пирамидальных ацинарных клеток. Внутрилобулярные и межлобулярные протоки сходятся в основной проток ПЖ - проток Вирсунга, который у человека проходит вдоль всей железы. Внутрилобулярные артерии, артериолы и капилляры вместе образуют микроциркуляторное русло органа. ПЖ богато иннервируется симпатическими, парасимпатическими и афферентными волокнами [9].

1.1.2 Морфология и функция островков Лангерганса

Панкреатический островок (островок Лангерганса) человека может рассматриваться как микроорган, представляющий собой васкуляризованный кластер из эндокринных клеток округлой или овальной формы размерами от 50 до 300 мкм [10, 11]. В ПЖ человека насчитывается приблизительно от 200 тыс. до 1,8 млн. ОЛ, общая масса которых 0,5-1,5 г (1-2% от всей массы органа).

Островки Лангерганса диффузно распределены в экзокринной паренхиме ПЖ и отделены от экзокринной ткани неплотной периферической капсулой, состоящей из одного слоя фибробластов и коллагеновых волокон [12]. Плотность ОЛ на единицу объема одинакова в головке и теле, но примерно в 2 раза выше в хвосте. Характерной особенностью ОЛ является их обширная васкуляризация, они получают 5-15% прямого артериального кровотока ПЖ. ОЛ также богато иннервируются вегетативной нервной системой как симпатическими, так и парасимпатическами волокнами [9,13].

ОЛ состоит из а, в, РР, 5, е клеток, совокупное количество которых в среднем составляет ~ 1,0х10 9, между которыми существуют клеточные взаимодействия, включающие тесные паракринные связи [8, 14]. Эти взаимодействия состоят из молекул клеточной адгезии, играющих важную роль в развитии архитектуры ОЛ, а

также в секреции как инсулина, так и глюкагона. Паракринная передача сигналов между островковыми клетками служит для эффективной секреторной деятельности эндокринных клеток и обеспечения метаболизма глюкозы [12]. Р-клетки, секретирующие инсулин, являются наиболее распространенными в островках (в среднем 60%) и локализуются, в основном, на периферии внутриостровковых кровеносных сосудов [15]. Далее следуют а-клетки, секретирующие глюкагон и 5-клетки, секретирующие соматостатин. Два более редких типа клеток продуцируют панкреатический полипептид (клетки РР) и грелин (е-клетки).

У ОЛ человека нет четкой границы ядро-мантия: пять типов клеток обнаруживаются и в центре островка, и на периферии. ОЛ находятся в тесном контакте с базальной мембраной эндотелиальных клеток и других экзокринных клеток ПЖ [12].

Функция Р-клеток заключается в освобождении инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы в крови, основное действие которого в регулировании углеводного обмена. Инсулин взаимодействует со многими другими тканеспецифичными клетками (жировыми, мышечными, печени) для инициации их метаболизма глюкозы. Запуская процесс распада глюкозы на более мелкие молекулярные соединения, инсулин стимулирует образование гликогена в печени и мышцах, усиливает синтез жиров и белков [8].

1.1.3 Внеклеточный матрикс поджелудочной железы

Нативный внеклеточный матрикс (ВКМ) ПЖ представляет собой трехмерный каркас, состоящий из полипептидных цепей фибриллярных белков (коллаген и эластин), переплетенных с полисахаридными цепями - гликозаминогликанами [16]. Эндокринные клетки ПЖ находятся в состоянии структурного и биохимического взаимодействия с компонентами ВКМ [17-19]. Фундаментальная роль ВКМ проявляется не только в определении топографического расположения эндокринных клеток (поддержка архитектоники) [20], но и во влиянии на клеточные процессы посредством связывания с клеточными рецепторами - интегринами, ответственными

за адгезию клеточного матрикса и передачу внешних сигналов в цитоскелет [21]. Интегрины представляют собой семейство трансмембранных молекул адгезии, которые служат для интеграции внутреннего механизма клетки во внеклеточную среду. Такая интеграция достигается за счет связывания компонентов ВКМ и последующей активации внутриклеточных сигнальных элементов (каскадов) в эндокринной части ПЖ [22, 23]. Роль ВКМ проявляется также в организации связей между эндокринными клетками и эндотелиальными клетками сосудов, нервными и иммунными клетками [24].

В ПЖ ВКМ регулирует такие процессы жизнедеятельности островковых клеток, как развитие, морфологию, дифференцировку, внутриклеточную передачу сигналов, экспрессию генов, адгезию, миграцию, пролиферацию, выживаемость и секрецию инсулина [16, 17, 25]. ВКМ выполняет эти функции не только посредством трехмерной структуры [26, 27] и сигнальных молекул, а также путем секреции и накопления факторов роста и цитокинов [28]. Факторы роста играют важную роль в сохранении выживаемости Р-клеток и нормальной функции островков, к ним относят: инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста соединительной ткани (CTGF) и фактор роста фибробластов (FGF) [12].

Непосредственно в ОЛ как в базальной мембране, так и в интерстиции, обнаруживаются молекулы ВКМ одного типа, участвующих в сохранении целостности и функционирования островков in vitro и in vivo [29-32].

1.2 Сравнительный анализ существующих методов лечения больных

сахарным диабетом 1-го типа

Основными методами лечения СД 1 в настоящее время являются инсулинотерапия [33, 34] и пересадка донорской ПЖ [35]. Кроме того, в ряде стран нашло клиническое применение трансплантация изолированных ОЛ [36-38], в том числе, ксеногенных ОЛ [39] или выделенных из них Р-клеток [40, 41].

Разработки современных технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины [42-46] позволяют надеяться на появление эффективных способов

лечения пациентов с частичной или полной утратой эндокринной функцией ПЖ, альтернативных трансплантации ПЖ. В ряде экспериментальных исследований показано, что на их основе возможно создание ТЭ ПЖ, называемых также тканеинженерными конструкциями (ТИК) или Tissue engineering medical product, как для регенерации пула Р-клеток поврежденной ПЖ [47], так и для замены (полной или частичной) эндокринной функции ПЖ [13, 21].

1.2.1 Инсулинотерапия

Открытие инсулина в 1921 г. F. Banting и С. Best [34] и внедрение в клиническую практику инсулинотерапии позволяет сохранить жизнь миллионам больных СД 1. До настоящего времени препараты инсулина кратковременного и пролонгированного действия являются основным терапевтическим средством в лечении СД 1 . Однако, экзогенное введение инсулина при повторяющихся эпизодах острой гипергликемии (в произвольно выбранное время суток уровень глюкозы в плазме венозной крови превышает 11,1 ммоль/л) не в состоянии компенсировать функцию ПЖ для предотвращения диабетических осложнений [48, 49]. Применение высокоочищенного рекомбинантного инсулина [50], инсулинового насоса [51], методов трансдермального [52] или трансбуккального [53] введения гормона не спасает пациентов от гипогликемического шока и развития тяжелых осложнений СД, таких как диабетическая ангиопатия и нейропатия [49]. Заместительная инсулинотерапия не восстанавливает физиологическую регуляцию уровня глюкозы в крови [54], вследствие этого продолжительность жизни таких пациентов меньше, чем в целом у населения [55].

Низкая эффективность инсулинотерапии обусловлена тем, что аутоиммунное повреждение Р-клеток приводит не только к снижению уровня эндогенного инсулина, но также таких биологически активных эндогенных полипептидов с собственными физиологическими эффектами как С-пептид и амилин, секретируемыми Р-клетками. В норме эти полипептиды циркулируют в крови в типичной для гормонов концентрации. Важная роль С-пептида отмечается в

исследованиях на животных с моделью СД и клинических испытаниях у пациентов с СД 1: С-пептид оказывает благоприятное воздействие на ранние стадии диабетической нефропатии, ретинопатии и нейропатии [56]. С-пептид специфически связывается с клеточными мембранами, включая эндотелиальные, почечные и нервные клетки, с последующей активацией внутриклеточного сигнального каскада, приводящего к стимуляции эндотелиальной синтазы оксида азота (еКОБ), Ка+-К+-АТФазы и экспрессии белков в клетках почечных канальцев. Снижение активности фермента Ка+-К+-АТФазы в периферическом нерве является характерной анамалией при ИЗСД. С-пептид в физиологических концентрациях предотвращает или частично корректирует вызванное диабетом снижение активности Ка+-К+-АТФазы в нервной системе [57]. С-пептид стимулирует несколько факторов транскрипции, а также несколько нейротрофических факторов, имеющих важное значение для противовоспалительных, антиоксидантных и цитопротекторных механизмов, которые обеспечивают защиту от вредных эффектов гипергликемии. С-пептид также снижает экспрессию генов циркулирующих иммунных клеток, что приводит к ингибированию экспрессии цитокинов, хемокинов и молекул клеточной адгезии, а также к снижению апоптоза эндотелиальных клеток [58].

Менее изучено действие другого в-клеточного пептида-амилина, известного как островковый амилоидный полипептид (1АРР), представляющего собой пептидный гормон из 37 аминокислот и высвобождающегося в ответ на глюкозу, липиды или аргинин. Однако известно, что амилин контролирует пролиферацию в-клеток в зависимости от уровня глюкозы; при низких концентрациях глюкозы амилин вызывает пролиферацию островковых в-клеток, тогда как при высоких концентрациях глюкозы амилин уменьшает пролиферацию в-клеток [59].

1.2.2 Трансплантация поджелудочной железы

Клиническим подходом, считающимся «золотым стандартом» [38, 60] способным восстановить не только пул Р-клеток у пациентов с СД 1, но и полностью заместить эндокринную функцию ПЖ реципиента, является аллотрансплантация ПЖ на сосудистых связях. Трансплантацию донорской ПЖ осуществляют в тех случаях, когда инсулинотерапия у пациентов с СД 1 достигла пределов и становится малоэффективной. Органная пересадка васкуляризованной целой ПЖ как заместительная терапия р-клетками способна полностью восстановить нормогликемию, достичь инсулиннезависимости и отсрочить осложнения диабета [ 61]. Таким образом, трансплантация донорской ПЖ является наиболее радикальным методом лечения СД 1 , позволяющим на длительное время обеспечить нормализацию гликемии без применения инсулинотерапии. По данным Global Observatory on Donation and Transplantarion [62] общее количество трансплантаций ПЖ, выполненных в мире за 2016 год составляет 2284, из которых 1013 проведены в США [ 35]. В 2018 году в Российской Федерации в шести центрах было осуществлено только 17 пересадок ПЖ [63].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Баранова Наталья Владимировна, 2020 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Creusot, R.J. Concise review: cell-based therapies and other non-traditional approacher for type 1 diabetes / R.J. Creusot, M. Battaglia, M.G. Roncarolo [et al.]. -Текст: непосредственный // Stem Cells. - 2016. - Vol.34, №4. - P.809-819.

