ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Сурина, Елизавета Рафаэлевна

• Сурина, Елизавета Рафаэлевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Сурина, Елизавета Рафаэлевна

Оглавление

Введение

Список сокращений и обозначений

Обзор литературы

Часть I. Прионы

Прионная концепция

Прионные болезни человека

Прионы других организмов

Функции белка 8ир35р

Биохимические свойства белка БирЗбр

Свойства белка иге2р

Фибриллы, образованные белками 8ир35р и 11ге2р

Прионы дрожжей: общие черты

Другие прионы дрожжей. Поиск новых белков с прионными свойствами

Две модели прионной конверсии

Роль Нзр104р и других белков в образовании [Р57+]

Штаммы прионов

Межвидовые барьеры

Надфибриллярные структуры. Структура прионных полимеров

Значение прионов

Строение белка Ргр. Подходы к диагностике и лечению прионных

болезней

Часть II. БЕЬЕХ

История БЕЬЕХ

Методология БЕЬЕХ

Библиотека олигонуклеотидов

Стадия связывания

Стадия разделения

Стадия амплификации

Мониторинг

2

Обработка аптамеров

Структура аптамеров

Преимущества аптамеров перед антителами

Вариации 8ЕЬЕХ и модификации аптамеров

Применение аптамеров

Часть III. Аптамеры к прионным и амилоидным белкам

Заключение к обзору литературы

Материалы и методы

Материалы

Штаммы

Питательные среды

Условия культивирования

Олигонуклеотиды (СИНТОЛ)

Буферные растворы:

Реактивы:

Компьютерные программы:

Генно-инженерные методы

Работа с белками

Электроблоттинг

Осаждение растворенных белков

Электронная микроскопия

Полимеразная цепная реакция

Радиоактивное мечение ДНК

ИФА-подобная методика определения эффективности связывания с

мишенью ДНК-аптамеров, содержащих 5'-биотин

Определение констант диссоциации комплексов [аптамер-мишень]

Выделение белковых агрегатов, нерастворимых в детергентах, из клеток

дрожжей БасскаготусеБ сегегг81ае

Разделение белков в полуденатурирующих условиях в агарозном геле (ЗОБ-АСЕ)

Дот-блот и специфическое окрашивание аптамерами белков на

нитроцеллюлозных мембранах

Результаты

1. Получение рекомбинантного фрагмента NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae

1.1. Выделение и хроматографическая очистка белка Sup35NM из клеток E.coli

1.2. Изучение свойств рекомбинантного белка Sup35NM

2. Полимеризация рекомбинантного белка Sup35NM in vitro

2.1. Дискриминация фибрилл и мономеров

2.2. Подбор буферных условий

2.3. Подбор условий центрифугирования

2.4. Подбор температурных режимов полимеризации

2.5. Оценка влияния ультразвука на размер полимеров Sup35NM

2.6. Влияние инкубации при отрицательной температуре на седиментацию фибрилл

2.7. Препаративная наработка фибрилл Sup35NM, характеристика полученного образца

2.8. Электронное микроскопирование полимеров белка Sup35NM, выделенного из клеток Е. coli

3. Получение аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM

3.1. Выбор нуклеотидной последовательности исходного ДНК-материала для SELEX

3.2. Проведение SELEX

3.3. Клонирование и секвенирование двухцепочечных копий ДНК-аптамеров по окончании SELEX

3.4. Обработка нуклеотидных последовательностей аптамеров: поиск гомологий

3.5. Выбор последовательностей для индивидуального синтеза

3.6. Оптимизация последовательностей аптамеров

4. Описание аптамеров с помощью ИФА-подобной методики, определение Kj. Формирование окончательной выборки аптамеров

4.1. Определение К& комплексов аптамер-фибриллярный Sup35NM для 10 выбранных аптамеров

4.2. Определение специфичности аптамеров: гибридизация с мономером и полимером белка Sup35NM в ИФА-подобном протоколе

