ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Романенков, Андрей Сергеевич

• Романенков, Андрей Сергеевич
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Романенков, Андрей Сергеевич

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ nf-кВ с участками узнавания в днк (литературный обзор).

1.1. Функционирование и роль NF-кВ в клетке.

1.2. Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом рентгеноструктурного анализа.

1.3. Определение ДНК-белковых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК в растворе.

1.3.1. Использование метода химической модификации для зондирования контактов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК.

1.3.1.1. Химическая модификация ДНК.

1.3.1.2. Химическая модификация аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-кВ.

1.3.2. Использование мутантных форм белка для определения аминокислотных остатков фактора транскрипции NF-kB, принимающих участие в связывании ДНК и димеризации.

1.3.3. Использование метода аффинной модификации белка реакционноспособными аналогами ДНК для зондирования контактов фактора транскрипции NF-кВ с кВ-участком.

2. ДНК-ДУПЛЕКСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ГРУППИРОВКИ В УГЛЕВОДОФОСФАТНОМ ОСТОВЕ,

КАК РЕАГЕНТЫ ДЛЯ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ

ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА И ЛИЗИНА БЕЛКОВ (обсуждение результатов).

2.1. Анализ бслково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК.

2.2. Аффинная модификация остатков цистеина белков ДНК-дуплексами, содержащими реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове.

2.2.1. Использование ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2'-дезокси-2'~ йодацетамидоуридиновые звенья, для аффинной модификации белков.

2.2.1.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичной 2-йодацетамидной группировкой.

2.2.1.2. Комплексообразование и ковалентное связывание 2'-йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.2.2. Использование ДНК-дуплексов с единичными 2 -дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями для аффинной модификации белков.

2.2.2.1. Синтез и свойства олигонуклеотидов с единичными 2'-дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями.

2.2.2.2. Ковалентное связывание ДНК-дуплексов с единичными 2'-дисульфидсодержащими уридиновыми звеньями с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.2.3. Использование ДНК-дуплексов, содержащих межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки, для аффинной модификации белков.

2.2.3.1. Синтез и свойства фосфорилдисульфидсодержащих олигонуклеотидов.

2.2.3.2. Комплексообразование и ковалентное связывание фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.2.3.3. Ковалентное связывание фосфорилдисульфидсодержащих

ДНК-дуплексов с ДНК-метилтрансферазой SsoII.

2.3. Аффинная модификация остатков лизина белков ДНК-дуплексами, содержащими реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове.

2.3.1. Использование ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2,-0-(2-оксоэтил)уридиновые (цитидиновые) звенья, для аффинной модификации белков.

2.3.1.1. Комплексообразование и ковалентное связывание 2'-альдегид-содержащих ДНК-лигандов с гомодимером р50 субъединицы NF-kB.

2.3.1.2. Ковалентное связывание 2'-альдегидсодержащих ДНК-лигандов с ДНК-метилтрансферазой SsoII. Исследование возможности одновременного участия С-концевой (метилирующей) и N-концевой («регуляторной») областей M.SsoII во взаимодействии с ДНК.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков»

Нуклеиново-белковые взаимодействия являются определяющими для основных процессов, протекающих в клетке - репликации, транскрипции и трансляции ДНК, а также при процессинге РНК. Структуру НК-белковых комплексов изучают как с помощью инструментальных методов, например, рентгеноструктурного анализа (РСА) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), так и молекулярио-биологических подходов: направленной замены определенных аминокислотных остатков белка и ковалентного связывания белков с НК. Безусловно, наиболее достоверная информация о структуре НК-белкового комплекса может быть получена методом РСА, однако выделение и кристаллизация соответствующего комплекса возможны далеко не всегда. Кроме того, РСА часто не позволяет выявить конформационные перестройки белков при их взаимодействии с НК и влияние нуклеотидной последовательности участков НК, фланкирующих участок связывания белка. ЯМР-спектроскопия, один из методов изучения динамики белково-нуклеиновых комплексов в растворе, не всегда может быть использована для изучения сложных мультисубъединичных комплексов, а также в том случае, когда в процессе взаимодействия происходит значительное изменение структуры биополимеров. Направленная замена определенных аминокислотных остатков белков является мощным и активно используемым методом анализа НК-белковых взаимодействий, однако он весьма трудоемок и в ряде случаев дает некорректную информацию из-за изменения структуры биополимеров, вызванной заменой функциональных остатков аминокислот.

