Эффективность патогенетически обоснованной цитокинотерапии в комбинированном лечении больных наружным генитальным эндометриозом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Дурнева Елена Игоревна

• Дурнева Елена Игоревна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Дурнева Елена Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Актуальность проблемы наружного генитального эндометриоза. Факторы риска

1.2 Теории происхождения эндометриоза

1.3 Патогенез генитального эндометриоза

1.3.1 Изменения эндометрия у больных наружным генитальным эндометриозом

1.3.2 Анатомические и функциональные изменения строения органов малого таза при наружном генитальном эндометриозе

1.3.3 Роль гормональных нарушений в патогенезе эндометриоза

1.3.4 Генетическая предрасположенность у больных генитальным эндометриозом

1.4 Иммунологические аспекты эндометриоза

1.4.1 Врожденный иммунитет: роль КК-клеток и интерферонов

1.4.1.1 Роль КК-клеток в патогенезе эндометриоза

1.4.1.2 Интерфероны в патогенезе генитального эндометриоза

1.4.2 Адаптивный иммунитет и генитальный эндометриоз

1.4.2.1 Клеточно-опосредованный иммунитет: эффекторные Т-лимфоциты

1.4.2.2 Гуморальный иммунитет: В-лимфоциты

1.4.3 Цитокины

1.5 Микровезикулы клеточного происхождения и их роль в межклеточном взаимодействии

1.6 Патогенез боли при эндометриозе

1.7 Медикаментозная терапия эндометриоза

1.7.1 Прогестагены

1.7.2 Агонисты гонадотропин-рилизинг гормона

1.7.3 Антигонадотропины

1.7.4 Комбинированные контрацептивы

1.7.5 Ингибиторы ароматазы

1.8 Применение иммуномодулирующей терапии при наружном генитальном

эндометриозе

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Общие методы исследования

2.2 Эндоскопические методы обследования

2.3 Методика забора перитонеальной жидкости

2.4 Иммунологические методы обследования пациенток с НГЭ

2.4.1 Метод проточной цитофлуориметрии

2.4.2 Оценка субпопуляций лимфоцитов

2.4.3 Подсчет и характеристика микровезикул в периферической крови

2.5 Схемы терапии, которые были применены к пациенткам с НГЭ

2.6 Статистическая обработка полученных данных

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

3.1 Клиническая характеристика пациенток

3.1.1 Клиническая характеристика пациенток с НГЭ

3.1.2 Клиническая характеристика контрольной группы пациенток

3.2 Результаты иммунологического обследования пациенток с НГЭ

3.2.1 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания NK-клеток и активности NK-клеток периферической крови пациенток с эндометриозом

3.2.2 Оценка содержания цитокинов в перитонеальной жидкости и периферической крови пациенток с НГЭ

3.2.3 Оценка взаимосвязи между содержанием цитокинов в перитонеальной жидкости и в периферической крови у пациенток с НГЭ

3.2.4 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания NK-клеток и их способности к активации в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным IFNa-2b и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

3.2.5 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания КК-клеток и активности КК-клеток периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

3.2.6 Оценка содержания цитокинов в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным ШКа-2Ь и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

3.2.7 Оценка содержания цитокинов в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

3.3 Клиническая эффективность различных вариантов терапии НГЭ 1-11 степени

3.4 Характеристика содержания микровезикул лейкоцитарного происхождения в периферической крови больных НГЭ

3.5 Оценка содержания микровезикул в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения терапии только аГнРГ, рекомбинантным ГРКа-2Ь и аГнРГ, а также рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ

3.6 Оценка изменения содержания микровезикул в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным ШКа-2Ь и аГнРГ, а также рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ

в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и степень разработанности темы

Эндометриоз - это одно из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, основными клиническими проявлениями которого являются хроническая тазовая боль, дисменорея, диспареуния, бесплодие и дисфункция тазовых органов, что достоверно ухудшает качество жизни пациенток, оказывая негативное влияние на социальную и семейную сферы [215]. К факторам, обеспечивающим выживание, имплантацию и пролиферацию клеток эндометрия, относят гормоны, факторы роста, цитокины и простагландины, клетки иммунной системы и эндотелиальные клетки сосудов [242]. Снижение активности цитотоксических Т-клеток и NK-клеток, изменение секреции цитокинов Т-хелперами играют существенную роль в развитии и прогрессировании заболевания [128].

Лечение наружного генитального эндометриоза (НГЭ) включает комбинацию хирургического этапа и медикаментозной терапии. В настоящий момент накоплено достаточно доказательств того, что оперативное вмешательство и гормональная терапия не всегда сопровождаются эффективным устранением клинических симптомов заболевания, при этом риск рецидивов остается достаточно высоким [27,156]. Поэтому, учитывая вовлеченность клеток иммунной системы в патогенез заболевания, а также недостаточный эффект от стандартных способов терапии эндометриоза, включение в комплексное лечение таргетных иммуномодулирующих препаратов представляется актуальным.

К молекулам межклеточных взаимодействий, играющим важную роль в патогенезе данного заболевания, относят интерфероны (IFN), основными функциями которых являются модуляция работы клеток иммунной системы, регуляция апоптоза и ангиогенеза [82]. Ранее установлена эффективность человеческого IFN альфа в лечении экспериментального эндометриоза у крыс, а также изучено его влияние в различных концентрациях на рост линий клеток эндометриомы in vitro [11,79,138]. Однако только в нескольких клинических

исследованиях была оценена потенциальная роль ШКа-2Ь в терапии женщин с эндометриозом и полученные результаты носили противоречивый характер [157,256].

Полагают, что выживание и рост эндометриоидных гетеротопий в брюшной полости обусловлены нарушением их распознавания и элиминации локальными компонентами иммунной системы, такими как макрофаги и КК-клетки [248]. Известно, что положительным стимулирующим эффектом на цитотоксическую активность КК-клеток обладает рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (1Ь-2), который продемонстрировал свою эффективность в экспериментальной модели на животных при интраперитонеальном введении, а также при применении у женщин с различными формами эндометриоза, увеличивая как цитотоксическую активность КК-клеток, так и уменьшая размеры эндометриоидных очагов [14,148,253].

До настоящего времени не проводилась сравнительная оценка как клинической, так и патогенетической эффективности применения рекомбинантных ШКа-2Ь и 1Ь-2 в комплексной терапии НГЭ, а также недостаточно данных о влиянии препаратов на частоту наступления беременности у пациенток с эндометриозом и возникновение рецидивов заболевания, что требует дальнейшего изучения.

За последние 30 лет было определено множество маркеров, связанных с заболеванием, однако, ни один из них не оказался высокочувствительным и специфичным для рутинного применения в клинической диагностике [31]. По-прежнему остается актуальным поиск новых маркеров, которые помогут в ранней неинвазивной диагностике заболевания.

Одним из новых направлений становится изучение феномена образования микровезикул (МВ) эукариотическими клетками и их участие в межклеточных взаимодействиях. Микровезикулы выполняют функцию транспортеров биологически активных молекул между клетками, наряду с участием в регуляции различных процессов, в частности воспаления, гемокоагуляции, сосудистых реакций, апоптоза и клеточной пролиферации [174]. Эндометриоз

характеризуется хронической воспалительной реакцией, при развитии которой возможно образование микровезикул лейкоцитами. Исследование состава микровезикул периферической крови у больных эндометриозом, а также на фоне заместительной цитокинотерапии, представляется актуальным для понимания патогенеза заболевания и разработки новых подходов к диагностике, как самой патологии, так и для мониторинга эффективности лечения и прогнозирования риска возможных рецидивов.

Цель исследования: изучить роль цитокинов и субпопуляционного состава лимфоцитов, а также фенотипа микровезикул лейкоцитарного происхождения в патогенезе наружного генитального эндометриоза и разработать схемы патогенетически обоснованной цитокинотерапии.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать клиническое течение перитонеальных форм наружного генитального эндометриоза 1-11 степени согласно классификации г-ЛБЯМ.

2. Оценить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (ПК) и содержание цитокинов (1Ь-8, ТОТа, МСР-1, 1Р-10, RANTES) в перитонеальной жидкости (ПЖ) и в ПК у больных НГЭ.

3. Изучить изменения субпопуляционного состава лимфоцитов и цитотоксического потенциала (ЦП) КК-клеток на основании экспрессии CD107a, а также содержание цитокинов (1Ь-8, Т№а, МСР-1, 1Р-10, RANTES) в ПК женщин с НГЭ 1-11 степени до и на фоне лечения рекомбинантным IFNа-2b.

4. Определить эффективность применения рекомбинантного 1Ь-2 в составе комбинированной терапии эндометриоза на основании изменений субпопуляционного состава лимфоцитов и ЦП КК-клеток, а также содержание цитокинов (1Ь-8, Т№а, МСР-1, 1Р-10, RANTES) в ПК пациенток с НГЭ 1-11 степени распространенности.

5. Проанализировать влияние интерферонозаместительной терапии и рекомбинантного интерлейкина-2 на клиническое течение НГЭ. Сравнить эффективность применения различных схем иммуномодулирующей терапии в составе комплексного лечения по отношению к стандартной гормональной терапии аГнРГ.

6. Оценить возможность использования микровезикул лейкоцитарного происхождения в ПК в качестве маркеров неинвазивной диагностики перитонеальных форм НГЭ 1-11 степени.

7. Изучить содержание и фенотип микровезикул лейкоцитарного происхождения в ПК женщин НГЭ 1-11 степени до и после лечения рекомбинантными ШКа-2Ь и 1Ь-2.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые оценено влияние рекомбинантного ШКа-2Ь в составе комплексной терапии пациенток с НГЭ 1-11 степени на субпопуляционный состав лимфоцитов и содержание цитокинов в ПК. Впервые установлено, что применение ГРКа-2Ь у больных НГЭ сопровождалось повышением общего числа Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических и В-лимфоцитов, а также снижением содержания RANTES и Т№а в ПК по сравнению с применением стандартной гормономодулирующей терапии аГнРГ.

Показано, что применение рекомбинантного интерлейкина-2 в комплексной терапии НГЭ 1-11 степени приводит к повышению количества КК-клеток, а также их способности реагировать активацией на действие стандартного индуктора в ПК по сравнению с монотерапией аГнРГ. Впервые продемонстрировано, что применение рекомбинантного 1Ь-2 сопровождалось выраженным снижением количества хемокина RANTES в ПК, а также более высокой клинической эффективностью по сравнению с монотерапией аГнРГ.

Впервые выявлен феномен образования микровезикул лейкоцитарного происхождения в ПК пациенток с НГЭ 1-11 степени, а также определены их фенотипы и количество. Установлено, что для пациенток с перитонеальным

эндометриозом характерно повышение содержания МВ, экспрессирующих поверхностные маркеры СD14+ и СD16+, а также комбинацию антигенов СD54+CD14+ на своей поверхности. У пациенток с перитонеальным эндометриозом 1-11 степени впервые было выявлено снижение содержания в ПК МВ с фенотипом CD45+CD4+, CD3+CD4+, CD3+CD8+.

Практическое значение исследования

Доказана более высокая клиническая эффективность применения рекомбинантных IFNа-2b и 1Ь-2 в составе комбинированной терапии у больных НГЭ 1-11 степени по сравнению с терапией только аГнРГ на основании снижения интенсивности болевого синдрома и частоты рецидивирования заболевания, а также повышения частоты наступления беременности. Полученные данные обосновывают целесообразность включения в комплексную терапию заболевания патогенетически направленной иммуномодулирующей терапии.

Впервые разработаны критерии назначения иммуномодулирующих препаратов для терапии НГЭ на основании субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания КК-клеток и их способности к активации в ПК.

Впервые определено, что пациенткам с НГЭ 1-11 степени с выраженным болевым синдромом и бесплодием, у которых при анализе субпопуляционного состава лимфоцитов ПК имеется снижение содержания Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических и В-лимфоцитов, рекомендована иммуномодулирующая терапия рекомбинантным IFNa-2b в комбинации со стандартной терапией аГнРГ.

Впервые установлено, что при наличии у больных НГЭ 1-11 степени выраженного болевого синдрома и бесплодия, а также преимущественно нарушений в клеточном звене иммунитета (сниженное число КК-клеток и их способность к активации в ПК), целесообразно назначать цитокинотерапию рекомбинантным ТЬ-2 в дополнение к гормономодулирующей терапии аГнРГ.

Впервые определено, что МВ с фенотипом CD54+CD14+ могут рассматриваться в качестве неинвазивного маркера для диагностики НГЭ с чувствительностью 80,5% и специфичностью 71%.

Впервые показана эффективность применения IFNa-2b в комплексной терапии НГЭ (на основании снижения в ПК интенсивности экспрессии CD14+ на поверхности МВ в ПК) и IL-2 (за счет повышения количества МВ с фенотипом CD3+CD8+ в ПК) при сравнении с терапией только аГнРГ. Использование только гормономодулирующего препарата (аГнРГ) сопровождалось повышением в ПК интенсивности экспрессии CD14+ на поверхности МВ, отсутствием изменения МВ с поверхностными маркерами CD3+CD8+ и увеличением относительного количества МВ с фенотипами CD45+CD14+, CD45+CD56+, CD45+CD16+, CD56+CD14+, CD54+CD56+, CD54+CD14+.

Методология и методы исследования: выполнено проспективное когортное исследование с использованием системного подхода к анализу полученных данных, в котором приняли участие пациентки с НГЭ I-II степени с выраженным болевым синдромом и бесплодием, а также здоровые женщины репродуктивного возраста. В работе использованы клинико-анамнестический, эндоскопический, гистологический, иммунологический методы исследования. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA v10.0 for Windows» (StatSoft Inc., США).

Научная работа выполнена в рамках поискового научного исследования по теме «Разработка схем и патогенетическое обоснование применения иммуномодулирующей терапии у пациенток с различными формами генитального эндометриоза на различных этапах лечения» (№ гос. регистрации темы: АААА-А20-120041390031-0), а также в рамках фундаментального научного исследования по теме «Разработка стратегий диагностики, терапии генитального эндометриоза и опухолей женского репродуктивного тракта» (№ гос. регистрации темы: АААА-А19-119030490009-6).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Перитонеальный эндометриоз 1-11 степени, проявляющийся выраженным болевым синдромом и бесплодием (преимущественно первичным), характеризуется повышением в ПК числа ККТ-клеток, снижением способности КК-клеток к активации и увеличением содержания ГЬ-8 и RANTES, а также повышением числа провоспалительных цитокинов (ГЬ-8, Т№а, МСР-1, RANTES) и уменьшением количества 1Р-10 в ПЖ, что сопровождается нарушением процессов элиминации эндометриоидных гетеротопий, развитием и поддержанием хронической воспалительной реакции, как на локальном, так и на системном уровнях.

2. Применение рекомбинантных IFNa-2b и ГЬ-2 в дополнение к стандартной терапии аГнРГ у больных с НГЭ повышает эффективность проводимого лечения, уменьшая выраженность болевого синдрома, увеличивая длительность безрецидивного периода и частоту наступления беременности.

3. Клиническая эффективность применения рекомбинантного IFNa-2b совместно с гормономодулирующей терапией аГнРГ подтверждена положительным иммуномодулирующим влиянием на субпопуляционный состав лимфоцитов (повышением количества Т- и В-лимфоцитов, а также цитотоксических лимфоцитов), сохранением способности КК-клеток к активации при снижении их количества, а также уменьшением выраженности воспалительной реакции за счет снижения содержания цитокинов RANTES и Т№а в ПК.

4. Включение рекомбинантного IL-2 в комплексную терапию НГЭ совместно с аГнРГ повышает эффективность лечения за счет увеличения количества КК-клеток и их способности реагировать активацией на добавление стандартного индуктора, а также за счет снижения выраженности воспалительного процесса и ангиогенеза, проявляющихся уменьшением количества RANTES и повышением содержания антиангиогенного хемокина 1Р-10 в ПК.

5. Содержание микровезикул, присущих моноцитам с фенотипом CD54+CD14+ в плазме крови пациенток с НГЭ I-II степени, равное 5,22% или превышающее данное значение, соответствует прогнозу наличия НГЭ с чувствительностью 80,5% и специфичностью 71%.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанные методы обследования и лечения внедрены и используются в практической работе научно-консультативного отделения, гинекологического отделения II, а также гинекологического отделения с операционным блоком ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», в практическую деятельность гинекологического отделения СПб ГБУЗ «Городская больница № 26» и СПб ГБУЗ «Городская больница № 40», а также в учебный процесс кафедры и клиники акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова» Минздрава России.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эффективность патогенетически обоснованной цитокинотерапии в комбинированном лечении больных наружным генитальным эндометриозом»

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 17 Всемирном конгрессе по гинекологической эндокринологии (ISGE 2016, Italy), на Всероссийской конференции «Междисциплинарные аспекты репродуктивной медицины» (Москва, 2019), на 27 Всемирном конгрессе «The 27th world congress on controversies in obstetrics, gynecology and infertility» (Paris, 2019), на XIV Международном научном конгрессе «Рациональная фармакотерапия» (Санкт-Петербург, 2019), на X ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина - взгляд молодых» (Санкт-Петербург, 2019), на II Общероссийской научно-практической онлайн конференции «Оттовские чтения» (Санкт-Петербург, 2020), на научно-практической конференции с международным участием «Здоровье женщины, плода, новорожденного» (Санкт-Петербург, 2021), на научно-практической школе

«Гиперпролиферативные заболевания органов репродуктивной системы» (Санкт-Петербург, 2021).

По теме исследовательской работы опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи - в ведущих рецензируемых научных изданиях, в том числе 3 статьи опубликованы в ведущих изданиях, рецензируемых в международной реферативной базе данных Scopus. Автор является победителем конкурса на право получения стипендии Президента Российской Федерации молодых ученых и аспирантов (Номер стипендии СП-1900.2019.4). Подана заявка о выдаче патента на изобретение «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза» регистрационный номер 2021109986 от 09.04.2021/ Ярмолинская М.И., Дурнева Е.И., Маркова К.М., Сельков С.А., Соколов Д.И.

