Экологические аспекты ферментативного гидролиза древесины ивы (Salix caprea) предобработанной паровым взрывом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат биологических наук Приставка, Алексей Александрович

• Приставка, Алексей Александрович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Приставка, Алексей Александрович

Оглавление

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Целлюлазы и механизм ферментативного гидролиза целлюлозы

1.1.1 Источники получения целлюлолитических ферментов

1.1.2. Классификация целлюлолитических ферментов и структура целлюлазного комплекса

1.1.3. Молекулярные механизмы действия целлюлаз

1.1.4. Нейтральные и щелочные эндоглюканазы

1.2. Лигниназный комплекс и роль лакказ в разложении лигнина

1.3. Предобработка лигноцеллюлозного субстрата паровым взрывом

2. Материалы и методы

2.1. Характеристика субстрата и ферментных препаратов

2.2. Ферментативный гидролиз субстрата

2.2.1. Определение оптимального соотношения ферментных препаратов «целловиридин ГЗх» и «пектофоетидин ГЗх» для достижения синергизма при ферментативном

гидролизе субстрата

2.2.2. Определение оптимальных условий проведения ферментатитивного гидролиза

2.2.3. Методы определения степени ингибирования и инактивации фермента продуктами реакции

2.2.4. Методы гидролиза с подпиткой свежим субстратом: регенерация адсорбированного фермента

2.2.5. Регенерация ферментативной активности из гидролизата и выделение компонентов с пониженной степенью адсорбции

2.3. Биохимические методы исследования

2.3.1. Анализ состава ферментных комплексов, отличающихся по

степени адсорбции на лигноцеллюлозе, с помощью

электрофореза

2.3.2. Методы определения активности ферментов

2.3.3. Определение концентрации и состава Сахаров

2.4. Культивирование микроорганизмов на гидролизатах ивы

2.5. Скрининг микроорганизмов - продуцентов нейтральных

и щелочных ферментов: эндоглюканаз и лакказ

2.6. Исследование термо- и рН-стабильности неочищенных

эндоглюканаз из различных природных источников

2.7. Ионообменная хроматография культуральной жидкости

РешсШшт зр. штамм 4-6

2.8. Статистическая обработка экспериментальных данных

3. Результаты и обсуждение

3.1. Ферментативный гидролиз древесины ивы, предобработанной паровым взрывом: требования к составу целлюлазного комплекса

3.1.1. Гидролиз без предварительной водной отмывки субстрата в условиях высокой плотности субстрата и при отсутствии перемешивания

3.1.2. Снижение затрат фермента на единицу веса субстрата -

регенерация фермента

3.1.2.1. Регенерация прочно связывающейся части ферментного комплекса путем периодической подгрузки предобработанной древесины в реактор без перемешивания, с высокой плотностью субстрата

3.1.2.2.Многократное использование слабосорбирующихся целлюлолитических ферментов

3.2. Рост микроорганизмов на гидролизатах и динамика потребления

глюкозы

3.3. Нейтральные и щелочные эндоглюканазы

3.3.1. Скрининг микроорганизмов - продуцентов нейтральных и

щелочных эндоглюканаз

3.3.2. Хроматографическое фракционирование белков культуральной жидкости Pénicillium sp. 4-6 на

ионообменнике DEAE-сферон

3.4. Зависимость ингибирования лакказ из различных источников

ионами Cl " от условий рН. Эффект активации

Выводы

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экологические аспекты ферментативного гидролиза древесины ивы (Salix caprea) предобработанной паровым взрывом»

ВВЕДЕНИЕ

Практически любая деятельность человека приводит к образованию и накоплению большого количества твердых, жидких и газообразных отходов, приводящих к загрязнению воды, атмосферы и почвы. Значительную долю составляют лигноцеллюлозные отходы, источником которых являются деревоперерабатывающая, лесная промышленность, сельское хозяйство и городские отходы. Растущий уровень загрязнения окружающей среды стимулирует поиск альтернативного и экологически безопасного способа переработки отходов, в первую очередь - лигноцеллюлозных, являющихся важнейшим компонентом сырьевых ежегодно возобновляемых ресурсов биосферы.

Лигноцеллюлозные субстраты могут компенсировать дефицит невосполнимых природных ископаемых, путем их конверсии ферментами микроорганизмов в сахара и последующего или одновременного сбраживания Сахаров в этанол.

Эффективность конверсии лигноцеллюлозного сырья зависит от потребления трех основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина.

Наиболее доступным компонентом, составляющим основную часть растительных материалов, является целлюлоза - ее ежегодный прирост составляет 10^1/тонн. В ферментативном разрушении целлюлозы участвует комплекс целлюлолитических ферментов, таких, как целлобиогидролазы и эндоглюканазы, которые могут быть выделены из различных грибных и бактериальных источников. Эти ферменты могут использоваться не только для получения из целлюлозы глюкозы, которая, в свою очередь, может быть сырьем для микробиологического синтеза различных ценных продуктов, но и для

выделения лекарственных веществ (стероидов) из растений; для улучшения качества растительных масел; как добавка в комбикорма для животных (Лобанок и др., 1988; Тиунова, 1981); для "каменной отмывки" тканей а так же для производства стиральных порошков. Последние две точки приложения особенно бурно развиваются в последние годы. Это связано с тем, что были обнаружены новые термостабильные эндоглюканазы, способные работать в более щелочных условиях, чем ферменты из традиционного продуцента Trichodeima reesei. Повышенный интерес к нейтральным эндоглюканазам связан с возможностью их использования для создания pH-совместимых ферментных комплексов для одновременного сбраживания гидролизных Сахаров (Lange, 1993).

Хотя промышленное получение целлюлаз было начато еще в 60-х годах, до сих пор проблема получения глюкозы ферментативным гидролизом целлюлозы не решена. Это связано с тем, что целлюлоза представляет собой водонерастворимый полимер со сложной надмолекулярной структурой, которая трудно поддается действию фермента. Биохимические механизмы действия как отдельных целлюлаз, так и целлюлазного комплекса в целом также недостаточно полно изучены.

Для повышения реакционной способности субстрата обычно предусматривают его предварительную обработку. Наиболее перспективным способом является использование парового взрыва, который представляет собой кратковременную обработку древесных опилок или щепы нагретым водяным паром при повышенном давлении с последующим мгновенным снижением давления до одной атмосферы (Гравитис, 1987). В процессе предварительной обработки происходит дезацетилирование гемицеллюлоз с высвобождением уксусной кислоты, гидролизом гемицеллюлоз до мономеров и частичным разрушением лигноуглеводных связей, выплавление лигнина из срединной пластинки. В результате увеличивается удельная поверхность

целлюлозы, доступная для ферментативного воздействия, что повышает степень конверсии субстрата.

Однако, ферментативное разложение лигнина является процессом еще более трудным, чем гидролиз целлюлозы. В разрушении лигнина принимают участие такие ферменты, как лигниназа, Mn-пероксидаза (Kaushik & Bisaria, 1989; Wariishi et al. 1991; Perie & Gold 1991) и лакказа (Shimada et al. 1980; Munoz et al., 1997) которая в последнее время находят множество применений в иммуноанализах, в изготовлении биосенсоров и очистке промышленных сточных вод, хотя низкий рН-оптимум активности промышленных ферментов затрудняет их использование (Crecchio et al. 1995; Zouari et al. 1994; Yaropolov et al. 1994; Cliffe et al. 1994; Gardiol et al. 1996).

Таким образом, все компоненты растительных отходов могут быть утилизированы с применением различного набора ферментов грибного и бактериального происхождения. В настоящее время проблема заключается в повышении эффективности и технологичности процесса до такой степени, чтобы он мог конкурировать с традиционными методами получения энергии из природных ископаемых.

