Экспериментальное изучение фармакокинетики нового антидиабетического лекарственного средства – 3-(1h-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновой кислоты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат наук Куликов Александр Леонидович

• Куликов Александр Леонидович
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Куликов Александр Леонидович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Низкомолекулярные лиганды имидазолиновых рецепторов Функциональные особенности имидазолиновых рецепторов

1.2. Влияние лигандов имидазолиновых рецепторов на

инсулинпродуцирующую функцию

1.3. Исследования фармакологической активности С7070

1.4. Исследования фармакокинетики при разработке новых лекарственных средств

1.5. Обоснование и выбор доз

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Нормативно - правовые аспекты экспериментальных исследований

2.1.2. Объект исследования

2.1.3. Реактивы, материалы и оборудование

2.1.4. Лабораторные животные

2.1.5. Методы исследования

2.2. Дизайн исследования

2.3. Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации

данных

2.4. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка биоаналитической методики

3.1.1. Биоаналитическая методика определения С7070 в биологических матрицах (плазме крови крыс, кроликов собак, гомогенатов органов, моче и кале крыс)

3.2. Валидация биоаналитической методики

3.3. Оценка основных фармакокинетических параметров у животных

3.3.1. Оценка основных фармакокинетических параметров у кроликов

3.3.2. Оценка основных фармакокинетических параметров у крыс

3.3.3. Исследование накопления, органного распределения и экскреции препарата на крысах

3.3.4. Оценка основных фармакокинетических параметров у собак

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Планирование экспериментальных работ, составление дизайна исследования

4.2. Обсуждение результатов разработки и валидация биоаналитической методики определения С7070 в биологической матрице

4.3. Обсуждение результатов фармакокинетических параметрову кроликов

4.4. Обсуждение результатов фармакокинетических параметров у крыс

4.5. Обсуждение результатов исследования накопления, органного распределения и экскреции препарата на крысах

4.6. Обсуждение результатов фармакокинетических параметров у собак

4.7. Межвидовое сравнение фармакокинетических параметров

4.8. Межвидовой перенос фармакокинетических данных

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АиС(о-о ¡^ - площадь под фармакокинетической кривой «концентрация лекарственного вещества-время» при внутривенном введении в интервале времени от 0 до момента (;) отбора последней пробы биоматериала;

АиС(о-о еу - площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества-время» при внесосудистом введении в интервале времени от 0 до момента (;) отбора последней пробы биоматериала;

АиМС(о-о ¡V - площадь под кривой «произведение времени на концентрацию» при внутрисосудистом введении в интервале времени от 0 до момента (;) отбора последней пробы биоматериала;

АиМС(о-о еу - площадь под кривой «произведение времени на концентрацию» при внесосудистом введении в интервале времени от 0 до момента (;) отбора последней пробы биоматериала;

MRT(o-t) ¡V - среднее время пребывания в организме молекулы лекарственного вещества при внутривенном введении;

MRT(o-t) еу - среднее время пребывания в организме молекулы лекарственного вещества при внесосудистом введении;

Ке1 ¡у - константа скорости элиминации при внутривенном введении;

Ке1 ¡у - константа скорости элиминации при внесосудистом введении;

Т1/2 ¡у - период полувыведения лекарственного вещества при внутривенном введении;

Т1/2 еу - период полувыведения лекарственного вещества при внесосудистом введении;

АиС(о-<») ¡у - площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества -время» в интервале времени от 0 до да при внутривенном введении;

АиС(о-<) еу - площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества -время» в интервале времени от 0 до да при внесосудистом введении;

Стах ¡у - максимальная концентрация лекарственного вещества в крови за период наблюдения при внутрисосудистом введении;

Cmax ev - максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме крови при внесосудистом введении;

Tmax iv - время достижения максимальной концентрации (Cmax) лекарственного вещества в крови при внутрисосудистом введении;

Tmax ev - время достижения максимальной концентрации (Cmax) лекарственного вещества в крови при внесосудистом введении;

МАТ - среднее время всасывания лекарственного вещества;

D - доза лекарственного вещества;

С1т - общий клиренс;

Vss - стационарный объём распределения;

fa - абсолютная биодоступность;

fr - тканевая доступность;

Kd - кажущийся коэффициент распределения;

Cl renal - почечный клиренс;

Cmax/AUCo-t - относительная скорость всасывания; АФС - активная фармацевтическая субстанция; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения; СД - сахарный диабет;

МС/МС - тандемное масспектрометрические детектирование; С7070 - лабораторный шифр исследуемого вещества

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное изучение фармакокинетики нового антидиабетического лекарственного средства – 3-(1h-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновой кислоты»

Актуальность темы исследования

Настоящая работа посвящена изучению фармакокинетических свойств нового противодиабетического средства - 3-(Ш-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновой кислоты, агониста имидазолиновых рецепторов с лабораторным шифром С7070 (далее С7070).

Интерес к данному веществу - потенциальному лекарственному средству для лечения СД обусловлен тем, что агонистами имидазолиновых рецепторов являются антигипертензивные препараты клонидин, моксонидин и рилменидин, а также противодеабетический препарат метформин. Антигипертензивные препараты клонидин, моксонидин и рилменидин в отличие от С7070 не влияют на гликемический контроль. Метформин по безопасности (острая токсичность, лактатацидоз и др. побочные действия), широте терапевтического индекса и выраженности антидиабетических свойств уступает С7070.

Среди преимуществ предлагаемого лекарственного средства над имеющимися аналогами можно выделить:

над глибенкламидом:

- низкотоксичное средство (LD50 14900 мг/кг, крысы, per os);

- отсутствие риска гипогликемических состояний при применении (антигипергликемическое действие);

- восстановление инсулинпродуцирующей функции панкреатических в-клеток;

- позитивное влияние на проявления метаболического синдрома;

-благоприятный спектр сопутствующих фармакологических эффектов

(гиполипидемический, снижающий инсулинорезистентность, нефропротекторный и др.).

над метформином:

- имеет более низкую токсичность (LD50 14900 мг/кг и 1000 мг/кг, крысы, per os, соответственно)

- более низкую терапевтическую дозу (250 мг и 500 мг соответственно),

- восстанавливает инсулинпродуцирующую функцию панкреатических в-клеток,

- проявляет благоприятный спектр сопутствующих фармакологических эффектов (нефропротекторный и др.),

- проявляет более выраженное сахароснижающее и другие характерные для метформина фармакологические действия.

Степень разработанности проблемы

С учетом актуальности проблемы лечения СД 2 типа ведется постоянный поиск как биологических мишеней, так эффективных фармакологически средств [1]. Объект исследования попадает в фокус научной направленности и для дальнейшего внедрения в медицинскую практику потенциального противодиабетического препарата, проведено изучение фармакокинетики на животных. Исследуемое химическое соединение имеет синтетическое происхождение. По механизму действия потенцирует имидазолиновые рецепторы I, II типов. Обладает специфическим пространственным и элементным строением, позволяющим ему взаимодействовать с биологическими мишенями.

Современный уровень лекарственных средств, применяемых для терапии сахарного диабета 2 типа, базируется на активации у-рецептора PPARy, ингибировании а-глюкозидазы, стимулировании секреции инсулина с использованием аналогов ГПП-1, ингибировании DPP4. В изученной литературе нет данных об использовании агонистов имидазолиновых рецепторов I и II типов для лечения сахарного диабета 2 типа. Однако имеются данные о том, что имидазолиновые рецепторы I и II могут влиять на гомеостаз глюкозы опосредованно. Агматин оказывает прямой эффект на гомеостаз глюкозы и увеличивает чувствительность к инсулину у пациентов с метаболическим синдромом. Эксперименты на мышах показали, что введение агматина приводит к увеличению уровня эндорфинов в плазме крови и уменьшает уровень глюкозы. Антигепертензивный препарат моксонидин, являющийся агонистом рецепторов I

и II, снижает активность симпатической нервной системы и уменьшает резистентность тканей к инсулину.

В литературе представлены данные [1] относительно синтеза новых биологически активных веществ производных бензимидазола, в том числе и соединения С7070, проявляющих антигипергликемическое действие, способность снижать инсулинорезистентность путем повышения чувствительности тканей к инсулину, а также улучшать функцию панкреатических в-клеток. Приведенные в упомянутом источнике данные также касаются применения производных бензимидазола, в том числе соединения С7070 и их фармацевтических композиций.

С7070 синтезируют химическим путем. По физико - химическим свойствам это мелкокристаллический порошок с фракцией 13 - 100 мкм, не гигроскопичный, запах отсутствует. Имеет хорошую растворимость в диметилкетоне и этиловом спирте, плохо растворим в воде.

Молекула С7070, как фармакологически активное средство, была открыта инициативной группой украинских ученных (Национальный фармацевтический университет (НФаУ)) путем комбинаторного метода обработки информации для производных бензимидазола. Выявленная молекула обладала всеми необходимыми качествами для потенциального лекарственного средства (проявляла сахороснижающее и антиоксидантное действие). С7070 вызвало высокий интерес у ученых и исследования были продолжены с целью углубленного изучения механизмов действия и проявляемых эффектов. В результате экспериментальных работ установлены и другие положительные аспекты (снижение ишемически-реперфузионных поражений печени, дерматопротекторные свойства и др.). Учитывая множественные плеотропные эффекты становится очевидным, что С7070 приобретает высокую клиническую значимость, особенно при лечении СД 2 типа.

Установление фармакологической активности и выявление потенциальных лекарственных средств проходит на начальных этапах научного поиска. Для понимания коммуникации активной молекулы с организмом необходимо дальнейшее изучение фармакокинетических свойств. До момента и во время

проведения диссертационного исследования данных в литературе о фармакокинетических свойствах С7070 не было представлено.

Таким образом, проведенное исследование позволит восполнить данный пробел и продвинет еще ближе потенциальное лекарственное средство к клинической практике.