В ряду молекулярио-биологических подходов важное место занимает метод ковалентного связывания белка с НК. Существует ряд задач, для решения которых этот метод на сегодняшний день представляется оптимальным. Прежде всего, он позволяет идентифицировать отдельные аминокислоты белка, взаимодействующие с заданным фрагментом НК в НК-белковом комплексе [1-5]. При изучении мультибелковых комплексов, образующихся при репликации, трансляции и т.п., возможно определение белкового компонента, взаимодействующего с определенным участком НК [6]. Этот подход может использоваться для поиска в клеточных экстрактах белков, селективно взаимодействующих с определенной нуклеотидной последовательностью, а также в технологии SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) для создания олигонуклеотидов специфической первичной структуры (НК-аптамеров), необратимо связывающихся с белком [7, 8]. В последние годы достигнуты определенные успехи в кристаллизации ковалентно связанных НК-белковых комплексов и изучении их структур методом РСА [9]. Авторы подчеркивают, что ковалентное взаимодействие ферментов нуклеинового обмена с НК является уникальной возможностью получения комплексов в определенном структурном состоянии и предлагают использовать эту стратегию как необходимый этап, предшествующий РСА.

В настоящее время наиболее широко используется фотоаффинная модификация белков, в основе которой лежит ковалентное связывание немодифицированных или модифицированных нуклеиновых кислот с белками под действием УФ-излучения [10-13]. Однако, из-за неспецифичности взаимодействия, происходящего при облучении УФ-светом, данный метод вряд ли можно признать универсальным. Кроме того, для него также характерны низкие выходы НК-белковых конъюгатов и деструкция биополимеров.

Химические методы присоединения белков к НК основаны на использовании неспецифических агентов, например, формальдегида [14-16], а также на селективном введении в состав белка или НК реакционноспособных группировок. В последнем случае основное внимание уделяется использованию модифицированных НК для зондирования белково-нуклеиновых контактов, т.е. определения аминокислот, сближенных с нуклеиновой кислотой в участке специфического связывания [17]. Возможность вводить активную группировку в любое заранее выбранное положение олигонуклеотидной цепи позволяет зондировать точечные контакты между различными участками биомолекул. Оптимальные для ковалентного связывания НК-реагенты должны обладать рядом характерных свойств:

1) селективно взаимодействовать со сближенными в пространстве функциональными группами аминокислот белка;

2) образовывать устойчивый конъюгат с белком без дополнительной активации извне при физиологических значениях рН (6,0-8,0);

3) сохранять стабильность в нейтральных водных растворах в течение длительного времени без потери реакционной способности.

Химически активные группы могут быть введены в любое положение НК -гетероциклическое основание и различные участки углеводофосфатного остова. Однако следует отметить, что наиболее часто используемая модификация гетероциклических оснований может нарушать как комплементационные взаимодействия в НК, так и специфические взаимодействия в белково-нуклеиновом комплексе. В тоже время, введение химически активных групп по концевым фосфатным группам не несет полезной информации о структуре НК-связывающего центра белка, так как аффинной модификации чаще всего подвергаются его нефункциональные участки.

Известно, что контакты между белком и углеводофосфатным остовом НК составляют более половины всех взаимодействий в белково-нуклеиновом комплексе и вносят существенный вклад в его устойчивость и структурную организацию. В связи с этим для изучения особенностей функционирования ДНК-узпающих белков и ферментов необходимо создание ДНК-лигандов с модифицированными межнуклеотидными фосфатными группами и углеводными остатками. Наиболее перспективным представляется введение в состав синтетических олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов различных реакциопноспособных группировок, способных селективно взаимодействовать с остатками лизина, аргинина или цистеина, реализующими большую часть контактов белка с углеводофосфатным остовом ДНК [18]. Подобные ДНК-реагенты представлены пока малочисленным классом соединений, к числу которых можно отнести дуплексы с межнуклеотидными замещенными пирофосфатными и ацилфосфатными группировками [19-25], а также диальдегидсодержащие аналоги НК [26, 27].