Цели и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось исследование ферментативного гидролиза древесины ивы, предобработанной паровым взрывом и изучение возможных путей повышения эффективности гидролиза.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи: - подбор наиболее эффективных условий проведения ферментативного гидролиза взорванного субстрата с применением наиболее оптимальных соотношений ферментных препаратов целлюлолитического действия из Trichodeima reesei и Aspergillus foetidus;

- обоснование целесообразности проведения гидролиза в нетрадиционных условиях без предварительной отмывки и перемешивания реакционной среды в ходе процесса;

- определение ферментного состава целлюлазного комплекса, обладающего пониженной степенью адсорбции на субстрате по сравнению с исходным комплексом, и при этом сохраняющего высокую осахаривающую способность;

- изучение возможности выращивания микроорганизмов на полученных гидролизатах;

выявление перспективных штаммов микроорганизмов, способных продуцировать pH-устойчивые ферменты целлюлазного (эндоглюканазы) и лигниназного (лакказы) комплексов и изучение особенностей действия этих ферментов;

Научная новизна работы

Предложен новый нетрадиционный и экологически безопасный способ осахаривания целлюлозосодержащего материала (древесина ивы (Salix caprea), предобработанная паровым взрывом) ферментами микроорганизмов. Подобраны условия проведения гидролиза, которые отличаются от общепринятых отсутствием перемешивания реакционной среды. Это позволят достичь высокой исходной концентрации субстрата и получить высокую концентрацию продукта реакции.

Впервые показано, что причина быстрого прекращения гидролиза и слабого роста микроорганизмов на гидролизатах обусловлена низким значением pH неотмытого субстрата, а также отмечено незначительное влияние водорастворимых ингибиторов целлюлаз и роста микроорганизмов.

Современные представления о молекулярных механизмах деструкции кристаллической целлюлозы целлюлазным комплексом предусматривают

обязательное участие целлобиогидролазы I. Однако, в ходе работы установлено, что эффективный гидролиз взорванного материала может осуществляться целлюлазным комплексом, целлобиогидролазная компонента которого представлена преимущественно целлобиогидролазой II. Одновременно показано, что такой комплекс обладает низкой степенью адсорбции на субстрате и исследована возможность его многократного рецикла в сравнении с известной регенерацией ферментативной активности путем сдвига адсорбционного равновесия добавлением к лигнифицированному остатку новых порций субстрата.

Проведен результативный поиск продуцентов эндоглюканаз и лакказ, имеющих широкий рН-оптимум, среди микроорганизмов, обитающих в таких неблагоприятных условиях среды как засоленные почвы пустыни Гоби и Южно-Вьетнамские почвы, обработанные дефолиантами в годы войны с США. Обнаружен, ранее не описанный у известных ферментов, эффект активации в нейтральной области рН лакказы из штамма РешсШшт ер. 4-6 ионами СГ, что, по-видимому, является результатом качественных изменений в структуре фермента.

Практическая ценность работы

Промышленное использование технологического процесса в изученных условиях может привести к значительному удешевлению гидролизных Сахаров за счет отказа от постоянного перемешивания реакционной среды, гидролиза при высокой плотности субстрата, отсутствия его предварительной отмывки, и рецикла фермента, возможного при использования целлюлазных комплексов, слабо сорбирующихся на субстрате.

Нейтральные и щелочные эндоглзоканазы из отобранных микроорганизмов могут найти применение в текстильной промышленности и в производстве стиральных порошков, а так же для создания новых ферментных композиций.

Наконец, обнаруженный эффект активации лакказы из Penicillium sp. ионами С1 " может значительно повысить эффективность этих ферментов при деструкции лигнина, иммуноанализах, очистке промышленных сточных вод и др.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

■ The 9th European Bioenergy Conference on Biomass for energy and the environment, Denmark - 1996.

■ 19th symposium on biotechnology for Fuels and Chemicals, Colorado Springs, Colorado, USA - 1997.

■ Third Biomass Conference of the Americas, Quebec, Canada - 1997.

■ International Conferens on Sustainable, Agriculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany - 1997.

■ Конференция молодых ученых, посвященная 850-летию г. Москвы, Москва-1997.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

1. Литературный обзор

1.1. Целлюлазы и механизм ферментативного гидролиза целлюлозы

1.1.1. Источники получения целлюлолитических ферментов

Целлюлазы образуют многие микроорганизмы: грибы, бактерии, актиномицеты, некоторые беспозвоночные животные и растения. Микроорганизмам и беспозвоночным животным эти ферменты необходимы для расщепления целлюлозы до глюкозы, которая используется как источник энергии и углерода, а микроорганизмы-фитопатогены таким образом разрушают клеточную стенку растений для проникновения в цитоплазму. У растений целлюлазы участвуют в процессах роста и дифференциации растительных клеток - при росте клеток растяжением, опадании листьев, удлинении пыльцевой трубки, созревании плодов и дифференциации сосудов (Родионова, 1981; Тиунова, 1981). Ферменты обнаружены в системе пищеварения некоторых моллюсков, переваривающем соке улиток (Рабинович и др. 1988). У позвоночных животных нет собственных целлюлаз. Способность растительноядных животных усваивать целлюлозу связана с наличием в их органах пищеварения многочисленной целлюлолитической микрофлоры (Родионова, 1981).

Наиболее эффективными продуцентами целлюлаз являются грибы. На их долю приходится свыше 90% расщепляемой в природе целлюлозы. Грибы используются и в промышленности для получения препаратов внеклеточных целлюлаз (Грачева, 1987).

Было селекционировано несколько высокопродуктивных штаммов целлюлолитических грибов, которые относятся к видам Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Pénicillium funiculosum, Pénicillium iriensis, Pénicillium veruculosum, Fusarium solani, Aspergillus terreus, Phanerochaete chrisosporium, Poliporus adustus, Myrothecium verrucaria, Pellicularia filamentosa и Eupenicillium

javanicum (Родионова, 1981; Тиунова, 1981; Грачева, 1987; Лобанок и др., 1988; Coughlan, 1985).

Другим перспективным продуцентом целлюлаз являются бактерии. Хотя они производят значительно меньшее количество целлюлозы, зато гораздо быстрее растут и удобнее при генетических манипуляциях (Фогарти, 1986).

Бактериальные целлюлазы организованы иначе, чем грибные. Они действуют в составе сложных надмолекулярных ансамблей, определенным образом расположенных на клеточной поверхности, в то время как внеклеточные грибные целлюлазы могут действовать индивидуально и пространственно независимы друг от друга (Клесов, 1990).

Способностью разлагать целлюлозу обладают аэробные виды бактерий -миксобактерии, псевдомонады; факультативные анаэробы Bacillus, Cellulomonas и строгие анаэробы - Clostridium и Bacteroides (Тиунова, 1981; Наплекова, 1974; Лобанок и др., 1988).

Для решения ряда проблем, связанных с использованием известных целлюлаз (низкая удельная активность, низкая термостабильность, сильная катаболитная репрессия, несбалансированность различных ферментов в целлюлазном комплексе) продолжается поиск технологичных и дешевых целлюлаз (Рабинович и др., 1988).

В этом плане перспективным является использование термофильных микроорганизмов. Их ферменты действуют при высокой температуре и в более широком диапазоне рН и температур по сравнению с ферментами мезофилов. Кроме этого, у целлюлаз термофилов наблюдается большая устойчивость к ингибирующему действию глюкозы.

Из термофилов к целлюлозоразрушающим грибам относятся: Chrisosporium lignorum, Thermoascus aurontiacus, Mucor pussillus, Chetomium thermophile, Myceliophtora thermophilia и др. Все эти грибы имеют оптимальную температуру роста 40-45 иС и более высокую по сравнению с мезофилами скорость разложения целлюлозы. Например, Thermoascus aurontiacus разрушает

целлюлозу в три раза быстрее, чем Trichoderma viridie, которая является лучшим целлюлолитиком среди мезофилов.