2. Shaw, J.E. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030 / J.E. Shaw, R.A. Sicree, P.Z. Zimmet. - Текст: непосредственный // Diabetes Res Clin Pract. - 2010. - Vol.87, №1. - P.4-14.

3. Stanekzai, J. Treatment options for diabetes: potential role of stem cells / J. Stanekzai, E.R. Isenovic, S.A. Mousa. - Текст: непосредственный // Diabetes Res Clin Pract. - 2012. - Vol.98, №3. - P.361-368.

4. Дедов И.И. Государственный регистр сахарного диабета в Российской Федерации: статус 2014 г. и перспективы развития / И.И. Дедов, М.В. Шестакова, О.К. Викулова. - Текст: непосредственный // Сахарный диабет. - 2015. - Т. 3. -С.5-22.

5. Сахарный диабет: острые и хронические осложнения / под ред. И.И. Дедова, М.В. Шестаковой. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство". - 2011. - С.480. - Текст: непосредственный.

6. Ehlers, M.R. Strategies for clinical trials in type 1 diabetes / M.R. Ehlers. -Текст: непосредственный // J Autoimmun. - 2016. Vol.71. - P.88-96.

7. Шереметьева М.Е. Инсулин-продуцирующие клетки в лечении инсулинозависимого сахарного диабета / М.Е. Шереметьева, Т.Б. Бухарова, Д.В. Гольдштейн. - Текст: непосредственный // Гены & Клетки. - 2016. - Т. XI, №1. -С.24-34.

8. Тимофеев А.В. Клеточно-популяционная организация поджелудочной железы и применение клеточных технологий в лечении сахарного диабета / А.В. Тимофеев. - Текст: непосредственный // В кн. «Биология стволовых клеток и клеточные технологии». - М.: «Медицина». - 2009. - Т. 2. - С.253-310.

9. Dolensek, J. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas / J. Dolensek, M.S. Rupnik, A. Stozer. - Текст: непосредственный // Islets. - 2015. Vol.7, №1. - e1024405.

10. Bosco, D. Unique arrangement of alpha- and beta-cells in human islets of Langerhans / D. Bosco, M. Armanet, P. Morel [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 2010. Vol.59, №5. - P.1202-1210.

11. Proshchina, A.E. Pancreatic endocrine cell arrangement during human ontogeny / A.E. Proshchina, Y.S. Krivova, V.M. Barabanov [et al.]. - Текст: непосредственный // Acta Histochem. - 2019. Vol.121, №5. - P.638-645.

12. Aamodt, K.I. Signals in the pancreatic islet microenvironment influence ß-cell proliferation / K.I. Aamodt, A.C. Powers. - Текст: непосредственный // Diabetes Obes Metab. - 2017. Vol.19, Suppl 1. - P.124-136.

13. Salg, G.A. The emerging field of pancreatic tissue engineering: a systematic review and evidence map of scaffold materials and scaffolding techniques for insulin-secreting cells / G.A. Salg, N.A. Giese, M. Schenk [et al.]. - Текст: непосредственный // J Tissue Eng. - 2019. Vol.30, №10. - 2041731419884708.

14. Kelly, C. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion / C. Kelly, N.H. Mc Clenaghan and P.R. Flatt. - Текст: непосредственный // Islets. - 2011. Vol.3, №2. - P.41-47.

15. Cabrera, O. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function / O. Cabrera. - Текст: непосредственный // Proc Natl Acad Sci USA. - 2006. Vol.103. - P.2334-2339.

16. Stendahl, J.C. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation / J.C. Stendahl, D.B. Kaufman DB and S.I. Stupp. - Текст: непосредственный // Cell Transplantation. - 2009. Vol.18, №1. - P. 1-12.

17. Tremmel, D.M. Rebuilding a better home for transplanted islets / D.M. Tremmel, J.B. Odorico. - Текст: непосредственный // Organogenesis. - 2018. Vol.14, №4. -P.163-168.

18. Song, J.J. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds / J.J. Song, H.C. Ott. - Текст: непосредственный // Trends Mol Med. - 2011. Vol.17, №8. -P.424-432.

19. Napierala, H. Engineering an endocrine neo-pancreas by repopulation of a decellularized rat pancreas with islets of Langerhans / H. Napierala, K-H. Hillebrandt, N. Haep [et al.]. - Текст: непосредственный // Sci Rep. - 2017. Vol.2, №7. - 41777.

20. Lucas-Clerc, C. Long-term culture of human pancreatic islets in an extracellular matrix: morphological and metabolic effects / C. Lucas-Clerc, C. Massart, J.P. Campion [et al.]. - Текст: непосредственный // Mol Cell Endocrinol. - 1993. Vol.94, №1. -P.9-20.

21. Salvatori, M, Katari R, Patel T, Peloso A, Mugweru J, Owusu K, Orlando G. Extracellular matrix scaffold technology for bioartificial pancreas engineering: state of the art and future challenges / M. Salvatori, R. Katari, T. Patel [et al.]. - Текст: непосредственный // J DiabSci Technol. - 2014. Vol.8, №1. - P.159-169.

22. Kaido, T. Impact of defined matrix interactions on insulin production by cultured human beta-cells: effect on insulin content, secretion, and gene transcription / T. Kaido, M. Yebra, V. Cirulli [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 2006. Vol.55, №10. - P.2723-2729.

23. Arous, C. Role and impact of the extracellular matrix on integrin-mediated pancreatic P-cell functions / C. Arous, B. Wehrl-Haller. - Текст: непосредственный // Biol Cell. - 2017. Vol.109, №6. - P.223-237.

24. Smink, A.M. Therapeutic strategies for modulating the extracellular matrix to improve pancreatic islet function and survival after transplantation / A.M. Smink, P. de Vos. - Текст: непосредственный // Curr Diab Rep. - 2018. Vol.18, №7. - P.39.

25. Riopel, M. Collagen matrix support of pancreatic islet survival and function / M. Riopel, R. Wang. - Текст: непосредственный // Front. Biosci. (Landmark Ed). - 2014. Vol.1, №19. - P.77-90.

26. Shimizu, H. Bioengineering of a functional sheet of islet cells for the treatment of diabetes mellitus / H. Shimizu, K. Ohashi, R. Utoh [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2009. Vol.30, №30. - P.5943-5949.

27. Weber, L.M. Hayda KN, Anseth KS. Cell-matrix interactions improve beta-cell survival and insulin secretion in three-dimensional culture / L.M. Weber, K.N. Hayda,

K.S. Anseth. - Текст: непосредственный // Tissue Eng Part A. - 2008. Vol. 14, №12. -P.1959-1968.

28. Beattie, G.M. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells / G.M. Beattie, V. Cirulli, A.D. Lopez [et al.]. - Текст: непосредственный // J Clin Endocrinol Metab. - 1997. Vol.82, №6. - P.1852-1856.

29. Abualhassan, N. Lung-derived microscaffolds facilitate diabetes reversal after mouse and human intraperitoneal islet transplantation / N. Abualhassan, L. Sapozhnikov, R.L. Pawlick [et al.]. - Текст: непосредственный // PLoS One. - 2016. Vol.11, №5. - e0156053.

30. Amer, L.D. Tissue engineering approaches to cell-based type 1 diabetes therapy / L.D. Amer, M.J. Mahoney and S.J. Bryant. - Текст: непосредственный // Tissue engineering. - 2014. Vol.20, №5. - P.455-467.

31. Hynes, R.O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils / R.O. Hynes. -Текст: непосредственный // Science. - 2009. Vol.326, №5957. - P.1216-1219.

32. Tziampazis, E. Tissue engineering of a bioartificial pancreas: modeling the cell environment and device function / E. Tziampazis, A. Sambanis. - Текст: непосредственный // Biotechnol Prog. -1995. Vol.11, №2. - P. 115-126.

33. Дедов, И.И. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом / Под редакцией И.И. Дедова, М.В. Шестаковай, А.Ю. Майорова. - Текст: непосредственный // - 8-й выпуск. - М.: УП ПРИНТ. -2017.

34. Zimmerman, C. The discovery and structure of human insulin / C. Zimmerman, G. Forlenza, D. Schatz. - Текст: непосредственный // Pediatr Endocrinol Rev. - 2020. Vol.17 (Suppl 1). - P.131-137.

35. Cimen, S.G. Challenges of pancreas transplantation in developing countries, exploring the Turkey example / S.G. Cimen, S. Cimen, N. Kessaris [et al.]. - Текст: непосредственный // World J Transplant. - 2019. Vol.20, №9 (8). -P.158-164.

36. Alekberzade, A.V. [Current state of the problem of allotransplantation of Langerhans cells (achievements and prospects)] / A.V. Alekberzade, N.N. Krylov, Z.

Adzhun [et al.]. - Текст: непосредственный // Khirurgiia (Mosk). - 2018. №11. -P.80-88.

37. Ricordi, C. Beta-cell transplantation for diabetes therapy / C. Ricordi, B.J. Hering, A.M. Shapiro. - Текст: непосредственный // Lancet. - 2008. Vol.372, №9632.

- P.27-28.

38. Bottino, R. The future of islet transplantation is now / R. Bottino, M.F. Knoll, C.A. Knoll [et al.]. - Текст: непосредственный // Front Med (Lausanne). - 2018. №5.

- P.202.

39. Carvalho Oliveira, M. Generating low immunogenic pig pancreatic islet cell clusters for xenotransplantation / M. Carvalho Oliveira, E. Valdivia, M. Verboom [et al.]. - Текст: непосредственный // J Cell Mol Med. - 2020. Vol.24, №9. - P.5070-5081.

40. Дедов И.И. Современные возможности применения стволовых клеток при сахарном диабете / И.И. Дедов, И.А. Лисуков, Д.Н. Лаптев. - Текст: непосредственный // Сахарный диабет. - 2014. №2. - С.20-28.