4.3. Проведение дополнительного цикла БЕЬЕХ

4.4. Финальная выборка аптамеров

5. Структурные особенности аптамеров

5.1. Квадруплексы

5.2. Шпильки

5.3. Палиндромы и димеры

6. Характеристика связывания аптамеров с нерастворимыми в детергентах прионными и неприонными агрегатами 8ир35р и некоторых других белков, выделенных из клеток дрожжей Басскаготусез сегеу1$1ае

6.1. Взаимодействие аптамеров с нерастворимыми в 8Б8 агрегатами белка 8ир35р, выделенными из клеток дрожжей

6.2. Аптамеры взаимодействуют с устойчивыми к детегрентам агрегатами различных амилоидогенных белков

Обсуждение

Выводы

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

Введение

Прионы - это особый класс инфекционных агентов, вызывающих неизлечимые заболевания центральной нервной системы человека и животных. Их отличие от всех других патогенов - бактерий, вирусов, состоит в отсутствии генома, состоящего из нуклеиновой кислоты. Их инфекционные свойства связаны с белком. Этот инфекционный белок, как предполагается, может существовать в двух различных конформационных формах: инфекционной и неинфекционной, причем инфекционная форма способна катализировать превращение нормальной формы в инфекционную посредством белок-белковых взаимодействий [9].

У человека известны четыре прионных болезни, связанные с агрегацией прионного белка, РгР. Это болезнь куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба, а также синдром Герстманна-Штройслера-Шейнкера и фатальная семейная инсомния.

Особенностью прионных заболеваний является долгий латентный период: он может измеряться десятилетиями. Особую опасность представляет возможность межвидовой передачи прионных болезней. Например, эпидемия так называемого «бешенства коров» послужила причиной возникновения «нового варианта болезни Крейтцфельда-Якоба» (нвБКЯ) у людей, принимавших в пищу мясо заражённых животных. Название болезни отражает клиническую картину, практически не отличимую от таковой при классическом варианте болезни Крейтцфельда-Якоба (БКЯ) [4, 123].

Следует отметить, что белковые агрегаты могут образовываться не только при прионных заболеваниях. По своей природе прионы очень напоминают другой широко распространенный феномен - амилоиды. Амилоиды - это отложения фибриллярных белков, накапливающиеся при некоторых болезнях человека, называемых амилоидозами.

В 90-х годах прошлого века прионы были найдены у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также у мицелиального гриба Podospora anserina и некоторых других эукариот [38, 41, 150]. В отличие от человека и млекопитающих, подверженных нейродегенеративным прионным заболеваниям, низшие эукариоты при переходе белков в автокаталитически поддерживаемое прионное состояние приобретают нехромосомно наследуемые признаки, зачастую эволюционно прогрессивные.

Обнаружение белков с прионными свойствами у низших организмов имеет не только самостоятельную научную ценность, но также открывает возможности для всестороннего изучения феномена прионизации, ведь дрожжевые прионы не опасны для человека, следовательно, на работу с ними не накладываются ограничения, актуальные для работы с инфекционными белками животных. Кроме того, дрожжи Saccharomyces cerevisiae в качестве классического объекта генетических исследований имеют широкую базу хорошо

6

разработанных молекулярно-биологических методов, что способствует быстрой наработке данных по прионам дрожжей.

Нехромосомно наследуемый детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae является фенотипическим отражением прионного состояния белка Sup35p - члена семейства факторов терминации трансляции eRF3. Среди прионных детерминант низших эукариот [P/S7+] является наиболее хорошо изученным.

Аптамеры (лат. aptus - подходящий) - это молекулы однонитевой РНК или ДНК, которые связывают избранную мишень с высокой аффинностью и специфичностью за счёт своей вторичной и третичной структуры. Именно вторичная структура аптамера позволяет ему образовывать с мишенью гидрофобные, водородные и электростатические контакты. Известно, что основными элементами вторичной структуры аптамеров являются короткие двуцепочечные участки, образованные за счет комплементарного спаривания оснований, и одноцечочечные петли. При этом одноцепочечные участки аптамера отвечают за специфичность взаимодействия аптамера с мишенью, а двухцепочечные стабилизируют структуру аптамера и обеспечивают правильное расположение функциональных групп для узнавания аптамером мишени [2].