Большое внимание уделяется термофильным анаэробным бактериям -развиваясь при более высоких температурах (60-65 °С), они обладают большей скоростью роста, чем грибы, и их ферменты более термостабильны. Основные исследования ведутся с анаэробной термофильной бактерией Clostridium thermocellum.

Среди аэробных термофилов есть несколько актиномицетов, обладающих целлюлазной активностью. Это Thermonospora curvata и Thermonospora cellulosae (Билай,1986; Логинова, 1988; Логинова и др. 1986, Лобанок и др., 1989).

Наконец, в последнее время описано несколько источников термостабильных нейтральных и щелочных эндоглюканаз грибного (Schulein et al, 1993) и актиномицетного (Wilson, 1988, Presutti et al, 1993) происхождения. Целлюлазы и гемицеллюлазы из различных источников привлекают внимание специалистов своим широким pH-оптимумом активности, высокой термостабильностью и способностью работать в синергизме с грибной целлобиогидролазой I (Irwin et al., 1993; Hu et. al., 1992; Presutti et al., 1993; Trigo et al., 1994). В литературе описано несколько примеров высокой активности и стабильности целлюлаз из актиномицетов. Термостабильная ксиланаза, производимая Thermomonospora fusca сохраняет 96% своей активности после инкубирования в течении 18 часов при 75°С. Она имеет pH оптимум в районе 7 и сохраняет 80% свой максимальной активности между pH 5 и 9 (Irwin and Wilson, 1994). Эндоглюканаза из Thermomonospora curveta имеют pH оптимум 8,0-8,5 при 70°С (Presutti et al., 1993).

1.1.2. Классификация целлюлолитических ферментов и структура целлюлозного комплекса

К целлюлазам относится группа гидролитических ферментов, способных гидролизовать нерастворимую целлюлозу до ее мономера путем расщепления 1,4-р-гликозидной связи между остатками Б-глюкозы. Все целлюлазы относятся к классу карбогидраз - ферментов, катализирующих гидролиз О-гликозидной связи.

Целлюлазы образуются в виде белковых комплексов, в состав которых входит несколько ферментов.

К ферментам целлюлазного комплекса традиционно относят три типа ферментов: эндоглюканазы, экзоглюканазы и Р-глюкозидазы (целлобиазы).

I. Эндо-1,4-р-Б-глюканазы (КФ 3.2.1.4)

Это фермент, неупорядоченно гидролизующий (3-1,4-связи в р-1,4-глюканах. Он способен с одинаковой вероятностью гидролизовать любую из гликозидных связей в молекуле целлюлозы, включая и самые крайние. Однако, при достаточно высокой степени полимеризации молекулы субстрата, суммарная вероятность действия эндоглюканаз на внутренние гликозидные связи будет выше, чем на две крайние связи. Поэтому, продуктами действия эндоглюканаз в основном являются фрагменты молекул целлюлозы произвольной длины.

II. 1,4-Р-0-глюкан-целобиогидролаза или экзо-целлобиогидролаза (КФ 3.2.1.91.). Фермент действует на вторую от конца молекулы целлюлозы гликозидную связь с образованием целлобиозы. Фермент обладает высокой специфичностью - гидролизует Р-1,4-глюканы, но не действует на Р -1,3- и р -1,6-глюканы (\\/оос1е, 1980; Клесов и др., 1980).

Известно два типа целлобиогидролаз - I и II. Первая гидролизует целлюлозную цепь с восстанавливающего конца по направлению к невосстанавливающему, а вторая - наоборот, начинает вести гидролиз с невосстанавливающего конца ^аЫЬе^ а1. 1997).

III (3-глюкозидаза или целлобиаза (КФ 3.2.1.21). Эти ферменты практически не действуют на полимерные молекулы целлюлозы, но могут расщеплять короткие целлоолигосахариды в состав которых входит до 6 глюкозных единиц, причем, с возрастанием молекулярной массы олигосахарида, катализирующая способность фермента уменьшается. Многие целлобиазы не специфичны по отношению к определенному типу связи. В ходе реакции могут расщепляться и P-1,2-, р-1,3-, (3-1,4- и |3-1,6- связи (Wood, 1980; Ryu and Mandéis, 1980; Nisizawa, 1973; Клесов и др., 1980).

Было отмечено существование еще одного типа целлюлаз - 1,4-(3-глюкан-глюкогидролазы или экзоглюкогидролазы (КФ 3.2.1.74). Фермент отщепляет глюкозу от невосстанавливающего конца целлюлозной молекулы. Однако в индивидуальном виде он был выделен только из одного источника и не проявляет активности по отношению к упорядоченной целлюлозе (Вуд, 1984). Роль этого компонента в гидролизе целлюлозы пока остается неопределенной.

Все целлюлазы, синтезируемые микроорганизмами относятся к 5 различным белковым семействам: 5, 6, 7, 12 и 45 (Schulein, 1997).

Ферменты целлюлазного комплекса, выделенные из различных источников, различаются по своим молекулярным характеристикам (молекулярной массой, аминокислотным составом и последовательностью, изоэлектрической точкой, содержанием углеводов и т.д.), каталитической активностью, константой адсорбции, субстратной специфичностью и др. Кроме этого, целлюлазы почти из любого организма найдены в виде целого ряда изоферментов. Известны целлюлазы, связанные с клетками и каталитически активные внеклеточные целлюлазы. Известны целлюлазы, объединенные в надмолекулярные структуры - целлюлосомы, обнаруженные у некоторых бактерий (Клесов, 1990; Клесов и Рабинович, 1980)

Существуют и другие различия эндо- и экзоферментов внутри целлюлазного комплекса.

Конфигурация аномерного гидроксила у продуктов реакции зависит от типа фермента, действующего на субстрат. Так, Р-конфигурация ОН-групп у С-1 продукта реакции сохраняется при действии на субстрат эндоглюканаз и р-глюкозидаз (Рабинович и др. ,1988) . При действии на субстрат целлобиогидролаз, происходит стереоспецифический процесс - аномерный гидроксил инвертируется целлобиогидролазой II, а целлобиогидролаза I сохраняет Р-конфигурацию (Бтой, 1990).

В отличие от экзоферментов, эндоглюканазы и глюкозидазы способны катализировать реакции трансгликозилирования. Трансгликозилирование - это перенос ферментом фрагмента углеводного субстрата с активного центра на подходящий акцептор, которым может быть другая молекула субстрата, ее фрагмент, различные спирты. В результате могут образовываться продукты со степенью полимеризации большей, чем у исходного субстрата. (Максимов, 1988; Клесов, 1990, Краева и др. 1986).

Кроме этого, экзоглюканазы наиболее упорядоченно действуют на полимерный субстрат и обычно образуют единственный низкомолекулярный продукт (например, целлобиоза для целлобиогидролаз). Эндоглюканазы напротив, образуют несколько низкомолекулярных продуктов в различных соотношениях.

У некоторых грибов, осуществляющих сопряженную деградацию целлюлозы и лигнина, помимо целлюлолитических ферментов, обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, которые могут принимать участие в деградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. Это целлобиозооксидаза и целлобиозо-хинон-оксидоредуктаза. Они окисляют целлоолигосахариды до целлобионолактона или, после его омыления до целлобионовой кислоты. Целлобиозооксидаза использует в качестве акцептора электронов кислород, восстанавливая его до Н2О2. Целлобиозо-хинон-оксидоредуктаза окисляет целлюлозу хиноном, продуктом деградации лигнина, восстанавливая его до фенола (Рабинович и др. 1988).