В настоящей работе было проведено всестороннее исследование возможности использования для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белков ДНК-дуплексов, содержащих единичные 2'-йодацетамидные, 2-дисульфидсодержащие, 2'-0-2-оксоэтильные и межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки. Важной • особенностью предложенных ДНК-лигандов является то, что модифицированные уридиновые или цитидиновые звенья могут быть введены в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи. Реакционноспособные группировки в составе 2'-йодацетамид-, 2'-дисульфид- и фосфорилдисульфидсодержащих ДНК-дуплексов способны селективно взаимодействовать с тиогруппами пространственно сближенных остатков цистеина белков, а 2'-0-2-оксоэтильная группировка ДНК-лиганда - подвергаться нуклеофильной атаке со стороны е-аминогрупп остатков лизина.

В процессе работы предложенные ДНК-лиганды применяли для аффинной модификации двух ДНК-узнающих белков: гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека и прокариотической ДНК-метилтрансферазы SsoII (M.SsoII), входящей в систему рестрикции-модификации Shigella sonnei 47. Следует отметить, что для фактора транскрипции NF-кВ в литературе имеются данные рентгеноструктурного анализа его комплексов с различными последовательностями участка узнавания ДНК. Сравнение данных РСА с результатами аффинной модификации позволяет оценить целесообразность использования тех или иных типов ДНК-лигандов для изучения структурно-функциональных аспектов взаимодействия различных белков, в частности M.SsoII, с углеводофосфатным остовом участка узнавания в ДНК. Для M.SsoII отсутствуют данные

РСА ее комплексов с ДНК, однако, известно, что в составе этого белка присутствуют два различных ДНК-связывающих центра, обуславливающие способность M.SsoII выступать, с одной стороны, как С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза, а с другой - как фактор транскрипции, связывающийся с «регуляторным» участком, локализованным в промоторной области генов системы рестрикции-модификации SsoII. При отсутствии данных РСА метод аффинной модификации белка предложенными реакционноспособными ДНК-лигандами позволял нам проверить способность M.SsoII формировать комплекс, в состав которого входит как участок метилирования, так и «регуляторный» участок, а также выявить некоторые особенности, сопровождающие образование такого комплекса.

Работа содержит литературный обзор, посвященный особенностям взаимодействия фактора транскрипции NF-кВ с участками узнавания ДНК, изученным с помощью различных методов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Романенков, Андрей Сергеевич

выводы

Сконструированы ДНК-лиганды для аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ и С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII — синтетические дуплексы, содержащие единичную межнуклеотидную фосфорилдисульфидную, 2'-йодацетамидную или 2'-С>-2-оксоэтильную группировку в заданном положении углеводофосфатного остова ДНК. Впервые разработаны методы получения и изучены свойства 2'-дисульфидсодержащих ДНК-лигандов, реакционная способность которых варьировалась путем замены остатка 2-тиопиридила в составе единичных 2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]уридиновых звеньев на остаток тиогликолевой кислоты, цистеина или глутатиона.

На основании имеющихся рентгеноструктурных данных с привлечением методов компьютерного моделирования проанализированы контакты в различных комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. Построены схемы ДНК-белковых взаимодействий гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ с кВ-участком различной нуклеотидной последовательности: Id-кВ (5'-GGGAATTCCC-3') и Ig-кВ (5'-GGGACTTTCC-3')- Полученная информация использована для выбора места введения реакционноспособных группировок в состав углеводофосфатного остова участка узнавания ДНК и интерпретации результатов аффинной модификации гомодимера р50 NF-кВ различными ДНК-лигандами.

Установлено, что ДНК-лиганды, содерл<ащие единичные 2'-йодацетамидные, 2'-(З-цистеинилтио)пропионамидные или межнуклеотидные фосфорилдисульфидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка. Результаты аффинной модификации гомодимера р50 субъединицы NF-кВ тремя типами модифицированных дуплексов свидетельствуют о сближенности остатка Cys59 белка с 7Ь|М нуклеотидом (Id-кВ)- и (Ig-кВ)-участка и демонстрируют его различную локализацию по отношению к 60му нуклеотиду этих участков узнавания в составе специфических ДНК-белковых комплексов.