Цель исследования

Экспериментальное in vivo изучение фармакокинетики нового потенциального противодиабетического лекарственного средства - 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновой кислоты с

лабораторным шифром С7070.

Задачи исследования

1. Разработать и метрологически аттестовать высокочувствительный и селективный аналитический метод количественного определения С7070 в биологическом материале;

2. Изучить основные фармакокинетические параметры после однократного внутривенного и внутрижелудочного введения С7070 с качеством фармацевтической субстанции у крыс и кроликов;

3. Оценить экскрецию с мочой и калом после однократного внутрижелудочного введения С7070 с качеством фармацевтической субстанции у крыс, определить массовый баланс;

4. Изучить основные фармакокинетические параметры после однократного внутривенного и внутрижелудочного введения С7070 с качеством фармацевтической субстанции и готовой лекарственной формы у собак;

5. Оценить органное распределение после многократного внутрижелудочного введения крысам;

6. Провести межвидовое сравнение фармакокинетических показателей у животных и смоделировать межвидовой перенос на человека.

Научная новизна

В исследовательской работе впервые разработана методика количественного определения С7070 методом ВЭЖХ МС/МС для широкого спектра биологических

матриц (плазма крови крыс, собак, кроликов, экскременты и гомогенаты органов крыс). Методика метрологически аттестована и позволяет гарантированно получать достоверные результаты.

С помощью разработанного инструмента in у^о изучена и описана фармакокинетическая модель С7070, установлены закономерности депонирования в органы и ткани, определены пути выведения и сделано предположение о механизме метаболизма.

На основании фармакокинетической модели проведен прогностический расчет некоторых фармакокинетических характеристик на человека.

Теоретическая и практическая значимость работы

В ходе исследований установлено, что С7070 хорошо всасывается через желудочно-кишечный тракт, быстро достигает системного кровотока, имеет линейную зависимость отклик/доза, хорошо распределяется в органы и ткани. Практически не подвергается биодеградации.

Результаты изучения фармакокинетики являются составной частью НИОКР «Доклинические исследования антидиабетического лекарственного средства -агониста имидазолиновых рецепторов», шифр «2.1 Агонист имидазолиновых рецепторов 2014» выполненных по заданию Минпромторга России в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».

Методология и методы исследования

В диссертационной работе использована совокупность биологических и химических моделей для получения экспериментальных и расчетных характеристик. Исходный материал, которым является концентрация С7070 в биологических объектах, определялся разработанной и аттестованной ВЭЖХ МС/МС методикой. Аттестация выполнена в соответствии с установленными мировыми требованиями на сертифицированном оборудовании.

Получение исходного материала выполнено in vivo у лабораторных животных (крысы, кролики, собаки) в соответствии с дизайном исследования,

который составлен исходя из установленных норм. Все манипуляции с животными заблаговременно обсуждались на локальном этическом комитете НИУ БелГУ.

Расчетная и прогностическая часть работы выполнена общепринятыми математическими методами с использованием пакета специализированных программ (Statistica 10; Origin Pro 8; MS Exel 2010). В каждой программной среде создавались пакеты (шаблоны), которые подвергались верификации.

Расчет фармакокинетической модели выполнен в соответствии с общепринятыми нормами [144,145], используя некомпартментный подход.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана и метрологически аттестована методика количественного определения С7070 в биологических матрицах.

2. Изучены основные фармакокинетические параметры С7070 после однократного внутривенного и внутрижелудочного введения крысам, кроликам и собакам для потенциального лекарственного средства и её готовой лекарственной формы, изучено органное распределение и экскреция.

3. Проведены межвидовые сравнения фармакокинетических показателей у исследуемых животных и осуществлен межвидовой перенос на человека.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов исследования подтверждается адекватными моделями, достаточным количеством измерений, валидными методами и современным оборудованием, которые соответствуют поставленным целям и задачам. Все измерительное оборудования имело сертификаты государственной поверки. Положения, сформулированные в ходе диссертационной работы подкреплены фактическими данными, представленными в таблицах, графиках и рисунках. Статистическая обработка проведена с использованием современных пакетов программ и соответствует типу данных.

Публикации

Научные положения и выводы диссертационной работы опубликованы в 11 работах в центральной и местной печати, в том числе 3 из них - в изданиях,

рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, 2 статьи - в индексируемых в международных базах данных Web of Scence и Scopus журналах.

Личный вклад автора

Автор работы принимал непосредственное участие при проведении всех этапов диссертационного исследования: планировании, получении экспериментальных данных, забор и количественный анализ биологического материала, статистической обработкой и описанием полученных результатов, написана рукопись диссертационной работы, а также опубликованы материалы по выполненной работе.

Объем и структура и диссертационной работы Работа представлена на 149 страницах машинописного текста. Структурно состоит из списка сокращений, введения, четырех основных глав, в которых отображён обзор литературы (ГЛАВА 1), используемые материалы и методы (ГЛАВА 2), результаты собственных исследований (ГЛАВА 3), обсуждения результатов (ГЛАВА 4), заключения, выводов, и списка литературы, включающего 157 источников, из них 107 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Низкомолекулярные лиганды имидазолиновых рецепторов Функциональные особенности имидазолиновых рецепторов

Исследование имидазолиновых рецепторов началось в 60-х годах прошлого века после открытия клонидина, препарата, снижающего артериальное давление. В соответствии с аффинностью к различным лигандам, локализацией в организме и физиологической функцией выделяют три типа имидазолиновых рецепторов.

Имидазолиновые рецепторы 1 типа (II) располагаются в плазматических мембранах в головном мозге, сердце, почках, печени и поджелудочной железе. Рецепторы II с высокой аффинностью связывают клонидин и моноксидин и отвечают за гипотензивный эффект этих лекарственных препаратов [3]. Имидазолиновые рецепторы 2 типа (12) являются аллостерическими сайтами связывания для моноаминоксидазы-Б (МАО-Б). Рецепторы 12 связывают имидазолины и гуанидины и обладают более низкой аффинностью к 2-аминоимидазолинам, таким, как клонидин. Лиганды 12 могут вызывать психотропное действие. Рецепторы 3 типа (13) располагаются в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы и модулируют секрецию инсулина [4,5]. Механизмы действия имидазолиновых рецепторов остаются в значительной степени не изучены.

Некоторые лиганды имидазолиновых рецепторов допущены для использования в клинической практике. Клонидин, гуанфацин, моксонидин и рилменидин широко применяется для лечения артериальной гипертензии. Тетрагидрозолин (тетризолин) используется в качестве глазных капель для сужения сосудов при покраснении глаз и уменьшения отека конъюктивы, а также в назальных спреях для снижения отечности слизистой оболочки носа. Тизанидин ингибирует секрецию нейромедиаторных аминокислот из интернейронов и является миорелаксантом центрального действия. Нафазолин вызывает вазоконстрикцию и обладает противоотченым и противовоспалительным действиями. Назначается при таких показаниях как острый ринит, гайморит, отек

гортани аллергического генеза и пр. Аналогичным эффектом обладает оксиметазолин. Дексмедетомидин применяется в качестве седативного препарата при интубации.

Следует отметить, что из перечисленных препаратов только моксонидин и рилменидин относят к фармакологической группе агонистов имидазолиновых рецепторов.

Рецепторы II

Рецепторы 11 обнаружены в периферической и центральной нервной системах и по механизму действия обладают высокой аффинностью к клонидину. Препараты клонидинового типа приводят к уменьшению выделения трансмиттеров норэпинефрина и эпинефрина из синаптического нервного окончания в периферические ткани. Это приводит к снижению периферического сопротивления сосудов, частоты сердечных сокращений и артериального давления.

Первоначально предполагалось, что основными рецепторами препаратов клонидинового типа являются альфа-2 адренергические рецепторы (АА-2), однако позже было показано, что гипотензивный эффект препаратов обеспечивается преимущественно рецепторами 11 [6,7].

Важно отметить, что клонидин и аналогичные соединения воздействуют на АА-2 рецепторы, что обуславливает возникновения ряда нежелательных явлений, таких как сухость во роту и седативный эффект [8,9]. Например, микроинъекции селективных агонистов АА-2 (таких, как гуанфацин или медетомидин), обладающих низкой аффинностью к 11, в ростральный отдел вентролатерального продолговатого мозга крыс не приводят к значимому гипотензивному эффекту [9,10]. Применение медетомидина вызывает сильный седативный эффект и лишь незначительное понижение кровяного давления [9].

Моксонидин Имидазо-

Рилменидин О линовый

Агматин рецептор 1

RVLM

Клонидин

Гуанфацин

Дексмедетомидин

Тизандин

Тетрагидрозолин

Нафазолин

Оксиметазолин

Ксилометазолин

t *

Я Ингибирование Ингибирование

Ш симпатической (/} высвобождения П>

Я активности норадреналина

и

I 1 NTS

Г

Снижение

вазокон-

стрикции

Гипотензия

Брадикардия

Альфа-2 адреноцептор

Голубое пятно

Седативный эффект

ч

Слюнные железы

Сухой рот

Моксонидин Агматин

Гарман

Имидазо-линовый рецептор 2 Ф

Имидазо-линовый рецептор 3 Ф

МАО-А МАО-Б

ANS ?

Психиатрические эффекты Гомеостаз глюкозы Истощение Антиноцицепция

Бета-клетки поджелудочной железы

Повышенная секреция инсулина

Примечание: RVLM - rostral ventrolateral medulla (ростральный отдел вентролатерального

продолговатого мозга), NTS - nucleus tractus solitarii (ядро одиночного пути) Рисунок 1.1 - Направления преимущественного действия некоторых эндогенных лигандов имидазолиновых рецепторов, а также лигандов, одобренных к использованию в клинической практике [6]

При регуляции артериального давления рецепторы II и АА-2 работают в тандеме [9]. Кроме того, рецепторы II могут подавлять выделения медиаторов постганглионарными нейронами симпатической нервной системой путем модуляции ряда других сигнальных систем (кальциевые каналы ^типа, аденозиновые рецепторы, G-белок-связанные калиевые каналы внутреннего выпрямления, фосфатидилхолин специфическая фосфолипаза С и никотиновые рецепторы).