1.1.3. Молекулярные механизмы действия целлюлоз

Современные представления о молекулярных процессах, обуславливающих ферментативный гидролиз целлюлозы, еще недостаточно полны. Это связано с тем, что целлюлоза является субстратом со сложной надмолекулярной структурой, которую трудно охарактеризовать даже с помощью большого набора физико-химических параметров, таких, как размер частиц, степень полимеризации, степень кристалличности и т.д. С другой стороны, целлаолазный комплекс имеет довольно сложную структуру: в него входит до 20 ферментов, различающихся как продуктами реакции, так и молекулярными характеристиками (молекулярной массой, аминокислотным составом и последовательностью, способностью адсорбироваться на целлюлозе, каталитической активностью и т.д.). Кроме того, целлюлазы почти из любого организма найдены в виде целого ряда изоферментов. Наконец, еще большие сложности в изучение действия целлюлаз вносит наличие синергизма между их отдельными компонентами при совместном действии на целлюлозу (Рабинович и др., 1988; Клесов, 1990).

Тем не менее, способ действия на субстрат должен быть сходным у всех ферментов, катализирующих гидролиз О-гликозидной связи.

Одна из моделей активного центра карбогидраз (в том числе и целлюлаз) представляет его структуру в виде последовательности сайтов, каждый из которых вмещает по одному углеводному остатку. Все субсайты имеют разное сродство к моносахаридному остатку, причем субсайт, непосредственно предшествующий каталитическому центру препятствует сорбции глюкопиранозного остатка и называется барьерным. Сорбция на этом субсайте сопровождается искажением структуры и фермента и субстрата и происходит лишь за счет связывания соседних углеводных остатков с субсайтами, обладающими высоким сродством к субстрату (рис.1).

312 1 -1 -2 -3 -4

1 -1 -2 -3|

4 3 2 ■-и 1 ' -1 -2 -3 -4

а

6

Рис.1 Условные гистограммы показателей сродства субсайтов в активных центрах карбогидраз различных типов, а - экзофермент, отщепляющий дисахарид от невосстанавливающего конца молекулы субстрата; б -олигосахаридгидролаза, специфичная к дисахариду и не действующая на полимеры; в - эндоглюканаза, специфичная к восстанавливающему концу полисахарида (Рабинович и др.,1988).

Так, активный центр экзогидролаз имеет высокий барьерный сайт, блокирующий продвижение невосстанавливающего конца субстрата вглубь фермента, а количество связывающих сайтов гликоновой части активного центра определяет длину отщепляемого продукта (1 - для глюкогидролаз, 2 -для целлобиогидролаз и т.д.). После местоположения расщепляемой связи следуют несколько связывающих сайтов агликоновой части.

У олигосахаридгидролаз, не действующих на полисахариды, высокие барьерные сайты должны ограничивать как гликоновый, так и агликоновый участки активного центра. Например, у целлобиогидролаз гликоновая часть, ограниченная барьерным сайтом, содержит один связывающий сайт, а агликоновая один или несколько слабо связывающих или барьерных сайтов,

которые и определяют более слабое действие фермента на три- и тетрасахариды.

Активный центр эндоглюканаз не ограничен ни в гликоновой, ни в агликоновой части. Однако в нем присутствуют барьерные сайты непосредственно вблизи положения расщепляемой связи и/или на краю активного центра. Длина активного центра эндоглюканаз варьирует от четырех до двенадцати моносахаридных остатков (Рабинович и др. 1988).

С применением современных методов исследования, таких, как рентгеноструктурный анализ, доказана справедливость субсайтной модели для большинства целлюлаз.

Так, целлобиогидролазы I и II из Т. reesei из длинных полипептидных цепей формируют на поверхности фермента тоннель активного центра. Гликоновая цепь из нескольких глюкозных единиц может быть связана гидрофобными связями с триптофановыми остатками, выстилающими внутренние стенки тоннеля (Rouvinen et al. 1990, Divne et al. 1994).

Целлобиогидролаза I, относящаяся к семейству 7, образует тоннель длиной 50 А и имеет 10 гликозил связанных субсайтов - от -7 до +3. Все субсайты расположены внутри тоннеля, за исключением -7, который направляет полисахарид в активный центр. Целлюлозная цепь, продвигаясь по тоннелю, скручивается примерно на 180°, что усиливает деформацию напряжения и способствует разрыву связи (Stahlberg et al. 1997).

Подобным же образом устроена молекула Целлобиогидролазы II из семейства 6. Каталитический домен фермента тоже имеет для связывания субстрата и катализа тоннель длиной 20 А. Тоннель содержит 4 связывающих сайта (-2, -1, +1, +2) для сахарных единиц. Так же имеется дополнительный связывающий сайт +4 для шестого гликозильного остатка у входа в тоннель. В сайтах -2, +1, +2 и +4 сахара связаны гидрофобными связями с Тгр135 (-2), Тгр269 (+1), Тгр367 (+2) и Тгр272 (+4) (Rouvinen, 1990).

Эндогтоканаза I из Т. гееве! очень похожа на целлобиогидролазы I с 45% идентичностью. Однако, тоннель образующая петля намного короче или вообще отсутствует, поэтому формируется не тоннель, а желоб ^аЫЬе^ а1. 1997).

После того, как, благодаря субсайтному взаимодействию, полисахаридная цепь соответствующим образом ориентирована в активном центре фермента, происходит непосредственно гидролиз О-гликозидной связи.

В зависимости от того, сохраняется или обращается конфигурация аномерного гидроксила при разрыве Р-1,4-гликозидной связи, возможны два механизма гидролиза.

Механизм, протекающий с сохранением (З-конфигурации, выглядит следующим образом (Рабинович и др., 1988; Клесов, 1984; Хорлин, 1974). Протондонорная группа атакует гликозидазный кислород, а отрицательно заряженная группа способствует гидролизу гликозидной части и стабилизирует карбоний аксониевый катион, в котором положительный заряд на С-1 атоме частично перераспределяется на кислород пиранозного кольца. Образуется тесная ионная пара, ориентированная в активном центре таким образом, что доступ молекулы воды возможен только со стороны уходящей группы. После десорбции агликона, со стороны уходящего остатка атом С-1 атакуется водой, ориентируемой депротонированной группой фермента А. В результате происходит сохранение Р-конфигурации у продукта реакции, десорбирующегося последним из гликоновой части (Рис. 2).

Важным моментом в каталитическом акте является искажение конформации "кресла" пиранозного кольца в конформацию "полукресла". Как отмечалось выше, барьерный субсайт не обладает высоким сродством к конформации "кресла". Однако он обладает высоким сродством к конформации полукресла, реализуемой в переходном состоянии. Таким образом, этот субсайт выполняет функцию стабилизации переходного состояния в активном центре фермента.

в в

Рис. 2 Механизм гидролиза целлюлозы, протекающий с сохранением конфигурации аномерного гидроксила у продукта реакции. АН каталитическая группа фермента, осуществляющая общий кислотный катализ путем протонирования гликозидазного кислорода (например, СООН - группа асп или глу); В - каталитическая группа фермента, осуществляющая синхронно общий основной или нуклеофильный катализ и атакующая С-1 (карбоксилат анион асп); Я - фрагмент субстрата, локализующийся на агликоновых субсайтах (Рабинович и др., 1988).

Для ферментативного катализа, протекающего с обращением конфигурации аномерного гидроксила у продуктов реакции в а-форму, предложен другой механизм. В этом случае С-1 атом атакуется не нуклеофильной группой фермента, а молекулой воды, координируемой в активном центре, нуклеофильность которой повышается благодаря взаимодействию с основной группой активного центра. Десорбция гликона должна происходить первой, после чего на его место диффундирует молекула воды, и лишь затем возможна десорбция агликона (Рис. 3) (Рабинович и др., 1988).

А

I

Н i

Ó-R.

О.

O—н ц

В"

А

I I

н

0-R

-О. i

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Приставка, Алексей Александрович, 1999 год

Список литературы

1. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментные свойства. - М.: Наукова думка, 1986,- 172 с.