41. Barton, F. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010 / F. Barton, M. Rickels, R. Alejandro [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes Care. - 2012. Vol.35, №7. - P.1436-1445.

42. Harrison, R.H. Tissue engineering and regenerative medicine: a year in review / R.H. Harrison, J.P. St-Pierre, M.M. Stevens. - Текст: непосредственный // Tissue Eng Part B Rev. - 2014. Vol.20, №1, - P.1-16.

43. Lemos, N.E. Use of additives, scaffolds and extracellular matrix components for improvement of human pancreatic islet outcomes in vitro: a systematic review / N.E. Lemos, L. de Almeida Brondani, C. Dieter [et al.]. - Текст: непосредственный // Islets. - 2017. Vol.9, №5. - P.73-86.

44. Mirmalek-Sani, S.H. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering / S.H. Mirmalek-Sani, G. Orlando, J. Mc Quilling [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2013. Vol.34, №22. - P.5488-5495.

45. Yu, H. The rat pancreatic body tail as a source of a novel extracellular matrix scaffold for endocrine pancreas bioengineering / H. Yu, Y. Chen, H. Kong [et al.]. -Текст: непосредственный // J Biol Eng. - 2018. №12. - P.6.

46. Peloso, A. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas / A. Peloso, L. Urbani, P. Cravedi [et al.]. - Текст: непосредственный // Ann Surg. - 2016. Vol.264, №1. -P.169-179.

47. Скалецкая Г.Н. Экспериментальная имплантация тканеинженерной конструкции поджелудочной железы / Г.Н. Скалецкая, Н.Н. Скалецкий, Л.А. Кирсанова и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2019. - Т. XXI, №2. - С. 104-111.

48. Van Bell, T.L. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies / T.L. Van Bell, K.T. Coppieters, M.G. von Herrath. - Текст: непосредственный // Physiol Rev. - 2011. Vol.91, №1. - P.79-118.

49. Gan, M.J. Type 1 diabetes: current concepts in epidemiology, pathophysiology, clinical care, and research / M.J. Gan, A. Albanese-O'Neill, M.J. Haller. - Текст: непосредственный // Curr. Probl. Pediatr. Adolesc. Health Care. - 2012. Vol.42, №10. - P.269-291.

50. Gururaj Setty, S. New insulins and newer insulin regimens: a review of their role in improving glycaemic control in patients with diabetes / S. Gururaj Setty, W. Crasto, J. Jarvis [et al.]. - Текст: непосредственный // Postgrad Med J. - 2016. Vol.92, №1085. - P.152-164.

51. Woo, V.C. New insulins and new aspects in insulin delivery / V.C. Woo. -Текст: непосредственный // Can J Diabetes. - 2015. Vol.39, №4. - P.335-343.

52. Ng, L.C. Transdermal drug delivery systems in diabetes management: a review / L.C. Ng, M. Gupta. - Текст: непосредственный // Asian J Pharm Sci. - 2020. Vol.15, №1. - P.13-25.

53. Shah, R.B. Insulin delivery methods: past, present and future / R.B. Shah, M. Patel, D.M. Maahs [et al.]. - Текст: непосредственный // Int J Pharm Investig. - 2016. Vol.6, №1. - P.1-9.

54. Mannucci, E. Achieving HbAlc targets in clinical trials and in the real world: a systematic review and meta-analysis / E. Mannucci, M. Monami, I. Dicembrini [et al.].

- Текст: непосредственный // J Endocrinol Invest. - 2014. Vol.37, №5. - P.477-495.

55. Lind, M. Glycemic control and excess mortality in type 1 diabetes / M. Lind, AM. Svensson, M. Kosiborod [et al.]. - Текст: непосредственный // N Engl J Med. -2014. №371. - P.1972-1982.

56. Wahren, J. C-peptide: new findings and therapeutic possibilities / J. Wahren, C. Larsson. - Текст: непосредственный // Diabetes Res Clin Pract. - 2015. Vol.107, №3.

- P.309-319.

57. Wahren, J. C-peptide is a bioactive peptide / J. Wahren, K. Ekberg, H. Jornvall. -Текст: непосредственный // Diabetologia. - 2007. Vol.50, №3. - P.503-509.

58. Wahren, J. C-peptide and the pathophysiology of microvascular complications of diabetes / J. Wahren. - Текст: непосредственный // J Intern Med. - 2017. Vol.281, №1. - P.3-6.

59. Kiriyama, Y. Role and cytotoxicity of amylin and protection of pancreatic islet ß-cells from amylin cytotoxicity / Y. Kiriyama, H. Nochi. - Текст: непосредственный // Cells. - 2018. Vol.7, №8. - P.95.

60. Jamiolkowski, R.M. Islet transplantation in type 1 diabetes mellitus / R.M. Jamiolkowski, L.Y. Guo, Y.R. Li [et al.]. - Текст: непосредственный // Biol Med. -2012. Vol.85, №1. - P.37-43.

61. Dean, P.G. Pancreas transplantation / P.G. Dean, A. Kukla, M.D. Stegall [et al.].

- Текст: непосредственный // BMJ. - 2017. №357. - j 1321.

62. Global Observatory on Donation and Transplantarion Global Activity in Organ Transplantation Activities 2014 / Global Observatory on Donation and Transplantarion

- Текст: электронный // Available from: http: //www.transplant-observatory.org/summary/.

63. Готье С.В. Донорство и трансплантация органов в Российской Федерации в 2018 году / С.В. Готье, С.М. Хомяков. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2019. - Т. XXI, №3. - С.7-32.

64. Venturini, M. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US / M. Venturini, E. Angeli, P. Maffi. - Текст: непосредственный // Radiology. -2005. №234. - P.617-624.

65. Matsumoto, S. Islet cell transplantation for type 1 diabetes / S. Matsumoto. -Текст: непосредственный // J Diabetes. - 2010. Vol.2, №1. - P.16-22.

66. Shapiro, A.M. Novel approaches toward early diagnosis of islet allograft rejection / A.M. Shapiro, E.G. Hao, J.R. Lakey [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplantation. - 2001. Vol.71, №12. - P.1709-1718.

67. Ballinger, W.F. Transplantation of intact pancreatic islets in rat / W.F. Ballinger, P.E. Lacy. - Текст: непосредственный // Surgery. - 1972. Vol.72, №2. - P.175-186.

68. Najarian, J.S. Islet cell transplantation in treatment of diabetes / J.S. Najarian. -Текст: непосредственный // Hosp Pract. - 1977. Vol.12, №10. - P.63-69.

69. Clayton, H.A. Survival and function of islets during culture / H.A. Clayton, N.J. London. - Текст: непосредственный // Cell Transplant. - 1996. Vol.5, №1. - P.1-12.

70. Shapiro, A.M. Clinical pancreatic islet transplantation / A.M. Shapiro, M. Pokrywczynska, C. Ricordi. - Текст: непосредственный // Nat Rev Endocrinol. -2017. Vol.13, №5. - P.268-277.

71. Bellin, M.D. Potent induction immunotherapy promotes long-term insulin independence after islet transplantation in type 1 diabetes / M.D. Bellin, F.B. Barton, A. Heitman [et al.]. - Текст: непосредственный // Am J Transplant. - 2012. Vol.12, №6. - P.1576-1583.

72. Gruessner, R.W. The current state of pancreas transplantation / R.W. Gruessner, A.G. Gruessner. - Текст: непосредственный // Nat Rev Endocrinol. - 2013. Vol.9, №9. - P.555-562.

73. Maffi, P. Clinical results of islet transplantation / P. Maffi, A. Secchi. - Текст: непосредственный // Pharmacol Res. - 2015. №98. - P.86-91.

74. Shapiro, A.M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen / A.M. Shapiro, J.R. Lakey,

E.A. Ryan [et al.]. - Текст: непосредственный // N Engl J Med. - 2000. №343. -P.230-238.

75. Ryan, E.A. Five-year follow-up after clinical islet transplantation / E.A. Ryan, B.W. Paty, P.A. Senior [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 2005. Vol.54, №7. - P.2060-2069.

76. McCall, M. Update on islet transplantation / M. McCall, A.M. Shapiro. - Текст: непосредственный // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2012. Vol.2, №7. - a007823.

77. O'Connell, P.J. Multicenter Australian trial of islet transplantation: improving accessibility and outcomes / P.J. O'Connell, D.J. Holmes-Walker, D. Goodman [et al.]. - Текст: непосредственный // Am J Transplant. - 2013. №13. - P.1850-1858.

78. Balamurugan, A.N. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010 / A.N. Balamurugan, B. Naziruddin, A. Lockridge [et al.]. - Текст: непосредственный // Am J Transplant. - 2014. Vol. 14, №11. - P.2595-2606.

79. Shapiro, A.M. International trail of the Edmonton protocol for islet transplantation / A.M. Shapiro, C. Ricordi, B.J. Hering [et al.]. - Текст: непосредственный // N Engl J Med. - 2006. Vol.355, №13. - P.1318-1330.

80. Севастьянов В.И. Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины / В.И. Севастьянов. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2014. - Т. XVI, №3. - С.93-108.

81. Kumar, N. Polymeric scaffolds for pancreatic tissue engineering: a review / N. Kumar, H. Joisher, A. Ganguly. - Текст: непосредственный // Rev Diabet Stud. -2018. Vol.14, №4. - P.334-353.

82. Sumi, S. Regenerative medicine for insulin deficiency; creation of pancreatic islets and bioartificial pancreas / S. Sumi, Y. Gu, A. Hiura [et al.]. - Текст: непосредственный // J Hepatobiliary Pancreat Sci. - 2011. Vol.18, №1. - P.6-12.

83. Aguayo-Mazzucato, C. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus / C. Aguayo-Mazzucato, S. Bonner-Weir. - Текст: непосредственный // Nat Rev. - 2010. №6. - P.139-149.

84. Uccelli, A. Mesenchymal stem cells in health and disease / A. Uccelli, L. Moretta, V. Pistoia. - Текст: непосредственный // Nat Rev Immunol. - 2008. Vol.8, №9. - P.726-736.

85. Baeyens, L. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells / L. Baeyens, S. De Breuck, J. Lardon [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetologia. - 2005. №48. - P.49-57.