Личный вклад автора в работу

Автором самостоятельно проведен подбор больных, включенных в исследование, и выполнено комплексное клиническое обследование: сбор анамнеза, объективный осмотр, ультразвуковое исследование, анализ результатов лабораторных данных, а также участие в качестве ассистента в проведении лапароскопических операций. Автор принимала непосредственное участие в сборе и оценке биоматериала методом ИФА на базе лаборатории клинической иммунологии с группой по диагностике СПИД и лаборатории межклеточных взаимодействий. Автором самостоятельно осуществлялся мониторинг пациенток, получавших иммуномодулирующую терапию в течение 1,5 лет после проведенного оперативного вмешательства, систематизация, статистическая обработка и анализ полученных данных, сформулированы выводы и предложен комплекс мероприятий, повышающий эффективность диагностики и лечения больных перитонеальным эндометриозом I-II степени распространенности.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и содержит: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, клиническую характеристику групп обследованных пациенток, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации. Библиографический указатель включает 268 источников литературы, из которых 24 отечественных и 244 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Актуальность проблемы наружного генитального эндометриоза.

Факторы риска

Эндометриоз является хроническим, воспалительным, эстрогензависимым заболеванием, которое характеризуется ростом ткани подобной эндометрию за пределами полости матки. Эндометриоидные гетеротопии обычно располагаются на тазовой брюшине, яичниках и в ректовагинальной перегородке, а также могут встречаться в перикарде, плевре и даже в головном мозге [103]. Для женщин с эндометриозом характерно снижение качества жизни за счет учащение случаев депрессии, неблагоприятного влияния заболевания на интимные отношения, снижение социальной активности, производительности и связанного с этим дохода. Более того, новые данные показывают, что заболевание связано с повышенным риском акушерских и неонатальных осложнений [10]. Эта патология также наблюдается у 30% всех женщин с бесплодием [119].

Эндометриоз ассоциируется с такими симптомами как дисменорея, диспареуния, хронические боли в области таза, дисхезия, что ухудшает качество жизни женщины. Таким образом, наружный генитальный эндометриоз имеет настолько распространенные последствия, что его описывают как «чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения», требующую междисциплинарного подхода с применением комбинированных методик [119].

В настоящее время репродуктивные возможности женщин характеризуются уменьшением возраста наступления первой менструации, увеличением возраста наступления первой беременности, уменьшением количества беременностей и продолжительности лактации. Это способствует увеличению общего числа овуляций и менструаций у женщины в течение репродуктивной жизни [88] что, вероятно повышает риск возникновения эндометриоза. Была подтверждена роль овуляции в генезе эндометриоза яичников. Было продемонстрировано, что эндометриомы развиваются из фолликула сразу после овуляции путем прямого перехода от геморрагического желтого тела [42]. Также риск возникновения

эндометриоза увеличивается у пациенток, у которых в семье имелись случаи этого заболевания, имело место ранее наступление менархе, которые имеют короткий или длинный менструальный цикл, а также у которых в анамнезе имелись внутриматочные вмешательства [98].

Несмотря на многолетнюю историю изучения данного заболевания, вопрос о происхождении и патогенезе эндометриоза по-прежнему остается спорным.

1.2 Теории происхождения эндометриоза

Превалирующей теорией происхождения эктопических очагов, является имплантационная, предложенная Sampsоn в 1927 г. Он предположил, что эндометриальные клетки, путем рефлюкса попадая в брюшную полость, могут адгезироваться и имплантироваться в мезотелий брюшины, и, в конечном итоге, превращаться в эндометриодные поражения, которые располагаются и на поверхности яичников и в Дуглассовом пространстве [221]. Эта теория подтверждается данными, что женщины с эндометриозом имеют больший объем рефлюксной крови во время менструации по сравнению с женщинами без данного заболевания [122]. Кроме того, эндометриоз встречался у бабуинов, которым в ходе эксперимента была выполнена окклюзия шейки матки, чтобы предотвратить антеградную менструацию [68].

Гипотеза о том, что эндометриоз может возникать из целомического эпителия, была впервые описана в начале 1920-х годов. «Метаплазия» представляет собой процесс, посредством которого тип клеток (например, мезотелий) трансформируется в альтернативный тип клеток (например, эпителий эндометрия). При эндометриозе, однако, точные воспалительные «индукторы» метаплазии неизвестны. В своей работе Мацузаки утверждает, что метаплазия, скорее всего, может объяснить происхождение глубокого инфильтративного эндометриоза в ректовагинальной перегородке, но это явление вряд ли будет доминирующим механизмом для поверхностных поражений брюшины [166].

Эндометриоз также был выявлен в местах, удаленных от таза, включая брюшные лимфатические узлы, легкие, плевру, головной мозг. Теория

метастазирования предполагает, что ткань эндометрия во время менструации перемещается из полости матки в дозорные лимфатические узлы и оттуда через лимфатические каналы и вены до отдаленных мест [100]. Подобный «метастатический» механизм, при котором стволовые клетки, полученные из костного мозга, играют важную роль в развитии и прогрессировании эндометриоза, был описан Хью Тейлором и его группой [197].

Ни одна из теорий, описанных выше, не способна до конца объяснить развитие эндометриоза. Ретроградная менструация кажется универсальным явлением, однако у всех женщин происходят менструации, но далеко не у каждой (7-15%) возникает заболевание. Наличие внематочного эндометрия должно сопровождаться дополнительными факторами для того, чтобы болезнь развивалась. Биохимические и молекулярные аберрации в эутопическом эндометрии, аномальная чувствительность к стероидным гормонам, неадекватный иммунный ответ, пороки развития матки, провоспалительная среда перитонеальной жидкости и генетическая предрасположенность - все факторы, которые в конечном итоге могут быть вовлечены в развитие и прогрессирование данного заболевания.

1.3 Патогенез генитального эндометриоза

1.3.1 Изменения эндометрия у больных наружным генитальным эндометриозом

Эутопический эндометрий у женщин с эндометриозом отличается от эндометрия женщин без заболевания. Это говорит о том, что первичный дефект в эутопическом эндометрии является пусковым фактором для развития заболевания. Активация антиапоптотического гена BCL-2 (B-cell lymphoma 2, В-клеточная лимфома 2) показана как в эутопическом, так и на эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом. В дополнение к уменьшенному апоптозу, усиленная пролиферация может способствовать выживанию эндометрия вне полости матки женщин, предрасположенных к эндометриозу. Таким образом,

рефлюкс фрагментов измененного базального эндометрия в брюшную полость или его проникновение в глубину стенки миометрия с последующим инфильтративным ростом и хроническим воспалением, приводят к образованию эндометриоза или аденомиоза [45].

1.3.2 Анатомические и функциональные изменения строения органов малого таза при наружном генитальном эндометриозе

Относительная неспособность очищать брюшину от рефлюксного эндометрия может ухудшаться за счет определенных анатомических особенностей, которые увеличивают ретроградную менструацию у пациенток с эндометриозом. К ним относятся пороки развития матки, нарушающие нормальную антеградную менструацию, волнообразные сокращения тубулярной мускулатуры и миометрия, повышенное давление в маточно-трубном переходе. Менструации у женщин с эндометриозом часто бывают дольше и тяжелее, а циклы имеют тенденцию быть короче, что также способствует развитию заболевания [88].

1.3.3 Роль гормональных нарушений в патогенезе эндометриоза

Хорошо известно, что развитие эндометриоза тесно связано с метаболизмом стероидных гормонов. 17^-Эстрадиол (Е2) является ключевым гормоном для роста эндометриоидной ткани, а также связанных с этим воспаления и боли. Эстрадиол в основном вырабатывается локально в эндометриоидной ткани. Образование эстрогенов из андрогенов инициируется ферментом ароматазой Р450. Этот фермен экспрессируется в ряде тканей человека, включая яичник и жировую ткань, но в норме не синтезируется в эндометрии. Тем не менее, этот фермент был найден в эндометриоидных гетеротопиях и в эндометрии женщин с эндометриозом [45]. Кроме того, эндометриоидная ткань имеет дефицит фермента 17^-гидроксистероиддегидрогеназы (17P-HSD) типа 2, который обычно превращает сильный эстроген 17^-эстрадиол в слабый эстрон. Следовательно,

этот защитный механизм, который снижает уровень эстрадиола, нарушается при эндометриозе. Это подтверждается наличием более высокого уровня Е2 у женщин с эндометриозом по сравнению с контролем [25]. Местная выработка эстрогенов ускоряет синтез простагландина Е2 (PGE2), стимулируя активность циклооксигеназы тип 2 (ЦОГ-2), тем самым создавая петлю положительной обратной связи повышенного образования эстрогена и усиления воспаления. В свою очередь повышенное количество PGE2 стимулирует ароматазную активность, которая играет ключевую роль в развитии эндометриоза [206]. Клиническая значимость этих результатов подтверждается успешным лечением агрессивного случая эндометриоза в постменопаузе с использованием ингибитора ароматазы, и положительный эффект нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) для лечения болевого симптома [209].

Роль прогестерона в развитии эндометриоза на настоящий момент остается не до конца изученной. В исследованиях продемонстрировано, что, несмотря на достаточную продукцию прогестерона эндометриодной гетеротопией, экспрессия рецепторов к данному гормону более низкая по сравнению с эндометрием женщин из группы контроля. Это объясняет характерную для эндометриоза резистентность к этому гормону и его недостаточную эффективность в подавлении эстрогенов [201]. Показано, что прогестерон в эндометриоидных очагах способен превращаться в менее биологически активную форму, которая имеет сниженную чувствительность к прогестероновым рецепторам, 20а-гидроксипрогестерон (20а-ОНР), это, в свою очередь, усиливает влияние эстрогенов [202].

В последние годы нарушения в экспрессии изоформы рецептора прогестерона все чаще связывают с измененным действием прогестерона. Влияние прогестерона на клетки-мишени обусловлено наличием двух форм его рецептора - рецептора В (PR-B) и рецептора А (PR-A), который подавляет действие РЯ-Б. В работе А1йа et а1. показано, что уровни транскриптов РЯ-Б были заметно снижены при эндометриоидных поражениях. Поэтому одной из возможных причин развития устойчивости к прогестерону является изменение

соотношения между «ингибиторной» изоформой (PR-A) и «активирующей» изоформой (PR-B) прогестероновых рецепторов [201].

1.3.4 Генетическая предрасположенность у больных генитальным эндометриозом

Недавние исследования показали, что эндометриоз имеет многофакторную этиологию, причем генетические факторы играют одну из важных ролей в патогенезе заболевания. Исследования по изучению семейного эндометриоза, а также близнецов с данным заболеванием показали, что генетическая предрасположенность играет центральную роль в возникновении, развитии и рецидиве заболевания. Следует обращать внимание на наличие НГЭ у родственников первой линии родства, так как такие пациентки имеют более высокий риск его развития по сравнению с населением в целом. Наследственные формы заболевания имеют более раннее начало, тяжелое течение, повышенный риск к формированию эндометриодных инфильтратов, а также наличие экстрагенитальных форм, и, что важно, устойчивы к терапии. Эти факторы важно учитывать при составлении плана ведения таких пациенток [10].

Исследование монозиготных близнецов показало высокую степень конкордантности по эндометриозу. Тем не менее, сообщения о семейном характере заболевания являются спорными при тщательном рассмотрении. Хотя различные списки генов-кандидатов и их полиморфизмы, участвующие в развитии эндометриоза были опубликованы, в выявлении генетических вариантов, предрасполагающих к эндометриозу, наблюдается незначительный прогресс [198].

1.4 Иммунологические аспекты эндометриоза

Полагают, что в патогенезе наружных форм эндометриоза важную роль играет, как нарушение надзорных функций иммунной системы в целом, так локальное взаимодействие отдельных ее компонентов с патологически

измененными клетками эндометрия, поскольку доказана важная роль иммунной системы в контроле пролиферации/дифференцировки клеток и процессов инфильтративного роста любой ткани. Как только клетки эндометрия достигают брюшной полости у здоровых женщин не происходит их имплантации, а они устраняются системой «иммунного надзора» за счет индукции апоптоза [189]. Полагают, что у женщин с эндометриозом изменения, как в клеточно-опосредованном, так и гуморальном иммунном ответе могут способствовать развитию болезни [128]. Эти изменения, вероятно, способствуют тому, чтобы клетки эндометрия достигли брюшной полости и имплантировались там, а также поддерживают дальнейшее развитие эндометриоидных гетеротопий [189].

Описаны функциональные изменения иммунологических компонентов перитонеальной жидкости и периферической крови женщин с эндометриозом, таких как моноциты/макрофаги, естественные киллерные клетки (КК), Т- и В-лимфоциты, цитокины [128]. Однако роль этих изменений в развитии заболевания до конца не ясна [115].

1.4.1 Врожденный иммунитет: роль NK-клеток и интерферонов 1.4.1.1 Роль NK-клеток в патогенезе эндометриоза

КК-клетки представляют собой лимфоциты, способные элиминировать клетки-мишени без предварительной иммунизации и секретировать цитокины, участвующие в формировании адаптивного иммунного ответа. КК-клетки выполняют цитотоксические и цитокин-продуцирующие функции в отношении клеток, лишенных молекул главного комплекса гистосовместимости I класса (МНС-1) на поверхности мембраны, являясь одним из важнейших компонентов клеточного врожденного иммунитета [189]. КК-клетки формируются в результате дифференцировки лимфобластов и не имеют Т-клеточных рецепторов или поверхностных иммуноглобулинов. КК-клеток несут на своей поверхности молекулы СD16, СD56. КК-клетки с фенотипом CD56dlm/CD16+ клетки, демонстрируют высокий цитотоксический потенциал, составляют

приблизительно 90% всех циркулирующих NK-клеток. NK-клетки с фенотипом CD56bnght/CD16- играют регуляторную роль, продуцируя большое количество цитокинов, включая интерферон гамма (LFNy) и TNFa (tumоr necrоsis factor alfa, фактор некроза опухоли альфа) [69]. Механизмы цитотоксичности включают индукцию апоптоза в клетках-мишенях путем высвобождения содержимого цитолитических гранул (перфорина и гранзина) или при помощи FasL (лиганд для рецептора Fas, экспрессируемый на поверхности клетки) - опосредованного механизма за счет активности проапоптотического рецептора Fas (рецептор суперсемейства TNFa) (CD95) [142,199]. Преобладание одного из механизмов цитотоксичности, связанного с апоптозом или лизисом клеток-мишеней, имеет большое значение в реализации патологического процесса при многих заболеваниях.

Принято считать, что эндометриоидные гетеротопии мало подвержены апоптозу [212]. Предполагают, что одной из возможных причин «избегания» клеток эндометриоидных гетеротопий элиминации NK-клетками, является сниженная цитотоксическая активность естественных киллеров, которая впервые описана Ооsterlynck et al. (1991) и коррелирует со стадиями заболевания [263]. Это состояние наиболее характерно для NK-клеток в перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом, но также наблюдается и в периферической крови [128] (таблица 1). Механизмы нарушения функции NK-клеток при эндометриозе неясны. Предполагают, что система обнаружения поврежденных клеток включает в себя различные активирующие KAR (Killer Activatton Receptors) и ингибирующие KIR (Killer Ingibitory Receptors) рецепторы, координация которых регулирует активность NK-клеток. По-видимому, запуск цитотоксической реакции NK-клеток определяется балансом между сигналами активации и ингибирования [60].

Таблица 1 - Характеристики NK-клеток у пациенток с эндометриозом

Тип NK-клеток Характеристика NK-клеток

Количество Цитотоксическая активность

NK-клетки периферической крови Не различается по сравнению с пациентками без эндометриоза [41,153,179] Снижена [131,264]

NK-клетки перитонеальной жидкости Не различается по сравнению с пациентками без эндометриоза [133,153,193] Снижена [78,132]

Маточные NK-клетки Повышено количество в секреторную фазу менструального цикла за счет незрелых КК-клеток [121,132] Повышена [121]

Ранее установлено увеличение экспрессии KIR на поверхности перитонеальных NK-клеток у женщин с эндометриозом, что могло быть причиной уменьшения активности NK-клеток у этих пациентов [132]. Сниженная цитотоксическая функция NK-клеток может объяснить возможность эндометриоидных клеток избегать элиминации и способствовать их адгезии и пролиферации. Вероятно, нарушенная функция NK-клеток является следствием хронической воспалительной реакции окружающей среды, связанной с развитием эндометриоза [248]. Было показано, что как интерлейкин-6 (Interleukin, IL-6), так и трансформирующий фактор роста (Transforming growth factor beta, TGF-^1) в брюшной жидкости у женщин с эндометриозом снижают цитотоксическую активность NK-клеток [26, 121].

В одной из работ оценивали лиганды для NKG2D: MICA (MHC class I chain related proteins), MICB и ULBP-2 (UL16 binding protein) в перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом. Авторы выявили более низкую экспрессию лигандов для NKG2D на поверхности эндометриоидных клеток, что было расценено как возможность эндометриодных клеток избегать элиминации NK-клетками [226].

Было показано, что NK-клетки важны для взаимодействия между врожденным и адаптивным иммунным ответом и что они имеют разные подтипы. NKT-клетки - это особая популяция лимфоцитов, которые экспрессируют как

маркеры КК-клеток (CD16+, CD56+), так и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3+, CD4+). Подобно гранулоцитам и КК-клеткам, КККТ-клетки одними из первых реагируют на проникновение в организм чужеродных агентов. В то же время, подобно Т-лимфоцитам, КККТ-клетки участвуют в распознавании аутоантигенов и чужеродных антигенов [239]. Среди КККТ-клеток различают 2 типа. Роль КККТ-клеток I типа в противоопухолевом иммунном ответе заключается в активации КК-клеток и CD8+ Т-лимфоцитов (Т-киллеры) за счет секреции ШКу, а также активации дендритных клеток и синтеза ими 1Ь-12 и 1Ь-2. КККТ-клетки II типа участвуют в супрессии противоопухолевого иммунного ответа за счет продукции 1Ь-13, который активирует ряд сигнальных путей, что приводит к подавлению активности CD8+ Т-лимфоцитов. ККТ клетки II типа могут подавлять активность клеток I типа [1]. Несмотря на растущее внимание к участию ККТ-клеток в развитии эндометриоза, на настоящий момент существует очень ограниченное число работ по изучению их роли в патогенезе заболевания. Так в одном исследовании показано снижение содержания ККТ-клеток как в периферической крови, так и в перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом по сравнению с группой здоровых женщин. Кроме того, число ККТ-клеток было обратно пропорционально связано со стадией эндометриоза, предполагая, что ККТ-клетки могут играть, по крайней мере, частично, защитную роль, предотвращающая ухудшение заболевания [184].