2. Вуд Т.М. Экспериментальные данные и предположения о механизме ферментативного расщепления целлюлозы.//16 конф. ФЕБО: Материалы. М., 1984, с. 116

3. Гиндилис А.Л., Жажина Е.О., Баранов Ю.А., Карякин A.A., Гаврилова В.П., Ярополов А.И. выделение и свойства лакказы из базидиального гриба Coriolus hirsutus (Fr.) Quel //Биохимия,- 1988,- T.53, вып.5.-С.735-739.

4. Гравитис Я.А. Теоретические и прикладные аспекты метода взрывного автогидролиза растительной биомассы. // Химия древесины,- 1987,- N5,- с.З-21.

5. Грачева И.М. Технология ферментативных препаратов,- М.: Мир, 1987,- 335 с.

6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т. 1. М., Мир, 1982, 389 с.

7. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М: Наука, 1993,- 272 с.

8. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М. Высшая школа,- 1974.-212 с.

9. Каллавус У.Л., Гравитис Я.А. О воздействии парового взрыва на ультраструктуру древесины. // Химия древесины. 1990,- N6,- с.66-72.

Ю.Каткевич Ю.Ю., Веверде П.Я. Особенности ферментативного гидролиза древесной целлюлозы. Тез. докл. Всесоюзная конференция по химии и использованию лигнина. Рига.- 1988,- с. 8-25.

П.Клесов A.A. Биохимия и энзимология гидролиза целлюлозы.// Биохимия, том 55.-М.-1990.-1731-1765.

П.Клесов А.А, Черноглазов В.М., Рабинович M.JL, Глазов М.В., Адаменкова М.Д. Способность целлюлаз к деградации кристаллической целлюлозы как

результат их эффективной адсорбции на субстрате: Экспериментальное подтверждение и теоретическая интерпретация//Биохимия. 1983. Т. 48. N 9. С. 1411-1420.

13.Клесов A.A., Рабинович M.JI. Ферментативный гидролиз целлюлозы. II Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников // Биоорганическая химия, т.6, N 9 - М,- 1980.

14.Клесов A.A., Рабинович M.JI., Синицин А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. 1. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников. - Биоорг. химия, 1980. Т. 3.N8. с. 1225-1242.

15.Клесов А.А, Черноглазов В.М., Рабинович M.JI., Синицин А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы//Биоорган. химия. 1982.Т. 8. N 5. С. 643-651.

16.Клесов A.A. Ферментативный катализ. Ферментативная деструкция полимеров (Полимерные субстраты)., М., МГУ, 1984, 216 с.

17.Краева Н.Э., Рабинович М.Л., Клесов A.A., Березин И.В. Промотируемая целлюлозой и ее производными деградация низкомолекулярного хромогенного субстрата под действием эндоглюканазы Trichoderma уШе//Докл.АН СССР. 1986.T.290.N2. С.484-486.

18.Клесов A.A., Черноглазов В.М., Ермолова О.В., Елкин В.В. Влияние лигнина на ферментативный гидролиз лигноцеллю лозных материалов. //Биотехнология, 1985, N 3, 106-112.

19.Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов - 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш.шк., 1990,- 352 е.: ил.

20.Левит М.Н., Шкраб A.M. Лигнин и лигниназа.//Биоорганическая химия,-1992.-Т.18- N3. - с. 309-344.

21.Леонович A.A., Оболенская A.B. Химия древесины и полимеров,- М.: Лесная промышленность,- 1988,- 146 с.

22.Леонтьевский Л.А., Головлева JI.A. Внеклеточные лигнинразрушающие ферменты гриба Panus Tigrinus // Биохимия,- 1990,- Т. 55, вып. 3,- С.423-430.

23.Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты. - М.: Наука и техника, 1988,- 261 с.

24.Лобанок А.Г., Астапович Н.И., Михайлова Р.В. Биотехнология микробных ферментов. - М.: Наука и техника, 1989,- 205 с.

25. Логинова Л.Г. Термостабильные целлюлазы и термостабильные микроорганизмы//Итоги науки и техники, серия биотехнология, т. 10,- М.: 1988,- 221 с.

26.Логинова Л.Г., Иванова И.И., Гужова И.П. Целлюлазы термофильных микроорганизмов//Проблемы биоконверсии растительного сырья,- М.: Наука, 1986.-с.165-192.

27. Максимов В. И. Реакции трансгликозилирования в ферментативном гидролизе полисахаридов и методы их исследования //Микробиология и биохимия разложения растительных материалов/ Под ред. Скрябина Г.К., Головлева Е.Л., Клесова A.A. М.: Наука, 1988. С. 181-230.

28.Митькевич О.В., Синицын А.П., Клесов A.A. О механизме действия полиферментных целлюлолитических препаратов на растворимую целлюлозу.//Прикл. Биохим. Микробиол., 1985, 21, вып. 2, 213-218.

29.Наплекова H.H. Аэробное разложение целлюлозы микроорганизмами в почвах Западной Сибири,- Новосибирск: Наука, 1974,- 250 с.

ЗО.Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ултрацентрифугирование: Практ пособие/Ин-т молекул, биол. АН СССР, - М.: Наука, 1981,- 286 с.

31.0стерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985.- 536 с.

32.Рабинович M.JL, Клесов A.A., Григораш С.Ю., Калнина И.А., Черноглазов В.М. Ферментативный гидролиз целлюлозы. VI. Адсорбция целлобиазы целлюлазного комплекса на целлюлозе.//Биоорг. Химия, 1982, 8, N 1, 84-95.

33.Рабинович М.Л., Клесов А.А, Черноглазов В.М., Нгуен Ван Вьет, Березин И.В.Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментов - фактор, определяющий реакционную способность нерастворимой (кристаллической) целлюлозы//Докл. АН СССР. 1981. Т. 260. N 6. С. 1481-1486

34.Рабинович M.JL, Черноглазов В.М., Клесов A.A. Изоферменты эндоглюканазы в целлюлазных комплексах: различное сродство к целлюлозе и неодинаковая роль в гидролизе нерастворимого субстрата//Биохимия. 1983. Т.48. N 3. С. 369-377

35.Рабинович M.JL, Нгуен Ван Вьет, Клесов А.А.Синергизм при совместном действии эндоглюканаз с высоким и низком сродством к целлюлозе//Прикл. биохимия и микробиология. 1986. Т. 22. N 1. С. 70-79.

36.Рабинович M.JL, Нгуен Ван Вьет, Клесов A.A. Адсорбция целлюлолитических ферментов на целлюлозе и кинетика действия адсорбированных ферментов: Два типа взаимодействия ферментов в нерастворимом субстрате//Биохимия. 1982. Т. 47. N 3, С. 465-477.

37.Рабинович M.JI.,Черноглазов В.М., Клесов A.A. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы действия целлюлаз // Итоги науки и техники, серия биотехнология, том 11.-М.-1988,-223 с.

38.Рабинович M.JL Полисахаразы: новый материал для белкового дизайна // Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья. Сыктывкар, 1992,- 13 с.

39.Рабинович M.JL, Клесов A.A., Березин И.В. Механизм переноса фермента, адсорбированного на поверхности нерасворимого субстрата.//Доклады АН СССР. 1984. Т. 274. С.758-763

40.Рабинович M.JL Механизм ферментативного разложения целлюлозы: роль адсорбции ферментов/ТМикробиология и биохимия разложения

растительных материалов/ Под ред. Скрябина Г.К., Головлева E.JL, Клесова A.A. M.: Наука, 1988. С. 70-108.

41.Рабинович M.JL, Клесов A.A., Березин И.В. Кинетика действия целлюлолитических ферментов из Geotrichum candidum. Вискозометрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы. -Биоорган, химия. 1977, т. 3. N 3. с. 405-414.

42.Родионова Н. А. Ферментативное расщепление целлюлозы//Целлюлазы микроорганизмов.- М.: Наука, 1981,- 213 с.

43.Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов A.A. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы: влияние ингибирования продуктами и изменения реакционной способности субстрата на скорость ферментативного гидролизаю.//Прикл. Биохим. Микробиол., 1981, 17, N 3, 315-321.