86. Minami, K. Seino S. Pancreatic acinar-to-beta cell transdifferentiation in vitro / K. Minami, S. Seino. - Текст: непосредственный // Front Biosci. - 2008. №1. -P.5824-5837.

87. Lu, Y. Transdifferentiation of hepatic oval cells into pancreatic islet betacells / Y. Lu, Y. Li. - Текст: непосредственный // Front Biosci. - 2012. №17. - P.2391-2395.

88. Grapin-Botton, A. Ductal cells of the pancreas / A. Grapin-Botton. - Текст: непосредственный // Int J Biochem Cell Biol. - 2005. Vol.37, №3. - P.504-510.

89. Karaoz, E. Protection of rat pancreatic islet function and viability by coculture with rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells / E. Karaoz, Z.C. Genc, P.C. Demircan [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Death Dis. - 2010. №1. - e36.

90. Matsumoto, S. Pancreatic islet transplantation for treating diabetes / S. Matsumoto, H. Noguchi, Y. Yonekawa [et al.]. - Текст: непосредственный // Expert Opin Biol Ther. - 2006. Vol.6, №1. - P.23-37.

91. Zhang, X.L. Improved, low-cost methods for pancreatic islet purification in rats / X.L. Zhang, J.K. Yang, M. Yu [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplant Proc. - 2009. Vol.41, №10. - P.4297-4301.

92. Piemonti, L. 25 years of the Ricordi automated method for islet isolation / L. Piemonti, A. Pileggi. - Текст: непосредственный // CellR4. - 2013. Vol.1, №1. -e128.

93. Berney, T. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis / T. Berney, R.D. Molano, P. Cattan. - Текст: непосредственный // Transplantation. - 2001. Vol.71, №1. - P.125-132.

94. Lake, S.P. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator / S.P. Lake, P.D. Bassett, A. Larkins [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 1989. №38, Suppl 1. - P.143-145.

95. Tanioka, Y. Excellence of the two-layer method in pancreas preservation before islet isolation / Y. Tanioka, D.E. Sutherland, Y. Kuroda [et al.]. - Текст: непосредственный // Surgery. - 1997. Vol.122, №2. - P.435-441.

96. Mohammadi Ayenehdeh, J. Introducing a new experimental islet transplantation model using biomimetic hydrogel and a simple high yield islet isolation technique / J. Mohammadi Ayenehdeh, B. Niknam, S.M. Hashemi [et al.]. - Текст: непосредственный // Iran Biomed J. - 2017. Vol.21, №4. - P.218-227.

97. Zongyi, Y. A rapid efficient, and economic device and method for the isolation and purification of mouse islet cells / Y. Zongyi, Z. Funian, L. Hao. - Текст: непосредственный // PLoS One. - 2017. Vol.12, №2. - e0171618.

98. Piemonti, L. Defining outcomes for beta cell replacement therapy: a work in progress / L. Piemonti, E.J.P. de Koning, T. Berney [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetologia. - 2018. Vol.61, №6. - P.1273-1276.

99. Fisher, S.A. Tissue mimetics: engineered hydrogel matrices provide biomimetic environments for cell growth / S.A. Fisher, R.Y. Tam, M.S. Shoichet. - Текст: непосредственный // Tissue Engineering. - 2014. Vol.20, №5-6. - P.895-898.

100. Трансплантология и искусственные органы / под ред. С.В. Готье. -Москва: «Лаборатория знаний». - 2018. - Текст: непосредственный. - С.298-312.

101. Биосовместимые материалы. Учебное пособие / под ред. В.И. Севастьянова, М.П. Кирпичникова. - Москва: МИА. - 2011. - Текст: непосредственный. - C.237-253.

102. Готье С.В. Влияние природы матрикса на функциональную эффективность биомедицинского клеточного продукта для регенерации поврежденной печени (экспериментальная модель острой печеночной недостаточности) / С.В. Готье, М.Ю. Шагидулин, Н.А. Онищенко и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2017. Т. XIX, №2. - С.78-89.

103. Севастьянов В.И. Клеточно-инженерные конструкции в тканевой инженерии и регенеративной медицине / В.И. Севастьянов. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2015. Т^УП, №2. - С.127-130.

104. Zhang, X. A novel 3-D model for cell culture and tissue engineering / X. Zhang, Y. Xie, C.G Koh [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomed Microdevices.

- 2009. Vol.11, №4. - P.795-799.

105. Zhang, Y. Three-dimensional scaffolds reduce islet amyloid formation and enhance function of cultured human islets / Y. Zhang, R.B. Jalili, G.L. Warnock [et al.].

- Текст: непосредственный // Am J Pathol. - 2012. Vol.181, №4. - P.1296-1305.

106. Page, H, Flood P, Reynaud EG. Three-dimensional tissue cultures: current trendsand beyond / H. Page, P. Flood, E.G. Reynaud. - Текст: непосредственный // Cell Tissue Res. - 2013. Vol.352, №1. - P.123-131.

107. Buitinga, M. Micro-fabricated scaffolds lead to efficient remission of diabetes in mice / M. Buitinga, F. Assen, M. Hanegraff [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2017. №135. - P. 10-22.

108. Coronel, M. Engineering a local microenvironment for pancreatic islet replacement / M. Coronel, C. Stabler. - Текст: непосредственный // Curr Opin Biotechnol. - 2013. №24. - P.900-908.

109. Advances in biomaterials for biomedical applications / eds. A. Tripathi, J.S. Melo. - Текст: непосредственный // Springer Nature Singapore Pte Ltd. - 2017. -P.73-93.

110. Хенч Л. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / Л. Хенч, Д. Джонс. - Москва: «Техносфера». - 2007. - Текст: непосредственный.

111. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения / М.И. Штильман. - Москва: ИКЦ «Академкнига». - 2006. - Текст: непосредственный.

112. Богородский С.Э. Формирование биоактивных высокопористых полимерных матриксов для тканевой инженерии / СЭ. Богородский, В.Н. Василец, Л.И. Кротова и др. - Текст: непосредственный // Перспективные материалы. - 2013. №5. - C.44-54.

113. Chun, S. Adhesive growth of pancreatic islet cells on a polyglycolic acid fibrous scaffold / S. Chun, Y. Huang, W.J. Xie [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplant Proc. - 2008. №40. - P.1658-1663.

114. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая. - Красноярск: «Платина». - 2006. - Текст: непосредственный.

115. Агапова О.И. Биодеградируемые изделия на основе фиброина шелка для тканевой инженерии и регенеративной медицины / О.И. Агапова, И.И. Агапов. - Москва: «Техносфера». - 2018. - Текст: непосредственный.

116. Тимашев П.С. Сверхкритическая флюидная обработка трехмерных гидрогелевых матриксов, полученных из производных хитозана / П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, С.Н. Чурбанов и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2016. Т. XVIII, №3. - С.85-93.

117. Harrington, S. Hyaluronic acid/collagen hydrogel as an alternative to alginate for long-term immunoprotected islet transplantation / S. Harrington, J. Williams, S. Rawal [et al.]. - Текст: непосредственный // Tissue Eng. - 2017. Vol.23, №19-20. - P.1088-1099.

118. Muthyala, S. Cytocompatibility studies of mouse pancreatic islets on gelatin-PVP semi IPN scaffolds in vitro: potential implication towards pancreatic tissue engineering / S. Muthyala, R.P. Bhonde, P.D. Nair. - Текст: непосредственный // Islets. - 2010. Vol.2, №6. - P.357-366.

119. Moisenovich, M.M. In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds / M.M. Moisenovich, O.L. Pustovalova, A.Yu Arhipova [et al.]. - Текст: непосредственный // J Biomed Mater Research. -2010. Vol.96A, №1. - P.125-131.

120. Sakata, N. Encapsulated islets transplantation: past, present and future / N. Sakata, S. Sumi, G. Yoshimatsu [et al.]. - Текст: непосредственный // World J Gastrointest Pathophysiol. - 2012. Vol.3, №1. -1910.4291.

121. Antosiak-Iwanska, M. Isolation, banking, encapsulation and transplantation of different types of Langerhans islets / M. Antosiak-Iwanska, E. Sitarek, M. Sabat [et

al.]. - Текст: непосредственный // Pol Arch Med Wewn. - 2009. Vol.119, №5. -P.311.

122. Lembert, N. Encapsulation of islets in rough surface, hydroxymethylated polysulfone capillaries stimulates VEGF release and promotes vascularization after transplantation / N. Lembert, J. Wesche, P. Petersen [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Transplant. - 2005. Vol.14, №2-3. - 97.10.3727.

123. Opara, E.C. Design of a bioartificial pancreas / E.C. Opara, S.H. Mirmalek-Sani, O. Khanna [et al.]. - Текст: непосредственный // J Investig Med. -2010. Vol.58, №7. - P.831-837.

124. Daoud, J. Long-term in vitro human pancreatic islet culture using three dimensional microfabricated scaffolds / J. Daoud, K. Asami, L. Rosenberg [et al.]. -Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2011. №32. - P.1536-1542.

125. Rana, D. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering / D. Rana, H. Zreigat, N. Benkirane-Jessel [et al.]. - Текст: непосредственный // J Tissue Eng Regen Med. - 2017. Vol.11, №4. - P.942-965.

126. Онищенко Н.А. Гепатоспецифический мелкодисперсный матрикс как важный компонент имплантируемых клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени / Н.А. Онищенко, М.Е. Крашенинников, М.Ю. Шагидулин и др. - Текст: непосредственный // Гены & Клетки. - 2016. - Т. XI, №1. - С.54-60.

127. Немец Е.А. Особенности технологии децеллюляризации фрагментов печени человека как тканеспецифического мелкодисперсного матрикса для клеточно-инженерной конструкции печени / Е.А. Немец, Л.А. Кирсанова, Ю.Б. Басок и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2017. - Т. XIX, №4. - С.70-77.

128. Севастьянов В.И. Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии хряща / В.И. Севастьянов, Ю.Б. Басок, Е.А. Немец и др. - Текст: непосредственный // Патент на изобретение RU 2716577 C1, 12.03.2020. Заявка № 2019115236 от 17.05.2019.