КК-клетки матки (иКК) представляют собой отдельную субпопуляцию КК-клеток, расположенных в эутопическом эндометрии, и выполняющих специфичные функции. Во время пролиферативной фазы число этих клеток снижено, но заметно возрастает в постовуляторную фазу цикла [220]. На этой стадии менструального цикла количество клеток иКК резко увеличивается за счет миграции из периферической крови и дифференцировки из гемопоэтических стволовых клеток [52,86]. На ранних сроках беременности иКК-клетки накапливаются в виде плотного инфильтрата вокруг клеток трофобласта [158, 223,257]. Активированные иКК клетки продуцируют ангиогенные факторы (VEGF, ANG2), которые способствуют ремоделированию спиральных артерий,

секретируют цитокины (ОМ-СБЕ, СБЕ-1, ЮТа, TGFp, ЬШ, 1Ь2, CXCL10, СХЫ2), которые направляют миграцию и инвазию трофобласта и напрямую взаимодействуют с антигенами трофобласта [65]. С другой стороны, субпопуляция клеток иКК с фенотипом С056^С016+ проявляет цитотоксическую активность в отношении вневорсинчатого трофобласта и аутологичного эндометрия, что может способствовать нарушению имплантации. [75] Обнаружено, что снижение цитотоксичности иКК-клеток в секреторную фазу циклу, вероятно, облегчает имплантацию эмбрионов и создает подходящую среду для развивающейся плаценты [258]. Только несколько исследований изучили изменения количества иКК-клеток при эндометриозе, демонстрируя более низкий процент CD56+ КК-клеток и дефект активности КК-клеток в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом. В эутопическом эндометрии женщин с НГЭ было обнаружено большее число незрелых иКК-клеток по сравнению с контролем, что, вероятно, способствует аномальному развитию эндометрия, патологической плацентации, увеличению неудач имплантации и плохие исходы беременности, которые часто встречаются у женщин с эндометриозом [127] (таблица 1). Также у женщин с эндометриозом и бесплодием или потерей беременности иКК-клетки имели повышенную экспрессию маркеров цитотоксичности (CD16 и ККр46), в сравнении с пациентками с эндометриозом, которые не имели бесплодия [55].

Клетки эндометрия, полученные у женщин с эндометриозом, обладают подавляющим влиянием на функцию КК-клеток по сравнению с этими же клетками, полученными от женщин без данного заболевания. Вероятно, что микросреда матки оказывает значительное воздействие на функцию иКК у женщин с эндометриозом [55].

Учитывая, что сниженная цитотоксическая функция КК-клеток ПК и ПЖ -один из ключевых аспектов патогенеза эндометриоза, активация цитотоксичности КК-клеток, в том числе цитокинами, возможно, будет являться новой стратегией в лечении эндометриоза.

1.4.1.2 Интерфероны в патогенезе генитального эндометриоза

Интерфероны (^К) принадлежат к семейству цитокинов, среди которых выделяют две группы: тип I (а и в) и тип II (у). Помимо модулирующего действия на иммунную систему, эти цитокины проявляют ряд биологических эффектов, таких как ингибирование пролиферации клеток, регуляция дифференцировки клеток и индукция апоптоза. Интерфероны а/р обладают выраженным иммунорегуляторным действием: индуцируют экспрессию молекул МНС I класса, модулируют продукцию антител, повышают клеточную цитотоксичность Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток [129]. Интерфероны I типа также стимулируют синтез хемокинов - МСР-1 (mоnоcyte Летоайга^аП рг^ет 1, моноцитарный хемотаксический протеин-1), МСР-3 и 1Р-10 (ШКу -inducible prоtein, интерферон у индуцированный протеин) эндотелиальными клетками, необходимых для привлечения в локусы инфекции моноцитов/макрофагов, КК-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов [5]. Описанные биологические эффекты ШКа являются многообещающими в поиске новых подходов в лечении эндометриоза, так как он оказывает иммуномодулирующее действие на различные компоненты иммунной системы, которые вовлечены в патогенез данного заболевания [138].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дурнева Елена Игоревна, 2021 год

Г - Л

1 подгруппа: 32 паинентш с НГЭ 1-11 степени,

которые получали аГнРГ -совместно с 1РХа-2Ь.

2 подгруппа: 30 папненток с НГЭ 1-И степени, которые получали аГнРГ совместно с ГЬ-2.

3 подгрупп! (сравнения) 35 гтаиненток с НГЭ III степени, которые получали только аГнРГ

Рисунок 1 - Дизайн исследования

2.1 Общие методы исследования

Для оценки тяжести НГЭ и распространённости спаечного процесса была использована пересмотренная классификация американского общества фертильности r-ASRM (American Society for Reproductive Medicine) [216].

Для оценки данных о болевом синдроме на протяжении всего менструального цикла была применена визуально-аналоговая шкала боли (ВАШ). Данная шкала оценивает болевой синдром во время и вне менструаций, а также при половой жизни. При этом для оценки интенсивности болевого синдрома используется бальная шкала от 0 до 10 баллов, где 0 - отсутствие болей, 10 -нестерпимые боли, которые с трудом купируются нестероидными противовоспалительными препаратами и приводят к социальной дезадаптации на момент приступа [234]. Так как терапия аГнРГ сопровождалась аменореей, оценить выраженность дисменореи не представлялось возможным, поэтому данный параметр не вошел в оценку.

2.2 Эндоскопические методы обследования

Все лапароскопические вмешательства и обследования проводились при помощи оборудования и инструментов фирмы «Karl Storz» (Германия). В асептических условиях, под общей анестезией под эндотрахеальным наркозом, в брюшной полости при помощи иглы Вереша формировался карбоперитонеум углекислым газом до уровня 12 мм рт.ст. после чего, в нижнем полюсе пупочного кольца устанавливался 12 мм троакар для видеомониторинга и 2 троакара слева и справа диаметром 5 мм. Дальнейшая подача и регуляция давления в системе поддерживалась автоматически при помощи инсуфлятора. Гемостаз обеспечивался биполярной и ультразвуковой коагуляцией.

Во время лапароскопии проводилась ревизия органов брюшной полости и малого таза справа налево и по часовой стрелке толстая кишка с аппендиксом, печень, желчный пузырь, желудок, большой сальник, диафрагма. Далее осматривались органы репродуктивной системы: оценивали цвет брюшины,

консистенцию матки, наличие миоматозных узлов и узлов аденомиоза, переднематочное пространство на предмет наличия инфильтратов и поражений мочевого пузыря, позадиматочное пространство, париетальная брюшина, тщательному осмотру подвергались также маточные трубы и яичники.

За сутки до оперативного вмешательства производился забор венозной крови у пациенток, с последующим центрифугированием в течении 15 минут при 200 g, затем сыворотка разливалась в пластиковые микропробирки объемом 0,5 мл и хранилась при температуре -20°С не более 6 месяцев до начала исследования.

2.3 Методика забора перитонеальной жидкости

Через троакар диаметром 5 мм вводилась аспирационная игла, соединенная со стерильным шприцом, емкостью 20,0 мл. После чего путем подтягивания поршня шприца производился забор перитонеальной жидкости. Далее полученный материал перемещался в стерильную пробирку и центрифугировался в течение 20 минут при 200 g в центрифуге, затем разливался в пластиковые микропробирки емкостью 0,5 мл и замораживался при температуре -20°С.

Затем выполнялся непосредственно хирургический этап, который включал в себя разделение спаек и коагуляцию очагов эндометриоза.

2.4 Иммунологические методы обследования пациенток с НГЭ

Иммунологические тесты проводили в лаборатории клинической иммунологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (руководитель - з.д.н. РФ, д.м.н., профессор С.А.Сельков).

Перед проведением оперативного вмешательства и через 6 месяцев после начала лечения в ПК определяли уровни цитокинов - Ш-8, 1Р-10, Т№а, МСР-1, RANTES. Следует отметить, что в ПЖ определение перечисленных цитокинов проводили только до начала лечения, ввиду невозможности проведения повторной инвазивной диагностики и получения образцов перитонеальной

жидкости после проведения курса терапии. Концентрацию цитокинов определяли с помощью метода CBA (Cytometry Bead Analisys) с использованием тест-систем (Becton Dickinsоn (BD), США) при помощи проточного цитофлуориметра FaCSCanto II (BD, США).

2.4.1 Метод проточной цитофлуориметрии

Исследование проведено при участии С.В. Чепанова (к.м.н., ст. научный сотрудник группы протеомной иммунорегуляции отдела иммунологии и межклеточных взаимодействий ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта») и А.В. Селютина (к.б.н., ст. научный сотрудник лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД отдела иммунологии и межклеточных взаимодействий ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта»).

Для определения цитокинов в периферической крови и перитонеальной жидкости был использован метод мультиплексного анализа и проточной цитофлуориметрии, для которого применялись стандартные тест-системы BD Cytometric Bead Array (СВА) (BD, США) и проточный цитофлюориметр FaCSCanto II (BD, США).

Метод проточной цитофлуориметрии состоит из:

Подготовительного этапа:

1. Для анализа использовали стандартные наборы: Human Sоlube Protein Flex Set Assay BD (США) и наборы для определения цитокинов: BD CBA human TNFa, Flex Set, BD CBA human IL-8 Flex Set, BD CBA human RANTES Flex Set, BD CBA human IP-10 Flex Set, BD CBA human MCP-1 Flex Set.

2. Надосадочную жидкость плазмы или ПЖ в объеме 50 мкл помещали в пробирку и центрифугировали (200 g) в течение 5 минут.

3. 50 мкл образцов с известным содержанием цитокинов помещали в контрольные пробирки, содержащие микробусы с дискретной флюоресценцией, имеющие на своей поверхности антитела к исследуемым цитокинам.

4. Подготовленные пробирки с микробусами и образцами инкубировали в течение трех часов в защищенном от света месте. В каждую пробирку

добавляли смесь проявляющих антител к каждому из исследуемых цитокинов.

5. После инкубации в каждую пробирку добавляли по 1 мл буферного раствора и центрифугировали при 200g в течение 5 минут для осаждения микробус.

6. Аккуратно производили забор полученных надосадков, микробусы разводили их буферным раствором.

Этап регистрации полученных данных проводили при помощи проточного цитометра FaCSCanto II (BD, США). Предварительно, для калибровки цитометра и адекватной оценки результатов, использовали стандартный набор контрольных реагентов с известным содержанием анализируемых цитокинов перед каждым исследованием.

Этап обработки полученных данных проводили при помощи компьютерной программы FaCSDiva (BD, США).

2.4.2 Оценка субпопуляций лимфоцитов

Перед оперативным вмешательством и через 6 мес. после проведенной терапии в периферической крови пациенток определяли субпопуляционный состав лимфоцитов, содержание и способность NK-клеток к активации на проточном цитофлуориметре FacsCanto II (Beckton Dickensоn (BD), США). Исследование методом проточной цитометрии производили стандартным методом в общей фракции мононуклеарных клеток. С помощью стандартных наборов (BD, США) определяли абсолютное и относительное содержание лимфоцитов с фенотипом CD3+ (Т-лимфоциты), CD3+CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD19+ (В-лимфоциты), CD16+CD56+ (NK-клетки). NK-клетки выделяли по фенотипу CD3-CD16+CD56+, NKT-клетки по фенотипу CD3+CD16+CD56+. Для анализа способности NK-клеток к активации мононуклеары периферической крови выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (Sigma, США) стандартным методом. Затем мононуклеары инкубировали в пробирке 3 ч в культуральной среде RPMI-1640

(Sigma, США), 10%ТС (Sigma, США), 1% стрептомицина и пенициллина (Sigma, США), 1% глютамина (Sigma, США) во влажной атмосфере при 37°С и 5% CO2 в концентрации 1 млн. клеток/мл. Для оценки дегрануляции клеток использовали метод, предложенный G. Alter и соавт. [32]. Часть клеток от каждой пациентки инкубировали в присутствии антител к CD107a (BD, США) и 8 мкг/мл монензина (BD, США). Вторую часть клеток от тех же пациенток инкубировали в присутствии антител к CD107a, 8 мкг/мл монензина и стандартного реагента для активации лейкоцитов. Затем оценивали количество NK-клеток периферической крови, экспрессирующих CD107a-гликопротеин, ассоциированный с лизосомальными мембранами, отражающий степень активации NK-клеток в случае экспрессии их на поверхности клеточной мембраны. Активированные NK-клетки были разделены на спонтанно активированные (NKA-), то есть которые экспрессировали CD107a без воздействия реагента для активации, и индуцировано активированные (NKA+), которые соответственно экспрессировали этот антиген после добавления стандартного индуктора. Экспрессия CD107a характеризует процесс активации NK-клеток, сопровождающийся дегрануляцией лизосом с последующим экспонированием на поверхности клеток LAMP-белка (Lysоsоmal assоtiated membrane protein).

2.4.3 Подсчет и характеристика микровезикул в периферической крови

Исследование проведено при участии К.Л. Марковой (мл. научный сотрудник лаборатории межклеточных взаимодействий отдела иммунологии и межклеточных взаимодействий ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта»).

Для выделения микровезикул использовали метод, описанный авторами Gelderman M. и Semak J. [116]. Все растворы для работы с микровезикулами были заранее профильтрованы через ультрафильтр с диаметром пор 0,2 мкм (^ming, США).

Для длительного хранения микровезикул (МВ), полученных из периферической крови, был использован метод криоконсервации плазмы. Хранение образцов производили в сосуде Дьюара при -196°С. Разморозку

образцов плазмы, хранящихся в жидком азоте, осуществляли незамедлительно. Процедуру проводили на водяной бане при 37°С. Далее полученную плазму центрифугировали в течение 20 минут при 19800g +10°С с целью осаждения микровезикул (МВ). Далее полученные МВ отмывали холодным раствором Хенкса без CaCl2 (Sigma, США), содержащим гепарин натрия в концентрации 30 Ед/1 мл раствора, путем центрифугирования в течение 20 минут при 19800g+10°C. Полученный осадок МВ ресуспендировали в растворе Хенкса («БиолоТ» Россия), содержащего 0,35% сывороточного альбумина (Sigma, США) и гепарин натрия в концентрации 30 Ед/1мл раствора, и обрабатывали антителами к CD4, CD3, CD8, CD45, CD41a, CD14, CD54, CD16 и CD56 в соответствии с указаниями производителя. В работе была проанализирована экспрессия указанных маркеров, как по отдельности, так и в различных комбинациях. Оценку экспрессии указанных маркеров производили при помощи проточного цитофлюориметра BD FACS Canto II (BD, США). Гейт МВ по показателям светорассеяния выделяли при помощи полистироловых бус, калиброванных по размерам 1,0 мкм и 0,2 мкм (Invitrogen, США). Окрашивание антителами к CD41a использовали для отделения тромбоцитов и их МВ, оценка которых не входила в задачи данного исследования.

2.5 Схемы терапии, которые были применены к пациенткам с НГЭ

Всем пациенткам с НГЭ после операции назначали агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) (Бусерелина ацетат, Фарм-синтез АО (Россия)) в течение 6 месяцев (1 инъекция в 28 дней). В дальнейшем больные были разделены на три подгруппы. Первую подгруппу составили 32 пациентки с НГЭ I-II степени, которым одновременно с первой инъекцией аГнРГ назначали рекомбинантный а-2Ь-интерферон в свечах (Виферон, Ферон ООО (Россия)) 3 млн. Ед ректально 2 раза/день в течение 10 дней, затем после 10-дневного перерыва проводили повторный курс иммуномодулирующей терапии. Вторую подгруппу составили 30 больных НГЭ I-II степени, которым одновременно с первой инъекцией аГнРГ назначали рекомбинантный IL-2 (Ронколейкин,

Биотех) в дозе 500000 МЕ/мл в виде трехкратной внутривенной инфузии каждые 48 ч капельно в 400 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Третью подгруппу (сравнения) составили 35 человек, которые получали только терапию аГнРГ в течение 6 мес.

2.6 Статистическая обработка полученных данных

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов непараметрического анализа. Накопление, корректировка, систематизация исходной информации и визуализация полученных результатов осуществлялись в электронных таблицах Micrоsоft Оffice Excel 2007. Статистический анализ проводился с использованием программы STATISTICA v. 10.0 (Statsoft Inc., Tulsa, США). Критический уровень достоверности нулевой гипотезы принимали равным вероятности не менее 95% (p<0,05). Определение достоверности различий между качественными показателями сравниваемых групп проводили с помощью критерия х2 (хи-квадрат) с учетом поправки Йетса для сравнения частот бинарного признака в двух несвязанных группах парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений. Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению, для этого использовали критерий Шапиро-Уилка (при числе исследуемых менее 50). Совокупности количественных показателей, распределение которых не отличалось от нормального, описывали при помощи среднего и ДИ 95%, а в случае не нормального распределения - значений медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1;Q3). Для сравнения независимых совокупностей использовали t-test и U-критерий Манна-Уитни. Для исследования динамики изменения показателей внутри групп использовали W-критерий Уилкоксона для зависимых выборок. Для выявления взаимосвязи между количественными показателями использовали непараметрический коэффициент корреляции Спирмена.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

3.1 Клиническая характеристика пациенток 3.1.1 Клиническая характеристика пациенток с НГЭ

У всех пациенток основной группы интраоперационно был установлен диагноз наружный генитальный эндометриоз, что было подтверждено при гистологическом исследовании. При использовании классификации r-ASRM у данной группы больных выявлено, что НГЭ I степени встречался у 43,3% (42) больных, НГЭ II степени - у 56,7% (55) пациенток. У всех женщин были оценены особенности менструального цикла. Средний возраст наступления менархе у женщин с НГЭ составил 12,4±1,4 лет (минимальный - 11,5 лет, максимальный -13,8 лет). Менструальный цикл длился в среднем 29,4±2,4 дней (от 25 до 33 дней). У большинства (86,6%, 84) пациенток отмечен регулярный менструальный цикл. У 55,7% (54) женщин с НГЭ отмечены аномальные маточные кровотечения по типу межменструальных мажущих кровянистых выделений (до начала менструаций - у 50% (24) женщин, после - у 22,2% (12), до и после - у 33,3% (18) пациенток). Болевой синдром (альгодисменорея, тазовая боль и диспареуния), который чаще всего заставлял женщин обращаться к гинекологу для обследования, отмечался у всех пациенток. При этом до начала терапии жалобы на хроническую тазовую боль были отмечены у 90,7% (88), альгодисменорея встречалась у 93,8% (91), диспареуния наблюдалась у 70,1% (68) пациенток с эндометриозом. Сочетание трех видов боли встречалось у 72,2% женщин (70). Для оценки болевого синдрома была применена визуально -аналоговая шкала боли (ВАШ). Выраженность тазовой боли у пациенток с НГЭ 1-11 степени составила 7,6±0,3 балла, альгодисменореи - 8,2±0,4 балла, а диспареунии - 5,3±0,6 баллов.