44.Синицын А.П., Митькевич О. В., Калюжный C.B., Клесов А.А.Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса//Биотехнология. 1987, 3,N 1.С. 39-46.

45.Синицин А.П., Ковалев Г.В., Меса-Мапреса С.Р. Сравнительное изучение влияния различных методов предобработки на скорость гидролиза целлюлозосодержащих материалов. // Химия древесины,- 1984,- N5,- с. 60-71.

46.Синицин А.П., Клесов A.A., Рабинович М.Л., Гусаков A.B., Морозов A.M. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы.// Итоги науки и техники, серия биотехнология, том 12.-М.-1988.-153 с.

47.Тиунова H.A. Применение целлюлаз//Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981.-213.

48.Фогарти В.М. Микробные ферменты и биотехнология.- М.: Агропромиздат, 1986.-213 с.

49.Холькин Ю.И. Новые методы гидролиза растительного сырья. Обзорная информация Главмикробиопрома, сер. IV. М., 1985, 39 с.

50.Хорлин А.Я. В кн.: Структура и функции активных центров ферментов. М., Наука, 1974, 39-69.

51 .Черноглазов В.М., Клесов А.А, Ермолова О.В. Действие высокоочищенной эндоглюканазы из Trichoderma longibrachiatum на кристаллический, аморфный и растворимый субстраты//Биохимия. 1983. Т. 48. N 10.С. 16171623.

52.Almin К.Е., Eriksson К.-Е., Pettersson В.//Extracellular enzyme system utilized by the fungus Sporotrichum pulverulentum (Chrysosporium lignorum) for the breakdown of cellulose. 2. Activities of the five endo-l,4-p-glucanases forwards carboxymethylcellulose. - Europ. J. Biochem., v. 51, N 1. p. 207-211.

53.Ander, P., Eriksson, K.-E. Lignin degradation and utilisation by microorganisms.-In: Progress Ind. Microbiol. - Amsterdam, 1978,- Vol. 14,- P. 1-58.

54.Atchison, J.E. Nonwood Fiber Could Play Major Role in Future U.S.Papermaking Furnishes// Pulp & Paper, July, 1995. P.35

55.Becker, D.K., Emert, G.H. Developments in Industrial Microbiology. General Meeting of the Society for Industrial Microbiology, St. Paul, Minn., 1982, vol. 24, 123-129.

56.Bhikhabhai, R., Johansson, G. and Pettersson, G. Isolation of cellulolytic enzymes from Trichoderma reesei QM 9414. J. Appl. Biochem., 6, 366, 1984.

57.Bower, В., Larenas, E., Swanson, B. and Ward, M. Trichoderma reesei EG III expression and modification. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Agriculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany. June, 1997.

58.Bungay H.R., Garcia M.A., Foody B.F. Treatment and characterization of exploded wood fraction.//Biotechnol. Bioeng. Symp., 1983,N 13,121-127.

59.Chenzy H., Henrissat В., Vuong R., Schulein The action of 1,4-P-D-glucan cellobiohydrolas on valonia cellulos microcristals: An electron microscopic study//FEBS Letters. 1983. V. 153. P.113-118.

60.Chenzy H., Henrissat B. Electron microscope study of the enzymatic hydrolysis of Valonia cellulos//Carbohyd. Polym. 1983. V. 3. P. 161-173.

61.Chernoglazov, V.M., Ermolova, O.Y. and Klyosov, A.A. The characterization and Purification endoglucanases from Trichoderma reesei./ZBiokhimiya, 1985, 50, 1108-1119.

62.Cliffe, S., M. S. Fawer, G. Maier, K. Takata H G. Ritter. 1994. Enzyme is Valued for Phenolic Contentses of Natural Juice.// J. Agricultur and Food Chem. 42:18241828.

63.Coughlan, M.P. The properties of Fungal and Bacterial Cellulases with comment on their Production and Application//Biotechnology and Genetic Engineering. 1985,- Vol.3.

64.Crecchio, C., P. Ruggiero, and M. D. R. Pizzigallo. (1995). Polyphenoloxidases Immobilized in Organic Gels: Properties and Applications in the Detoxification of Aromatic Compounds. Biotechnte, and D. Thomas. 1994. Laccase Electrode for the Continuous-Flow Determination of Phenolic Compounds. Biotechnology Techniques. 8:503-508.

65.Davies, G.D., Tolley, S.P., Schulein, M. (1993). Structure of the endoglucanase Y from Humicula insolens. In: Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases. Enzyme structures, Biochemistry, Genetics and Application. Proceedings of the Tricel Symposium, June 2-5, 1993, Espoo, Finland (P. Suominen and T. Reinikainen ads.) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, v.8. pp. 81-86.

66.Davies, G.J., Tolley, S., Wilson, K., Schulein, M, Waldike, H.F. and Dodson, G. (1992). Crystallisation and Preliminary X-ray analysis of a fungal endoglucanase I. J. Mol. Biol. 228, 970-972.

67.Dekker, R.F.H, Wallis, P. (1983) Enzymic saccharification of sugarcane bagasse pretreated by autohydrolysis - steam explosion. Biotechnol. Bioeng. 25:3027-3048.

68.Divne A.T. The tree dimensional structure of CBHI Tree dimensional structure of CBH II from Trichoderma reesei from Trichoderma reesei . 1994, Science 265, 524-528.

69.Enari, T.-M., Niku-Paavola, M.-L., Hargu, L., Lappalainen, A. and Nummi, M. Purification of Trichoderma reesei and Aspergillus niger P-glucosidase. J. Appl. Biochem., 3, 157, 1981.

70.Eriksson K.E.., Ander P., Petterson B. Regulation of lignin degradation in Phanerochaete chrysosporium // Materiuals of the third Int. Conf. Biotechnol. In the Pulp Ind. - Stockholm, 1986.-P.24-27.

71.Eriksson K.E., Pettersson B. Extracellular enzyme system utilized by the fungus Sporotrichum pulverulentum for the breakdown of cellulos./ZEurop. J. Biochem., 1975, V. 51,213-218.

72.Fagerstam L.G., Pettersson L. G. The 1,4-beta-glucancellobiohydrolases of Trichoderma reesei QM 9414: a new type of cellulolytic synergism//FEBS Letters, 1980. V. 119. P.97-101.

73.Feng Xu (1997). Effects of Redox Potential and Hydroxyd Ingibition on the pH Activity Profile of Fungal Laccases. J. Biol. Chem. V. 272., N 2., P. 924-928.

74.Feng Xu (1996) Oxydation of Phenols, Anilines, and Benzenethiols by Fungal Laccases: Corelation between Activity and Redox Potentials as Well as Halide Inhibition. Biochemistry, 35, P. 7608-7614.

75.Food and Agriculture Organization of the U.N., 1990-1995 Survey.

76.Forss, K., Jokinen, K., Williamsson, H. Utilization of enzymes for effluents treatment in the pulp and paper industry//Paperi ja puu.- 1989,- Vol. 71, N 10,-P.1108-1112.

77.Gardiol, A. E., R. J. Hernandez, B. Reinhammar H B. R. Harte. (1996). Development an Oxygen of Gas Phase of Use a Biosensor of Blue Contents Copper Oxidase.// Enzym and Microb. Tech. 18:347-352.

78.Ghose T.K., Bisaria V.S. Studies on the mechanism of enzymatic hydrolysis of cellulosic substance.//Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 131-146.

79.Ghose T.K., Sachdev R.K. Kinetics of immobilized p-glucosidase for hydrolysis of cellobiose to glucose.//! Molec. Catal.,1979,6,99-109.

80.Ghose T.K. Measurement of cellulose activities.//Pure and Appl. Chem., 1987, 5, N 2, 257-268.