Аптамеры по сути являются аналогами моноклональных антител. Соответственно, основные области применения аптамеров и антител совпадают - аптамеры могут использоваться как в протеомике, для изучения пространственных структур и функциональных свойств белков, так и в медицине, для диагностики и лечения ряда заболеваний [102, 131].

Опасные свойства прионов - инфекционность и способность преодолевать межвидовые барьеры, - обусловливают высокий интерес к их исследованию. Разработка систем диагностики и лечения прионных болезней представляет важную научно-медицинскую задачу. Особую сложность представляет преодоление гематоэнцефалического барьера, так как на поздних стадиях болезни агрегаты РгР локализуются в мозгу, что сопуствтует нарастанию нежелательной неврологической симптоматики [4].

Явление прионного перехода мономер -> полимер до сих пор до конца не изучено, и использование аптамеров является перспективным подходом к исследованию прионного феномена. На данный момент получены аптамеры как к белку РгР различных млекопитающих [90, 87, 98, 105, 112, 131], так и к некоторым амилоидным белкам человека [29, 111].

Основываясь на структурной схожести прионных и амилоидных фибрилл, образованных не родственными по первичной структуре мономерами, мы избрали своей

целью получение аптамеров к фибриллярной форме дрожжевого прионного белка Sup35p, и предположили, что эти аптамеры смогут взаимодействовать с прионными и амилоидными полимерами других белков. Для достижения данной цели мы поставили перед собой следующие задачи:

• Выделить рекомбинантный фрагмент NM белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae в препаративных количествах из продуцирующих его клеток Escherichia coli.

• Полимеризовать препарат мономера Sup35NM и охарактеризовать полученные полимеры. Составить мишень для SELEX из полимеров белка Sup35NM.

• Отобрать аптамеры к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM.

• Охарактеризовать полученные аптамеры: проанализировать первичные последовательности, найти возможные группы гомологии, выбрать последовательности для химического синтеза.

• Подтвердить специфичность избранных аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM в ИФА-подобном протоколе, измерить Kd комплексов [аптамер-фибриллярный Sup35NM] для избранных аптамеров. Отследить возможные особенности вторичной структуры избранных аптамеров при помощи компьютерных программ.

• Определить специфичность охарактеризованных аптамеров к нерастворимым в детергентах агрегатам белка Sup35p, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Проверить сродство аптамеров к нерастворимым в детергентах агрегатам ряда других амилоидогенных белков, выделенным из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Список сокращений и обозначений

РНК - рибонуклеиновая кислота ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ SDS - додецилсульфат натрия

PrD - прионный домен; домен белка, необходимый для поддержания его прионного состояния

БСА - бычий сывороточный альбумин ПААГ - полиакриламидный гель ДАБ - диаминобензидин Е. coli — Escherichia coli

Xgal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-0-галактопиранозид

IPTG - изопропилтиогалактозид

a.o. - амнокислотный остаток

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

«дцПЦР» - полимеразная цепная реакция с равным соотношением праймеров dirS и revS, с получением двухцепочечного ДНК-продукта

«оцПЦР» - полимеразная цепная реакция с соотношением праймеров ¿//rS:revS=10:l, с получением преимущественно одноцепочечного продукта

Обзор литературы Часть I. Прионы

Прионная концепция

Прионная концепция возникла при необходимости объяснения ненуклеиновой природы некоторых инфекционных энцефалопатий. Необычные свойства инфекционного агента, вызывающего скрейпи, были впервые отмечены ещё в 1966 году [13], а в начале 80-х С. Прузинер выделил из мозга животных, больных скрейпи, инфекционный агент, и описал его свойства. Оказалось, что инфекционные свойства выделенного агента сохраняются после обработки протеиназой К, мочевиной, SDS, хаотропными солями, нуклеазами и псораленами, однако теряются после обработки ионизирующим излучением в присутствии кислорода. Таким образом, патоген проявляет свойства не нуклеиновой кислоты, но гидрофобного белка, ассоциированного с мембраной [109]. В связи с этим авторы ввели термин «прион» (от proteinaceous infectious particle) для обозначения нового инфекционного агента [106]. При дальнейшем исследовании оказалось, что прион - это белок. Прионный белок получил название РгР (от Prion Protein). РгР кодируется геном PRNP, присутствующим в геномах млекопитающих, а также птиц и рыб. Инфекционная

л р

изоформа белка РгР получила название РгР , в то время как нормальная - РгР . После открытия белков с похожими свойствами у других организмов название «прионный» стало нарицательным; прионными белками, или прионами, называют все инфекционные белки.