Вторым важнейшим клиническим симптомом эндометриоза являлось бесплодие, которое встречалось у 73,2% (71) больных, при этом первичное бесплодие наблюдалось у 69% (49) пациенток, доля вторичного бесплодия

составила 31% (22). Длительность первичного бесплодия у больных с НГЭ составила 5,3±2,2лет, вторичного - 4,5±1,8 года.

Также у пациенток с эндометриозом проведена оценка акушерского анамнеза, в ходе которого установлено, что у 39,2% (38) пациенток были беременности. Срочными родами закончились только 57,8% (22) случаев, причем через естественные родовые пути родоразрешены 77,3% (17) женщин были, а остальные 22,7% (5) закончились операцией кесарева сечения. Самопроизвольные выкидыши на ранних сроках и неразвивающиеся беременности наблюдались у 18,5% (7) пациенток. Искусственные аборты в анамнезе отмечены у 23,7% (9) женщин.

Среди сопутствующей соматической патологии ведущую роль занимала фиброзно-кистозная болезнь молочных желез, которая была отмечена у 70,1% (68) больных с эндометриозом. Заболевания ЛОР-органов наблюдались у 43,3% (42) пациенток с эндометриозом. Со стороны сердечно-сосудистой системы патологий отмечено не было. У 15,5% (15) пациенток в анамнезе отмечена рецидивирующая герпетическая инфекция. У 12,4% (12) больных отмечено сочетание НГЭ с хроническим гастритом, у 11,3% (11) - с синдромом раздражённой кишки. Хронический цистит сочетался с эндометриозом у 22,7% (22) больных.

У всех пациенток была проведена оценка функции яичников, для этого на 25 день менструального цикла в периферической крови определяли уровни фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ) и антимюллерова гормона (АМГ) иммуноферментным методом (ИФА). Согласно полученным данным, не выявлено достоверных различий между содержанием ФСГ и ЛГ в группах больных наружным генитальным эндометриозом и в контрольной группе. Средняя концентрация ФСГ в группе больных НГЭ составила 5,81±0,36 МЕ/л; ЛГ - 4,97±0,57 МЕ/л; в контрольной группе содержание ФСГ составило 5,2±0,78 МЕ/л, а количество ЛГ в сыворотке крови был 4,24±0,54 МЕ/л. Содержание антимюллерова гормона (АМГ) в крови у пациенток с наружным генитальным эндометриозом также не различалось

в сравнении с таковым у пациенток контрольной группы и составило 2,8±1,2 МЕ/л и 3,2±0,9 МЕ/л соответственно. На основании определения концентрация прогестерона у пациенток во вторую фазу менструального цикла (с 18 по 22 дни менструального цикла), у всех женщин был отмечен овуляторный менструальный цикл. Количество прогестерона в группе больных НГЭ и в группе контроля составило 42,6±1,7 нмоль/л и 37,2±2,3 нмоль/л соответственно.

При проведение ультразвукового исследования органов малого таза в 1 фазу цикла (7-9 день цикла) было выявлено, что у пациенток с НГЭ в 92,8% (90) случаев наблюдалось обычное строение матки, в среднем ее размеры составили 5,7^4,4x4,9 см. В 7,2% (7) случаев отмечено увеличение размеров матки за счет аденомиоза, они составили в среднем 6,4x5,3x6,0 см. В 65% (63) случаев матка располагалась в anterflexiо versiо, в 35% (34) случаев в retrоflexiо versiо. Средний объем левого яичника составлял 7,4±2,3 см3 (минимальный - 4,7 см3; максимальный - 11,1 см3). Средний объем правого яичника составил 6,1±1,6 см3 (минимальный 4,9 см3, максимальный 10,1 см3). Как эндометриоидные кисты, так и эндометриоидные инфильтраты не были обнаружены ни у одной из пациенток с НГЭ.

Всем пациенткам было произведено оперативное вмешательство лапароскопическим доступом.

Во время лапароскопии были оценены следующие параметры:

1. Топографические особенности органов: положение матки, ее размеры, наличие и проходимость маточных труб, строение и размеры яичников.

2. Наличие поверхностных очагов эндометриоза на брюшине малого таза.

3. Степень спаечной болезни: вовлечение органов репродуктивной системы и смежных органов в спаечный процесс.

4. Наличие сопутствующей патологии при ревизии органов брюшной полости.

В ходе лапароскопии было выявлено, что у пациенток с НГЭ в 92,8% (90) случаев наблюдалось обычное строение матки, в 7,2% (7) случаев отмечено увеличение размеров матки за счет аденомиоза. В 65% (63) случаев матка располагалась в anterflexiо versiо, в 35% (34) случаев в retrоflexiо versiо. Проверка проходимости маточных труб осуществлялась всем пациентка путем введения раствора индигокармина в полость матки. У 91,8% (89) больных определялась нормальная проходимость маточных труб, у 6,2% (6) - нарушение проходимости отмечалось с одной стороны, у 2% (2) женщин обе маточные трубы были непроходимы.

У пациенток основной группы были обнаружены лишь эндометриоидные гетеротопии. В 85,6% (83) случаев они располагались на брюшине Дугласова пространства, в 10,3% (10) случаев в области пузырно-маточной складки, в 4,1% (4) случаев были диссеминированны по брюшине малого таза.

Спаечная болезнь I степени наблюдалась в 36,1% (35) случаев; II степени -в 22,6% (22); III степени отмечалась в 6,2% (6), спаечная болезнь IV степени -не наблюдалась у пациенток с НГЭ.

3.1.2 Клиническая характеристика контрольной группы пациенток

В контрольную группу вошли 20 женщин, проходивших обследование в отделениях оперативной гинекологии и гинекологической эндокринологии ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», которым была произведена диагностическая лапароскопия в связи с бесплодием в рамках подготовки к протоколу ЭКО. У данной группы пациенток интраоперационно не было обнаружено гинекологических патологий. В дальнейшем процедура ЭКО была выполнена им в связи с мужским фактором бесплодия.

Средний возраст пациенток в группе контроля составил 25,5±1,1 лет (минимальный - 21,2 год, максимальный - 33 года). У всех женщин из данной группы были оценены особенности менструального цикла. Средний возраст наступления менархе у женщин из группы контроля составил 13,8±1,3 лет (минимальный - 12,3 лет, максимальный - 14,3 лет). Средняя продолжительность

менструального цикла была 28,2±1,6 дней (минимальная - 24 дня, максимальная -33 дня). Регулярный менструальный цикл отмечался у 90% (18) пациенток. Среди нарушений менструального цикла у женщин из контрольной группы была выявлена опсоменорея, характерная для 10% (2) пациенток, при этом средняя длительность менструального цикла составила 38±1,5 дней (от 26 до 40 дней).

Жалобы на боли в течение всего менструального цикла не предъявляла ни одна из пациенток. Основной причиной обращения явилось наличие первичного или вторичного бесплодия. У всех супружеских пар был установлен мужской фактор бесплодия. У 3 пациенток из контрольной группы в анамнезе были беременности, из которых лишь у 1 женщины беременность завершилась срочными родами, искусственные аборты в анамнезе отмечены у 2 женщин. Самопроизвольные выкидыши в анамнезе отмечены не были.

Среди сопутствующей соматической патологии в наибольшем числе случаев отмечена фиброзно-кистозная болезнь молочных желез (у 75% (15) пациенток). Заболевания ЛОР-органов наблюдались у 25% (5) женщин из контрольной группы. Со стороны сердечно - сосудистой системы патологий выявлено не было. У 20% (4) больных отмечен хронический гастрит. Хронический цистит был диагностирован у 10% (2) пациенток из контрольной группы. Всем пациенткам было произведено оперативное вмешательство лапароскопическим доступом.

3.2 Результаты иммунологического обследования пациенток с НГЭ

3.2.1 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания NK-клеток и активности NK-клеток периферической крови пациенток с эндометриозом

При анализе субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови пациенток с НГЭ 1-11 степени до начала лечения отмечено повышение количества ККТ-клеток с фенотипом CD3+CD16+56+ в 1,46 раза, а также снижение индуцировано активированных КК-клеток (ККА+) в 1,65 раза при

сравнении абсолютных величин относительно группы контроля. При этом различий между количеством СD3+, CD4+, CD8+, CD19+, а также КК-клеток с фенотипом CD3-CD16+56+ и спонтанно активированных КК-клеток (ЫКА-) в обеих группах обнаружено не было (рисунок 2).

ККА+ МКА-]>1КТ-клетки КК-клетки В-лимфоциты Цитотокс лимф оциты Т-хелперы Т-лимфоциты

Рисунок 2 - Сравнение содержания субпопуляций лимфоцитов, ККТ-, КК-клеток и их способности к активации в ПК больных НГЭ 1-11 степени и у пациенток из группы контроля

3.2.2 Оценка содержания цитокинов в перитонеальной жидкости и периферической крови пациенток с НГЭ

Для выявления возможного участия цитокинов в развитии генитального эндометриоза мы определяли их концентрацию в ПЖ и ПК больных НГЭ 1-11 степени и в контрольной группе. В ПЖ было обнаружено повышенное содержание 1Б-8, КАКТББ, Т№а и МСР-1 у пациенток с НГЭ до начала лечения по сравнению с группой контроля в 2,4, 2,6, 2,3 и 1,2 раза соответственно. Количество №-10 было ниже в 4 раза у пациенток с НГЭ по сравнению со здоровыми женщинами. Данные представлены в таблице 2. При сравнении количества цитокинов в ПК было обнаружено, что содержание 1Б-8 и КАКТББ

у пациенток с эндометриозом было в 1,1 и 1,2 раза больше по сравнению с группой контроля соответственно (таблица 3).

Таблица 2 - Содержание цитокинов в перитонеальной жидкости больных НГЭ 1-11 степени и в контрольной группе

Цитокины, пг/мл Основная группа (n=97), M±m Группа контроля (n=20), M±m

IL8 16,1±2,3* 6,7±4,6

RANTES 21,5±3,6* 8,3±3,4

TNFa 5,6±0,2* 2,4±1,2

MCP-1 175,4±32,4* 142,2±12,1

IP10 734,8±132,6** 3037,5±244,2

Примечание: * - р<0,05, ** - p<0,01 - по сравнению с группой контроля

Таблица 3 - Сравнение цитокинов в ПК между пациентками с НГЭ и контролем

Цитокины, пг/мл Основная группа (n=97), M±m Группа контроля (n=20), M±m

IL8 11,44 (9,99;13,9)* 10,15 (8,73;11,61)

RANTES 10111,97 (7719,3;10,5)* 8675,19 (6956,3;9809,5)

TNFa 4,87 (4,2;5,5) 4,3 (4,2;5,32)

MCP-1 57,7 (42,6;82,3) 53,42 (40,85;81,77)

IP10 71,9 (49,3;101,29) 66,08 (53,26;86,2)

Примечание: * - р<0,05 - по сравнению с группой контроля

3.2.3 Оценка взаимосвязи между содержанием цитокинов в перитонеальной жидкости и в периферической крови у пациенток с НГЭ

Было проанализировано содержание цитокинов (КАКТББ, Т№а, 1Р-10, МСР-1, 1Ь-8) в ПК и ПЖ пациенток с НГЭ. Несомненно, наиболее информативным является анализ количества цитокинов в ПЖ, однако, получение данного материала возможно лишь при инвазивных вмешательствах, которые проводятся по строгим медицинским показаниям. Поэтому, выявление взаимосвязи между содержанием вышеуказанных цитокинов в ПЖ и ПК позволяет в дальнейшем, не подвергая пациентку лапароскопическому

вмешательству, судить об изменениях данных иммунологических показателей на фоне терапии, основываясь на результатах анализа периферической крови. На основании проведения корреляционного анализа была установлена положительная корреляция Spearman Rs=0,45; p<0,05 и Rs=0,69; p=0,05 между содержанием IL-8 и TNFa в крови и в ПЖ соответственно до лечения (рисунки 3,4).

1» и м

тс ^ 60

PQ К 00

J *

П »

зс 10 a

+ в 4 10 12 Н 18 20 22 2в 24 М

IL-8 в ПК

Рисунок 3 - Корреляционный анализ содержания цитокина IL-8 в крови и перитонеальной жидкости у пациенток с НГЭ

*

н& „т»*'

-1, „ ь У "" ____—

...... fA * 9 ft *

4 а * « • т. -

ш

» в * ее К

« в 10 и 16 14 ?0 а 26 ¿0

ТХРавПК

Рисунок 4 - Корреляционный анализ содержания цитокина Т№а в крови и перитонеальной жидкости у пациенток с НГЭ

3.2.4 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания NK-клеток и их способности к активации в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой

монотерапии аГнРГ

Была проведена проверка двух сравниваемых подгрупп пациенток с НГЭ до начала лечения на однородность с использованием W-критерия Уилкоксона. Было установлено, что 1 и 3 подгруппы пациенток с НГЭ до начала терапии не различались ни по одному из исследуемых показателей. После комбинированной терапии НГЭ аГнРГ в сочетании с ШКа-2Ь отмечено увеличение в периферической крови абсолютного числа клеток с фенотипом CD3+, CD3+СD4+, CD3+CD8+ в 1,1, 1,1 и 1,2 раза соответственно, а также повышение относительного количества клеток с фенотипом CD3+, CD19+ в 1,1 и 1,1 раза соответственно по сравнению с этими показателями до оперативного лечения. Нами также установлено снижение относительного количества КК- и ККТ-клеток после лечения в 1,3 и 1,9 раза соответственно, и снижение абсолютного числа ККТ-клеток в 1,8 раза после терапии (таблица 4).

У пациенток, получавших монотерапию аГнРГ, было отмечено снижение абсолютного и относительного числа ККТ-клеток в 3 и 3,4 раза соответственно, а также обнаружено снижение абсолютного количества ККА+ в 1,3 раза по сравнению с его содержанием до терапии. Не обнаружено различий в содержании в периферической крови клеток с фенотипом CD3+, CD3+СD4+, CD3+CD8+, СD19+ и КК-клеток до и после лечения в 3 подгруппе (таблица 4).

Для сравнения динамики изменения исследуемых показателей после лечения между подгруппами мы использовали дельту (Д=Мсред. до лечения-Мсред. после лечения). При оценке динамики изменения исследуемых показателей после лечения в 1 и 3 подгруппах нами были получены следующие данные: ДКК-клеток (относительное содержание) в ПК пациенток после комбинированной терапии аГнРГ совместно с №Ка-2Ь составило -4,72 ДИ95% (-7,36;-2,07), а в подгруппе монотерапии аГнРГ ДКК-клеток составило 3,16 ДИ95% (-0,68;7,01). ДККТ-клеток (относительное содержание) в 1 и 3 подгруппах после лечения имела отрицательную динамику, но в большей степени в подгруппе сравнения и составило -4,85 ДИ95% (-7,15;-2,56). В 1 подгруппе комбинированной терапии ДККТ-клеток равнялось -2,82 ДИ95% (-4,37;-1,27). ДККА+ (относительное содержание) так же имело отрицательную динамику как при применении аГнРГ совместно с интерфероносодержащим препаратом, так и при монотерапии аГнРГ: -0,15 ДИ95% (-0,42;0,1) и -2,64 ДИ95% (-4,38;-1,23) соответственно (рисунок 5).

Таблица 4 - Сравнительная оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, а также содержания ККТ-, КК-клеток и их способности к активации в периферической крови до и после терапии внутри подгрупп

л ч и Подгруппа 1 (аГнРГ+ШШ-2Ь), п=32 Ме(025;075) Подгруппа 3 (сравнения, аГнРГ), п=35 Ме(025;075)

н а со а до лечения после лечения до лечения после лечения

о К % тыс./мкл % тыс./мкл % тыс./мкл % тыс./мкл

CD3+ 73,10 1,35 77,60 1,43 76,50 1,38 78,40 1,27

(68,0;77,8) (1,01;1,49) (74,1;79,0)*** (1,18;1,78)* (72,9;78,0) (1,01;1,59) (68,8;80,2) (1,2;1,54)

CD3+CD4+ 44,50 0,76 44,60 0,84 45,40 0,72 46,30 0,81

(37,4;49,5) (0,57;0,87) (42,3;48,2) (0,69;1,0)* (43,6;51,1) (0,64;1,11) (39,0;54,4) (0,69;0,91)

CD3+CD8+ 23,30 0,41 25,00 0,49 24,30 0,47 23,00 0,40

(19,9;28,1) (0,29;0,54) (21,0;28,4) (0,35;0,56)* (21,8;29,6) (0,3;0,59) (20,0;28,9) (0,34;0,53)

CD19+ 10,30 0,18 10,60 0,21 10,70 0,17 7,90 0,15

(8,2;12,3) (0,11;0,26) (10,0;11,9)* (0,15;0,26) (8,8;14,6) (0,15:0,26) (7,6;12,2) (0,12;0,18)

CD3-CD16+ 14,10 0,24 10,90 0,21 12,40 0,22 13,30 0,24

CD56+ (12,1;19,4) (0,19;0,38) (9,3;13,0)* (0,16;0,25) (8,8;14,7) (0,15;0,26) (11,6;15,4) (0,2;0,28)

CD3+CD4+/ 1,90 1,87 1,67 2,00

CD3+CD8+ (1,39;2,18) (1,46;2,66) (1,53;2,29) (1,52;2,73)

ККТ 6,30 (5,1; 8,4) 0,11 (0,08;0,15) 3,40 (2,4;5,3)*** 0,06 (0,05;0Д1)*** 7,90 (3,7;9,1) 0,15 (0,04;0,18) 2,30 (1,7;2,8)*** 0,05 (0,02;0,05) ***

ККА- 1,20 (0,8;1,4) 0,02 (0,01;0,03) 1,30 (1,0;1,5) 0,03 (0,02;0,03) 1,80 (1,1;2,2) 0,03 (0,03;0,04) 1,10 (0,7;1,9) 0,02 (0,01;0,04)

ККА+ 9,90 (6,8;16,2) 0,18 (1,13;0,23) 9,80 (8,0;11,9) 0,20 (0,13;0,24) 9,50 (6,7;12,0) 0,18 (0,09;0,26) 7,20 (3,1;10,9)* 0,1 (0,09;0,15)

Примечание: * - р<0,05, *** - р<0,001 - по сравнению с показателями до лечения

Рисунок 5 -Изменение содержания ККТ-, КК-клеток и их способности к активации в ПК пациенток с НГЭ после терапии

между 1 и 3 подгруппами

3.2.5 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания NK-клеток и активности NK-клеток периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой

монотерапии аГнРГ

Была проведена проверка двух сравниваемых подгрупп пациенток с НГЭ до начала лечения на однородность с использованием W-критерия Уилкоксона. Было установлено, что 2 и 3 подгруппы пациенток с НГЭ до начала терапии различались только по одному из исследуемых показателей (относительное число ККТ-клеток). Для 2 подгруппы комбинированной терапии аГнРГ совместно с 1Ь-2 он составил 7,9 (3,7; 9,1) тыс./мкл, а для 3 подгруппы монотерапии аГнРГ -3,8 (2,8;5,1) тыс./мкл (р<0,05).