129. Shirakigawa, N. Decellularized Tissue Engineering / N. Shirakigawa, H. Ijima. - Текст: непосредственный // Advances in Biomaterials for Biomedical Applications. Springer Nature Singapore Pte Ltd. - 2017. - Vol.66. - P.185-226.

130. Crapo, P.M. An overview of tissue and whole organ decellularization processes / P.M. Crapo, T.W. Gilbert, S.F. Badylak. - Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2011. Vol.32, №12. - P.3233-3243.

131. Sackett, S.D. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas / S.D. Sackett, D.M. Tremmel, F. Ma [et al.]. - Текст: непосредственный // Sci Rep. - 2018. Vol.8, №1. -10452.

132. Patel, N. Strategies to recover proteins from ocular tissues for proteomics / N. Patel, E. Solanki, R. Picciani [et al.]. - Текст: непосредственный // Proteomics. -2008. - Vol.8, №5. - P.1055-1070.

133. Paulo Zambon J. Methods to generate tissue-derived constructs for regenerative medicine applications / J. Paulo Zambon, A. Atala, J.J. Yoo. - Текст: непосредственный // Methods. - 2019. - pii: S1046-2023(18)30445-6.

134. Badylak, S.F. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds / S.F. Badylak, D. Taylor, K. Uygun K. - Текст: непосредственный // Annu Rev Biomed Eng. - 2011. №13. - P.27-53.

135. Keane, T.J. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response / T.J. Keane, R. Londono, N.J. Turner [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2012. Vol.33, №6. - P.1771-1781.

136. Brown, B.N. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component / B.N. Brown, J.E. Valentin, A.M. Stewart-Akers [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2009. Vol.30, №8. - P.1482-1491.

137. Goh, S.K. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering / S.K. Goh, S. Bertera, P. Olsen [et al.]. -Текст: непосредственный // Biomaterials. - 2013. Vol.34, №28. - P.6760-6772.

138. Guruswamy Damodaran, R. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture / R. Guruswamy Damodaran, P. Vermette. - Текст: непосредственный // J Tissue Eng Regen Med. -2018. Vol.12, №5. - P.1230-1237.

139. Wu, D. 3D culture of MIN-6 cells on decellularized pancreatic scaffold: in vitro and in vivo study / D. Wu, J. Wan, Y. Huang [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomed Res Int. - 2015. - 432645.

140. Ko, J.H., Kim YH, Jeong SH, Lee S, Park SN, Shim IK, Kim SC. Collagen esterification enhances the ß-cells in 2D and 3D culture systemes / J.H. Ko, Y.H. Kim, S.H. Jeong [et al.]. - Текст: непосредственный // Biochem Blophys Res Commun. - 2015. Vol.483, №4. - P.1084-1090.

141. Llacua, L.A. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets / L.A. Llacua, M.M. Faas, P. de Vos. - Текст: непосредственный // Diabetologia. - 2018. Vol.61, №6. - P.1261-1272.

142. Jalili, R.B. Fibroblast populated collagen matrix promotes islet survival and reduces the number of islets required for diabetes reversal / R.B. Jalili, A. Moeen Rezakhanlou, A. Hosseini-Tabatabaei [et al.]. - Текст: непосредственный // J Cell Physiol. - 2011. Vol.226, №7. - P.1813-1819.

143. Szebeni, G.J. Real architecture for 3D Tissue (RAFT) culture system improves viability and maintains insulin and glucagon production of mouse pancreatic islet cells / G.J. Szebeni, Z. Tancos, L.Z. Feher [et al.]. - Текст: непосредственный // Cytotechnology. - 2017. Vol.69, №2. - P.359-369.

144. Jiang, K. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture / K. Jiang, D. Chaimov, S.N. Patel [et al.]. - Текст: непосредственный // Biomaterial. - 2019. №198. - P. 37-48.

145. Sojoodi, M. Enhanced maintenance of rat islets of Langerhans on laminin-coated electrospun nanofibrillar matrix in vitro / M. Sojoodi, A. Farrokhi, A.

Moradmand [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Biol Int. - 2013. Vol.37, №4.

- P.370-379.

146. Sigmundsson, K. Culturing functional pancreatic islets on a5-laminins and curative transplantation to diabetic mice / K. Sigmundsson, J.R.M. Ojala, M.K. Ohman [et al.]. - Текст: непосредственный // Matrix Biol. - 2018. №70. - P.5-19.

147. Pinkse, G.G. Integrin signaling via RGD peptides and anti-1 antibodies confers resistance to apoptosis in islets of Langerhans / G.G. Pinkse, W.P. Bouwman, R. Liawan-Lalai [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 2006. Vol.55, №2.

- P.312-317.

148. Navarro-Alvarez, N. Reestablishment of microenvironment is necessary to maintain in vitro and in vivo human islet function / N. Navarro-Alvarez, J.D. Rivas-Carrillo, A. Soto-Gutierrez [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Transplant. -2008. Vol.17, №1-2. - P.111-119.

149. Kaido, T. Impact of defined matrix interactions on insulin production by cultured human beta-cells: effect on insulin content, secretion, and gene transcription / T. Kaido, M. Yebra, V. Cirulli [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 2006. Vol.55, №10. - P.2723-2729.

150. Hamamoto, Y. Beneficial effect of pretreatment of islets with fibronectin on glucose tolerance after islet transplantation / Y. Hamamoto, S. Fujimoto, A. Inada [et al.]. - Текст: непосредственный // Horm Metab Res. - 2003. Vol.35, №8. - P.460-465.

151. Halper, J. Basic components of connective tissues and extracellular matrix: elastin, fibrillin, fibulins, fibrinogen, fibronectin, laminin, tenascins and thrombospondins / J. Halper, M. Kjaer. - Текст: непосредственный // Adv Exp Med Biol. - 2014. №802. - P.31-47.

152. Minardi, S. An elastin-based vasculogenic scaffold promotes marginal islet mass engraftment and function at an extrahepatic site / S. Minardi, M. Guo, X. Zhang [et al.]. - Текст: непосредственный // J Immunol Regen Med. - 2019. №3. -P.1-12.

153. Yeo, G.C. The elastin matrix in tissue engineering and regeneration / G.C. Yeo, S.M. Mithieux, A.S. Weiss. - Текст: непосредственный // Current Opinion in Biomedical Engineering. - 2018. №6. - P.27-32.

154. Irving-Rodgers, H.F. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection / H.F. Irving-Rodgers, F.J. Choong, K. Hummitzsch [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Transplant. - 2014. Vol.23, №1. - P.59-72.

155. Cheng, J.Y. Matrix components and scaffolds for sustained islet function / J.Y. Cheng, M. Raghunath, J. Whitelock [et al.]. - Текст: непосредственный // Tissue Eng Part B Rev. - 2011. Vol.17, №4. - P.235-247.

156. Севастьянов В.И. Инъекционный гетерогенный биополимерный гидрогель для заместительной и регенеративной хирургии и способ его получения / В.И. Севастьянов, Н.В. Перова. - Текст: непосредственный // Патент на изобретение РФ № 2433828. - 2011.

157. Севастьянов В.И. Биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ - инъекционный биодеградируемый имплантат / В.И. Севастьянов, Н.В. - Текст: непосредственный // Практическая медицина. - 2014. Том 8, №84. -С.120-126.

158. Scuteri, A. A double mechanism for the mesenchymal stem cells' positive effect on pancreatic islets / A. Scuteri, E. Donzelli, V. Rodriguez-Menendez [et al.]. -Текст: непосредственный // PLoS One. - 2014. Vol.9, №1. - e84309.

159. Hirabaru, M. A metod for performing islet transplantation using tissue-engineered sheets of islets and mesenchymal stem cells / M. Hirabaru, T. Kuroki, T. Adachi [et al.]. - Текст: непосредственный // Tissue Eng Part C Methods. - 2015. Vol.21, №12. - P.1205-1215.

160. Figliuzzi, M. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve islet graft function in diabetic rats / M. Figliuzzi, R. Cornolti, N. Perico [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplant Proc. - 2009. Vol.41, №5. - P.1797-1800.

161. Sakata, N. Bone marrow cell cotransplantation with islets improves their vascularization and function / N. Sakata, N.K. Chan, J. Chrisler [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplantation. - 2010. Vol.89, №6. - P.686-693.

162. Ito, T. Mesenchymal stem cell and islet co-transplantation promotes graft revascularization and function / T. Ito, S. Itakura, I. Todorov [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplantation. - 2010. Vol.89, №12. - P.1438-1445.

163. Hematti, P. Potential role of mesenchymal stromal cells in pancreatic islet transplantation / P. Hematti, J. Kim, A.P. Stein [et al.]. - Текст: непосредственный // Transplant Rev (Orlando). - 2013. Vol.27, №1, - P.21-29.

164. de Souza, B.M. Effect of co-culture of mesenchymal stem/stromal cells with pancreatic islets on viability and function outcomes: a systematic review and meta-analysis / B.M. de Souza, A.P. Boucas, F.D. Oliveira [et al.]. - Текст: непосредственный // Islets. - 2017. Vol.9, №2. - P.30-42.

165. Jung, E.J. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells support rat pancreatic islet survival and insulin secretory function in vitro / E.J. Jung, S.C. Kim, Y.M. Wee [et al.]. - Текст: непосредственный // Cytotherapy. - 2011. Vol.13, №1. -P.19-29.

166. Matsushima, H. Human fibroblast sheet promotes human pancreatic islet survival and function in vitro / H. Matsushima, T. Kuroki, T. Adachi [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Transplant. - 2016. Vol.25, №8. - P.1525-1537.

167. Rabinovitch, A. Factors from fibroblasts promote pancreatic islet B cell survival in tissue culture / A. Rabinovitch, T. Russell, D.H. Mintz. - Текст: непосредственный // Diabetes. - 1979. Vol.28, №12. - P.1108-1113.

168. Liu, D. The effect of fibroblast activation on vascularization in transplanted pancreatic islets / D. Liu, H. Xiao, C. Du [et al.]. - Текст: непосредственный // J Surg Res. - 2013. Vol.183, №1. - P.450-456.

169. Miki, A. Maintenance of mouse, rat, and pig pancreatic islet functions by coculture with human islet-derived fibroblasts / A. Miki, M. Narushima, T. Okitsu [et al.]. - Текст: непосредственный // Cell Transplant. - 2006. Vol.15, №4. - P.325-334.