81.Gong C.-S., Ladisch M.R., Tsao G.T. Cellobias from Trichoderma viride: ß-glucosidase enzyme from Sclerotium rolfsii.//Arch. Biochem. Biophys., 1977, 19, 959-981.

82.Halliwell G. Solubilisation of native and derived forms of cellulose by cell-free microbial enzymes/ZBiochem. J. 1966. V. 100. P.315-320.

83.Halliwel G., Riaz M. The formation of short fibers from native cellulos by components of Trichoderma koningii cellulase//Biochem. J. 1970. V.116. P. 35-42.

84.Hsu T.A., Gong C.-S., Tsao G.T. Kinetic studies of cellodextrins hydrolysis by exocellulas from Trichoderma reesie.//Biotechnol. Bioeng.,1980, 22, 2305-2320.

85.Hu, P., Kahrs, S.K., Chase, T., Eveleigh, D.E. (1992). Cloning of a Microbispora bispora cellobiohydrolase gene in Escherichia coli. Journal of Industrial Microbiology, 10, pp. 103-110.

86.1rwin, D.C. and Wilson, D.B. (1994). Charaterisation and sequence of a Thermomonospora fusca xylanase. Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 763-770.

87.Irwin, D.C., Spesio, M., Walker, L.P., Wilson, D.B. (1993). Activity studies of eight purified cellulases: specificity, synergism and domain effects. Biotechnol. and Bioeng. 42, pp. 1002-1013.

88.Karhunen E., Kantelinen A., Niku-Paavola M.L. Manganese-dependent Peroxydase from the lignin-degrading white rot fungus Phlebia radiata // Arch. Biochem. Biophys.-1990.- Vol.279, N1.-P. 25-31.

89.Karlsson, J, Medve, J, Tjerneld, F. Enzymatic hydrolysis of pretreated ligno-cellulos. Hydrilysis properties, sinergism and adsorption for EG II and CBH I of Trichoderma reesei. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Africulture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany. June, 1997.

90.Kaushik V., Bisaría V.S. Ligninases: biosynthesis and application // J. Sci. Res. -1989.-Vol.48, N 6.-P. 276-290.

91.Kersten, P.J., B. Kalyanaraman, K.E. Hammel, B. Reinhammar (1990). Comparison Lignin Peroxidase, Peroxidase a Horseradish and Laccase in Methoxybenzenes Oxidation// Biochem. J. 268:475-480.

92.Khan A.W., Lamb K.A. Use of pretreated lignocellulose for the production of cellulases.//Biotechnol. Lett.,1984, 6, N 12, 663-666.

93.King K. W. Enzymatic degradation of crystallin hydrocellulose/ZBiochem. and Biophys. Res. Communs. 1966. V. 24. N2. P.295-301.

94.Kirk, T.K., Shimada, M. Lignin biodégradation: the microorganisms involved and the physiology and biochemistry of degradation by white-rot fungi.- In: Biosynthesis and biodégradation of wood components / Ed. T. Higuchi.- San Diego, CA: Academic Press, 1985,- P. 579-605.

95.Klyosov A.A./Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation/Eds Aubert J.-P., Beguin P., Millet J.L.: Acad. Press, 1988. P. 87-89

96.Klyosov A.A., Rabinovitch M.L.Enzymatic conversion of cellulose to glucose: Present state of the art and potential//Enzyme Engineering - Future Direction. N.Y.: Plenum press, 1980, P. 83-165

97.Knowks, J., Lehtovaara, P. Cellulase families and their genes//Trends in Biotechnology. 1992.-V.5, - N 9.

98.Ladisch M.R., Lin K.W., Voloch M., Tsao G.T. Process consideration in the enzymatic hydrolysis of biomass.//Enzym. Microb. Technol., 1983, 5, 82-102.

99.Lange, N.K. (1993). Application of cellulases in the textile industry. In: Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases. Enzyme structures, Biochemistry, Genetics and Application. Proceedings of the Tricel Symposium, June 2-5, 1993, Espoo, Finland (P. Suominen and T. Reinikainen ads.) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, v.8. pp. 263-272.

100.Leonowicz, A., Edgehill, R.U., Bollag, J.-M. The effect of pH on the transformation of syringic and vanillic acides by the laceases of Rizoctonia

praticola and Trametes versicolor // Arch. Microbiol.- 1984,- Vol.137, N 2. - P. 8996.

101.Liwicki, R., Paterson, A., McDonald, M., Broda, P. Phenotypic classes of phenoloxidas negative mutants of the lignindegrading fungis Phanerocheate chrysosporium // J. Bacterid.- 1985,- Vol. 162, N 2,- P. 641-644.

102.Lund, L.R. (1990) Larg-scale fuel ethanol from lignocellulose: potentials, economics and research priorities. Appl. Biochem. Biotechnol., 24/25, 695-719.

103.Mandels M., Weber V. Production of Cellulases. Jn. Cellulases and their allication. Washington D.C., 1969. P.391.

104.Mandels M., Reese E. T. Fungal cellulase and the microbial decomposition of cellulosic fabric//Devel.Ind. Mycol.1964. V.5. N 1. P. 5-16.

105.Mattinen, M.-L., Linder, M., Lindeberg, G.,Annila, A. Structure of the cellulose binding domain of EG I from Trichoderma reesei and its interaction with soluble cellooligosaccharides// Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Africulture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany.June, 1997. P. 16.

106.Mattinen, M.-L., Konteli, M., Kerovuo, J., Lunder, M., Annila, A., Lundeberg, G., Reinikainen, T., Drakenberg, T. (1997). Three dimentional structures of three engineered the cellulose binding domain of CBH II from Trichoderma reesei. Prof. Sci., 6,1-10.

107.Meshartreei M., Saddler J. N. The nature of inhibitory materials present in pretreated lignocellulosic substrate which inhibit the enzymatic hydrolysis of cellulose.//Biotechnol. Lett., 1983, 5, N 8, 531-536.

108.Munoz C., Guillen F., Martinez A.T., Martinez M.J. Laccase isoenzymes of Pleorotus eryngyy: characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn oxydation.//Appl Environ Microbiol, 1997. Jun., 63(6), P. 2166-2174.

109.Nakansson, U., Fogerstam, L., Petterson, G. and Andersson, L. Purification and characterisation of a low molecular weight 1,4-p-glukan glucohydrolase from the

cellulolytic fangus Trichoderma viride QM 9414, Biochem. Biophys. Acta, 524, 385, 1978.

llO.Nelson M.G., Kelsey R.G., Shafizadeh F. Enhancement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulosic substrates.//Biotechnol. Bioeng., 1982, 24, 239-304.

111 .Niku-Paavola M.L., Karhunen E., Salola P., Raunio V. Ligninolytic enzymes of the the white rot fungus Phlebia radiata // Biochem.J. - 1988,- Vol.254. - P. 877884.

112.Nisizawa K. Mode of action of cellulases//J. Ferment. Technol., 1973, 51, 267304.

113.Nummi, M., Niku-Paavola, M.-L., Lappalainen, A.,Enari, T.-M. and Raunio O.V. Cellobihydrolases from Trichoderma reesei, Biochem. J., 215, 677, 1983.

114.0kazaki M., Moo-young M. Kinetics of enzymatic hydrolysis of cellulos: analytical description of mechanistic model.//Biotechnol. Bioeng., 1978, 20, 637 663.

115.Overend, R.P. and Chornet, E. Fractionation of Lignocellulosics by Steam-Aqueous Pretreatments.// Phil. Trans. R. Soc. Lond., A 321, p.523-536 (1987).

llö.Palmer J.M., Harvey P.J., Schoemaker H.E. The role of peroxidases, radical cation and oxygen in the degradation of lignin // Phil. Trans. Roy. Soc. London.-1987,- Vol. A 321, N 1561,- P.495-505.

117.Paszczynski A., Huynh V.-B., Crawford R. Comperison of ligninase-I and peroxydase-M2 from white rot fungus P.chrysosporium // Arch. Biochem. Biophys.- 1986,- Vol.244, N 2,- P.750-765.