После комбинированной терапии НГЭ аГнРГ в сочетании с рекомбинантным 1Ь-2 отмечено увеличение в периферической крови относительного числа клеток с фенотипом CD3-CD16+56+ и ККА+ в 1,26 и 1,34 раза соответственно по сравнению с подгруппой монотерапии аГнРГ (таблица 5).

При сравнении динамики изменения исследуемых показателей после лечения между подгруппами были получены следующие данные: ДЫКА+ клеток (относительное содержание) в ПК пациенток после комбинированной терапии аГнРГ совместно с 1Ь-2 составила 2,7 ДИ95% (0,8;7,2), а в подгруппе монотерапии аГнРГ ДЖА+ клеток составила -2,64 ДИ95% (-4,38;-1,23). ДККТ-клеток (относительное содержание) во 2 и 3 подгруппах после лечения имела отрицательную динамику, но в большей степени в подгруппе применения только аГнРГ и составило -4,85 ДИ95% (-7,15;-2,56). В подгруппе комплексной терапии аГнРГ и 1Ь-2 ДККТ-клеток равнялось -0,98 ДИ95% (-2,37;-1,36). Однако по данному показателю 2 и 3 подгруппы различались до начала лечения, поэтому его изменения мы учитывать не можем (рисунок 6).

Рисунок 6 - Изменение содержания ККТ-, ККА+ клеток и их способности к активации в ПК пациенток с НГЭ после терапии между подгруппами 2 и 3

Таблица 5 - Сравнительная оценка субпопуляционного состава лимфоцитов, а также содержания ККТ-, КК-клеток и их способности к активации в периферической крови до и после терапии внутри подгрупп

л ч и н подгруппа 2 (аГнРГ+1Ь-2), п=30, Ме (025;075) подгруппа 3 (сравнения, аГнРГ), п=35, Ме (025;075)

й к о до лечения после лечения до лечения после лечения

к % тыс./мкл % тыс./мкл % тыс./мкл % тыс./мкл

CD3+ 75,00 1,25 73,75 1,28 76,50 1,38 78,40 1,27

(70,10;77,8) (0,87;1,95) (71,40;78,90) (1,04;1,69) (72,9;78,0) (1,01;1,59) (68,8;80,2) (1,2;1,54)

CD3+CD4+ 44,90 0,76 46,70 0,84 45,40 0,72 46,30 0,81

(40,20;51,00) (0,58;1,06) (43,00;52,10) (0,68;1,00) (43,6;51,1) (0,64;1,11) (39,0;54,4) (0,69;0,91)

CD3+CD8+ 25,00 0,44 25,05 0,39 24,30 0,47 23,00 0,40

(20,40;30,00) (0,36;0,56) (20,40;28,80) (0,30;0,56) (21,8;29,6) (0,3;0,59) (20,0;28,9) (0,34;0,53)

CD19+ 11,70 0,20 10,55 0,23 10,70 0,17 7,90 0,15

(8,40;16,30) (0,14;0,26) (8,40;13,00) (0,13;0,25) (8,8;14,6) (0,15:0,26) (7,6;12,2) (0,12;0,18)

CD3-CD16+ 11,70 0,19 14,80 0,23 12,40 0,22 13,30 0,24

CD56+ (7,50;15,3) (0,14;0,30) (9,2;17,5)* (0,15;0,31) (8,8;14,7) (0,15;0,26) (11,6;15,4) (0,2;0,28)

CD3+CD4+/ 1,78 1,96 1,67 2,00

CD3+CD8+ (1,36;2,40) (1,51;2,39) (1,53;2,29) (1,52;2,73)

ККТ 3,80 (2,80; 5,10) 3,30 (2,7;5,0) 7,90 (3,7;9,1) 2,30 (1,7;2,8) ***

ККА- 1,50 1,70 1,80 1,10

(0,70;2,00) (1,10;2,20) (1,1;2,2) (0,7;1,9)

ККА+ 8,40 11,30 9,50 7,20

(5,40;12,50) (8,1;21,9)*** (6,7;12,0) (3,1;10,9)*

Примечание: * - р<0,05, *** - р<0,001 - по сравнению с соответствующими показателями до лечения

3.2.6 Оценка содержания цитокинов в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии

рекомбинантным IFNa-2b и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

При анализе содержания цитокинов (RANTES, TNF а, IP-10, MCP-1, IL-8) в ПК пациенток НГЭ до лечения и после терапии аГнРГ в сочетании с IFNa-2b, а также в подгруппе монотерапии аГнРГ нами не было обнаружено изменения содержания IL-8, TNFa, IP-10 после терапии (таблица 6).

Установлено увеличение содержания MCP-1 в ПК пациенток в 1 подгруппе в 1,1 раза, в подгруппе сравнения после лечения количество этого цитокина в ПК не изменилось. Содержание RANTES в ПК после терапии снизилось в подгруппе комбинированной терапии в 1,1 раза (р<0,001), в подгруппе монотерапии аГнРГ напротив содержание этого цитокина после лечения возросло в 1,2 раза (р<0,05) (таблица 6).

Таблица 6 - Динамика изменений количества цитокинов в периферической крови у больных НГЭ до и после лечения в 1 и 3 подгруппах

Показатель Подгруппа 1 (аГнРГ+ШШ-2Ь) Me (Q25;Q75), (n=32) Подгруппа 3 (сравнения, аГнРГ) Me (Q25;Q75), (n=35)

(пг/мл) до лечения после лечения до лечения после лечения

9196,0 (8206,2; 10520,0) 8578,2 7451,35 (5204,6; 10531,0) 8997,8

RANTES (7390,8; 9029,26)*** (8097,5; 10224,33)*

TNFa 5,60 5,70 4,76 5,09

(5,5;5,9) (5,2;5,8) (4,76;4,98) (4,87;5,32)

IP-10 53,30 53,4 80,16 76,98

(39,8;92,2) (39,3;89,6) (46,82;114,38) (66,41;116,56)

MCP-1 50,60 57,80 76,07 81,77

(32,7;62,7) (37,6;78,8)* (45,84;109,78) (62,75;131,53)

IL-8 11,60 12,50 10,8 11,61

(11,0;12,9) (12,3;14,6) (10,3;15,56) (9,6;14,45)

Примечание: * - р<0,05 , *** - р<0,001 по сравнению с показателями до лечения

При сравнении динамики изменения представленных показателей в ПК после терапии между подгруппами мы использовали дельту

(Д=Ме до лечения—Мепосле лечения ) (Q25;Q75). Нами были получены следующие данные: ДКАКТББ в ПК в подгруппе комбинированной терапии аГнРГ с IFNa-2b составила -1382,7 (-2171,9;691,5), а в 3 подгруппе монотерапии 874,95 (-306,79;1729,87) (рисунок 7).

Рисунок 7 -Изменение содержания КАКТЕБ в ПК пациенток с НГЭ после терапии между подгруппами 1и 3

Динамика изменения содержания в ПК Т№а была отрицательной в 1 подгруппе сочетанной терапии и составила -0,1 (-3,27;0,2), и положительной в подгруппе сравнения - 0,44 (-0,11;0,56) (рисунок 8).

аГнРГ с IFNa-2b

аГыРГ

□ ¡5»-f5»

Рисунок 8 - Изменение содержания ТКБа в ПК пациенток с НГЭ после терапии между подгруппами 1 и 3

3.2.7 Оценка содержания цитокинов в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии

рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

При оценке изменения содержания цитокинов в ПК пациенток после терапии аГнРГ в сочетании с 1Ь-2 было отмечено снижение количества КАКТББ в 1,03 раза и повышение содержания 1Р-10 в 1,1 раза (таблица 7). Количество остальных цитокинов в ПК после терапии во 2 подгруппе не изменилось.

Таблица 7 - Динамика изменений количества цитокинов в периферической крови

у больных НГЭ до и после лечения во 2 и 3 подгруппах

Показатель (пг/мл) Подгруппа аГнРГ+Ш-2 Me (Q25;Q75) , (n=30) Подгруппа сравнения аГнРГ Me (Q25;Q75), (n=35)

до лечения после лечения до лечения после лечения

RANTES 10112,49 (8503,34; 10513,03) 9731,9 (8118,9; 10712,46)* 7451,35 (5204,58; 10531,0) 8997,8 (8097,5; 10224,33)*

TNFa 4,42 (3,87;4,98) 4,64 (3,98;4,87) 4,76 (4,76;4,98) 5,09 (4,87;5,32)

IP-10 82,36 (62,77;125,47) 90,58 (63,54;110,13)* 80,16 (46,82;114,38) 76,98 (66,41;116,56)

MCP-1 64,73 (45,84;102,86) 84,2 (48,01;113,01) 76,07 (45,84;109,78) 81,77 (62,75;131,53)

IL-8 12,03 (8,27;14,53) 11,45 (8,04;12,27) 10,8 (10,3;15,56) 11,61 (9,6;14,45)

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями до лечения

При сравнении динамики изменения цитокинов в ПК после терапии между 2 и 3 подгруппами различия были установлены только в количестве RANTES. Так в подгруппе комбинированной терапии с IL-2 ARANTES составила -640 (-1842,62;455,56), а в подгруппе монотерапии 874,95 (-306,79;1729,87) (рисунок 9).

Рисунок 9- Изменение содержания КАКТББ в ПК пациенток с НГЭ после терапии между 2 и 3 подгруппами

3.3 Клиническая эффективность различных вариантов терапии НГЭ 1-11 степени

До начала терапии болевой синдром присутствовал у всех пациенток с НГЭ. В первой подгруппе боль в малом тазу была отмечена у 81,3% (26) женщин, альгодисменорея в 93,3% (30) случаев, диспареуния в 72% (23) случаев. Во второй подгруппе жалобы на хроническую тазовую боль были отмечены у 90% (27) пациенток, у 86,7% (28) женщин отмечалась альгодисменорея, диспареуния наблюдалась в 70,1% (21) случаев. В 3 подгруппе сравнения до лечения тазовая боль была отмечена у 82,9% (29), альгодисменорея у 80% (28), а диспареуния у 68,6% (24). Так как терапия аГнРГ сопровождалась аменореей, оценить выраженность дисменореи не представлялось возможным, поэтому данный параметр не вошел в оценку. Интенсивность болевого синдрома в области таза до начала терапии у пациенток из подгруппы сочетанной терапии аГнРГ+ШКа-2Ь составила 7,2±0,25 баллов, и была сопоставима с выраженностью болевого синдрома у женщин, применявших аГнРГ совместно с 1Ь-2 - 7,82±0,3 баллов, и в группе сравнения - 7,6±0,2 баллов. Выраженность диспареунии также была

сопоставима в трех подгруппах и составила 4,9±0,4, 5,4±0,25 и 5,26±0,4 баллов соответственно (таблица 8).

Таблица 8 - Результаты оценки выраженности болевого синдрома в баллах по визуально-аналоговой шкале до оперативного лечения и после комбинированной терапии у пациенток с НГЭ 1-11 степени внутри и между подгруппами

Характеристика боли Баллы по шкале ВАШ, М±т

Подгруппа 1 (аГнРГ+ШШ-2Ь) (п=32) Подгруппа 2 (аГнРГ+ГЬ-2) (п=30) Подгруппа 3 (сравнения, аГнРГ) (п=35)

до лечения после лечения до лечения после лечения до лечения после лечения

Хроническая тазовая боль 7,2±0,25 1,9±0,512 7,82±0,3 1,57±0,41,2 7,6±0,2 2,53±0,31

Диспареуния 4,9±0,4 0,95±0,31,2 5,4±0,25 0,85±0,31,2 5,26±0,4 1,55±0,31

Примечание: 1 - р<0,05 - достоверность различий по сравнению с показателями до лечения; 2 - р<0,05 - достоверность различий по сравнению с 3 подгруппой монотерапии аГнРГ

При применении ШКа-2Ь с аГнРГ практически полное отсутствие боли в области таза было отмечено в 84,4% (27) случаев, диспареунии в 90,6% (29) случаев (интенсивность хронической тазовой боли уменьшилась в 3,8 раза, выраженность диспареунии снизилась в 5 раз по ВАШ) (рисунок 10).

При применении 1Ь-2 с аГнРГ практически полное отсутствие боли в области таза было отмечено в 88,7% (26) случаев, диспареунии в 96,7% (29) случаев (интенсивность хронической тазовой боли уменьшилась в 5 раз, выраженность диспареунии снизилась в 6 раз по ВАШ) (рисунок 10).

При применении монотерапии аГнРГ боль в малом тазу отсутствовала в 74,2% (26), диспареуния в 80% (28) (хронической тазовой боли в 3 раза, выраженность диспареунии снизилась в 4,5 раза по ВАШ) (рисунок 10).

Рисунок 10 - Динамика количества пациенток без болевого синдрома в подгруппах 1, 2 и 3 после терапии

Примечание: * - р<0,05 - достоверность различий по отношению к 3 подгруппе сравнения

Частота наступления беременности в подгруппах комбинированной терапии с иммуномодулирующими препаратами ШКа-2Ь и 1Ь-2 составила 46,9% (15) и 53,3% (16) соответственно, что было достоверно выше чем в подгруппе терапии только аГнРГ - 34,3% (12) (р<0,05).

В течение 1 года после применения комбинированной терапии НГЭ с иммуномодулирующими препаратами рецидивы заболевания выявлены не были, а в подгруппе, получавшей монотерапию аГнРГ, возобновление болевого синдрома отмечено у 9 женщин (25,7%).

3.4 Характеристика содержания микровезикул лейкоцитарного происхождения в периферической крови больных НГЭ

В периферической крови пациенток с эндометриозом выявлено увеличение интенсивности экспрессии молекул CD16+ на поверхности микровезикул в 1,38 раза, а также повышение относительного содержания МВ с рецептором CD14+ на их поверхности в 1,1 раза по сравнению с данными показателями у пациенток без заболевания (рисунки 11, 12).

Рисунок 11 - Интенсивность экспрессии поверхностных маркеров на микровезикулах периферической крови пациенток с НГЭ по сравнению с контрольной группой

Примечание: ** - p<0,01 - группа женщин с НГЭ отличается от контрольной группы

Рисунок 12 - Относительное содержание микровезикул в периферической крови пациенток с НГЭ по сравнению с пациентками из группы контроля

Примечание: * - p<0,05- группа женщин с НГЭ отличается от группы здоровых женщин

Также для пациенток с НГЭ I и II степени характерно уменьшение относительного содержания микровезикул с антигенами CD45+CD4+, CD3+CD4+ и CD3+CD8+ на их поверхности в 1,2, 4 и 1,5 раза соответственно, а также

увеличение относительного содержания МВ с рецепторами СD54+CD14+ в 1,55 раза по сравнению с этими показателями у пациенток из группы контроля (рисунок 13).

Для проведения оценки качества (диагностическая эффективность) прогностической модели взаимосвязи между содержанием в ПК микровезикул с фенотипами CD14+, CD16+ и CD54+CD14+ и наружным генитальным эндометриозом использовался метод построения кривой взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов (ROC-кривой). Площадь под ROC-кривой, соответствующей взаимосвязи прогноза НГЭ и содержания микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в плазме крови, составила 0,7±0,056 с 95% ДИ: 0,59-0,81.

Рисунок 13 - Относительное содержание микровезикул в периферической крови пациенток с НГЭ, экспрессирующих различные комбинации лейкоцитарных маркеров, по сравнению с пациентками из группы контроля

Примечание: * - p<0,05, ** - p<0,01 - группа женщин с НГЭ отличается от группы контроля

Полученная модель соответствует хорошему прогностическому качеству и является статистически значимой ф<0,01). Пороговое значение содержания микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в точке порога классификации

составляет 5,22%. Чувствительность и специфичность метода составили 80,5% и 71% соответственно. Относительное содержание микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ в плазме крови равное 5,22% или превышающее данное значение соответствует прогнозу наличия НГЭ.

Площади под ROC-кривой, соответствующей взаимосвязи прогноза НГЭ и содержания МВ с фенотипами CD14+ и CD16+ в плазме крови, составили: 0,6±0,078 с 95% ДИ: 0,47-0,78 и 0,7±0,066 с 95% ДИ: 0,58-0,84 соответственно. Полученные модели также обладают хорошим прогностическим качеством, однако, статистически незначимы.

На основании проведения корреляционного анализа была установлена положительная корреляция Spearman между содержанием в ПК женщин с эндометриозом NK-клеток (CD3 - CD16+CD56+) и микровезикул с фенотипами CD54+, CD45+CD54+ и CD54+CD56+: Rs=0,25, Rs=0,26 и Rs=0,28 соответственно (р<0,05).

3.5 Оценка содержания микровезикул в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения терапии только аГнРГ, рекомбинантным IFNa-2b и аГнРГ, а также рекомбинантным IL-2 и аГнРГ

В периферической крови пациенток, применявших комбинированную терапию аГнРГ совместно с рекомбинантным IFNa-2b, выявлено снижение интенсивности экспрессии поверхностных молекул CD4+ и CD14+ на микровезикулах в 1,5 и 1,2 раза соответственно по сравнению со значением данного показателя до начала терапии (рисунок 14). В ПК различий между относительным содержанием МВ, несущих на своей поверхности, как единичные лейкоцитарные маркеры, так и комбинации антигенов до и после терапии в 1 подгруппе выявлено не было (рисунки 15,16).