170. Pellegrini, S. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes / S. Pellegrini, E. Cantarelli, V. Sordi [et al.]. - Текст: непосредственный // Acta Diabetol. - 2016. Vol.24, №3. - P.683-691.

171. Chiou, S.H. MafA promotes the reprogramming of placenta-derived multipotent stem cells into pancreatic islets-like and insulin-positive cells / S.H. Chiou, S.J. Chen, Y.L. Chang. - Текст: непосредственный // J Cell Mol Med. - 2011. Vol.15, №3. - P.612-624.

172. Bernardo, A.S. Biphasic induction of Pdx 1 in mouse and human embryonic stem cells can mimic development of pancreatic beta-cells / A.S. Bernardo, C.H. Cho, S. Mason. - Текст: непосредственный // Stem Cell. - 2009. №27. - P.341-349.

173. Скалецкий Н.Н. Разработка и экспериментальное исследование тканеинженерных конструкций поджелудочной железы из культур островковых клеток поджелудочной железы и биодеградируемых носителей с целью стимуляции регенерации Р-клеток у больных сахарным диабетом / Н.Н. Скалецкий, Л.А. Кирсанова, В.И. Севастьянов. - Текст: непосредственный // В книге «Трансплантология: итоги и перспективы» под ред. С.В. Готье. - Москва. -2015. - Том VI. - С. 120-124.

174. London, N.J. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans / N.J. London, S.M. Swift, H.A. Clayton. - Текст: непосредственный // Diabetes Metab. - 1998. Vol.24, №3. - P.200-207.

175. Min, T. Superiority of visipaque (iodixanol) - controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification / T. Min, L. Yi, Z. Chao [et al.]. -Текст: непосредственный // Transplant Proc. - 2010. Vol.42, №5. - P.1825-1829.

176. Hou, Y. Excellent effect of three-dimensional culture condition on pancreatic islets / Y. Hou, C. Song, W.J. Xie [et al.]. - Текст: непосредственный // Diabetes res Clin Pract. - 2009. Vol.86, №1. - P.11-15.

177. Paraskevas, S. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis / S. Paraskevas, D. Maysinger, R. Wang [et al.]. - Текст: непосредственный // Pancreas. -2000. Vol.20, №3. - P.270-276.

178. Potter, K.J. Amyloid formation in human islets is enhanced by heparin and inhibited by heparinase / K.J. Potter, I. Werner, H.C. Denroche [et al.]. - Текст: непосредственный // Am J Transplant. - 2015. Vol.15, №6. - P.1519-1530.

179. De Carufel, C.A. New insights into the roles of sulfated glycosaminoglycans in islet amyloid polypeptide amyloidogenesis and cytotoxicity / C.A. De Carufel, P.T. Nguyen, S. Sahnouni [et al.]. - Текст: непосредственный // Biopolymers. - 2013. Vol.100, №6. - P.645-655.

180. Thomas, F.T. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation / F.T. Thomas, J.L. Contreras, G. Bilbao. - Текст: непосредственный // Surgery. - 1999. Vol.126, №2. - P.299-304.

181. Lacy, P.E. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas / P.E. Lacy, M. Kostianovsky. - Текст: непосредственный // Diabetes. -1967. Vol.16, № 1. - P.35-39.

182. Кирсанова Л.А. Сравнительный морфологический анализ изолированных островков поджелудочной железы крысы, культивируемых в стандартных условиях и с биополимерным микрогетерогенным коллагенсодержащим гелем / Л.А. Кирсанова, Н.В. Баранова, Г.Н. Бубенцова и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2017. - Т. XIX, № 2. - С. 90-97.

183. Баранова Н.В. Роль мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы в жизнеспособности островков Лангерганса крысы при совместном культивировании с микрогетерогенным коллагенсодержащим гелем / Н.В. Баранова, Л.А. Кирсанова, З.З. Гоникова и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2018. - Т. XX, № 3. - С. 54-63.

184. Pang, X. Experimental studies onislets isolation, purification and function in rats / X. Pang, W. Xue, X. Feng [et al.]. - Текст: непосредственный // Int J Clin Exp Med. - 2015. Vol. 8, №11. - P.20932- 20938.

185. Morris, A.H. The host response to naturally-derived extracellular matrix biomaterials / A.H. Morris, D.K. Stamer, T.R. Kyriakides. - Текст: непосредственный // Semin Immunol. - 2017. Vol.29. - P.72-91.

186. Баранова Н.В. Сравнительный анализ секреторной способности островков Лангерганса, культивированных с биополимерным коллагенсодержащим гидрогелем и тканеспецифическим матриксом / Н.В. Баранова, Л.А. Кирсанова, А.С. Пономарева и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2019. - Т. XXI. № 4. - С. 45-53.

187. Готье С.В. Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности / С.В. Готье, М.Ю. Шагидулин, Н.А. Онищенко и др. - Текст: непосредственный // Патент на изобретение № 2010110063/14 (014141) от 03.03.2011.

188. Пономарева А.С. Децеллюляризация фрагмента донорской поджелудочной железы для получения тканеспецифического матрикса / А.С. Пономарева, Л.А. Кирсанова, Н.В. Баранова и др. - Текст: непосредственный // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2020. - Т. XXII, №1. -С.123-133.

Приложение А (рекомендуемое)

Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель директора Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии искусственных

органов имени ак В.И. Шумакова»

рофессор

евченко

2020 г.

МОДИФИЦИРОВАННАЯ МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫСЫ

Москва 2020

А.1 ВВЕДЕНИЕ

Настоящий протокол устанавливает порядок выполнения процедур и манипуляций по выделению островков Лангерганса (ОЛ) из поджелудочной железы (ПЖ) крысы, идентификации и оценки морфофункционального состояния свежевыделенных ОЛ, хранению монокультуры ОЛ. Выполнение этих процедур направлено на получение монокультуры островков Лангерганса с целью использования ее в качестве клеточного компонента тканевого эквивалента поджелудочной железы (ТЭ ПЖ) крысы для регенерации или временной замены поврежденной поджелудочной железы.

А.2 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ

Протокол обязателен для применения всеми сотрудниками, задействованными в работе с культурой ОЛ. Лаборанты ответственны за ежедневное выполнение рутинных процедур и заполнение соответствующей документации. Обо всех отклонениях от нормы при проведении рутинных процедур лаборант обязан своевременно сообщать руководителю исследования.

А.3 НОРМАТИВНАЯ БАЗА

• ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

• Приказ Минздравсоцразвития РФ № 708Н от 23.08.2010. «Об утверждении правил лабораторной практики».

• ГОСТ ISO 10993-2, Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными.

А.4 ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПРОТОКОЛА

Рутинные процедуры включают в себя регулярные мероприятия по поддержанию и контролю микробиологической чистоты и жизнеспособности клеточных культур, санитарную обработку помещений и инвентаря.

Рутинные процедуры выполняются персоналом, прошедшим обучение и имеющим опыт работы с культурами клеток.

Все работы, проводимые в чистой зоне, должны осуществляться в спецодежде, используемой только в чистой зоне и с использованием средств индивидуальной защиты (маски, перчатки).

Многоразовый инвентарь и инструменты хранятся в помещениях чистой зоны только после проведенной стерилизации.

Утилизация биологических отходов при подготовке и при проведении эксперимента должна осуществляться в соответствии с «Санитарными правилами и нормами СанПиН 2.1.7.728-99».

А.5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

Для выполнения настоящего протокола необходимы следующие специальное оборудование, инструменты и расходные материалы:

Оборудование:

- ламинарные боксы 2-го класса биологической защиты

- инвертированный микроскоп

- люминесцентный микроскоп

- орбитальный шейкер инкубатор

- микротом

- центрифуга

- СО2 инкубатор

- вытяжной шкаф

- микропланшетный ридер с программным обеспечением

Инструменты:

- микропинцеты

- металлическое сито с диаметром ячеек 0,6 мм

- хирургические ножницы и пинцеты

- глазные ножницы

- автоматическая микропипетка

- одноразовая стерильная пластиковая посуда (Corning, США): центрифужные пробирки объемом 15 мл, флаконы объемом 50 мл, чашки Петри диаметром 60

Л

мм, культуральные флаконы с вентилируемыми крышками площадью 25 см , серологические пипетки объемом 1 мл, 5 мл.

- гидрофобный карандаш (NovoPen) (DAKO, США)

- предметные стекла с адгезивной поверхностью («ApexLab», Россия) Среды и реактивы:

- коллагеназа I типа («Sigma-Aldrich», США)

- солевой раствор Хенкса без фенолового красного («ПанЭко», Россия)

- дитизон («Sigma-Aldrich», США)

- раствор DMSO (диметилсульфоксид) («ПанЭко», Россия)

- фосфатный буфер (PBS, TBS) («ПанЭко», Россия)

- питательная среда DMEM/F12 (1:1), содержащая глюкозу 1,0 г/л («ПанЭко», Россия)

- сыворотка крови эмбриональная телячья (ЭТС) («ПанЭко», Россия)

- раствор HEPES 1М (Na-соль) («ПанЭко», Россия)

- L-глутамин 2 мМ («ПанЭко», Россия)

- гентамицин 50 мкг/мл («ПанЭко», Россия)

- акридиновый оранжевый и пропидиум иодид (AO/PI) («Sigma-Aldrich», США)

- антитела к инсулину (Rabbit Monoclonal anti-insulin antibody, «Sigma-Aldrich», США).

- набор реактивов системы визуализации для иммуногистохимии Reveal-Biotin-Free Polyvalent DAB («Spring», США).

- 10%-ный забуференый раствор формалина («ПанЭко», Россия)

- жидкость Буэна

- гематоксилин («DAKO», США)

- набор реактивов для иммуноферментного анализа (ИФА) Rat Insulin ELISA Kit («Invitrogen», США)

А.6 ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РУТИННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ

Подготовка помещений, рабочих поверхностей и инвентаря включает в себя:

- еженедельную санитарную обработку помещений и рабочих поверхностей, включающую мытье полов, стен, потолков, рабочих поверхностей оборудования в помещениях чистой зоны раствором моющего средства с применением дезинфицирующих агентов;

- замену адгезирующего покрытия при входе в предбоксник чистой зоны;

- проверку наличия дезинфицирующих растворов в емкостях, необходимого запаса инструментов, расходных материалов, средств индивидуальной защиты на рабочем месте;

- проверку наличия необходимого количества питательных сред и реактивов в холодильнике чистой зоны.