Помимо инфекционных, форма PrPSc прионного белка обладает следующими свойствами: 1) плохая растворимость в детергентах, 2) устойчивость к протеазам, 3) склонность к агрегации, 4) содержание большого количества р-слоев, в отличие от обогащенной а-спиралями изоформы РгР .

Прионная концепция была сформулирована С. Прузинером на основании данных, полученных его группой в 1982 году:

- белок PrPSc является инфекционным агентом

- инфекционный агент PrPSc способен к репликации в отсутствии нуклеиновой кислоты

- переход белка от нормальной РгРс к инфекционной PrPSc изоформе происходит путём конформационной конверсии

- конформационный переход PrPc -> PrPSc может происходить спонтанно, либо индуцироваться патологической изоформой PrPSc, попавшей извне. Наконец, переход в патологическую изоформу может быть следствием мутаций в гене PRNP [106, 108].

Прионные болезни человека

Мозг больных, погибших от прионных болезней, имеет характерные изменения, выявляемые при патоморфологичееком исследовании. Среди типичных гистологических признаков - спонгиоформная дегенерация, атрофия нервных клеток, астроцитарный глиоз, присутствие амилоидных бляшек, содержащих прионный белок; также характерно отсутствие воспалительной реакции. Локализация в мозге и преобладание того или иного признака и отличают каждое из прионных заболеваний друг от друга [4]. Все прионные болезни человека и животных в настоящее время являются неизлечимыми.

Прионные болезни человека подразделяют на спорадические (-85% случаев), приобретённые (<1% случаев) и наследственные (~15% случаев). При спорадических прионных болезнях первичное появление PrPSc связано с новой мутацией гена PRNP, либо со спонтанной конверсией РгР в PrPSc (0,3 - 1 случай на 1000000 населения), при наследственных - с мутацией PRNP, при приобретённых - с инвазией PrPSc (например, при каннибализме). Независимо от причины возникновения, все прионные заболевания инфекционны [4, 123].

Патогенез прионных болезней проходит в два этапа: экстрацеребральный и церебральный. На первом этапе PrPSc после инвазии (интрацеребральной, интраперитонеальной, или пероральной) поступает в органы лимфоретикулярной системы (селезёнку, лимфатические узлы, пейеровы бляшки, глоточную миндалину). Лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки выступают в качестве переносчиков PrPSc. В органах лимфоретикулярной системы прион реплицируется и накапливается, не вызывая при этом каких-либо патологических изменений в их структуре. Полагают, что перенос инфекционного белка в спинной и головной мозг опосредуется вегетативной нервной системой. На церебральном этапе РгР8соткладывается в цитозоле нейронов, а также в синапсах, вызывая атрофию нервных тканей вследствие потери функции растворимого РгР и предположительно других, неизученных причин [4].

Амилоидозы, в отличие от прионных болезней, вызываемых РгР, ассоциированы с разными белками. Существует около 20 амилоидозов человека, связанных с внутри- и внеклеточными отложениями белков. К наиболее распространённым относятся: хорея Хантингтона, связанная с образованием агрегацией белка с полиглутаминовым фрагментом; болезнь Паркинсона, сопряженная с отложениями синуклеина, и болезнь Альцгеймера. При болезни Альцгеймера фрагмент амилоидного ß-белка (Aß-пептид), агрегирует в виде внеклеточных сенильных бляшек, и одновременно белок tau, ассоциированный с микротрубочками, формирует внутри клеток так называемые

11

нейрофибриллярные узелки. Механизм образования сенильной бляшки предполагает существование на поверхности нейронов высокоаффинных рецепторов для растворимых олигомеров Ар-пептида - ключевых интермедиатов образования бляшки. Оказалось, что таким рецептором служит РгР. В растворимом, РгРс, состоянии белок РгР связывает Ар-олигомер с наномолярной аффинностью, и служит медиатором синаптической дисфункции, вызываемой АР-олигомерами. Таким образом, специфические химические агенты, направленные против РгРс, нужны не только для лечения прионных болезней, но также потенциально ценны для предотвращения болезни Альцгеймера [82].