CD45CD3 CD4 CD8 CD54 CD56 CD14 CD16

Рисунок 14 - Сравнение интенсивности экспрессии поверхностных маркеров на микровезикулах ПК пациенток с НГЭ до и после комбинированной терапии

аГнРГ в сочетании с IFNa-2b

Примечание: * - p<0,05 - по сравнению с показателями до начала терапии

Рисунок 15 - Сравнение относительного содержания микровезикул в ПК пациенток с НГЭ, экспрессирующих различные лейкоцитарные маркеры, до и после комбинированной терапии аГнРГ в сочетании с ШКа-2Ь

до терапии аГнРГ- 1РКи-2Ь после терапии аГнРГ+ 1К>^а-2Ь

20 п

Л* к* <?,Х Кх <?,Х . (у* Vх ГХ г X г* Vх к_х ,х к>

& сЪ сУгЪ С? <^ оЧ о4 о4 о4 о4 о4 У ..о . ..о „о . о г9 г9 г9 г9 г9 г9 г9

„ Л (5э л л с* х ¿х" ,х -х -х „х Кх

о^ с? о« ^

Рисунок 16 - Сравнение относительного содержания микровезикул в ПК пациенток с НГЭ, экспрессирующих различные комбинации лейкоцитарных маркеров, до и после гормономодулирующей терапии аГнРГ и №Ка-2Ь

После применения комбинированной терапии аГнРГ совместно с рекомбинантным 1Ь-2 в периферической крови пациенток с НГЭ обнаружено усиление экспрессии молекул СD3+ на поверхности микровезикул в 2 раза по сравнению с показателем до лечения. Также во 2 подгруппе выявлено увеличение относительного содержания микровезикул с рецепторами CD45+CD3+, CD45+CD4+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD45+CD54+ в 6, 3,5, 3,3, 7,5 и 2 раза соответственно в ПК по сравнению с этими же показателями до начала терапии (рисунки 17,19). Различий в относительном содержании МВ с единичными поверхностными антигенами в ПК до и после комбинированной терапии аГнРГ и ТЬ-2 не обнаружено (рисунок 18).

Рисунок 17 - Сравнение интенсивности экспрессии поверхностных маркеров на микровезикулах ПК пациенток с НГЭ до и после комбинированной терапии аГнРГ в сочетании с 1Ь-2

Примечание:* - р<0,05 - по сравнению с показателями до начала терапии

Рисунок 18 - Сравнение относительного содержания микровезикул в ПК пациенток с НГЭ, экспрессирующих различные лейкоцитарные маркеры, до и после комбинированной терапии аГнРГ в сочетании с ТЬ-2

Рисунок 19 - Сравнение относительного содержания микровезикул в ПК пациенток с НГЭ, экспрессирующих различные комбинации лейкоцитарных маркеров, до и после терапии аГнРГ и IL-2

Примечание: * p<0,05- по сравнению с показателями до начала терапии

Во 2 подгруппе нами была установлена высокая положительная корреляция Spearman между содержанием в ПК пациенток с НГЭ NKA+ и микровезикул с фенотипами CD45+CD54+, CD45+CD56+, CD56+CD14+ и CD54+CD56+ после терапии только аГнРГ: Rs=0,73, Rs=0,71, Rs=0,73 и Rs=0,7 соответственно (p<0,05).

После применения терапии только аГнРГ в периферической крови пациенток с НГЭ было выявлено увеличение интенсивности экспрессии молекул CD3+ и CD14+ на поверхности микровезикул в 2,2 и в 1,6 раза соответственно, а также увеличение относительного содержания микровезикул с поверхностным антигеном CD54+ в 1,3 раза по сравнению с этими же показателями до лечения (рисунки 20, 21).

Рисунок 20 - Сравнение интенсивности экспрессии поверхностных маркеров

на микровезикулах ПК пациенток с НГЭ до и после гормономодулирующей терапии аГнРГ

Примечание:* - р<0,05 - по сравнению с показателями до начала терапии

Рисунок 21 - Сравнение относительного содержания микровезикул в периферической крови пациенток с НГЭ до и после гормономодулирующей терапии аГнРГ

Примечание: * - р<0,05 - по сравнению с показателями до терапии

При оценке изменения экспрессии различных комбинаций лейкоцитарных маркеров на поверхности микровезикул было выявлено, что после применения терапии только аГнРГ в ПК повысилось относительное содержание микровезикул с поверхностными рецепторами CD45+CD3+, CD45+CD4+, CD3+CD4+, CD45+CD54+, CD45+CD14+, CD45+CD56+, CD45+CD16+, CD56+CD14+, CD54+CD56+, CD54+CD14+ в 5, 10, 7,8, 12,8,10,6, 13,75, 6,2, 1,79, 5,78, 4,3 раза соответственно по сравнению с этими же показателями до лечения (рисунок 22).

до терапии аГнРГ после терапии аГнРГ

15п

<гС <гС л гх гх гх гх гх гх к* к* <гС „л 1к

& ^ Л? ^

У су* с5>с5>с5>с5>с5>с5>с5>с5>с>'

Рисунок 22 - Сравнение относительного содержания микровезикул в ПК пациенток с НГЭ, экспрессирующих различные комбинации лейкоцитарных маркеров, до и после гормономодулирующей терапии аГнРГ

Примечание: * - p<0,05,** - p<0,01 - по сравнению с показателями до начала терапии

3.6 Оценка изменения содержания микровезикул в периферической крови пациенток с эндометриозом на фоне применения комбинированной терапии рекомбинантным и аГнРГ, а также рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ

в сравнении со стандартной схемой монотерапии аГнРГ

При сравнении динамики изменения содержания микровезикул в ПК после терапии между подгруппами мы использовали дельту (Д=Медо лечения-Мепосле лечения) (025;075).

После применения комбинированной схемы терапии рекомбинантным ШКа-2Ь и аГнРГ динамика изменения интенсивности экспрессии молекул CD45+, CD14+ и CD4+ в периферической крови пациенток с НГЭ различалась по сравнению с изменением данных показателей после терапии только аГнРГ. Так в 1 подгруппе терапии изменения показателей имели отрицательную динамику и составили: ДCD45+= -64,0 (-282,5;-21,0), ДCD14+= -21,5 (-90,00;45,5) и CD4+= -49,25 (-100,5;8,5). В 3 подгруппе монотерапии изменения показателей имели положительную динамику: ДCD45+=30,25 (-16,5;127,0), ДCD14+=194,25 (105,5;316,5) и CD4+=149,75 (-9,5;169,0) (рисунки 23, 24, 25).

Рисунок 23 - Изменение интенсивности экспрессии молекул на поверхности

микровезикул в ПК пациенток с НГЭ после терапии между подгруппами 1 и 3

Рисунок 24 - Изменение интенсивности экспрессии молекул на поверхности

микровезикул в ПК пациенток с НГЭ после терапии между подгруппами 1 и 3

Рисунок 25 - Изменение интенсивности экспрессии молекул на поверхности

микровезикул в ПК пациенток с НГЭ после терапии между подгруппами 1 и 3

Не было выявлено различий ни по одному из показателей после лечения при сравнении применения комбинированной терапии рекомбинантным 1Ь-2 и аГнРГ и использования только аГнРГ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возраст является важным фактором, определяющим риск развития эндометриоза. Частота встречаемости НГЭ увеличивается с возрастом от менархе до менопаузы, поэтому средний возраст постановки диагноза соответствует 28 годам [109]. В нашем исследовании возраст пациенток варьировал от 26 до 40 лет (средний возраст 29,3±1,4 лет), что не противоречит данным, описанным в литературе. Эпидемиологические исследования в разных популяциях свидетельствуют о том, что женщины с ранним возрастом наступления менархе подвергаются более высокому риску развития эндометриоза [88]. Что касается характеристик менструации, то регулярный менструальный цикл на протяжении всей жизни и обильные менструальные кровотечения также связаны с повышенным риском развития эндометриоза [98]. Это может быть объяснено более высокой вероятностью регургитации эндометриальной ткани с менструальной кровью в брюшную полость через маточные трубы. В нашем исследовании среди пациенток с НГЭ не было выявлено женщин с ранним возрастом наступления менархе, средний возраст наступления менструации составил 12,4±1,4 лет (минимальный - 11,5 лет, максимальный -13,8 лет). Однако следует отметить, что при сравнении с возрастом наступления менархе девушек-подростков в XX веке, в настоящее время у обследованных нами пациенток менархе наступало раньше [24].

Анализ менструальной функции у пациенток с НГЭ не выявил достоверной разницы между средней продолжительностью менструального цикла и длительностью менструального кровотечения по сравнению с контрольной группой, что соответствует и данным, описанным в литературе [119]. Характерным симптомом НГЭ является наличие аномальных маточных кровотечений по типу мажущих темно-коричневых или кровянистых выделений, которые встречались у 55,7% (54) больных. До начала менструаций присутствие выделений отметили 50% (24) женщин, после менструальной реакции - 22,2% (12), перименструальные выделения до и после - 33,3% (18) пациенток. Такие

нарушения менструального цикла довольно часто встречаются при перитонеальном эндометриозе согласно данным литературы [54].

Что касается акушерского анамнеза, клинические данные свидетельствуют о том, что частота наступлений беременности обратно пропорционально связана с риском развития эндометриоза. Кроме того, риск возникновения заболевания уменьшается с увеличением числа родов. Этот вывод предполагает прямой протективный эффект беременности [87]. Однако, в настоящее время, это утверждение не является доказанным фактом и беременность не рассматривается в качестве средства лечения эндометриоза. В нашей работе показано, что беременность в анамнезе встречалась в 39,2% (38) случаев, родами она завершилась в чуть более половине случаев, из которых в 22,7% (5) случаев отмечено родоразрешение путем операции кесарево сечения. Внутриматочные вмешательства являются важным фактором, способствующим развитию заболевания [90]. Это подтверждается полученными нами данными, согласно которым у пациенток с эндометриозом в анамнезе отмечены медицинские аборты, а также у 18,5% (7) больных встречались самопроизвольные выкидыши и неразвивающиеся беременности, которые завершились выскабливанием полости матки. Также в ряде исследований показано, что эндометриоз является одной из возможных причин невынашивания беременности [89,200]. Согласно опубликованным данным, 30-50% женщин с эндометриозом имеют проблемы с фертильностью [29]. Таким образом, НГЭ следует рассматривать в качестве потенциальной причины бесплодия, особенно у женщин, имеющих болевой синдром [237]. У 73,2% (71) больных в нашей работе эндометриозу сопутствовал диагноз бесплодие, при этом преобладали пациентки с первичным бесплодием. Длительность первичного бесплодия составила 5,3±2,2 лет, вторичного 4,5±1,8 года, что в совокупности с наличием болевого синдрома свидетельствует о запоздалой диагностике заболевания. Кроме того, в 91,8% (89) случаев у пациенток с НГЭ на основании лапароскопического обследования была выявлена свободная проходимость маточных труб с обеих сторон. Это свидетельствует в пользу гипотезы о выработке самими эндометриоидным

гетеротопиями биологически активных веществ, препятствующих имплантации эмбриона, что в свою очередь приводит к длительному бесплодию, несмотря на отсутствие объективных анатомических или физиологических факторов [237].

У пациенток с перитонеальным эндометриозом в репродуктивном периоде обращает на себя внимание различная соматическая патология. Наиболее часто наблюдались хронический тонзиллит (70,1%, 68 женщин), высокая частота рецидивирующей герпетической инфекции (у 15,5%, 15 женщин), что может свидетельствовать о дефектах иммунной системы у больных НГЭ. В меньшем процентном соотношении 22,7% (22) и 11,3% (11) у пациенток встречался хронический цистит и синдром раздраженного кишечника соответственно. Однако необходимо обращать внимание на пациенток с цисталгиями неясного генеза, а также синдромом разраженного кишечника, не имеющих положительного эффекта от медикаментозной терапии, так как они находятся в зоне риска по выявлению эндометриоза.

Эндометриоз сопровождается хронической эстроген-зависимой воспалительной реакцией, которая является ключевым фактором развития спаечного процесса. В нашей работе спаечная болезнь различной степени распространенности была выявлена у 65% (63) пациенток с НГЭ, несмотря на то, что в исследование были включены только пациентки с так называемым «начальным» эндометриозом 1-11 степени распространенности.

Также нами на основании результатов лапароскопического обследования было обнаружено, что наиболее часто в 86% случаев (83) эндометриоидные гетеротопии располагались на брюшине Дугласова пространства, что также не противоречит данным литературы [119].

Основным клиническим проявлением у больных НГЭ репродуктивного возраста является болевой синдром, наличие которого являлось критерием включения в основную группу пациенток. Именно болевой синдром использовался в качестве параметра для оценки клинической эффективности проведенной терапии, так как выполнение повторных лапароскопических операций в рутинной клинической практике для оценки течения заболевания не

представляется возможным. Патогенез эндометриоз-ассоциированного болевого синдрома также сложен, как и само заболевание, и хорошо известно, что не существует корреляции между выраженностью болевого синдрома и степенью тяжести самого заболевания, что необходимо учитывать в клинической практике [111].

До начала терапии жалобы на хроническую тазовую боль были отмечены у 90,7% (88), альгодисменорея встречалась у 93,8% (91), диспареуния наблюдалась у 70,1% (68) пациенток с эндометриозом. Сочетание трех видов боли встречалось у 72,2% женщин. Так как терапия аГнРГ, которая была применена во всех группах пациенток, сопровождалась аменореей, дисменорея была исключена из параметров оценки клинической эффективности медикаментозной терапии.

Анализируя динамику тазовых болей и выраженность диспареунии у пациенток с НГЭ в 1 и 3 подгруппах установлено, что применение препарата IFNa-2b в комплексной терапии НГЭ сопровождалось более эффективным снижением выраженности болевого синдрома, так боль в области малого таза отсутствовала у 84,4% (27) женщин, а в группе сравнения (монотерапия аГнРГ) -у 74,2% (26) соответственно (р<0,05) [9]. Боли, связанные с половым актом, также в большей степени уменьшились в 1 подгруппе больных НГЭ, по сравнению с 3 подгруппой терапии, диспареуния отсутствовала у 90,6% (29) и 80% (28) пациенток соответственно (р<0,05) [9]. Эффективность применения комбинированной схемы аГнРГ в сочетании с IFNa-2b также отражалась в более выраженном снижении интенсивности болевого синдрома. Так выраженность хронической тазовой боли в 1 подгруппе составила 1,9±0,5 балла и диспареунии 0,95±0,3 балла в сравнении со стандартной терапией аГнРГ - 2,53±0,3 балла и 1,55±0,3 балла соответственно (р<0,05) [9]. Кроме того, в течение 1 года после применения комбинированной терапии с включением рекомбинантного интерферона не было отмечено ни одного случая рецидива заболевания. Рецидивом эндометриоза считалось возобновление болевого синдрома. Беременность наступила в 46,9% (15) случаев. В подгруппе, получавшей монотерапию аГнРГ беременность наступила в 34,3% (12) случаев, рецидивы

заболевания встречались у 25,7% (9) пациенток с НГЭ в течение 1 года наблюдения [9]. Данные литературы о клинической эффективности применения препаратов ШКа-2Ь в лечении НГЭ малочисленны, однако, полученные нами результаты о снижении выраженности болевого синдрома, увеличения частоты наступления беременности, а также снижения числа рецидивов заболевания в сравнении со стандартной терапией аГнРГ, соответствуют результатам имеющихся исследований [157, 22].

Применение интерлейкина-2 совместно с аГнРГ в комплексной терапии НГЭ сопровождалось более эффективным снижением болевого синдрома в области малого таза по сравнению с подгруппой, получавшей монотерапию аГнРГ, так тазовая боль отсутствовала у 88,7% (26) и 74,2% (26) женщин соответственно (р<0,05) [12]. Боли, связанные с половым актом, также более значимо уменьшились во 2 подгруппе больных НГЭ, получавших комбинированную терапию аГнРГ в сочетании с 1Ь-2, в отличие от подгруппы сравнения, отсутствие диспареунии наблюдалось у 96,7% (29) и 80% (28) пациенток соответственно (р<0,05) [12]. Эффективность применения 1Ь-2 подтверждается и в более выраженном снижении интенсивности тазовой боли, выраженность которой после терапии составила 1,57±0,4 баллов и диспареунии 0,85±0,3 баллов по сравнению с 3 подгруппой, получавшей монотерапию аГнРГ -2,53±0,3 балла и 1,55±0,3 балла соответственно (р<0,05) [12]. Пациентки, применявшие 1Ь-2 в составе комплексной терапии, не имели рецидивов заболевания в сравнении с подгруппой 3, которые использовали только аГнРГ, а также имели больший процент наступления беременности 53,3% (16), в отличие от пациенток, применявших только аГнРГ.

Клинический эффект рекомбинантного 1Ь-2 характеризуется более выраженным уменьшением болевого синдрома или полным его устранением, что возможно связано с его способностью уменьшать синаптическую активность при передаче болевых импульсов [204]. Стойкое снижение болевого синдрома, а также уменьшение на треть рецидивов заболевания было отмечено и в другом исследовании, в котором также применялась комбинированная терапия ТЬ-2

с аГнРГ [18]. Антиноцицептивное действие 1Ь-2 подтверждается и в более ранних исследованиях на животных. Так введение 1Ь-2 в часть мозга у крыс, отвечающую за физиологический ответ на стресс, привело к снижению восприятия боли. Было обнаружено, что 1Ь-2 приводит к блокированию кальциевого канала и подавлению активности сенсорных корковых нейронов [12, 67].

При сравнении клинической эффективности двух схем комбинированной терапии, включающей иммуномодуляторы ШКа-2Ь и 1Ь-2, не было отмечено достоверных различий ни в интенсивности снижения болевого синдрома, ни в числе наступления беременностей, ни в количестве рецидивов. Поэтому оба этих препарата могут применяться для повышения эффективности стандартной схемы терапии эндометриоза с использованием аГнРГ.

К механизмам, способствующим формированию болевого синдрома при НГЭ, относятся изменение анатомии органов малого таза, вследствие образования спаек, нарушение иннервации органов при сдавлении нервных окончаний формирующимися эндометриоидными инфильтратами. Однако основным механизмом, приводящим к возникновению боли, является персистирующая воспалительная реакция, которая возникает вследствие нарушения надзорных функций иммунной системы [176]. Описаны функциональные изменения иммунологических компонентов перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом, таких как моноциты/макрофаги, естественные киллерные клетки, Т- и В-лимфоциты, цитокины [242]. Однако роль этих изменений в развитии заболевания до конца не ясна.