Ген, кодирующий II достоверно не определен, однако клонирован ген,

предположительно соответствующий рецептору IRAS (imidazoline receptor antisera-selected protein, также известен как нискарин) [12]. Этот белок не проявляет значимой гомологии аминокислотной последовательности по отношению к прочим известным белкам и структурно не похож на белки GPCR (G-ptotein coupled receptors), включая АА-2. IRAS вовлечен в связывание белков-субстратов инсулинового рецептора, что приводит к фосфорилированию ERK (extracellular receptor kinase). Сверхэкспрессия IRAS в клеточных культурах приводила к повышенной активации ERK инсулином и увеличению восприимчивости клеток к инсулину. Другим сигнальным путем IRAS является модуляция клеточной миграции путем взаимодействия с рецептором фибронектина и белками интегринового сигнального комплекса. IRAS связывает ряд имидазолиновых лигандов, что индуцирует инициацию клеточных каскадов, вовлеченных в клеточную выживаемость, рост и миграцию [11,13].

Рецепторы I2

Рецепторы I2 были обнаружены на внешних мембранах митохондрий [14]. Было предположено, что I2 являются аллостерическими сайтами моноаминоксидаз МАО-Б. Однако, данные по корреляции между количеством сайтов I2 и активностью МАО-Б разнятся (коэффициент корреляции r варьируется в пределах от 0,61 до 0,96) [10].

Таким образом, по-видимому не все молекулы МАО-Б связаны с имидазолиновыми рецепторами. Моноаминоксидазы играют важную роль в поддержании постоянной концентрации эндогенных моноаминов, а также метаболизируют экзогенные моноамины (в частности, психоактивные вещества). Фермент МАО-Б обнаружен в нейронах и астроглии, а также тромбоцитах. Субстратами МАО-Б являются фенилэтиламин и дофамин [15].

В связи с ассоциацией I2 и МАО-Б исследование лигандов I2 проводилось в аспекте поиска новых антидепрессантов. Действительно, было обнаружено, что плотность распределения I2 в лобной доле коры больших полушарий мозга жертв суицида снижена [16]. Другой физиологической ролью рецепторов I2 является влияние на ноцицепцию и зависимость. В опубликованных экспериментальных работах по изучению болевой чувствительности у мышей агматин усиливал

анальгезию морфина и оксикодона и подавлял развитие толерантности [17-20]. Этот эффект опосредован рецепторами АА-2, имидазолиновыми и опиоидными рецепторами. Рецепторы 12 сами по себе могут проявлять антиноцицептивную активность, работая в синергии с опиоидами при острой боли, а также снижают толерантность к опиоидной анальгезии [21, 22].

Рецепторы 12 оказывают схожее с 11 воздействие на инсулиновые рецепторы. Потенцирование 12 влияет на гомеостаз глюкозы и увеличивает восприимчивость клеток к инсулину [23]. Ген, кодирующий рецептор 12, не был клонирован и структура рецептора неизвестна [24]. На основании аффинности к амилориду выделяют рецепторные подтипы 12а и 12Ь [25].

Рецепторы И и их влияние на секрецию инсулина

Имидазолиновые рецепторы 13 напрямую влияют на секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы [6]. Взаимодействие рецепторов 13 с агонистами приводит к закрытию АТФ-чувствительных калиевых каналов (КАТР) и снижению проницаемости ионов К+ через клеточную мембрану бета-клеток поджелудочной железы [26]. Производные сульфонилмочевины связываются с большим регуляторным белком на КАТР, что инициирует экзоцитоз инсулина. Канал КАТР также включает меньшую субъединицу (Кк6.2), которая осуществляет перемещение ионов К+ через мембрану. Рецепторы 13 могут быть связаны с Кк6.2. Авторами [27, 28] показано, что имидазолины фентоламин и цибенозолин индуцируют блокаду КАТР в клетках, в которых отсутствует большая субъединица КАТР, ответственная за связывание производных сульфонилмочевины. Это означает, что лиганды могут связываться непосредственно с порой Кк6.2. В ряде других работ предполагается, что фентоламин и цибенозолин связываются именно с 13 и имидазолиновый рецептор может контролировать экзоцитоз инсулина напрямую [29, 30].

Эндогенный лиганд, агматин, способен активировать 13 рецепторы и, таким образом, оказывать антиапоптотическое протективное действие на бета-клетки [31]. Ген, кодирующий рецептор 13, не был клонирован и структура рецептора неизвестна [24].

Низкомолекулярные лиганды имидазолиновых рецепторов

Дизайн новых высокоселективных лигандов имидазолиновых рецепторов позволяет предположить получение новых лекарственных препаратов, вызывающих меньше побочных эффектов, а также получение новых соединений, исследование которых позволит более детально изучить фармакологические эффекты, связанные с ингибированием или стимулированием имидазолиновых рецепторов. На данный момент синтезировано большое количество селективных агонистов и антагонистов рецепторов I1, I2 и I3.

Эндогенные лиганды

Природные лиганды имидазолиновых рецепторов могут иметь высокую селективность, что делает эти молекулы привлекательными моделями для дальнейшей оптимизации. К эндонгенным лигандам относят агматин, имидазол-4-ацетатацидо-риботид (imidazole-4-acetic acid ribotide - IAA-RP), гарман и гармалан [32-34]. Агматин связывается с умеренной аффинностью с рецепторами АА-2, I1, I2 и I3 [35], тогда как IAA-RP является агонистом I1 и I3 [33]. Гарман и гармалан являются эндогенными лигандами I1 и I2 и обладают аналогичным клонидину гипотензивным эффектом, гарман также влияет на уровень глюкозы в крови, являясь лигандом I3 [34, 36].

Лиганды I1

Множество различных семейств лигандов I1 было исследовано на предмет аффинности к I1, I2 и АА-2 рецепторам (в том числе 2-аминоимидазолины, 2-аминооксазолины, аминопирролины, 2-арилимидазолины, 2-фенилимидазолины и 2-имидазолины) [24]. Исторически первый открытый лиганд клонидин обладает большей аффинностью к I1 и АА-2, чем к I2 [37, 38]. Дальнейшая модификация структуры клонидина привела к синтезу моксонидина [9] и рилменидина [11] -селективных агонистов I1, которые были выпущены в качестве лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке.

Введение пирролинового кольца в аминопирролиновых аналогах рилменидина позволило исключить связывание с АА-2 при незначительном снижении аффиности к I1 [39]. Беназолин эффективно активирует I1 и I2 и является

высоко селективным лигандом к 11 и 12 по сравнению с адренергическими рецепторами альфа 1 и альфа 2. Последующая оптимизация структуры беназолина привела к синтезу производных 2-фенилимидазолинов. Некоторые из синтезированных соединений показали высокую активность и селективность к 11 [40]. На основании этих данных было предположено, что рецепторы 11 связываются преимущественно с 2-фенилимидазолинами с метокси- или метильной группой в положениях 2' или 3' [40].

Существенного повышения селективности к 11 по отношению к 12 удалось добиться при замещении -СН2СН2- мостика производных фенилэтиленимидазолинов [41]. (^^)-(+)-изомер оказался более аффинным к 11, тогда как (1R,2R)-(-)-изомер проявил повышенную аффинность к 12. Аналогично, ^)-(-) изомер проявил высокую активность к 11, тогда как его ^)-(+) изомер оказался малоактивен.

Авторы [42] провели дальнейшую оптимизацию соединений. В работе [43] хронотропный и гипотензивный эффекты были подтверждены для марсанидина 33 и его аналогов 34(1^-80), 35(1^-54), 36(1^-213).

Поиск новых производных 2-арилиминопирролидинов позволил получить высокоаффинный и селективный в отношении АА-2 лиганд 11, (3-хлоро-2-метил-фенил)-(4-метил-4,5-дигидро-3Н-пиррол-2-ил)-амина гидрохлорид (Ь№599), который обладает гипотензивной активностью и улучшает симптомы метаболического синдрома на крысиной модели [44, 45, 46].

Новое семейство лигандов 11 было получено путем комбинации структур агматина и имидазолинового кольца. Производное гуанидина, аллантоин (5-уреидогидантион), является агонистом как рецептора 11, так и 13, и выполняет ряд физиологических функций, включая антигипертензивную и защиту от апоптоза бета-клеток островков Лангерганса [47].

Авторами [48] проведена оптимизация структуры релминидина и получены соединения с существенно меньшей аффинностью к АА-2, однако обладающие цитотоксическим действием в отношении некоторых линий раковых клеток. Предполагается, что основной цитотоксический эффект оказывается именно через путь, связанный с 11.

Лиганды 12

Для имидазолиновых рецепторов 12 характерна высокая аффинность к гуанидинам и имидазолинам и низкая аффинность к производным 2-аминоимидазолинов. К лигандам 12 также относят производные карболина [24].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Куликов Александр Леонидович, 2020 год

Материалы

• Наконечники 10, 200, 1000 мкл (TipOne, Кат. № 1111-3700, 1111-1700, 11112721); 20, 200, 300 мкл (Thermo Fisher Scientific,^. № 94410217, 94410317, 94410517);

• Пластиковые пробирки на 1,5 мл.

Оборудование

• Жидкостной хроматограф Thermo Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Оборудование каждый год проходит государственное освидетельствование. На момент проведения исследований имелся сертификат о поверке (исследование проведено в сентябре, дата поверки 08.2015);

•Тандемный масспектрометрический детектор Velos Pro (Thermo Fisher Scientific). Оборудование каждый год проходит государственное освидетельствование. На момент проведения исследований имелся сертификат о поверке (исследование проведено в сентябре, дата поверки 08.2015);

• Одноканальные пипетки 0,5-10 ^L, 10-100 ^L, 20-200 ^L и 100 -1000 ^L (Eppendorf). На момент проведения исследований действовал сертификат соответствия производителя (до 10.2016 года);

• Ультразвуковая баня мощностью 3 Вт;

• Zorbax Eclipse XDB-C18 (3,0 х 150 мм, 3,5 мкм + защитная колонка);

• Центрифуга Micro CL 17R (Thermo Scientific). Оборудование каждый год проходит государственное освидетельствование. На момент проведения исследований имелся сертификат об аттестации (исследование проведено в сентябре, дата аттестации 08.2015).