Несмотря на разницу в структуре и функции амилоидогенных белков, все они формируют похожие по свойствам фибриллы: примерно 10 нм в толщину, с поперечной p-структурой (Р-слои ориентированы перпендикулярно оси фибриллы). Водородные связи, скрепляющие полипептидные цепи, ориентированы вдоль оси фибриллы. Амилоидные фибриллы окрашиваются Конго красным и тиофлавином T [55], и проявляют устойчивость к детергирующему действию SDS при комнатной температуре [121]. Вообще, способность формировать амилоидные фибриллы зависит от их гидрофобности и заряда белка, и, по всей видимости, является неотъемлемым свойством белковых цепей [35]. Многие белки способны к формированию амилоид-подобных структур in vitro в условиях частичной денатурации, однако такие условия нельзя считать нативными. Атомная структура амилоидных фибрилл остаётся невыясненной, но изучение рентгеновской дифракции, а также электронная микроскопия фибрилл, сформированных глутамин-аспарагин-богатым пептидом прионного домена Sup35p, а также поли-Ь-глумтамином, и фрагментом хантингтина позволило сформулировать модель строения амилоидной фибриллы [103]. Согласно этой модели, амилоидная фибрилла состоит из нескольких протофибрилл, закрученных относительно друг друга; количество протофибрилл в фибрилле варьирует для индивидуальных белков. Протофибрилла представляет собой цилиндрический Р-слой - полую нанотрубочку диаметром 3 нм; полипептидная цепь уложена в спираль вокруг оси фибриллы. Каждый поворот спирали включает 20 аминокислотных остатков, повороты соединяются друг с другом за счёт водородных связей между амидами основной и боковых цепей (каждый карбонильный остаток предыдущего поворота взаимодействует с аминогруппой последующего). Ориентация боковых цепей для каждого поворота спирали различается: соседние боковые цепи располагаются по разные стороны от основной цепи, то есть направлены наружу и внутрь протофибриллы. Минимальная амилоид-формирующая единица состоит из двух поворотов спирали, то есть примерно из 40 аминокислотных остатков [123].

Амилоидогенные белки сильно различаются по свойствам в нормальной и полимерной формах, причем последняя может инициировать полимеризацию. Для прионных заболеваний также характерно отложение нерастворимых фибрилл белковой природы, которые показывают повышенное содержание Р-слоев и способность присоединять Конго красный и тиофлавин Т. Таким образом, прионы сходны с амилоидами, но ключевое отличие между ними состоит в наличии у прионов инфекционных свойств.

Чем обусловлена эта разница: тем ли, что имеются нюансы в структуре поперечных р-слоев, или тем, что комплексы клеточных белков взаимодействуют с прионами, но не «узнают» амилоиды, - до сих пор неясно [50].

Прионы других организмов

Среди нехромосомно наследуемых признаков, обнаруженных в недавнее время у низших эукариот, наиболее хорошо изучены на данный момент генетические детерминанты дрожжей [Р57+] и [URE3], которые не удалось связать с какой-либо нуклеиновой кислотой [84]. В отличие от других цитоплазматических детерминант, [Р57+] и [URE3] исчезают при росте дрожжевых клеток на питательной среде с добавлением низких (5-7тМ) концентраций гидрохлорида гуанидина, который является денатурируюшим агентом, но не является мутагеном, и могут быть восстановлены без введения новой ДНК, - спонтанно или в условиях гиперэкспрессии белков Sup35p и Ure2p, соответственно [142].