После транслокации ткани эндометрия в брюшную полость фрагменты эндометрия должны противостоять иммунному ответу, пройти адгезию и инвазию в брюшину, чтобы сформировалась эндометриоидная гетеротопия. При эндометриозе снижение цитотоксичности КК-клеток позволяет фрагментам эндометрия выжить в брюшной полости из-за нарушения их распознавания и устранения [150]. В большинстве исследований было обнаружено, что количество цитотоксических КК-клеток снижается в ПЖ и ПК пациенток с эндометриозом, и это сопровождается общим снижением активности КК-клеток [150,224,248].

Данные литературы подтверждены и в нашем исследовании, согласно которому у пациенток с НГЭ до начала лечения отмечено снижение количества индуцировано активированных NK-клеток (NKA+) по сравнению с женщинами без данного заболевания.

Также у пациенток с НГЭ выявлено повышение количества NKT-клеток по сравнению с содержанием этих клеток у пациенток из группы контроля [12]. Известно, что NKT-клетки - это особая популяция лимфоцитов, которые экспрессируют как маркеры NK-клеток (CD16+, CD56+), так и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3+, CD4+). Среди NKT-клеток различают 2 типа. Установлено, что роль NKT-клеток I типа в противоопухолевом иммунном ответе заключается в активации NK-клеток, CD8+ Т-лимфоцитов и макрофагов посредством секреции IFNy, а также стимулировании созревания дендритных клеток и синтеза ими IL-12 и IL-2. NKT-клетки II типа участвуют в супрессии противоопухолевого иммунного ответа за счет продукции IL-13, запускающий активацию ряда сигнальных путей, которые приводят к подавлению активности CD8+ T-лимфоцитов. NKT-клетки II типа могут подавлять активность клеток I типа [1]. Данные литературы об участии NKT-клеток в патогенезе эндометриоза малочисленны, однако, учитывая важную роль данной субпопуляции клеток во взаимодействии между клеточным и гуморальным иммунным ответом, а также их участии в противоопухолевом иммунном ответе, изучение их функций при данном заболевании представляется актуальным. Мы предполагаем, что количество NKT-клеток у пациенток с НГЭ повышено за счет NKT-клеток II типа, которые не обеспечивают противоопухолевый иммунный ответ, и, как следствие, способствуют развитию и прогрессированию заболевания. Однако на настоящий момент отсутствуют исследования по изучению роли различных типов NKT-клеток в патогенезе эндометриоза. В нашей работе не выявлено различий в количестве NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов у пациенток с НГЭ и пациенток из группы контроля, т.е. NKT-клетки не оказывают в данном случае своего стимулирующего действия на эти клетки, что говорит об их возможной

дефектной работе у пациенток с эндометриозом. Однако эти данные также требуют дальнейшего изучения.

Все клетки иммунной системы взаимодействуют между собой посредством медиаторов межклеточного взаимодействия - цитокинов. Это белки, которые продуцируются лейкоцитами и оказывают свою функцию на другие лейкоциты или ткани, экспрессирующие рецептор к данному цитокину [213]. При эндометриозе происходит нарушение содержания про- и противовоспалительных и регуляторных цитокинов, дисбаланс которых, вероятно, и приводит к развитию персистирующей воспалительной реакции, носящей неэффективный характер [3].

На основании результатов нашего исследования было обнаружено, что для всех пациенток с эндометриозом характерно повышение количества провоспалительных цитокинов (1Ь-8, Т№а, МСР-1 и КАКТББ) в ПЖ и повышение содержания 1Ь-8 и КАКТББ в ПК по сравнению с контрольной группой [207]. Это не противоречит данным литературы [76,93,112,115,182] и подтверждает, что возникновение и развитие эндометриоза происходит за счет усиления ангиогенеза, повышения способности к адгезии клеток эндометрия в брюшной полости, избегания апоптоза, за которые и отвечают вышеперечисленные цитокины, поддерживающие персистирующую воспалительную реакцию. Кроме того, снижение в ПЖ пациенток с НГЭ содержания антиангиогенного хемокина 1Р-10 по сравнению с пациентками без данного заболевания также может быть одним из патогенетических факторов развития эндометриоза, за счет отсутствия эффективного подавления неоангиогенеза. Это также подтверждается данными литературы [43].

Обнаруженная нами положительная корреляционная связь между уровнем 1Ь-8 и Т№а в ПК пациенток с НГЭ и в ПЖ до начала лечения отражает наличие, как локального, так и системного воспалительного процесса и, как следствие, возникновение выраженного болевого симптома. Это подтверждается данными литературы о том, что 1Ь-8 и Т№а как в перитонеальной жидкости, так и периферической крови являются основными маркерами развития эндометриоза

[43].

Таким образом, вовлеченность иммунной системы в патогенез наружного генитального эндометриоза по данным литературы, имеет место и в представленных нами результатах, согласно которым у пациенток с НГЭ отмечено снижение способности КК-клеток реагировать активацией в ответ на действие стандартного индуктора, что позволяет клеткам эндометриоидных гетеротопий избегать апоптоза. Повышение в периферической крови числа ККТ-клеток может способствовать развитию и прогрессированию заболевания в том случае, если происходит увеличение их количества за счет популяции ККТ-клеток II типа, которые обеспечивают супрессию противоопухолевого иммунитета. Это предположение требует проверки в дальнейшем. Увеличение количества провоспалительных цитокинов, вовлеченных в патогенез заболевания, как на местном, так и на системном уровнях, способствует возникновению персистирующей воспалительной реакции. Поэтому применение в составе комплексной терапии таргетных иммуномодулирующих препаратов, способствующих коррекции вышеперечисленных нарушений, является актуальным.

Интерферон а, являясь одним из основных факторов врожденного иммунитета, участвует, в первую очередь, в неспецифическом иммунном ответе, формируя защитный барьер на пути проникновения вирусов и бактерий, а также пролиферации опухолевых клеток намного раньше специфических защитных реакций иммунитета [241]. Установлено, что ШК I типа способствуют синтезу 1Ь-15 макрофагами для последующей пролиферации и дифференцировки КК-клеток. Интерферон а усиливает таксис КК-клеток и CD8-лимфоцитов в очаг инфекции, повышает в них экспрессию перфориновой мРНК и стимулирует их литическую активность в отношении опухолевых клеток [229]. Также интерфероны I типа являются активными участниками специфического иммунного ответа. При вирусных инфекциях и онкологических заболеваниях ШК а/р, прежде всего, контролируют развитие иммунного ответа по пути ТЫ [7,183,229]. По данным литературы ШК I типа играет важную роль в дифференцировке и активации CD4+, CD8+ лимфоцитов [3]. Установленное

нами повышение общего количества Т-лимфоцитов (CD3+), а также Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических (CD3+CD8+) и В-лимфоцитов (СD19+) на фоне комбинированной терапии с применением ГРКа-2Ь - содержащего препарата и отсутствие изменения этих показателей у пациенток после монотерапии аГнРГ, не противоречит представленным выше данным о влиянии 1БК 1 типа на специфический иммунный ответ. В совокупности с клиническими данными изменения субпопуляционного состава лимфоцитов свидетельствуют в пользу реализации адекватного иммунного ответа в отношении клеток эндометриоидных гетеротопий.

КК-клетки представляют собой лимфоциты врожденной иммунной системы, которые способны убивать клетки-мишени без предварительной иммунизации и секретировать цитокины, которые участвуют в формировании адаптивного иммунного ответа и в восстановлении тканей. До настоящего момента ученые не пришли к консенсусу в отношении количественного содержания КК-клеток как в перитонеальной жидкости, так и в периферической крови при НГЭ [248]. Однако было доказано, что пациентки с НГЭ имеют сниженную цитотоксическую активность естественных киллеров, как в перитонеальной жидкости, так и в периферической крови, причем это снижение коррелирует со стадиями заболевания [128]. Сниженная активность КК-клеток является важным фактором, который способствует имплантации, выживанию и пролиферации эмигрировавших в брюшную полость эндометриальных клеток [24]. В нашем исследовании установлено снижение содержания КК-клеток у пациенток, получавших генно-инженерный интерферон, что может свидетельствовать о более благоприятном перераспределении эффекторных клеток из периферической циркуляции к патологическому очагу в области малого таза. Сохранение способности естественных киллеров к активации (ККА+) у пациенток подгруппы комбинированной терапии аГнРГ с ШКа-2Ь, по сравнению со снижением количества ККА+ при увеличении содержания КК-клеток у женщин, получавших монотерапию аГнРГ, свидетельствует о том, что меньшее число КК-клеток обладает большей цитотоксической активностью, что

в совокупности с клиническими данными свидетельствует в пользу адекватного противоопухолевого иммунного ответа. Это может быть одной из причин снижения частоты рецидивов заболевания в дальнейшем [17]. Представленные результаты противоречат более ранним данным литературы о влиянии терапии аГнРГ на КК-клетки, согласно которым лечение препаратом данной группы увеличило число и активность естественных киллерных клеток в периферической крови пациенток с НГЭ. Однако в этом же исследовании показано, что низкая активность КК-клеток во время лечения аГнРГ и через 6 месяцев после терапии была связана с высокой частотой возникновения рецидивов заболевания [17,162]. Кроме того, в литературе описано снижение цитотоксической активности КК-клеток при воздействии аГнРГ т уйго [41]. ШКа-2Ь обладает иммуномодулирующей функцией, а именно повышает активность КК-, ККТ-клеток, цитотоксических лимфоцитов. Это находит отражение в полученных нами данных в отношении ККТ-клеток. Снижение количества ККТ-клеток в ПК после комбинированной терапии с рекомбинантным интерфероном менее выражено по сравнению с группой лечения только аГнРГ (р<0,05), что может свидетельствовать о возможной реализации интерфероном своих биологических свойств.

Повышение общего числа Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических и В-лимфоцитов, а также сохранение активности КК-клеток при снижении их числа на фоне комбинированной терапии с применением интерферонозаместительного препарата свидетельствуют в пользу реализации адекватного иммунного ответа в отношении клеток эндометриоидных гетеротопий, а также о протективном действии интерферона в отношении возникновения рецидивов заболевания. В связи с этим включение в комплексную терапию иммуномодулирующего ШКа-2Ь - содержащего препарата является патогенетически обоснованным [17].

Одним из основных цитокинов, запускающих иммунный ответ и активирующих факторы, участвующие в противоопухолевой защите, является №-2. Препарат рекомбинантного №-2 обладает стимулирующим эффектом в отношении повышения цитотоксической активности КК-клеток и

цитотоксических лимфоцитов, а также повышает синтез эндогенных интерферонов [14]. Во 2 подгруппе пациенток, применявших рекомбинантный 1Ь-2 в составе комплексной терапии с аГнРГ, отмечено повышение, как количества КК-клеток, так и их способности к активации (ККА+) в ПК, что не противоречит данным литературы о влиянии препарата на эти клетки врожденного иммунитета при эндометриозе [148,253,259]. Таким образом, применение 1Ь-2 способствует элиминации вновь образующихся эндометриоидных гетеротопий и препятствует их адгезии и пролиферации в дальнейшем, и, как следствие, обладает протективным действием в отношении рецидива заболевания. Это подтверждается и более эффективным снижением выраженности болевого синдрома в подгруппе применения комбинированной терапии с рекомбинантым 1Ь-2 по сравнению с подгруппой монотерапии аГнРГ, в которой количество КК-клеток после терапии не изменилось, а активность их снизилась [12].

Следует отметить, что при сравнении динамики изменений количества КК-клеток и их активности ККА+ в обеих подгруппах после лечения, различия были выявлены лишь в содержании ККА+ (рисунок 6). Во 2 подгруппе комбинированной терапии аГнРГ в сочетании с рекомбинантным 1Ь-2 число ККА+ было значительно выше, чем в подгруппе сравнения, что также подтверждает вышеуказанную эффективность данного вида терапии.

Таким образом, применение рекомбинантного 1Ь-2 в составе комбинированной терапии эндометриоза является патогенетически обоснованным, ввиду значительного повышения активности КК-клеток по сравнению с подгруппой, получавшей монотерапию аГнРГ.

Согласно данным литературы, цитокины - белки, контролирующие клеточную миграцию, регулирующие иммунный ответ и кроветворение [266]. Т№а является провоспалительным цитокином, секретируемым нейтрофилами, активированными макрофагами при повреждении. Этот цитокин влияет на воспаление и способствует росту и имплантации эндометрия в эктопических очагах за счет увеличения экспрессии адгезионных молекул, повышения инвазивности и индукции пролиферации клеток [18]. При оценке динамики

изменения содержания данного цитокина в ПК после лечения в 1 и 3 подгруппах было обнаружено, что его количество снизилось при комбинированной терапии аГнРГ с рекомбинантным ЮТа-2Ь, на фоне увеличения количества Т№а при применении монотерапии аГнРГ. Это подтверждает небходимость включения в комплексную терапию 1БКа-2Ь для снижения имплантации и роста эндометрия в эктопических местах, подавления воспалительной реакции и, как следствие, уменьшения риска рецидива заболевания и формирования спаечного процесса [9].

Моноцитарный хемотаксический белок-1 продуцируется многими клетками, включая моноциты, эндотелиальные клетки, фибробласты, лейкоциты и клетки гладких мышц. МСР-1 - это хемоаттрактант, который рекрутирует макрофаги в брюшную полость, секретирующие в дальнейшем провоспалительные хемокины, такие как RANTES и ангиогенный №-8 [34,147]. Установлено, что RANTES стимулирует высвобождение гистамина из базофилов, участвует в формировании воспалительных инфильтратов, способствует привлечению в эндометриоидные гетеротопии макрофагов, которые, в свою очередь, индуцируют синтез RANTES. Формируется своеобразный «порочный круг», усиливающий воспалительную реакцию [34,192]. Поэтому продемонстрированное в настоящем исследовании снижение количества RANTES в ПК у пациенток с НГЭ, получавших аГнРГ в сочетании с интерфероносодержащим препаратом, в 1,1 раза в отличие от подгруппы сравнения, в которой содержание RANTES в ПК увеличилось в 1,2 раза, свидетельствует о более эффективном снижении выраженности воспалительной реакции на фоне комбинированной терапии. Следует отметить, что повышение содержания хемокина МСР-1 после применения интерферонсодежащего препарата в составе комбинированной терапии, не противоречит данным литературы, в которых указано, что ШК I типа стимулируют синтез хемокинов - МСР-1, МСР-3 и 1Р-10 эндотелиальными клетками, необходимых для привлечения моноцитов/макрофагов, КК-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов [5]. Поэтому можно предположить, что IFNа-2b, повышая содержание МСР-1 в ПК, способствует привлечению моноцитов и, таким образом, обеспечивает более эффективный противоопухолевый иммунный

ответ. Это подтверждается результатами пациенток, получавших монотерапию аГнРГ, у которых количество МСР-1 в ПК не изменилось. Несмотря на описанную выше способность МСР-1 к увеличению секреции 1Ь-8 и RANTES, в ПК пациенток из 1 подгруппы после лечения концентрация 1Ь-8 не изменяется, а RANTES снижется. Поэтому мы можем предположить, что несмотря на увеличение содержания МСР-1 в ПК после проведенной терапии аГнРГ в сочетании с иммуномодулирующим препаратом, функция этого цитокина изменяется и в дальнейшем эффективность воспалительного ответа уменьшается

[9].

Таким образом, влияние препарата рекомбинантного IFNа-2b на цитокиновый профиль свидетельствует о более интенсивном подавлении процессов неоангиогенеза и воспаления. Проведение дальнейших исследований, расширяющих объем выборки пациентов и спектр цитокинов, позволит в будущем предложить максимально точный подход к диагностике и мониторингу цитокинотерапии НГЭ.

Нами было обнаружено, что применение рекомбинантного 1Ь-2 в составе комбинированной терапии НГЭ сопровождалось снижением количества КАКЫТЕБ в ПК, по сравнению с использованием только гормономодулирующей терапии аГнРГ, при которой количество данного хемокина возросло. Это способствует уменьшению привлечения лейкоцитов данным хемокином и, как следствие, уменьшению воспалительной реакции, что находит отражение в клинических результатах. Согласно данным литературы КАКЫТЕБ является хемоаттрактантом для КК-клеток [163]. Поэтому, так как после применения 1Ь-2 в ПК отмечено повышение, как количества КК-клеток, так и их способности к активации, это могло способствовать снижению содержания КАКЫТЕБ по принципу обратной связи. Однако механизм, при помощи которого 1Ь-2 воздействует на КАКЫТЕБ, не описан в литературе и требует дальнейшего изучения.

Кроме того, после применения 1Ь-2 в составе комплексной терапии в ПК пациенток с НГЭ было отмечено повышение количества 1Р-10. Цитокин 1Р-10 обладает выраженным ангиостатическим действием [205]. Таким образом,

повышая количество 1Р-10 у пациенток с эндометриозом, ГБ-2 может снижать прогрессирование патологического процесса за счет уменьшения неоангиогенеза, который также является одним из ключевых звеньев в развитии заболевания. Однако при сравнении динамики содержания данного цитокина после лечения в обеих подгруппах терапии не было обнаружено достоверных различий. Поэтому требуются дальнейшие исследования для установления влияния №-2 на 1Р-10, учитывая важную роль данного хемокина в патогенезе заболевания.

Влияние рекомбинантного №-2 на цитокиновый профиль еще раз подтверждает патогенетическую обоснованность его применения в составе комплексной терапии НГЭ за счет снижения выраженности воспалительной реакции, а также возможного подавления процессов неоангиогнеза.

Микровезикулы - внеклеточные структуры, окруженные билипидной мембранной, своеобразные транспортные системы, способные передавать биологически активные вещества и генетический материал между клетками [6,30]. В настоящий момент они рассматриваются в качестве важнейших регуляторов межклеточных взаимодействий [167] и участников физиологических и патофизиологических процессов [37]. Считают, что МВ могут выступать диагностическими маркерами различных заболеваний [77].

Определяемые в настоящем диссертационном исследовании поверхностные маркеры лейкоцитов не являются узко специфичными, и их экспрессия характерна для нескольких типов клеток, присутствующих в ПК (таблица 9).

По полученным нами данным НГЭ сопровождается появлением в периферической крови повышенного количества МВ, экспрессирующих такие поверхностные маркеры как СD14+ и СD16+, а также комбинацию антигенов СD54+CD14+ на своей поверхности. Моноциты и нейтрофилы являются источником CD14+, CD16+ и СD54+CD14+ микровезикул. Кроме того, CD16+ МВ также могут выделяться КК-клетками (таблица 9).