Программное обеспечение:

• Управление ВЭЖХ системой и масспектрометрическим детектором -Xcalibur 2.2 Sp1, Thermo Scientific (США);

• Статистическая обработка результатов - STATISTICA 10, StatSoft (США);

• Расчёт параметров фармакокинетики - Excel 2014, Microsoft (США);

• Расчет площадей AUC и обработка графиков в Origin Pro 8.1, Origin Lab, (США);

2.1.4.Лабораторные животные

Вид животных крысы линии \Vistar; кролики беспородные собаки беспородные

Пол Самцы

Источник получения: НИУ «БелГУ», г. Белгород

Вес животных к началу исследования 330-380 г (крысы) 2800-3200 г (кролики) 18000-22000 г (собаки)

Количество 18 (крыс) 12(кроликов) 12 (собак)

Все животные перед началом эксперимента проходили адаптацию с периодом не менее 7 дней. За это время визуально осматривали внешний вид и состояние. Животных, имеющих нарушения в рандомизацию, не включали. Дополнительно проводили отбор по массе с учетом максимального разброса ± 20 % от номинальной.

Уход и содержание соответствовали установленным нормативам [115,116117].

Рандомизационный номер маркировали у каждой особи на хвосте животного (для крыс), спине (для собак), ухе (для кроликов). Клетки маркировались этикетками с информацией об исследовании. При завершении эксперимента животным проводили СО2-эвтаназию.

Животных кормили в соответствии с установленными правилами [116116]. До эксперимента и после животным предоставляли свободный доступ к воде и корму (корм по ГОСТ 50258-92, Р51849-2001, вода - фильтрованная водопроводная с регулярным контролем на микробиологическую контаминацию).

2.1.5. Методы исследования

Для определения концентрации С7070 был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масспектрометрическим детектированием (МС/МС).

Метод ВЭЖХ широко используется в изучении фармакокинетики и позволяет достигать требуемой специфичности определения. Сущность метода заключается в подборе селективных процессов сорбции/десорбции между подвижной и неподвижной фазами. Принцип основан на пропускании растворённого аналита через объёмно-пористые сорбенты, протекающие физико-химические реакции позволяют удерживать его на поверхности и тем самым выделить из раствора. Применение метода ВЭЖХ, как правило, сопряжено с использованием детектирующего устройства, которое призвано качественно или количественно проводить определения. В настоящее время существует огромное количество детекторов, предназначенных для сопряжения с ВЭЖХ, но золотым стандартом в фармакокинетике является масспектрометрические. Это обусловлено сложностью биоматрицы, в которой нужно проводить определение [118, 119, 120].

В основе принципа масс-спектрометрического детектирования лежат физико-химические процессы, при которых происходит ионизация веществ и их последующая регистрация. Результатом детектирования является масс-спектр, который указывает на молекулярную массу аналита. В настоящее время масспектрометрические детекторы получили стремительный вектор развития, появились полностью автоматизированные приборы, с обширными базами библиотек (более 40 000 соединений), таким образом качественное определение не составляет большого труда. Для решения более сложных задач разработан МС/МС подход, который представляет собой последовательно определение иона родителя и его осколков [121, 122].

2.2. Дизайн исследования

Работа по изучению фармакокинетики была спланирована на основании рекомендации нормативных документов [85] и включала следующие этапы:

1. Разработка биоаналитической методики;

2. Валидация биоаналитической методики;

3. Оценка основных фармакокинетических параметров у кроликов;

4. Оценка основных фармакокинетических параметров у крыс;

5. Исследование накопления, органного распределения и экскреции препарата у крыс;

6. Оценка основных фармакокинетических параметров у собак;

Этап 1. Разработка биоаналитической методики начата с выполнения аналитического скрининга. На основе предварительных экспериментальных исследований выбран внутренней стандарт. Определены молекулярные ионы и основные ионы-осколки исследуемого соединения и внутреннего стандарта. Проведена полная оптимизация условий хроматографирования, где обоснованы хроматографическая колонка, объём ввода, скорость потока, температура колонки и растворитель пробы. Оптимизация параметров работы МС/МС детектора проведена в направлении достижения максимальной чувствительности и минимизации матричных эффектов.

Этап 2. Запланирована и выполнена валидация биоаналитической методики в соответствии с современными требованиями [144,156,157]:

Определены внутри- и меж-серийная точности и прецизионности, селективность, матричный эффект, линейность калибровочной кривой, нижний предел количественного определения, стабильность аналитов в процессе хранения и анализа образцов, степени извлечения, переносимый остаток. Все процессы перед выполнением были спланированы [123,124,125,126,127].

Этап 3. Запланировано и выполнено экспериментальное исследование основных фармакокинетических параметров фармацевтической субстанции у кроликов. Для этого 12 кроликам в ушную вену устанавливали

гепаринизированные катетеры. Перед началом эксперимента (за 12 часов) животных лишали корма, не ограничивая в питьевой воде.

Внутривенное дозирование осуществляли болюсно 6-ти кроликам раствором с концентрацией 26,7 мг/мл в пропиленгликоле в дозе 26,7 мг/кг в ушную вену. Забор крови через катетер в объеме 0,3 мл в пластиковые пробирки с 20 мкл 5% ЭДТА. Регламент отбора: до ввода (за 10 минут), через 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 1440 минут после дозирования. Per Os С7070 дозировали интрагастральным зондом в дозах 50 мг/кг, 26,7 мг/кг, 12,5 мг/кг (растворы для введения - растворы в пропиленгликоле с концентрациями 12,5 мг/мл, 26,7 мг/мл, и 50 мг/мл соответственно). Забор крови через катетер в объеме 0,3 мл в мл в пластиковые пробирки с 20 мкл 5% ЭДТА. Регламент отбора: до ввода (за 10 минут), 15, 30, 60, 120, 240, 480, 1440 минут после введения. Цельную кровь центрифугировали при 5600 g 10 мин, плазму отделяли и хранили при температуре - 70 °С до анализа.

Этап 4. Запланировано и выполнено экспериментальное исследование основных фармакокинетических параметров фармацевтической субстанции у крыс. Для этого 12 крысам в правую яремную вену устанавливали гепаринизированные катетеры. Для проведения операции применяли внутрибрюшинный наркоз: смесь 10 % золетила и 2 % ксилазина в объёмном соотношении 1:5, по 70 мкл на 100 г массы тела. После операции ежедневно проводили мониторинг состояния здоровья животных. Перед началом эксперимента (за 12 часов) животных лишали корма, не ограничивая в питьевой воде. Исследуемый препарат вводили на третий день после операции.

Внутривенное дозирование осуществляли болюсно 6-ти крысам раствором с концентрацией 50,0 мг/мл в пропиленгликоле, в дозе 50,0 мг/кг в хвостовую вену. Забор крови через катетер в объеме 0,2 мл в пластиковые пробирки с 20 мкл 5% ЭДТА. Регламент отбора: до ввода (за 10 минут), через 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 1440 минут после введения. Per Os С7070 дозировали интрагастральным зондом в дозе 50 мг/кг (раствор для введения - раствор в пропиленгликоле с концентрацией 50 мг/мл). Забор крови через катетер в объеме 0,3 мл в мл в пластиковые пробирки с 20 мкл 5 % ЭДТА. Регламент отбора: до ввода (за 10 минут), 15, 30, 60, 120, 240,

480, 1440 минут после введения. Цельную кровь центрифугировали при 5600 g 10 мин, плазму отделяли и хранили при температуре - 70 °С до анализа.

Этап 5. Запланировано и выполнено экспериментальное исследование по изучению экскреции препарата у крыс. Для этого 6 крыс самцам Per Os интрагастральным зондом однократно дозировали С7070 (50,0 мг/кг). Сбор экскретов проводили в метаболических клетках, временной регламент: 0-4, 4-8, 8-24 ч. Образцы хранили до анализа при температуре - 70 °С.

Запланировано и выполнено экспериментальное изучение накопления и органного распределения. Для этого 12 крысам самцах Per Os интрагастральным зондом однократно дозировали С7070 в двух дозах (25 мг/кг, 50 мг/кг) в течении 21 дня. На 22 день животным делали С02 эвтаназию, препарировали и собирали, плазму, жировую ткань, почки, тимус, кожу, кишечник, печень, мышцы, головной мозг, легкие, сердце, селезенку. Образцы хранили до анализа при температуре -70 °С.

Этап 6. Запланировано и выполнено экспериментальное исследование основных фармакокинетических параметров у собак. Для этого 6 собакам в бедренную вену устанавливали гепаринизированные катетеры. Перед началом эксперимента (за 12 часов) животных лишали корма, не ограничивая в питьевой воде. Исследуемый препарат вводили на третий день.

Внутривенное дозирование осуществляли болюсно 6-ти собакам раствором с концентрацией 30,0 мг/мл в пропиленгликоле в дозе 15,0 мг/кг в бедренную вену. Забор крови через катетер в объеме 0,3 мл в пластиковые пробирки с 20 мкл 5% ЭДТА. Регламент отбора: до ввода (за 10 минут), через 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 1440 минут после введения. Per Os С7070 дозировали интрагастральным зондом в дозе 15,0 мг/кг (суспензия для введения - раствор готовой лекарственной формы в воде с концентрацией С7070 30,0 мг/мл). Забор крови через катетер в объеме 0,3 мл в мл в пластиковые пробирки с 20 мкл 5% ЭДТА. Регламент отбора: до ввода (за 10 минут), 15, 30, 60, 120, 240, 480, 1440 минут после введения. Цельную кровь центрифугировали при 5600 g 10 мин, плазму отделяли и хранили при температуре - 70 °С до анализа.