- бактерицидную обработку УФО с использованием стационарных облучателей в боксе и в ламинарном шкафу в течение 1 часа перед началом работы.

- обработку рук и рабочих поверхностей дезинфицирующим раствором непосредственно перед началом работы, обжигание стеклянных горлышек бутылок и флаконов, металлических инструментов в пламени спиртовки.

- все манипуляции, требующие стерильности, проводятся только в рабочей зоне включенного в рабочий режим ламинарного шкафа (стрелка индикатора - в зеленой зоне).

- питательные среды и реактивы перед началом работой должны быть доведены до требуемой (в соответствии с технологией) температуры.

- удаление отходов из чистой зоны проводится в подготовленные емкости непосредственно после окончания работы.

А.7 ВЫДЕЛЕНИЕ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА ИЗ

ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫСЫ ПО МОДИФИЦИРОВАННОЙ МЕТОДИКЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОЛЛАГЕНАЗЫ

Все манипуляции с животными проводят с соблюдением биоэтических принципов, утверждённых Европейской конвенцией о защите позвоночных животных (European Convention for the Protection of Vertebrate Animais Used for Expérimental and other Scientific Purposes, 2005) и в соответствии с Правилами лабораторной практики, утверждёнными приказом Минздрава России №708 от 23.08.2010 г.

Животных подвергают ингаляционной эвтаназии диэтиловым эфиром, затем в стерильных условиях вскрывают брюшную полость и иссекают поджелудочную железу, которую немедленно помещают в чашку Петри с холодным (+4°С) раствором Хенкса. Все дальнейшие манипуляции по обработке поджелудочной железы проводятся в условиях ламинарного бокса.

Из чашки Петри полностью удаляют пипеткой раствор Хенкса. Затем последовательными инъекциями интрапаренхиматозно вводят в панкреатическую ткань 5-6 мл раствора коллагеназы I типа с активностью 100-110 ед/мл. Растянутую ПЖ разделяют микропинцетами на 10-12 приблизительно равных фрагментов, переносят во флакон и инкубируют 40-45 мин в орбитальном шейкер-инкубаторе при температуре 37,0°С-37,2°С в следующем режиме: 30 мин - 0 об/мин (статика), 10 мин - со скоростью вращения 150 об/мин. Переваривание останавливают добавлением холодного (+4°С) раствора Хенкса. Флакон с дезагрегированной панкреатической тканью 2-3 раза интенсивно встряхивают вручную в течение нескольких секунд. Образовавшиеся мелкие фрагменты фильтруют через металлическое сито с диаметром ячеек 0,6 мм. Перевар собирают в конические пробирки и центрифугируют 40-50 секунд при скорости 600-700 об/мин. В образовавшемся осадке с помощью инвертированного микроскопа визуализируют клетки ацинарной ткани и одиночные островки. Основная масса ОЛ выявляется в надосадочной жидкости (супернатанте). Затем

супернатант дважды отмывают при следующем режиме центрифугирования: 1-1,5 минут при 1200-1300 об/мин для получения осадка, состоящего из суспензии ОЛ. Из центрифужной пробирки осуществляют забор суспензии (до 0,5 мл) для идентификации островков с целью объективной оценки возможности получения монокультуры островков.

А.8 ИДЕНТИФИКАЦИЯ СВЕЖЕВЫДЕЛЕННЫХ ОСТРОВКОВ

ЛАНГЕРГАНСА

Идентификацию островков Лангерганса осуществляют, проводя окрашивание дитизоном. Рабочий раствор дитизона готовят, исходя из следующей пропорции: дитизон - 20 мг, DMSO - 2 мл, раствор Хенкса - 8 мл, и используют непосредственно перед исследованием или хранящийся при температуре -23 0С до 6 месяцев. Для идентификации ОЛ в чашку Петри вносят 0,2-0,4 мл суспензии ОЛ, добавляют 0,1-0,2 мл рабочего раствора дитизона и инкубируют в термостате в течение 20-30 мин при 37°С. Дитизон избирательно окрашивает панкреатические островки в терракотово-красный цвет, при этом ацинарные клетки остаются неокрашенными. Такое окрашивание позволяет не только идентифицировать островки Лангерганса, но и подсчитывать их количество в островково-клеточной суспензии.

А.9 ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКУЛЬТУРЫ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА

Для получения монокультуры островков Лангерганса свежевыделенные островки ресуспендируют в 2 мл среды DMEM/F12 (1:1) и переносят пипеткой емкостью 5 мл в культуральные флаконы, площадью 25 см2 каждый, равномерно распределяя островко-клеточную суспензию по дну культурального флакона. В каждый культуральный флакон добавляют 5 мл среды DMEM/F12 (1:1), 2 мМЬ-глутамина, 1 М Hepes и, 50 мкг/мл гентамицина и 0,7 мл эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), концентрация которой в ростовой среде составит 10 %. Затем

флаконы с островками переносят в инкубатор, обеспечивающий стабильную температуру культивирования 37,0оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислоты.

А.10 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СВЕЖЕВЫДЕЛЕННЫХ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА

Для изучения морфофункционального состояния свежевыделенных островков Лангерганса проводят определение их жизнеспособности, инсулинпродуцирующей активности, а также выявление инсулинпродуцирующих Р-клеток методом иммуногистохимии.

• Оценка жизнеспособности свежевыделенных островков Лангерганса

Для определения жизнеспособности свежевыделенных островков проводят

флуоресцентное окрашивание витальным красителем - акридиновым оранжевым и пропидиум-йодидом (AO/PI). Для этого 0,2-0,4 мл суспензии, содержащей свежевыделенные островки Лангерганса, помещают в чашку Петри, добавляют 0,02-0,03 мл готового раствора красителя и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15-17 минут. Результат оценивают с помощью люминесцентного микроскопа. Жизнеспособные клетки демонстрируют зеленую флуоресценцию, тогда как погибшие клетки, окрашенные пропидиум-йодидом, приобретают красную.

• Иммуногистохимическое исследование свежевыделенных островков

Лангерганса

Идентификацию Р-клеток в свежевыделенных островках Лангерганса осуществляют с помощью специальных иммуногистохимических методов окрашивания по классической методике с пероксидазой хрена, используя антитела к инсулину.

- материал фиксируют в 10%-ном забуференом растворе формалина или в жидкости Буэна.

- фиксированный материал обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (в двух порциях 70%, 80% и 96% этанола), выдерживают в смеси спирта и ксилола, ксилоле и заливают в парафин.

- стекла с парафиновыми срезами толщиной 4-5 мкм, полученные на микротоме, депарафинируют, проводя через ксилол и спирты нисходящей концентрации (96%, 96%, 80%,70%)и регидратируют в дистиллированной воде.

- стекла аккуратно осушают фильтровальной бумагой, срезы обводят гидрофобным карандашом. Один из срезов используют в качестве контрольного.

- на срезы микропипеткой наносят Hydrogen Peroxide Block для блокировки эндогенных энзимов и инкубируют в течение 10 минут.

- трижды ополаскивают фосфатным буфером (PBS) и наносят на срезы Protein Block для блокировки неспецифического окрашивания. Инкубируют в течение 10 минут.

- однократно ополаскивают фосфатным буфером и наносят антитела к инсулину с разведением 1:100, инкубируют при комнатной температуре в течение 60 минут. На контрольный срез наносят раствор фосфатного буфера.

- срезы трижды ополаскивают фосфатным буфером и наносят раствор Complement на 10 минут.

- срезы трижды отмывают в фосфатном буфере и наносят раствор HRP Conjugate на 15 минут.

- после четырехкратного отмывания фосфатным буфером на срезы наносят окрашивающий субстрат, который готовят непосредственно перед употреблением, смешивая 20 мкм хромогена (DAB Chromagen) и 1 мл субстратного буфера (DAB Substrate buffer).

- результат и степень окрашивания оценивают под контролем микроскопа, как правило, в течение 1 -2 минут, когда наблюдается появление коричневого преципитата в цитоплазме клеток-мишеней. В контрольных срезах подобной реакции не наблюдается.

- стекла со срезами трижды отмывают в фосфатном буфере и помещают в стаканчик с дистиллированной водой на 5 минут.

- срезы докрашивают гематоксилином в течение 2 минут, дегидратируют, проводя через спирты восходящей концентрации, ксилол, и заключают в бальзам.

• Определение инсулинпродуцирующей активности культивируемых островков Лангерганса

Для определения содержания инсулина в культуральной среде используют набор для иммуноферментного анализа (ИФА). Концентрацию гормона можно определять уже на ранних сроках культивирования суспензионной культуры ОЛ. В данном варианте ИФА (ЕЫБАКй), действующего по принципу твердофазный «сэндвич» - метод, используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена, что позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена (инсулина). В лунки 96-луночного планшета вносят попарно контрольный раствор, образцы стандартных разведений инсулина для построения калибровочной кривой и образцы исследуемой культуральной жидкости для связывания антигена с иммобилизованным на дне лунок антителом и инкубируют. Формирование комплекса - «сэндвич» (фермент-антитело-антиген) происходит в результате добавления второго (детекторного) антитела-ВюйпуЫеёАпйЬоёу, меченого биотинилированной ферментативной меткой и обнаруженного реагентом 81хер1ау1ёт-НКР. После инкубации добавляют раствор субстрата-ТМВБиЬв^е, который реагирует с комплексом для получения сигнала в виде окрашенного в синий цвет продукта. После остановки реакции с помощью стоп-раствора-81:ор 8о1шюп продукт окрашивается в желтый цвет. Интенсивность этого сигнала выражается через оптическую плотность, которая прямо пропорциональна концентрации инсулина, присутствующего в исследуемых образцах.

Оптическую плотность измеряют, не позднее 30 минут после остановки реакции, используя микропланшетный ридер с программным обеспечением на длинах волн 450 нм и 550 нм. Затем значение, полученное на 550 нм, вычитают из значения на 450 нм для исправления оптических дефектов микропланшета.

Статистическую обработку полученных данных проводят с помощью приложения МюшБОЙЕхсе! 2007. Результаты количественного метода ИФА

рассчитывают по линейной калибровочной кривой. Все результаты представляют в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение. Различия считают достоверными при р <0,05.