Таблица 9 - Антигены на поверхности основных популяций лейкоцитов в периферической крови

Маркеры на поверхности лейкоцитов Основные популяции лейкоцитов ПК, на поверхности которых расположены указанные маркеры Ссылки

CD3 Т-лимфоциты, КККТ-клетки [113], [149]

CD4 Т-лимфоциты хелперы, регуляторные Т-лимфоциты [47]

CD8 Цитотоксические Т-лимфоциты [238]

CD16 КК-клетки, моноциты, нейтрофилы [61], [125], [181]

CD14 Нейтрофилы, моноциты [123], [130]

CD56 КК-клетки, ККТ-клетки , моноциты [49], [195]

CD45 Все лейкоциты [217]

CD54 Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки [249], [124], [80]

CD45+CD3+ Т-лимфоциты [58]

CD45+CD4+ Т-лимфоциты хелперы, регуляторные Т-лимфоциты [47]

CD45+CD8+ Цитотоксические Т-лимфоциты [124]

CD3+CD4+ Т-лимфоциты хелперы [246]

CD3+CD8+ Цитотоксические Т-лимфоциты [107]

CD4+CD8+ Незрелые Т-лимфоциты

CD45+CD54+ Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки

CD45+CD14+ Нейтрофилы, моноциты

CD45+CD56+ КК-клетки , ККТ-клетки, моноциты [49], [195]

CD45+CD16+ Нейтрофилы, моноциты, КК-клетки [180], [231], [267]

CD56+CD16+ ККК-клетки [51]

CD16+CD14+ Моноциты [48]

CD56+CD14+ Моноциты [126]

CD54+CD56+ ККК-клетки [255]

CD54+CD14+ Моноциты [124]

Именно моноциты, нейтрофилы и ККК-клетки играют ключевую роль в развитии и прогрессировании эндометриоза. Установлено, что для ПЖ пациенток с НГЭ характерна повышенная инфильтрация нейтрофилами по сравнению с женщинами без данного заболевания [242]. Это, вероятно, является

результатом повышенной концентрации сильнодействующего хемоаттрактанта нейтрофилов, такого как ГБ-8, который присутствует в плазме и в перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом [233]. Это подтверждается и нашими результатами, согласно которым для пациенток с НГЭ характерно повышение содержания ГБ-8 как в ПК, так и в ПЖ. Кроме того, выявленная сильная положительная корреляционная связь между количеством №-8 в ПК и ПЖ отражает наличие воспалительной реакции, как на местном, так и на системном уровнях. Поэтому повышение количества микровезикул с поверхностными маркерами, присущими нейтрофилам, вероятно, свидетельствует об активации данных клеток и выраженности воспалительного процесса при эндометриозе и требует дальнейшего изучения.

Моноциты представляют собой крупные лейкоциты системы мононуклеарных макрофагов. Известно, что активированные макрофаги принимают участие в патогенезе эндометриоза путем синтеза растворимых медиаторов, таких как цитокины, простагландины, компоненты комплемента и ферменты. Через секрецию этих иммуномедиаторов, макрофаги могут вызывать воспаление, восстановление тканей, неоваскуляризацию, а также способствовать привлечению фибробластов и эндотелиальных клеток [128]. Так макрофаги ПЖ женщин с эндометриозом обладают повышенной способностью секретировать МСР-1, который играет роль в привлечении моноцитов ПК к участкам повреждения и воспаления [230]. Это находит отражение и в наших результатах, согласно которым в ПЖ пациенток с НГЭ выявлено повышение содержания хемокина МСР-1 по сравнению с женщинами контрольной группы.

Полученная нами хорошая прогностическая значимость модели взаимосвязи между содержанием в ПК микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ и НГЭ, на основании построения ROC-кривой, дает возможность использовать микровезикулы с вышеуказанным фенотипом в качестве неинвазивного диагностического маркера для постановки диагноза НГЭ. Содержание в плазме крови микровезикул с фенотипом CD54+CD14+ равное 5,22% (точка порога

классификации) или превышающее данное значение соответствует прогнозу наличия НГЭ с 80,5% чувствительностью и 71% специфичностью.

КК-клетки - это лимфоциты врожденной иммунной системы, которые могут убивать множество клеток-мишеней и секретируют цитокины, которые также участвуют в патогенезе генитального эндометриоза [190]. КК-клетки способны различать клетки, подвергшиеся повреждению, за счет ингибирующих и активирующих рецепторов. Одним из таких активирующих рецепторов является CD16+, который обладает способность связывать и разрушать поврежденные клетки, покрытые иммуноглобулином О (IgG), с помощью механизма, называемого антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность [184]. Повышенное число микровезикул с рецептором CD16+ в ПК пациенток с НГЭ свидетельствует о повышении у них числа активированных КК-клеток. Однако это не совпадает с полученными нами данными о снижении числа КК-клеток со способностью реагировать активацией на действие стандартного индуктора у пациенток с НГЭ, а также с данными литературы. Возможно, число микровезикул с фенотипом CD16+ у пациенток с эндометриозом увеличивается в ПК за счет активации CD16+ иККК, так как часть КК-клеток матки мигрирует из периферической крови. Показано, что при НГЭ повышено количество цитотоксических клеток CD16+ иККК в эутопическом эндометрии, по сравнению с фертильными женщинами из группы контроля [55]. Это указывает на то, что измененные клетки иККК у женщин с эндометриозом могут приводить к созданию чрезмерной воспалительной среды во время имплантации или децидуализации, что, в свою очередь, увеличивает риск бесплодия и невынашивания беременности [55]. Это подтверждается и нашими результатами, согласно которым у 73,3% пациенток с НГЭ наблюдалось первичное бесплодие, а у 22,5% женщин в анамнезе отмечены самопроизвольный выкидыш и неразвивающаяся беременность.

Обнаруженная нами положительная корреляционная связь между содержанием КК-клеток в ПК пациенток с эндометриозом и микровезикул с фенотипами CD54+ (Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки), CD45+CD54+

(Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки) и CD54+56+ (КК-клетки), указывает на то, что перечисленные микровезикулы образуются данными клетками врожденной иммунной системы, которые играют ключевую роль в патогенезе заболевания.

Также у пациенток с эндометриозом было выявлено снижение содержания в ПК микровезикул с фенотипом CD45+CD4+ (Т-хелперы, регуляторные Т-лимфоциты), CD3+CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (цитотоксические лимфоциты) (таблица 9). Т-лимфоциты являются субпопуляцией адаптивного иммунитета, которые играют важную роль в выживании и пролиферации клеток эндометрия [162]. Исследования, в которых оценивали Т-лимфоциты у пациенток с эндометриозом, показали более высокий уровень соотношения CD4/CD8 и повышенную концентрацию каждой подгруппы в перитонеальной жидкости этих женщин [243]. Более высокая концентрация Т-лимфоцитов была выявлена в эндометриоидных гетеротопиях, по сравнению с эутопическим эндометрием, но с аналогичным соотношением CD4/CD8. В ПК пациенток с НГЭ отмечено увеличение общего числа Т-лимфоцитов, но различий в соотношении CD4/CD8 не обнаружено [128].

Другой важной подгруппой Т-лимфоцитов являются регуляторные Т-клетки (Treg). Они рассматриваются как мощные супрессоры воспалительного иммунного ответа и отвечают за поддержание антиген-специфической толерантности и иммунного гомеостаза [74]. В систематическом обзоре оценивали роль Treg при эндометриозе. Авторы пришли к выводу, что в ПЖ и в эндометриоидных гетеротопиях у женщин с НГЭ наблюдается более высокая концентрация Treg-клеток и/или экспрессия их маркеров по сравнению с пациентками из группы контроля. Однако нет единого мнения о концентрации Treg-клеток в эутопическом эндометрии и в периферической крови пациенток с НГЭ [262].

Согласно полученным нами данным в ПК пациенток с НГЭ количество СD4+ и CD8+ лимфоцитов не отличается от их содержания у здоровых женщин, но сниженное количество микровезикул, выделяемых данными клетками,

возможно, показывает снижение их активации и уменьшения цитотоксического действия в отношении клеток эндометриоидных гетеротопий.

Таким образом, изучение феномена образования микровезикул эукариотическими клетками в периферической крови женщин с эндометриозом является перспективным направлением для изучения патогенеза заболевания, разработки маркеров для его диагностики и контроля над эффективностью лечения. Полученные нами результаты об увеличении в ПК женщин с НГЭ I и II степени количества микровезикул с фенотипами СD14+ и СD16+, а также снижение количества МВ с фенотипами CD45+CD4+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ присущими нейтрофилам, КК-клеткам, Т-хелперам, регуляторным Т-лимфоцитам и цитотоксическим лимфоцитам соответственно, свидетельствуют о возможном участии данных МВ в развитии и прогрессировании эндометриоза и требуют дальнейшего изучения. Так как именно эти клетки иммунной системы играют ключевую роль в патогенезе заболевания за счет участия в реализации воспалительного процесса. С высокой чувствительность (80,5%) и приемлемой специфичностью (71%) количество микровезикул с фенотипом СD54+CD14+ равное 5,22% и выше возможно использовать в качестве маркера для ранней неинвазивной диагностики НГЭ 1-11 степени распространенности в периферической крови пациенток с болевым синдромом.

Для пациенток, которые применяли комбинированную терапию аГнРГ совместно с рекомбинантным ШКа-2Ь, характерно снижение количества микровезикул с фенотипом CD4+ (Т-лимфоциты хелперы, регуляторные Т-лимфоциты) в ПК. Также обнаружена высокая положительная корреляционная связь между МВ с данным фенотипом и количеством CD3+ лимфоцитов, что характеризует принадлежность МВ CD4+ к данному типу клеток. Интерфероны 1 типа обладают уникальным спектром биологической активности и являются наиболее изученными медиаторами врождённого иммунитета. Доказано, что действие ИФН реализуется с помощью множества механизмов, одним из которых является стимуляция Т-клеточного ответа за счет активации дифференцировки Т-клеток в сторону Т-хелперов [40]. В нашем исследовании количество МВ,

которые несут поверхностные маркеры присущие Т-хелперами и регуляторным Т-лимфоцитам в ПК пациенток с НГЭ снизилось, что, возможно, связано с перераспределением данных клеток из периферической крови к вновь образующимся эндометриодным очагам в брюшной полости. При сравнении динамики изменения состава МВ в ПК после терапии между подгруппами было выявлено, что после применения комбинированной терапии аГнРГ совместно с ШКа-2Ь содержание МВ с фенотипами CD45+ (все лейкоциты), CD14+ (нейтрофилы, моноциты), CD4+ (Т-лимфоциты хелперы, регуляторные Т-лимфоциты) было снижено по сравнению с этими же показателями в подгруппе лечения только аГнРГ, что также подтверждает возможное перераспределение этих клеток из ПК в брюшную полость к новым очагам эндометриоза.

В периферической крови пациенток с НГЭ, которые применяли комбинированную терапию аГнРГ совместно с рекомбинантным 1Ь-2, выявлено увеличение содержание МВ с поверхностными маркерами СD3+ (Т-лимфоциты, ККТ-клетки), CD45+CD3+ (Т-лимфоциты), CD45+CD4+ (Т-лимфоциты хелперы, регуляторные Т-лимфоциты, CD3+CD4+ (Т-лимфоциты хелперы), CD3+CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD45+CD54+ (Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки) (таблица 9). А также обнаружена высокая положительная корреляционная связь между концентрацией КК-клеток, отвечающих активацией на действие стандартного индуктора, и МВ с фенотипами CD45+CD54+, CD45+CD56+, CD56+CD14+ и CD54+CD56+, что отражает происхождение данных МВ от КК-клеток вследствие их активации. Интерлейкин-2 стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, моноцитов и КК-клеток [81]. Данный цитокин активирует Т-хелперы и цитотоксические лимфоциты к выполнению их основных функций в защитных реакциях организма. В Т-лимфоцитах он стимулирует продукцию самого 1Ь-2 и усиление цитотоксических свойств, в В-лимфоцитах стимулирует синтез антител, в КК-клетках - противоопухолевую активность, в моноцитах синтез провоспалительных цитокинов и усиливает фагоцитоз [105]. Иммуномодулирующее влияние данного цитокина подтверждается составом МВ

в ПК у пациенток, получавших комбинированную терапию с рекомбинантным 1Ь-2, который, вероятно, способствует активации Т-лимфоцитов хелперов, Т регуляторных лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоциты, моноцитов и КК-клеток. Таким образом, направляя иммунный ответ для элиминации вновь образующихся эндометриоидных гетеротопий.

Следует отметить, что при сравнении динамики изменения состава МВ в ПК пациенток с НГЭ после применения комбинированной терапии аГнРГ совместно с 1Ь-2 и при применении только терапии с аГнРГ не было выявлено достоверных различий ни по одному из показателей. Возможно, отсутствие различий в показателях между подгруппами после лечения не обнаружены в ПК, но были бы выявлены в ПЖ, так как эндометриоз - это патологический процесс, характеризующийся в большей степени местной воспалительной реакцией в брюшной полости. Данное утверждение не противоречит полученным нами результатам, согласно которым несмотря на увеличение в ПК способности КК-клеток к активации после применения терапии аГнРГ совместно с 1Ь-2 у пациенток с НГЭ, количество микровезикул с фенотипом CD56+, принадлежащих этим клеткам и секретируемых ими при активации [50] не изменяется. Поэтому в дальнейшем требуется изучение состава микровезул перитонеальной жидкости у пациенток с НГЭ после применения рекомбинантного 1Ь-2.

После применения монотерапии аГнРГ в ПК пациенток с НГЭ повысилось содержание микровезикул с фенотипами CD3+ (Т-лимфоциты, ККТ-клетки), CD14+ (нейтрофилы, моноциты) и CD54+ (Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки), а также увеличивалось количество дубль-позитивных МВ: CD45+CD3+ (Т-лимфоциты), CD45+CD4+ (Т-лимфоциты хелперы, Т регуляторные лимфоциты), CD3+CD4+ (Т-лимфоциты хелперы), CD45+CD54+ (Т-лимфоциты, моноциты, КК-клетки), CD45+CD14+ (нейтрофилы, моноциты), CD45+CD56+ (КК-клетки), CD45+CD16+ (нейтрофилы, моноциты, КК-клетки), CD56+CD14+ (моноциты), CD54+CD56+ (КК-клетки, моноциты), CD54+CD14+ (моноциты) (таблица 9).

Повышенный уровень эстрогенов лежит в основе патогенеза эндометриоза, так как под влиянием данного гормона происходит рост и пролиферация клеток

эндометриоидных гетеротопий. Поэтому применение аГнРГ, направленное на снижение содержания данного гормона, является одним из основных методов гормональной терапии заболевания на настоящий момент. Однако эстрогены также оказывают важное влияние на функционирование клеток иммунной системы. Так давно признано, что стероидные гормоны играют важную роль в регуляции иммунного ответа при воздействии инфекции или повреждении тканей и модулируют все уровни врожденного иммунитета (нейтрофилы, макрофаги / моноциты, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки), а также звенья адаптивного иммунитета (Т- и В-клетки) [178]. Было показано, что эстрогены регулируют количество нейтрофилов, уменьшая содержание таких хемоаттрактантов как СХСЛ, СХСБ2, СХСБ3 и СХСБ8 в очагах воспаления на моделях кишечника и легких у грызунов. За счет этого подавляется избыточное накопление нейтрофилов и, как следствие, развитие чрезмерного воспалительного иммунного ответа [178]. Также эстрогены подавляют выработку провоспалительных хемокинов, таких как МСР-1, Т№а, 1Ь-1р и 1Ь-6 нейтрофилами и макрофагами у мышей и людей [99,177]. Эстрогены активируют Treg лимфоциты, способные вызывать иммунную толерантность, подавляя провоспалительные ответы. Роль эстрогенов в иммунной толерантности продемонстрирована во время беременности, когда под влиянием этого гормона активируются Treg лимфоциты и организм матери становится менее восприимчивым к антигенам плода [152]. Эффекты эстрогенов имеют значение и для других подтипов Т-клеток. Например, было показано, что эстрогены ингибируют продукцию ТЫ- и ТЫ7- лимфоцитами провоспалительных цитокинов, включая ШКу, Т№а и 1Ь-17 [101]. Поэтому аГнРГ, подавляя влияние данного гормона на клетки эндометриоидных гетеротопий, одновременно снижают и его иммуномодулирующее влияние на клетки иммунной системы, способствуя ее ненаправленной активации. Это подтверждается полученными нами результатами о повышении в ПК пациенток с НГЭ в подгруппе 3 (монотерапии аГнРГ) количества МВ, принадлежащих следующим типам клеток: ККТ-клетки, нейтрофилы, моноциты, КК-клетки, Т-лимфоциты хелперы, регуляторные

Т-лимфоциты. Это может свидетельствовать о чрезмерной активации указанных клеток и, как следствие, объясняет наличие рецидивов заболевания в данной подгруппе больных.

Таким образом, применение терапии только аГнРГ способствует снижению уровня эстрогенов в ПК пациенток с НГЭ и одновременно снижает иммуномодулирующее действие данного гормона на иммунную систему, активируя клетки, как адаптивного, так и врожденного иммунитета. Добавление иммуномодулирующих препаратов к гормональной терапии способствует направленному действию клеток иммунитета в отношении эндометриоидных поражений.

В нашем исследовании продемонстрировано, что применение иммуномодулирующих препаратов в составе комплексной терапии НГЭ повышает эффективность проводимого лечения, снижая интенсивность болевого синдрома, увеличивая длительность безрецидивного периода и частоту наступления беременности, по сравнению со стандартной схемой терапии аГнРГ рекомбинантный 1№а-2Ь оказывает положительное иммуномодулирующее влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов (повышает количество Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, а также цитотоксических лимфоцитов), сохраняет способность КК-клеток к активации при снижении их количества, а также уменьшает выраженность воспалительной реакции за счет снижения содержания цитокинов RANTES и Т№а в ПК. Включение рекомбинантного 1Ь-2 в комплексную терапию НГЭ совместно с аГнРГ повышает эффективность лечения за счет увеличения количества КК-клеток и их способности реагировать активацией на добавление стандартного индуктора, снижения выраженности воспалительного процесса и ангиогенеза, проявляющихся уменьшением количества RANTES и повышением содержания 1Р-10 в ПК. Поэтому использование рекомбинантных ШБа-2Ь и 1Ь-2 может быть рекомендовано как в дополнение к гормональной терапии аГнРГ, а также в качестве противорецидивной стратегии лечения.

ВЫВОДЫ