2.3. Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации данных

Параметры фармакокинетики рассчитывали модельнонезависимым методом [85] и представлены следующими показателями: АиС(0-^ AUC(o-t) ev, AUMC(o-t) iv, AUMC(0.t) ev, MRT(0-t) iv, MRT(0-t) еv, Ке1 iv, Ке1 iv, Т1/2 Т1/2 еv , АиС(0-да) АиС(0-<») еv,

Стах iv, Стах еv, Ттах iv,Tmax еv, МА^ D, С1т, Vss, ^ ^ Kd, С1 renal, Cmax/AUC0-t.

Расшифровка показателей представлена в разделе «СПИСОК СОКРАШЕНИЙ».

2.4. Статистическая обработка результатов

Все результаты исследований обрабатывали методами дескриптивной статистики [128,129,130]. Для расчетов применяли пакет специализированных программ STATISTICA (версия 10, Stat Soft, США), MS Excel (версия 2010 Microsoft, США).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка биоаналитической методики

Для проведения качественных исследований была разработана биоаналитическая методика определения С7070 в биообъектах (плазма крови крыс, собак, кроликов; моча, кал, экстракты из органов и тканей крыс). Широкий спектр исследуемых матриц определял дополнительные требования к проведению работ. В частности, было очень важным анализировать образцы с разными матрицами в один аналитический цикл. Это позволит существенно ускорить работу (не меняя условий анализа прогонять образцы без потери заданных характеристик), нивелировать погрешности (у одной методики суммарная погрешность меньше чем у двух), тем самым возникает возможность более точной межвидовой корреляции. На момент проведения научного поиска, в рамках разработки методики, было сформировано техническое задание, в котором определены требования, способы достижения, этапы разработки и сроки выполнения. Техническое задание составлено исходя из современных требований к биоаналитическим методикам, достижениям в аналитической химии, особенностями выполняемой работы [124,125,126,127] и представлено в таблице 3.1.

На первом этапе работ был проведен сбор информации по анализируемому веществу. Источником информации выступал проект фармакопейной статьи предприятия производителя.

Химическое название 3-(1//-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновая кислота

Структурная формула соон N и

Эмпирическая формула С16 НМ02

Молекулярная масса 212,35

Форма выпуска Активная фармацевтическая субстанция для производства

нестерильных лекарственных средств

Категория и номер действующего нормативного документа Проект НД, заявитель ЗАО «ВладМиВа», г. Белгород, в соответствии с требованиями ГФ XIII,

Фармакологические свойства Фармакологическая группа: Пероральные противодиабетические

лекарственные средства

Описание Порошок почти белого или белого цвета

Растворимости ъ Растворим в 96% спирте и диметилкетоне, мало растворим в хлороформе, практически не растворим в воде

Подлинность УФ-спектр вещества должен иметь три максимума при длинах волн 247 нм, 276 нм и 282 нм

Температура плавления От 252°С до 258°С с разложением

Чистота Сумма примесей не превышает 0,5 %

Сульфатная зола Менее 0,1 %

Тяжелые металлы Менее 0,001 %.

Потеря в массе при Менее 1,0 %.

высушивании

Остаточные Толуола менее 0,089%

органические Этанола менее 0,5%

растворители

Количественное содержание Не менее 98,0 % и не более 102,0 %

Хранение В герметичных светонепрозрачных контейнерах, в сухом

помещении при температуре не выше 25 25 °С

Срок годности Два года

На этапе аналитического скрининга был применён отработанный и хорошо зарекомендовавший себя подход получения первичной информации. Подход разработан автором на базе лабораторий ОАО «Фармстандарт-Лексредства», г. Курск. Основной идеей было применение универсального модификатора ионной силы подвижной фазы, который позволяет получать удовлетворительные характеристики пиков практически для всех веществ с выраженными кислотно-основными свойствами в реверсивном режиме хроматографирования.

Таким образом, используя типовую неподвижную фазу (например, RP C18), остается подобрать органическую составляющую и её концентрацию. В качестве органической составляющей выбран ацетонитрил, что обеспечило стабильную ионизацию при детектировании методом электрораспыления (ESI). Подбор концентрации ацетонитрила проводился градиентным элюированием. Полученные результаты позволили рассчитать необходимую, учитывая заданные характеристики.

Таблица 3.1 - Техническое задание на разработку биоаналитической методики определения С7070 в биообъектах.

Наименование этапа Способ достижения Требования Срок выполнения Примечание

Предварительный поиск информации - Максимально охватить суть вопроса 07.2015 Работа с литературными данными

Аналитический скрининг Поиск условий хроматографирования и детектирования Получение первоначальных результатов. 08.2015 Практическая исследовательская работа

Оптимизация хроматографических условий Последовательное изменение параметров, аналитический расчет показателей, выбор оптимальных Хроматографические пики с фактором асимметрии не более 2,2, коэффициентом удерживания не менее 1, 1 08.2015 Практическая исследовательская работа

Разработка пробоподготовки Выбор способа коагуляции белков, подбор экстрагента Обеспечение максимальной устойчивости растворов, стабильности степени извлечения, высокой чувствительности и минимизация матричных факторов 08.2015 Практическая исследовательская работа

Изучение линейности диапазона определения Исследование растворов С7070 с минимальной и максимальной концентрацией Выбрать аналитические концентрации с коэффициентом корреляции более 0,98 09.2015 Практическая исследовательская работа

Формирование проекта биоаналитической методики Формирование документа В соответствии с современными требованиями 09.2015 Документооборот

Следующий этап аналитического скрининга включал подбор условий детектирования. Ввиду того, что используется детекция МС/МС необходимо было определить молекулярные ионы, а также ионы продукты (осколки). В качестве базисных и начальных настроек детектора использовали рекомендуемые заводом изготовителем. В результате был получен приемлемый массовый спектр молекулярного иона [М+]+ (рисунок 3.1). В соответствии с поставленными задачами необходимо количественно оценить содержание С7070, а как известно, работа с молекулярными ионами дает более узкий аналитический диапазон и более низкую специфичность в сравнении с работой по осколкам. На основании этого проводилась работа по получению устойчивых осколков. Для этого в автоматическом режиме подбирали энергию соударений (CE), газ соударений гелий. При значении СЕ 42 были получены положительные результаты. Масс спектр и схема разложения осколка с m/z 255,16 представлена на рисунке 3.2.

На завершающем этапе аналитического скрининга проведена работа по выбору внутреннего стандарта. От использования Н - или С - меченного стандарта было принято решение отказаться в виду ограниченности самой субстанции С7070 и существенного удорожания исследований, но имелось четкое понимание целей и назначения. Использование меченного внутреннего стандарта позволяет существенно сократить время на разработку методики путём минимизации издержек на научный поиск. В условиях крупных коммерческих лабораторий это имеет место быть, а в представленной работе цели, преследуемые использованием внутреннего стандарта были решены за счет глубокой проработки вопроса.

Рисунок 3.1 - Масс- спектр молекулярного иона [М+]+ С7070

N ™Н0

+Н

-Н20

m/z 273.16

255.15

Рисунок 3.2 - Масс-спектр финального осколка и схема разложения С7070.

Минимизация влияния матрицы на ионизацию (как основное назначение меченного внутреннего стандарта) решалось за счет полного хроматографического разделения компонентов матрицы (белков, фосфолипидов, липидов и тд.) [130]. Хроматографический цикл построен таким образом, что все балластные вещества элюируются в диапазонах до и после выхода пика С7070. Второй и важной задачей внутреннего стандарта является нормализация процессов экстракции целевого соединения. Ввиду сложности состава матрицы, из которых необходимо экстрагировать С7070, внутренний стандарт должен обладать схожими физико -химическими свойствами. Поиск подходящих кандидатов позволил выделить фабомотизола дигидрохлорид (рисунок 3.3).

Рисунок 3.3 - Формула внутреннего стандарта.

Фабомотизола дигидрохлорид имеет с С7070 общее бензимидазолиновое ядро, которое в большей степени обуславливает основные свойства определяемых соединений. Дополнительные хроматографические исследования, проведенные на базе разработанных ранее условий хроматографирования, выявили близость времён удерживания, что указывает на схожее сродство к неподвижной фазе. Как известно, хроматографические процессы основаны на актах сорбции-десорбции веществ на поверхности раздела подвижной и неподвижной фазы, а время удерживания указывает на количество таких актов. Таким образом, имея близкое время удерживание для двух веществ следует ожидать близкие физико-химические характеристики (обуславливающие процессы сорбции). Из этого следует, что фабомотизола дигидрохлорид позволит контролировать процессы экстракции С7070 из исследуемых матриц.

Выбранные хроматографические условия были оптимизированы. Этап проводили в следующих направлениях:

- оптимизация параметров детектирования;

- оптимизация условий работы хроматографа.

Оптимизация параметров детектирования включала в себя подбор режимов работы МС/МС детектора для получения максимальной чувствительности, устойчивой ионизации и стабильности аналитического сигнала. Процесс оптимизации с итоговыми результатами представлен в таблице 3.2.

Таблица 3.2 - Оптимизация условий детектирования.

Параметр Исследуемы диапазон Результат

Напряжение ионизации, kV +1-+5 3

Температура источника, 0С 260 - 380 300

Скорость потока Sheath газа, abr 5 -100 60

Скорость потока Aux газа, abr 5 -100 20

Скорость потока Sweep газа, abr 0 -10 0

Температура капилляра 260 - 380 350

Энергия коллизии:

С7070 (для m/z 255,15) 0-90 42

внутренний стандарт (для m/z 114,03) 0-90 19

В результате проведения исследовательских работ были оптимизированы основные хроматографические параметры. Цель проведения работ - получение удовлетворительных характеристик пиков, оптимальной чувствительности, устойчивых характеристик давления (дельта изменения не должна превышать 5 бар) и параметров детекции (начало и окончание пика). Полученные результаты представлены в таблице 3.3.