118.Perie H., Gold M.H. Manganese regulation of Manganese Peroxydase expression and lignin degradation by the white rot fungus Dichomitus squalens // Appl. Environ. Microbiol.- 1991.- Vol.57, N8,- P.2240-2245.

119.Presutti, D.G., Stutzenberger, F.J. (1993) Characterization of Thermomonospora curvata endoglucanas, expressed in E. coli. Journal of Biotechnology, v. 29, pp. 307-320.

120.Puri, V., Mamers, H. (1983) Explosive pretreatment of lignocellulosic residues with high pressure carbon dioxide for the production of fermentation substrates. Biotechnol. Bioeng. 25: 3149-3161.

121.Reese E.T., Siu R.G.T., Levinson H.S. The bilogical degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship ti the mechanism of cellulose hydrolysis //J. Bacterid., 1960, V. 59, 485-497.

122.Reese E.T. Degradation of polymeric carbohydrates of microbial enzymes.//The structure, biosinthesis and degradation of wood. / Ed. F. Loewus. N.Y.: Plenum Press, 1977, 311-367. (Recent Adv. Phytochem.; V. 11).

123.Richard, A., Taylor, John D.(1996) Unceasing steam explosion of pulp: viable alternative for pulp non- wood filament//TAPPI Proceedings, Pulping Conference.

124.Rouvinen, J., Bergfors, T., Teeri, T.T., Knowles, J., Jones, T.A.(1990), Tree dimensional structure of CBHII from Trichoderma reesei. Science 249, 380-386.

125.Rouvinen, J.(1990) PhD Thesis University of Joensuu. Joensuu, Finland, 38 pp.

126.Ruohonen, L., Koivula, A., Reinikainen, T., Valkeajarvi, A., Teleman, A., Claeyssens, N., Szardenings, M., Jones T.A. and Teeri, T.T. (1993). In.: Trichoderma reesei and other hydrolases (Suominen, P. and Reinikainen, T. (Eds.). Fondation for Biothechnical and Industrial Fermentation Research. Helsinki. Vol 8, P. 87-96.

127.Ruy D.D.Y., Mandels M. Cellulases: biosinthesis and application//Enz. Microb. Technol., 1980, 2, 91-102.

128.Saddler, J.N., Brownell, H.H., Clermont, L.P., Levitan, N. (1982) Enzymatic hydrolysis of cellulos and various pretreated wood fraction. Biotechnol. Bioeng. 24:1389-1402.

129.Salohumo, A., Henrissant, B., Hoffren A.-M., Teleman, O. and Penttila, M. (1994). A novel small endoglucanase gene, egl5, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast. Molec. Microbiol. 13: 219-228.

130.Schulein, M.(1997) Enzymatic properties of Cellulases from Humicula Insolens. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Airiculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany.June, 1997. P. 16.

131.Schulein, M., Tikhomirov, D.F., Schou, C. (1993). Humicola insolens alkaline cellulases. In: Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases. Enzyme structures, Biochemistry, Genetics and Application. Proceedings of the Tricel Symposium, June 2-5, 1993, Espoo, Finland (P. Suominen and T. Reinikainen ads.) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, v.8. pp. 109-116.

132.Schultz, T.P., Blerman, C.J., McGinnis, G.D. (1983) Steam explosion of mixed hardwood chips as a biomass pretreatment. Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Devel. 22:344-348.

133.Shimada, M. Stereobiochemical approach to lignin biodégradation: possible significance of nonstereospecific oxydation catalyzed by laccase for lignin decoposed by white-rot fungi.- In: Lignin biodégradation: microbiology, chemistry and application / Ed. T. K. Kirk and T. Higuchi. - West Palm Beach, Fia.: CRC Press, 1980.

134.Shimizu, K., Sudo, S., Nagasawa, S., Ishikara, M. (1983). Enzymatic hydrolysis of wood. YII. Enzymatic susceptibility of autohydrolyzed woods. Mokuzai Gakkaishi 29:428-437.

135.Sinitsyn, A.P., Clesceri, L.S., and Bungay, H.R. (1982), Appl. Biochem. Biotechnol. 7, 455-458.

136.Sinitsyn A.P., Clesceri L.E., Bungay H.R. Inhibition of cellulases by impurities in steam-exploded wood.// Appl. Biochem. Biotechnol, 1984, 7, N 4,458-461.

137.Sinott, M.Z. (1990). Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 90, 1171-1202.

138.Stahlberg, J., Pivne, C., Kleywegt, G., Zou, J., Claeysson, M., Teeri, T.T. and Jones, A. Carbohydrate interactiones in the active site of CBH I, CBH II and EG I and implication for cellulose hydrolyses. Abstract of International Conferens on

Bioconversion of Sustainable, Africulture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany June, 1997.

139.Szengyel, Zs., Zacchi, G. Cellulas production: effect of acetic acid and furfural. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Africulture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany.June, 1997. P. 32.

140.Trigo, C. and Ball, A.S. (1994). Production of extracellular enzymes during the solubilization of straw by Thermomonospora fusca BD25. Applied Microbiology and Biothechnology, 41, pp. 366-372.

141.Vallander, L., Eriksson, K.-E. Enzyme recirculation in saccharification of lignocellulosic materials. Enzyme Microb. Technol., 1987, vol. 9, 7/4 - 720.

142.Wariishi H., Valli K., Gold M.H. In vitro depolymerization of lignin by Manganese peroxydase of P.chrysosporium // Biochem.Biophys. Res. Commun.-1991,- Vol.176, N1.-P.269-275

143.White A.R., Brown R.M. Enzymatic hydrolysis of cellulos: Visual Characterization of the process/ZProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. N 2. P. 1047-1051.

144.Wilson, D.B. Cellulases of Thermomonospora fusca (1988). Methods in Enzymology, v. 160, pp. 314-323.

145.Wood T.M., Mc Crae S.I The cellulas of Trichoderma kiningii: purification and properties of some endoglucanase components with special reference to then-action on cellulose and in synergism with cellobiohydrolase.//Biochem.J., 1978, 171,61-72.

146.Wood T.M., Mc Crae S.I., Wilson C.A., Bhat K.M., Goq L.A. Biochemistry and Genetics of Cellulos Degradation/Eds Aubert J.-P., Beguin P., Millet J. L.: Acad. Press, 1988. P.31-52.

147.Woode T.M. Enzymes and mechanism involved into the solubilization of native cellulose.//Cienc.Biol.,1980, 5, 27-33.

148.Woodward J., Arnold S.L. The inhibition of ß-glucosidase activity in Trichoderma reesei C-30 cellulase by derivatives and isomers of glucose.//Biotechnol. Bioeng., 1981, 23, 1553-1562.

149.Wyman, C.E. The status of the DOE/NREL ethanol for biomass project (1995). In: Biomass for Energy, Environment, Agriculture and Indastry. Proceedings of the 8th European Biomass Conference, Vienna, Ausria, 3-5 October 1994 (Chartier Ph., Beenackers A.A.C.M., Grassi G. eds.) Pergamon, v. 2, pp. 1094-1107.

150.Yaropolov, A. I., O. V. Skorobogat'ko, S. S. Vartanov H S. D. Varfolomeyev. (1994) Laccase. Properties, Catalytic Mechanism and Aplicability.//Appl. Biochem. Biotech. 49:257-280.

151.Yu, E.K.C., Levitan, N., Saddler, J.N. (1982) Production of 2,3-butanediol by Klebsialla pneumoniae grown on acid hydrolyzed wood hemicellulose. Biotechnol. lett. 4:741-746.

152.Zouari, N., J.-L. Romette and D. Thomas. (1994). Laccase Electrode for the Determination of Unceasing Flow Phenolic Composition.//Tech. Biotech. 8:503508.