С помощью ДНК-лигандов, содержащих единичные 2'-0-2-оксоэтильиые группировки в составе кВ-участка, выявлены остатки лизина р50 субъединицы NF-kB, предпололсительно сближенные с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания ДНК-дуплекса гомодимером р50.

Методом аффинной модификации ДНК-метилтрансферазы SsoII ДНК-лигандами, содержащими фосфорилдисульфидную или 2'-0-2-оксоэтильную группировку, продемонстрирована возможность одновременного взаимодействия белка с метилируемой и «регуляторной» последовательностями ДНК. Установлено, что необратимое связывание N-концевой («регуляторной») области метилтрансферазы SsoII препятствует взаимодействию Cysl42 каталитического центра фермента с фосфорилдисульфидной группировкой в составе участка метилирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Романенков, Андрей Сергеевич, 2006 год

1. Шефлян Г.Я., Кубарева Е.А., Громова Е.С. Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам. // Успехи Химии. 1996. Т. 65. С. 765-781.

2. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции. // Успехи Химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.

3. Knorre D.G., Godovikova T.S. Photoaffinity labeling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes. // FEBS Lett. 1998. V. 433. P. 9-14.

4. Кнорре Д.Г., Годовикова T.C. Химические подходы к исследованию нуклеопротеидных структур. // Изв. РАН. Сер.хим. 1999. С. 1225-1231.

5. Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д. Химические подходы к изучению надмолекулярных биологических структур на примере хроматина. // Успехи химии. 1999. Т. 68. С. 365-375.

6. Kassabov S.R., Henry N.M., Zofall М., Tsukiyama Т., Bartholomew В. High-resolution mapping of changes in histone-DNA contacts of nucleosomes remodeled by ISW2. // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 7524-7534.

7. Golden M.C., Collins B.D., Willis M.C., Koch Т.Н. Diagnostic potential of PhotoSELEX-evolved ssDNA aptamers. II J. Biotechnol. 2000. V. 81. P. 167-178.

8. Smith D., Collins B.D., Heil J., Koch Т.Н. Sensitivity and specificity of photoaptamer probes. // Mol. Cell. Proteomics. 2003. V. 2. P. 11-18.

9. Verdine G.L., Norman D.P. Covalent trapping of protein-DNA complexes. // Annu.Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 337-366.

10. Rehrauer W.M., Kowalczykowski S.C. The DNA binding site(s) of the Escherichia coli RecA protein. II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 11996-12002.

11. Naryshkin N., Kim Y., Dong Q., Ebright R.H. Site-specific protein-DNA photocrosslinking. Analysis of bacterial transcription initiation complexes. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 148. P. 337-361.

12. Persinger J., Bartholomew B. Site-directed DNA photoaffinity labeling of RNA polymerase III transcription complexes. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 148. P. 363-381.

13. Robert F., Coulombe B. Use of site-specific protein-DNA photocrosslinking to analyze the molecular organization of the RNA polymerase II initiation complex. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 148. P. 383-393.

14. Gohring F., Fackelmayer F.O. The scaffold/matrix attachment region binding protein hnRNP-U (SAF-A) is directly bound to chromosomal DNA in vivo: a chemical cross-linking study. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 8276-8283.

15. Kuo M.-H., Allis C.D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. // Methods. 1999. V. 19. P. 425-433.

16. Orlando V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. // Trends Biol. Sci. 2000. V. 25. P. 99-104.

17. Luscombe N.M., Laskowski R.A., Thornton J.M. Amino acid-base interactions: a three-dimensional analysis of protein-DNA interactions at atomic level. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2860-2874.

18. Kozlov I.A., Kubareva E.A., Ivanovskaya M.G., Shabarova Z.A. Design of new reagents on the base of DNA duplexes for irreversible inhibition of transcription factor NF-kB. // Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 279-289.

19. Sheflyan G.Ya., Kubareva Е.А., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S., Shabarova Z.A. Cross-linking of SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. // FEBSLett. 1996. V. 390. P. 307-310.

20. Козлов И.А., Кубарева E.A., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. Определение положения контактов фактора транскрипции NF-кВ с ДНК методом региоселективного ковалентного связывания. // Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 63-73.25