Таблица 3.3 - Оптимизация условий хроматографирования.

Параметр Исследуемы диапазон Результат

Скорость потока, мл/мин +0,2-+0,8 0,4

Температура колонки, 0С 20 - 45 40

Объём ввода, мкл 0,1 -10,0 2,0

Температура образцов (в автосамплере), 0С 0 - 25 5

Режим элюирования Оптимизация не проводилась Градиентный

Оптимизированные условия позволили достоверно определять С7070 в аналитическом диапазоне от 0,020 до 3876,000 мкг в 1 мл плазмы крови. Итоговые хроматографические пики представлены на рисунке 3.4.

Примечания: 1 - С7070 на нижнем уровне предела количественного определения, 2 - С7070 на верхнем уровне предела количественного определения

3 - внутренний стандарт

Рисунок 3.4 - Итоговые хроматографические пики

3

На этапе разработки способов пробоподготовки были поставлены три основных задачи:

- обеспечение стабильности степеней извлечения С7070 и внутреннего стандарта из матриц;

- обеспечение максимальной стабильности испытуемых растворов;

- обеспечение удовлетворительной метрологических характеристик.

Имея опыт в разработке биоаналитических методик было четкое понимание необходимых ресурсов и методов для достижения поставленных задач. Так, с учётом физико-химических свойств определяемых веществ предложено

использовать простой, но эффективный способ пробоподготовки - коагуляция белков с помощью органических растворителей и последующей экстракцией целевых соединений в органическую фракцию. Способ экспрессный, обеспечивает выполнение двух других поставленных задач, но имеет один весомый минус -происходит экстракция балластных фосфолипидов. Фосфолипиды - основной источник матричных эффектов для ESI ионизации в масспектрометрии. Кроме того, используя простую коагуляцию белков с помощью органических растворителей возникает возможность сорбции целевых соединений на коагулированные белки.

Таким образом, на предварительных этапах работ была сформирована рабочая методика пробоподготовки. Она включала, взятие 0,2 мл жидкой биологической матрицы, прибавление раствора внутреннего стандарта, коагуляцию балластных белков, экстракцию целевых соединений, отделение экстракта. Правильность сделанного выбора подтверждена на последующих этапах работы.

Известно, что масспектрометрические детекторы обладают линейностью в узком диапазоне определений. Существуют множество причин возникновения таких явлений, из которых можно выделить две основные:

- аппаратные, обусловленные физико-химическими процессами, лежащими в основе измерений и приборным исполнением. На эти параметры, в рамках данной работы, оказать влияние не представляется возможным. Исходя из технических характеристик используемого детектора (Velos Pro - ESI источник и линейная ионная ловушка) достижима линейность с коэффициентом корреляции не менее 0,98 в интервале от нг до мг, при условии отсутствия других мешающих факторов. Используемая хроматографическая система представлена на рисунке 3.5;

- совокупность причин, связанная с физико-химическими процессами, лежащими в основе подготовки детектируемого образца. Сюда можно отнести основные - матричные эффекты при ионизации, и степень извлечения образца из биологической матрицы. Матричные эффекты были нивелированы хроматографическим отделением образца, стабильность степени извлечения -применением специфического экстрагента в сочетании с ультразвуком.

Примечание: хроматограф Thermo Ultimate 3000 совмещен с тандемный масспектрометрическим детектор Velos Pro Рисунок 3.5 - Используемая хроматографическая система

В качестве подтверждения правильности выбора условий была построена калибровочная крива по фактическим данным в интервале концентраций от 0,020 мкг до 3876,0 мкг/мл в одном плазмы. Результаты представлены на рисунке 3.6, расчёт критериев приемлемости в таблице 3.4 (по требованиям к биоаналитическим методикам).

Рисунок 3.6 - Калибровочная кривая отношения концентрации С7070 от площади, нормализованной на внутренний стандарт в интервале 0,020 мкг до 3876,0 мкг в одном мл плазмы.

Таблица 3.4 - Расчёт применимости калибровочной кривой С7070.

Марки ровка Концент рация введенная, мкг/мл Площадь пика С7070 Площадь пика И Отноше ние площадей Отношение концентраций Концент рация найденная, мкг/мл Ошиб ка, % Критерий приемлемости не более,%

к 1 0,020 1446 3516895 0,00041 0,00021 0,020 -2,38 20

к 2 0,194 14281 3326897 0,00429 0,00196 0,207 6,88 15

к 3 1,938 142516 3254578 0,04379 0,01958 2,111 8,95 15

к 4 19,380 1450689 3654874 0,39692 0,19576 19,137 -1,26 15

к 5 193,800 14590568 3654856 3,99210 1,95758 192,470 -0,69 15

к 6 1938,000 14590681 3624871 40,25159 19,57576 1940,638 0,14 15

к 7 3876,000 27241896 3389654 80,36778 39,15152 3874,748 -0,03 15

Вывод: полученная калиброванная кривая применима для расчетов

Выполнение всех разделов технического задания позволило сформировать биоаналитическую методику, которая представлен ниже.

3.1.1. Биоаналитическая методика определения С7070 в биологических матрицах (плазме крови крыс, кроликов собак, гомогенатов органов, моче и кале крыс)

Термины, определения и сокращения

Методика (метод) измерений: совокупность конкретно описанных операций, выполнение которых обеспечивает получение результатов измерений с установленными показателями, точности.

Показатель точности измерений: установленная характеристика точности любого результата измерений, полученного при соблюдении требований и правил данных методик измерений.

В качестве показателя точности методик измерений могут быть использованы характеристики погрешности измерений в соответствии с [131], показатели неопределенности измерений в соответствии с [132] и [133], показатели точности по ГОСТ Р ИСО 5725-1[134].

Назначение и область применения

Настоящий методика устанавливает способ измерения количественного содержания С7070 в биологических матрицах (плазме крови крыс, кроликов собак, гомогенатов органов, моче и кале крыс).

Диапазон измерения методики составляет 0,020 мкг до 3876,0 мкг в одном мл плазмы (или в эквивалентном объёме гомогената органа с пересчётом на массу). Границы относительной погрешности измерений в данном диапазоне составляют ±20,0 % при р = 0,95 для нижнего предела количественного определения и ±15,0 % при р = 0,95 для всех остальных растворов.

Область использования. Данная методика измерения может быть использована в лабораториях, оснащенных аналогичным аналитическим оборудованием или выше по классу точности. Объект исследования

Объектом исследования является биологические матрицы (плазма крови крыс, кроликов собак, гомогенат органов, моча и кал крыс).

Информация о анализируемом веществе. Химическое название - 3-(1Н-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентанкарбоновая кислота. Эмпирическая формула - С16Н2<№02. Кристаллический порошок белого или почти белого цвета. Молекулярная масса - 272,35.

Требования к средствам измерений, вспомогательным устройствам, материалам, реактивам

При выполнении измерений применяют следующее средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, стандартные образцы и реактивы.

А. Средства измерения: -жидкостной хроматограф с автоматической системой ввода, совмещенный с тандемным масспектрометрическим детектором, специализированным программным обеспечением;

^ весы аналитические не ниже I (Специальный) класса точности, согласно ГОСТ 53228-08 [135]; ^ колбы мерные 5, 10, 25, 50, 100 мл и 1000 мл не хуже 2 класса точности ГОСТ 1770-74 [136]; ^ пипетки мерные не хуже 2 класса точности ГОСТ 1770-74 [136];

^ цилиндры мерные не хуже 10 мл, 50 мл, 100 мл и 1000 мл 2 класса точности ГОСТ 1770-74[136];

^ центрифуга с вращением ротора не ниже 15 000 об /мин. Б. Вспомогательные устройства:

S стальная хроматографическая колонка Zorbax Eclipse XDB-C18 3,5 мкм, 150 х 3,0 мм или аналогичная, обеспечивающая выполнение требований «Пригодность хроматографической системы»;

S баня ультразвуковая с мощностью генератора 3,0 Вт. В. Реактивы:

S ацетонитрил, gradient grade; S вода деионизированная (сопротивление 18 МОм/см); S аммония ацетат (реагент для масспектрометрии); S кислота муравьиная (реагент для масспектрометрии);

S фабомотизола дигидрохлорид - внутренний стандарт с степенью чистоты не менее 99 %; S первичный стандартный образец С7070 (предоставленный фирмой производителем). Примечания:

1. Все используемы средства измерения должны быть занесены в Государственный реестр средств измерений и иметь свидетельство о поверки.

2. Реактивы и материалы должны быть пригодны и валидны.

3.Разрешено использование аналогичных средств измерений, реактивов и материалов, посуды, вспомогательных устройств с техническими и метрологическими характеристиками не хуже, чем у приведенных и выполнением требований теста «Проверка пригодности хроматографической системы».

Метод измерений

Измерения выполняют методом ВЭЖХ с МС/МС детектированием. Разделение осуществляют на хроматографической колонке жидкостного хроматографа с прямым детектированием. Идентификация проводится по времени хроматографического удерживания и выбранным ионам продуктам. Расчет количественного содержания проводится по площади пика, нормализованного внутренним стандартам с использованием внешней калибровки. Требования безопасности

При проведении измерений соблюдают требования безопасности, оговоренные следующими документами:

^ правилами, указанными в Государственных стандартах ГОСТ 12.2.003[137], ГОСТ12.2.007-0 [138] , ГОСТ 22782.7 [139]; ^ правилами, указанными в ПНД Ф 12.13.1-03 [140] .

^ руководством по эксплуатации для жидкостной хроматографической системы.

Требования к квалификации операторов

Для измерения и обработки результатов допускают операторов с квалификацией химик, химик-аналитик, прошедших лабораторное обучение, проверку знаний и имеющих опыт работы на жидкостных хроматографах и с химическими реактивами. К работе допускаются лица, достигшие 18 лет и прошедшие медицинский осмотр в соответствии с действующими приказами Минздравсоцразвития РФ № 302н от 12.04.2011.