А.11 ХРАНЕНИЕ МОНОКУЛЬТУРЫ ОСТРОВКОВ ЛАНГЕРГАНСА

На вторые сутки инкубации монокультура островков Лангерганса может быть использована в качестве клеточной компоненты при создании тканевого эквивалента поджелудочной железы (ТЭ ПЖ) крысы с целью регенерации или временной замены поврежденной поджелудочной железы.

При необходимости суспензионная культура островков Лангерганса может сохраняться в условиях их инкубации в термостате при 37°С и 5%-ном содержании углекислоты в атмосфере инкубации без существенных потерь их морфофункциональных свойств от 3 до 5 суток. Таким образом, может осуществляться временное хранение островков Лангерганса до намеченного срока их использования, в том числе для создания тканевых эквивалентов ПЖ.

Приложение Б (рекомендуемое)

Министерство здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»

ТЕХНОЛОГИЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕЛКОДИСПЕРСНОГО МАТРИКСА ИЗ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОЙ ТКАНИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫСЫ

вченко

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель директора Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр

органов имени академика * х, ттт ЛжЛХЛ^ А 1 В.И. Шуткова», Д.М.Н., л£рфессор

Москва 2020

Б.1 ВВЕДЕНИЕ

Настоящий протокол устанавливает порядок выполнения процедур и манипуляций по децеллюляризации поджелудочной железы (ПЖ) крысы, оценке биосовместимых, морфологических и функциональных свойств образцов децеллюляризованной панкреатической ткани, хранению децеллюляризованной ПЖ. Выполнение этих процедур направлено на получение тканеспецифического матрикса (ДПЖ матрикса) с сохранением основных белков внеклеточного матрикса (ВКМ) панкреатической ткани, низкой иммуногенностью и отсутствием цитотоксичности. ДПЖ матрикс используется в качестве каркаса на основе естественного ВКМ при создании тканевого эквивалента поджелудочной железы (ТЭ ПЖ) крысы для регенерации или временной замены поврежденной поджелудочной железы.

Б.2 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ

Протокол обязателен для применения всеми сотрудниками, задействованными в работе в лаборатории. Лаборанты ответственны за ежедневное выполнение рутинных процедур и заполнение соответствующей документации. Обо всех отклонениях от нормы при проведении рутинных процедур лаборант обязан своевременно сообщать руководителю исследования.

Б.3 НОРМАТИВНАЯ БАЗА

• ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики»,

• Приказ Минздравсоцразвития РФ № 708Н от 23.08.2010. «Об утверждении правил лабораторной практики»

• ГОСТ ISO 10993-2, Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными.

Б.4 ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПРОТОКОЛА

В лаборатории назначаются ответственные за соблюдением правил техники безопасности по ГОСТ 12.1.007-76, правильного хранения химических веществ, санитарного состояния помещений, обеспеченности средствами индивидуальной защиты и аптечками первой помощи.

Рутинные процедуры выполняются персоналом, прошедшим обучение и имеющим опыт работы в химической лаборатории.

Все сотрудники в лаборатории должны быть обеспечены необходимой спецодеждой и средствами индивидуальной защиты (маски, перчатки, защитные очки).

Лабораторные запасы реактивов должны храниться в специально оборудованных, хорошо вентилируемых, сухих помещениях согласно разработанной в лаборатории схеме размещения.

Все исследования, связанные с работой на культурах клеток (цитотоксичность, функциональные свойства) проводятся только в чистой зоне в асептических условиях.

Проведение рутинных мероприятий включает в себя регулярную санитарную обработку с применением дезинфицирующих агентов и бактерицидную обработку УФО с использованием стационарных облучателей боксовых помещений.

Все процедуры и манипуляции, требующие стерильности, проводятся только в стерильной рабочей зоне включенного в рабочий режим ламинарного шкафа (стрелка индикатора - в зеленой зоне).

Утилизация биологических отходов в лаборатории должна осуществляться в соответствии с «Санитарными правилами и нормами СанПиН 2.1.7.728-99».

Б.5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

Для выполнения настоящего протокола необходимы следующие специальное оборудование, инструменты и расходные материалы: Оборудование:

- ротационная система MultiBio RS-24 (BioSan, Латвия)

- вытяжной шкаф

- инвертированный микроскоп

- люминесцентный микроскоп

- микротом

- морозильник

- термостат

- радиционный у-стерилизатор (источник: изотоп кобальт-60)

- микропланшетный ридер c программным обеспечением

- ламинарный бокс 2-го класса биологической защиты

- центрифуга Инструменты:

- хирургические пинцеты

- глазные ножницы

- автоматическая микропипетка

- криопрбирки

- бумажные фильтры

- нейлоновые сетки с диаметром пор 10 мкм (Millipore, Ирландия)

- одноразовая стерильная пластиковая посуда (Corning, США): чашки Петри диаметром 60 мм, центрифужные пробирки объемом 15 мл, культуральные флаконы площадью 25 см2, серологические пипетки объемом 1 мл, 5 мл

- гидрофобный карандаш (NovoPen) (DAKO, США)

- предметные стекла с адгезивной поверхностью («ApexLab», Россия)

Среды и реактивы:

- додецилсульфата натрия (SDS) («ПанЭко», Россия)

- NaCl, раствор 1N («ПанЭко», Россия)

- фосфатно-солевой буфер (PBS) («ПанЭко», Россия)

- амфотерицин, 1,5 мкг/мл («ПанЭко», Россия)

- ампицилин, 10 мкг/мл («ПанЭко», Россия)

- набор для выделения ДНК DNeasyBlood&TissueKit («QIAGEN», Германия)

- флуоресцентный краситель™ Picogreen Quant - iT («Invitrogen», США)

- краситель prestoBlue™ CellViabilityReagent («Invitrogen», США)

- стандарт цинка одноэлементный водный 10000 мкг/мл («Sigma-Aldrich», США)

- сыворотка крови эмбриональная телячья (ЭТС) (« HyClone», США)

- питательная среда DMEM, содержащая глюкозу 1,0 г/л («ПанЭко», Россия)

- акридиновый оранжевый и пропидиум иодид (AO/PI) («Sigma-Aldrich», США)

- 10%-ныйзабуференый раствор формалина («ПанЭко», Россия)

- флуоресцентный краситель DAPI («Sigma-Aldrich», США)

- гематоксилин («DAKO», США)

- орсеин («ПанЭко», Россия)

- реактивы для окраски по методу Массона

- трипсин («ПанЭко», Россия)

- антитела к коллагену I (anti-collagenlantibody, «Abcam», Великобритания)

- антитела к коллагену IV (anti-collagenIVantibody, «Abcam», Великобритания)

- набор реактивов системы визуализации Rabbit Specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC kit («Abcam», Великобритания)

Б.6 ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИЯ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫСЫ

Все манипуляции с животными проводят с соблюдением биоэтических принципов, утверждённых Европейской конвенцией о защите позвоночных животных (European Convention for the Protection of Vertebrate Animais Used for Expérimental and other Scientific Purposes, 2005) и в соответствии с Правилами лабораторной практики, утверждёнными приказом Минздрава России №708 от 23.08.2010 г.

Животных подвергают ингаляционной эвтаназии диэтиловым эфиром, затем в стерильных условиях вскрывают брюшную полость и иссекают поджелудочную железу, которую помещают в чашку Петри с холодным (+4°С) раствором Хенкса.

Для получения мелкодисперсного тканеспецифичного матрикса из ткани ПЖ крысы с сохранением свойств исходного ВКМ применяют способ физико-химической децеллюляризации ПЖ крысы с использованием растворов поверхностно-активных веществ (ПАВ) высокой и низкой ионной силы (метод осмотического шока) с последующим тщательным удалением остатков ПАВ из децеллюляризованных фрагментов панкреатической ткани.

Субтотально удаленную ПЖ крысы измельчают вручную с помощью глазных ножниц до размера фрагментов не более 1х1х2 мм. Фрагменты ПЖ обрабатывают при комнатной температуре в условиях непрерывного перемешивания (ротационная система, скорость 5 оборотов/мин) последовательно в 0,1% растворе додецилсульфата натрия (SDS) на дистиллированной воде в течение 3 часов, в 0,1% растворе SDS на 1N NaCl в течение 3 часов и в 0,1% растворе SDS на фосфатно-солевом буфере (PBS, рН = 7,35) в течение 18 часов. На завершающей стадии получения ДПЖ матрикса децеллюляризованные фрагменты панкреатической ткани отмывают от остатков ПАВ в течение 72 часов в трех сменах PBS, содержащего антибиотик (ампицилин, 10 мкг/мл) и антимикотик (амфотерицин, 1,5 мкг/мл). Смену раствора осуществляют один раз в сутки.

Образцы ДПЖ матрикса (суспензия фрагментов ДПЖ в PBS) вносят в криопробирки по 1 мл, замораживают и стерилизуют (у-стерилизация, 1,5 Мрад).

Б. 7 ИССЛЕДОВАНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО МАТРИКСА НА ИММУНОГЕННОСТЬ ПО СОДЕРЖАНИЮ ОСТАТОЧНОГО

КОЛИЧЕСТВА ДНК

Для определения степени иммуногенности децеллюляризованного материала по остаточному количеству ядерного материала в ДПЖ матриксе проводят выделение и флуоресцентное окрашивание ДНК. Перед исследованием образцы ДПЖ матрикса хранят при температуре -20°С.

Выделение ДНК проводят с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit согласно инструкции производителя. Предварительно с поверхности децеллюляризованных образцов с помощью бумажных фильтров и нейлоновых сеток с диаметром пор 10 мкм аккуратно удаляют избыточную влагу. Образцы механически измельченной децеллюляризованной ткани массой 10 мг лизируют добавлением AL буфера и протеиназы К в течение 16 часов при температуре +57°С. После добавления AL буфера и 100% этанола пробирки с образцами центрифугируют в течение 1 мин при 6000 g. Затем образцы последовательно обрабатывают промывочным раствором AW1, центрифугируют при 6000 g, промывают буфером AW2 и центруфугируют при 20 000 g для высушивания мембраны колонки. Для увеличения выхода ДНК из образца проводят трехкратное элюирование с использованием АЕ буфера.