Требования к условиям измерения

При проведении измерения по ГОСТ 12997 [141] соблюдают следующее: ^ температура микроклимата, °С 20±5; ^ относительная влажность микроклимата, % от 30 до 80; ^ атмосферное давление, кПа от 84 до 106,7; ^ напряжение сети, 220В (+15; -10); ^ частота сети, Гц 50±1.

Подготовка к выполнению измерений

Перед началом анализа проводят следующие работы: готовят элюенты для подвижной фазы, жидкостной хроматограф, стандартные растворы k и QC, холостые матрицы для каждого животного (плазма, моча, кал, гомогенаты органов) и тест-растворы.

Приготовление элюентов подвижной фазы. В качестве элюента Б используют ацетонитрил (МеСМ). В качестве элюента Б - метанол (МеОН).

Элюент А. Взвешивают 3,85 г аммония ацетата, переносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 500 мл воды для хроматографии, растворяют, к раствору прибавляют 1,0 мл муравьиной кислоты перемешивают, доводят объем в колбе до метки водой для хроматографии, тщательно перемешивают и фильтруют через

гидрофильный мембранный фильтр 0,45 мкм (5 мМ аммония ацетат + 0,1 % муравьиная кислота). Срок годности раствора 14 суток.

Температура термостата проб (автосемплера): 5 ° С

Температура термостата колонки: 40 ° С

Объем вводимой пробы 2 мкл

Время удерживания С 7070 около 4,7 мин

Время удерживания внутреннего стандарта около 8,5 минут

Подготовка жидкостного хроматографа. Все работы осуществляются в соответствии с стандартными процедурами. Включают жидкостной хроматограф и выдерживают 30 минут для стабилизации параметров работы. Подключают хроматографическую колонку. Устанавливают температуру термостата колонок 40 оС, термостата образцов - 5 оС. Задают следующие режимы масспектрометрическому детектору:

тип ионизации электроспрей в «+» моде

переход масс С 7070: 272,35—255,15; Внутренний стандарт: 307,41—>114.

температура спреера 300 °С

напряжение спреера 3000 V

Программируют насосную систему по следующей программе:

Время, мин Скорость потока, мл/мин Элюент А, % об./об. Элюент Б, % об./об. Элюент В, % об./об.

0 0,4 80 0 20

5,0 0,4 80 0 20

8,5 0,4 65 10 10

9,0 0,4 20 10 70

11,0 0,4 20 10 70

11,1 0,4 80 0 20

12,5 0,4 80 0 20

Устанавливают 2,0 мкл автоматической системе ввода образца.

Приготовление стандартных растворов для калибровки прибора (к) и контроля качества ^^.

Исходный раствор 1. Около 20,0 мг (точная навеска) С7070 помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 7 мл метанола, встряхивают до растворения, доводят объём в колбе до метки этим же растворителем и перемешивают.

Исходный раствор 2. 0,1 мл исходного раствора 1 помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 7 мл метанола, объём в колбе доводят до метки этим же растворителем и перемешивают.

Исходный раствор 3. 0,1 мл исходного раствора 2 помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 7 мл метанола, объём в колбе доводят до метки этим же растворителем и перемешивают.

Приготовления стандартных растворов представлено в таблице 3.5. Растворы QC до анализа хранили при - 70°С.

Таблица 3.5 - Приготовление стандартных растворов k и QC.

Маркировка раствора V исходного раствора 1, мкл V исходного раствора 2, мкл V исходного раствора 3, мкл Концентрация в плазме, нг/мл Концентрация, нг/мл

к 1 - - 10 20,0 2,00

к 2 - - 100 200,0 20,0

к 3 - 10 - 2000,0 200,0

к 4 - 100 - 20000,0 2000,0

к 5 10 - - 200000,0 20000,0

к 6 100 - - 2000000,0 200000,0

к 7 200 - - 4000000,0 400000,0

QC (нижний) - - 10 20,0 2,00

QC (средний) - 100 - 20000,0 2000,0

QC (верхний) 100 - - 2000000,0 200000,0

Для приготовления стандартных растворов k и QC 100 мкл холостой матрицы помещают в пластиковые пробирки на 1,5 мл, в соответствии с таблицей 3.5 добавляют аликвоты исходных растворов, прибавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта, встряхивают, прибавляют 100 мкл ацетонитрила, встряхивают. Затем экстрагируют определяемое вещество на ультразвуковой бане в течении 3 минут для плазмы, 20 минут для гомогенатов. Затем пробы замораживают в течении 20 минут при температуре -70 °С. После размораживания

центрифугируют при 13000 об/мин, 4 °С, 25 минут. Надосадочный слой анализируют. Нулевая плазма крыс, кроликов, собак, нулевые экскреты и гомогенаты органов крыс используется в качестве холостых для проверки селективности, а также для приготовления растворов контроля качества.

Тест-растворы. Плазма. 0,1 мкл испытуемой плазмы помещают в пластиковую пробирку на 1,5 мл, добавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта, перемешивают, прибавляют 0,1 мл ацетонитрила, встряхивают. Затем экстрагируют С7070 на ультразвуковой бане в течении 3 минут. После извлечения пробы помещают в морозильную камеру при температуре -70 °С на 20 минут. Размораживают и центрифугируют при 13000 об/мин, 4 °С, 25 минут. Надосадочный слой анализируют.

Пробоподготовка органов. Препарируют животное. Выделяют анализируемый орган или фрагмент ткани. Излишки жидкости удаляют при помощи безворсовой абсорбирующей ткани. Взвешивают, помещают в термобокс, добавляют эквивалентное массе количество воды, замораживают при - 70°С, и в твёрдом агрегатном состоянии гомогенизируют. Извлечение С7070 в жидкую фазу гомогената проводят ультразвуковой обработкой в течении 20 минут (финальный гомогенат).

0,100 мл финального гомогената помещают в пластиковую пробирку на 1,5 мл, добавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта, перемешивают, прибавляют 100 мкл ацетонитрила, перемешивают. Экстрагируют С7070 на ультразвуковой бане в течении 20 минут. Затем пробы замораживают в течении 20 минут при температуре -70 °С. После размораживания пробы центрифугируют при 13000 об/мин, 4 °С, 25 минут. Супернатант аккуратно декантируют в виалы для хроматографирования и анализируют.

Пробоподготовка кала и мочи крыс. Кал за отчетный период взвешивают, усредняют, отделяют точную навеску, добавляют эквивалентное массе количество воды, замораживают при -70°С, и в твёрдом агрегатном состоянии гомогенизируют. Извлечение С7070 в жидкую фазу гомогената проводят

ультразвуковой обработкой в течении 20 минут (финальный гомогенат). Моча за отчетный период взвешивается и обработке не подвергается.

0,100 мл (финального гомогената) или нативной мочи помещают в пластиковую пробирку на 1,5 мл, прибавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта, встряхивают, прибавляют 100 мкл ацетонитрила, встряхивают. Затем экстрагируют С7070 на ультразвуковой бане в течении 20 минут. После извлечения пробы помещают в морозильную камеру при температуре -70 °С на 20 минут. Размораживают и центрифугируют при 13000 об/мин, 4 °С, 25 минут. Надосадочный слой анализируют.

Порядок выполнения измерений

Генерируют аналитический цикл, состоящий из нулевых биологических матриц, растворителей, растворов к, QC, и тест растворов. Хроматографируют по 2 мкл, регистрируют хроматограммы.

Обработка измерений

В специализированной программе рассчитывают площади определяемых пиков. Нормализуют по внутреннему стандарту, вычисляют уравнение калибровочной кривой, оценивают отклонения. Результат отображают графически. Концентрации С7070 в исследуемых объектах рассчитывают по уравнению калибровочной кривой.

Оценку выбросов (аномально выделяющиеся результатов) выявляют с помощью статистического критерия Граббса [142]. Для N=6 критическое значение Ъ равно 1,89, результаты с Ъ>1,89 считаются выбросами и должны быть исключены из расчётов [143].

Оформление результатов анализа

Оформление результатов анализа по биоаналитической методике определения С7070 в биологических матрицах (плазме крови крыс, кроликов собак, гомогенатов органов, моче и кале крыс) осуществляют в виде отчёта по согласованию с заинтересованными лицами и выдаётся с подписью ответственных за проведение эксперимента.

3.2. Валидация биоаналитической методики

Цель работы: на основании лабораторных исследований подтвердить надежность методики (биоаналитическая методика представлена в пункте 3.1.1) определения концентрации С7070 в биологических матрицах (плазме крови крыс, кроликов собак, гомогенатов органов, моче и кале крыс) для получения достоверного результата.

При проведении исследований руководствовались соответствующей нормативной документацией [144,156,157].

Условия пробоподготовки, проведения измерений. При отборе проб и приготовлении растворов все растворы имели температуру (18-200С) в соответствии с ГФ XIII изд. Условия измерений при определении каждого параметра были постоянными.

Матрица. В качестве холостой матрицы использовали плазму крови крыс, кроликов, собак, гомогенаты органов, мочу и кал крыс от 6 индивидуальных источников. Матрица была получена от исследуемых животных до начала эксперимента в период адаптации, гомогенаты органов от интактных животных с последующим хранением при температуре -70 °С.

Исходные данные для планирования валидационных экспериментов. В соответствии с указанной выше нормативной документацией биоаналитическая методика должна выдерживать испытания, представленные в таблице 3.6. Краткое описание процедур, количество проб и анализов для проведения метрологической оценки представлены в таблице 3.6.

Таблица 3.6 - Схема проведения валидации методики.

Валидационная характеристика Выполнение определения Количество проб (для каждой матрицы)

Селективность Анализ холостых матриц 6

Эффект переноса (carry-over) Анализ раствора с максимальной концентрацией и холостых матриц 6

Валидационная характеристика Выполнение определения Количество проб (для каждой матрицы)

Нижний предел количественного определения (lower limit of quantification) Математический расчёт -

Оценка линейности, коэффициент вариации. Интервал методики Анализ калибровочных растворов 7 уровней по 2 повторности 14

Точность, прецизионность, внутри цикла Анализ образцов контроля качества 4 уровня по 5 повторностей 20

Точность, прецизионность, между циклами (цикл 1 день 1) Анализ образцов контроля качества 4 уровня по 5 повторностей 20

Точность, прецизионность, между циклами (цикл 2 день 2) Анализ образцов контроля качества 4 уровня по 5 повторностей 20

Точность, прецизионность, между циклами (цикл 3 день 3) Анализ образцов контроля качества 4 уровня по 5 повторностей 20

Точность, прецизионность, между циклами (цикл 4 день 4) Анализ образцов контроля качества 4 уровня по 5 повторностей 20

Эффект матрицы Анализ образцов контроля качества 2 уровня в 6 различных матрицах 12

Стабильность образцов при хроматографировании (в автоматическом дозаторе) Анализ образцов контроля качества 2 уровня по 2 повторности 4

Стабильность образцов при размораживании Анализ образцов контроля качества 2 уровня по 2 повторности 3 цикла разморозки заморозки 12

Стабильность образцов при долгосрочном хранении Анализ образцов контроля качества 2 уровня по 2 повторности 4 контрольных точки 16

Краткосрочная стабильность Анализ образцов контроля качества 2 уровня по 2 повторности 12

Определение селективности. Проводили по установленной программе (таблица 3.6).

Критерии приемлемости: отсутствие интерференции (посторонних пиков) на пики C7070 и внутреннего стандарта. Допускается наличие незначительной интерференции - не более чем 5 % от нижнего предела количественного определения (НПКО) или (и) не более 5 % от площади внутреннего стандарта.

Хроматограммы, полученные в результате проведенной работы представлены ниже в таблице 3.7. Полученные результаты показали удовлетворительную селективность разработанной методики.

Таблица 3.7 - Хроматограммы подтверждения селективности.

Наименование матрицы

Диапазон сканирования С7070

Диапазон сканирования внутреннего стандарта

1

2

3

Нулевая плазма кролика

Нулевая плазма крысы

Нулевая плазма собаки

Нулевой гомогенат сердца крысы

Нулевой гомогенат почки крысы

Нулевой гомогенат селезёнки крысы

Наименование матрицы

Диапазон сканирования С7070

1

2

3

Нулевой гомогенат мозга крысы

Нулевой гомогенат лёгкого крысы

Нулевой гомогенат печени крысы

Нулевой гомогенат мышц крысы

Нулевой гомогенат кожной ткани крысы

Нулевой гомогенат поджелудоч ной железы крысы

Наименование матрицы

Диапазон сканирования С7070

1

2

3

Нулевой гомогенат тимуса крысы

Нулевой гомогенат

малого кишечника крысы

Нулевой гомогенат жировой ткани крысы

Нулевая моча крысы

Нулевой кал крыс

Определение эффекта переноса (carry-over). Проводили по установленной программе (таблица 3.8). Критерии приемлемости: отсутствие определяемых пиков на хроматограммах холостой матрицы после ввода раствора с максимальной концентрацией. Допускается наличие незначительного переноса - не более чем 5 % от нижней концентрации определяемых веществ или (и) не более 5 % от содержания внутреннего стандарта.

Таблица 3.8 - Схема изучения эффекта переноса.

Наименование раствора Количество инжекций

Бланк 1

Калибровочный стандарт К7 (максимальная концентрация, первая серия эксперимента) 1

Холостая матрица 1

Калибровочный стандарт К7 (максимальная концентрация, вторая серия эксперимента) 1

Холостая матрица 1

Калибровочный стандарт К7 (максимальная концентрация, третья серия эксперимента) 1

Холостая матрица 1

Так как эффект переноса характеризует аппаратную контаминацию (сорбция определяемых веществ на узлах прибора: капилляры, краны, сорбент

колонки......), соответственно от состава матрицы данный фактор не зависит.

Следовательно, нет смысла испытывать каждую из матриц на предмет эффекта переноса, а целесообразно провести на одной единице (наиболее часто встречающейся). Исследование было выполнено на плазме крови крыс, хроматограммы представлены в таблице 3.9. Полученные результаты показали отсутствие эффекта переноса.

Таблица 3.9 - Хроматограммы исследования эффекта переноса.

Наименование раствора

Диапазон сканирования С7070

Диапазон сканирования внутреннего стандарта

1

2

3

Бланк

Калибровочный стандарт К7 (максимальная концентрация, первая серия эксперимента)

Наименование раствора

Диапазон сканирования С7070

Диапазон сканирования

внутреннего стандарта

1

2

3

Нулевая плазма крыс

Калибровочный стандарт K7 (максимальная концентрация, вторая серия эксперимента)

Нулевая плазма крыс

Калибровочный стандарт K7 (максимальная концентрация, третья серия эксперимента)

Нулевая плазма крыс

Определение НПКО (lower limit of quantification). По хроматограммам, полученным при проведении исследований эффекта переноса, рассчитывали концентрацию С7070 при, которой соотношение сигнал/шум составляет 10/1. Данные использовали для приготовления модельных растворов с концентрацией НПКО.

Критерии приемлемости: Соотношение сигнал/шум для минимальной концентрации - не менее 10/1. При этом минимальная концентрация не должна

превышать 20 % от максимальной ожидаемой концентрации в биологическом объекте. Фактические результаты представлены в таблице 3.10.

Таблица 3.10 - Хроматограммы расчета НПКО.

Наименование раствора

Диапазон сканирования С7070

Фактическая концентрация, мкг/мл плазмы

Соотношение Сигнал/шум

Раствор с концентрацией НПКО

0,020

11

Точность, прецизионность.

Точность, прецизионность при построении калибровочной кривой. В соответствии с биоаналитической методикой готовили и анализировали растворы к. Для расчётов использовали данные, полученные в четырёх независимых аналитических цикла в четыре разные дня. Оценку точности проводили по результатам обратного пересчёта найденного количества от введенного по фактическому уравнению. Прецизионность оценивали по отклонению данных полученных в разные дни.

Критерии приемлемости: ошибка не должна превышать для минимальной концентрации (к1) 20 %, для всех остальных уровней не более 15 %. Графическое отображение результатов представлено на рисунке 3.7, математическое - в таблицах 3.11-3.16.

Таблица 3.11 - Итоговый расчет применимости калибровочной кривой С7070 (крысы).

Марки ровка Концент рация введенная, мкг/мл Площадь пика С7070 Площадь пика К Отноше ние площадей Отношение концентраций Концент рация найденная, мкг/мл Ошиб ка, % Критерий приемлемости не более,%

к 1 0,020 1446 3516895 0,00041 0,00021 0,020 -2,38 20

к 2 0,194 14281 3326897 0,00429 0,00196 0,207 6,88 15

к 3 1,938 142516 3254578 0,04379 0,01958 2,111 8,95 15

к 4 19,380 1450689 3654874 0,39692 0,19576 19,137 -1,26 15

к 5 193,800 14590568 3654856 3,99210 1,95758 192,470 -0,69 15

к 6 1938,000 14590681 3624871 40,25159 19,57576 1940,638 0,14 15

к 7 3876,000 27241896 3389654 80,36778 39,15152 3874,748 -0,03 15

Вывод: полученная калиброванная кривая применима для расчетов

Примечания: 1- крысы, 2 - кролики, 3 - собаки Рисунок 3.7 - Калибровочная кривая отношения концентрации С7070 от площади, нормализованной на внутренний стандарт в интервале 0,020 мкг до 3876,0 мкг в

одном мл плазмы.

1

2

3

Таблица 3.12 - Итоговый расчет применимости калибровочной кривой С7070 (кролики).

Марки ровка Концент рация введенная, мкг/мл Площадь пика С7070 Площадь пика И Отноше ние площадей Отношение концентраций Концент рация найденная, мкг/мл Ошиб ка, % Критерий приемлемости не более,%

к 1 0,020 1405 318654 0,00044 0,00021 0,022 7,13 20

к 2 0,194 14357 329658 0,00435 0,00196 0,189 -2,73 15

к 3 1,938 142417 328965 0,04329 0,01958 1,846 -4,76 15

к 4 19,380 1459302 318645 0,45797 0,19576 19,494 0,59 15

к 5 193,800 1498478 330158 4,53866 1,95758 193,167 -0,33 15

к 6 1938,000 1489865 326987 45,56339 19,57576 1939,167 0,06 15

к 7 3876,000 2872818 315489 91,05902 39,15152 3875,447 -0,01 15

Вывод: полученная калиброванная кривая применима для расчетов

Марки ровка Концент рация введенная, мкг/мл Площадь пика С7070 Площадь пика 18 Отноше ние площадей Отношение концентраций Концент рация найденная, мкг/мл Ошиб ка, % Критерий приемлемости не более,%

к 1 0,020 1426 346518 0,00041 0,00021 0,020 -1,58 20

к 2 0,194 14386 329684 0,00436 0,00196 0,208 7,23 15

к 3 1,938 142421 318956 0,04465 0,01958 2,121 9,44 15

к 4 19,380 1451126 359874 0,40323 0,19576 19,148 -1,20 15

к 5 193,800 1458896 359874 4,05390 1,95758 192,501 -0,67 15

к 6 1938,000 1458859 356984 40,86619 19,57576 1940,537 0,13 15

к 7 3876,000 2775787 340169 81,60021 39,15152 3874,798 -0,03 15

Вывод: полученная калиброванная кривая применима для расчетов

Таблица 3.14 - Расчёт прецизионности определения С7070 между циклами по

калибровочным растворам (крысы).

Концентрация Концентрация Концентрация Концентрация

найденная найденная найденная найденная Критерий

Раствор средняя, средняя, средняя, средняя, приемлемости, не

мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл более, %

Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 Цикл 4

1 0,020 0,021 0,019 0,020 4,09 20