Детерминанты [PS7+] и [URE3] проявляются так же, как рецессивные мутации (потеря функции) в соответствующих генах: [PS7+] усиливает супрессию нонсенс-мутаций. Фенотип [Р57+] был описан как цитоплазматически наследуемый детерминант, усиливающий действие нонсенс-супрессора SUQ5, кодирующего серин-специфичную тРНК с антикодоном, комплементарным нонсенс-кодону UAA [42]. [URE3] подавляет азот-зависимую репрессию пути утилизации уреидосукцината [80].

На основе вышеперечисленных наблюдений Р. Викнер предложил несколько критериев существования прионной основы для генетических факторов дрожжей: 1) цитоплазматический тип наследования детерминанта, 2) зависимость поддержания детерминанта от наличия хромосомно-кодируемого белка, 3) обратимость потери детерминанта и 4) увеличение частоты возникновения детерминанта de novo при увеличении внутриклеточной концентрации соответствующего белка [150].

Прионная природа детерминант [Р57+] и [URE3] была доказана биохимически; оказалось, что в клетках [PS7+] белок Sup35p проявляет устойчивость к протеазам и

13

находится в основном в агрегированном состоянии [100, 101]. Повышенная устойчивость к протеазам и присутствие в клетке в основном в агрегированном состоянии была показана и для белка Ure2p в клетках [URES] [54].

Следует упомянуть, что эффективное изучение прионов и прионных состояний в дрожжах возможно лишь за счет относительной устойчивости как [PSI+], так и [psi-]-фенотипов. Будучи \psi-], дрожжи могут спонтанно переходить в состояние [Р57+] с низкой частотой (хотя эта частота намного выше, чем вероятность спонтанной прионизации белка РгР в клетках млекопитающих). Однако, раз приобретая прионное, [Р57+]-состояние, клетки дрожжей способны эффективно его поддерживать в поколениях, преобразуя растворимые мономеры в амилоид. Таким образом, для эффективной конверсии Sup35p в прионную форму требуются предсуществующие фибриллы [143, 151]. Примечательно, что наследственные свойства прионов не зависят от клеток: синтетические PrD способны формировать фибриллы в нативных условиях in vitro, и при последующей трансформации клеток этими фибриллами происходит их прионный переход [60].

Прионный белок HET-s мицелиального гриба Podospora anserina участвует в запрограммированной смерти клетки в результате несовместимости гетерокариона. Примечательно, что прионное состояние HET-s как раз и является функциональным. У Р. anserina имеется два несовместимых генотипа - het-s и het-S, и кодируемые ими белки, HET-s и HET-S, соответственно, состоят от 289 аминокислот и отличаются 13 аминокислотными остатками. Прион-образующей способностью, однако, обладает только HET-s, а запрограммированная смерть происходит только в случае слияния клетки, содержащей прионную форму HET-s, с клеткой, экспрессирующей HET-S; неприонное состояние HET-s неопасно. За прионизацию отвечает аминокислотный участок 218-289 белка HET-s, содержащий двойной мотив р-слой-поворот-р-слой, то есть в общей сложности 4 р-слоя [114].

Функции белка Sup35p

Белок Sup35p является дрожжевым белком, членом семейства факторов терминации трансляции eRF3. Функционирует он в виде гетеродимерного рилизинг-фактора, образуемого с другим фактором - eRFl. При этом eRFl непосредственно распознает все три стоп-кодона, a eRF3 стимулирует терминацию при помощи гидролиза ГТФ. Фактор eRFl кодируется геном SUP45, а фактор eRF3 кодируется геном SUP35, который является консервативным, и практически не отличается у дрожжей и млекопитающих [74]. С-концевой домен белка eRF3 отвечает за связывание с фактором

14

eRFl и за гидролиз ГТФ. С-коицевой домен, в отличие от N-терминального региона, необходим для выживания клетки.

Через N-терминальный регион фактор eRF3 взаимодействует с поли(А)-связывающим белком, Pabp; это взаимодействие является эволюционно консервативным и, что интересно, не зависит от способности eRF3 к связыванию ГТФ. Так же не зависит от ГТФ способность eRF3 связываться с белком Upflp - так называемым фактором выживания. Когда к комплексу двух белков добавляются Upf2p и Upfip, а также партнер eRF3 по терминации трансляции, eRFl, формируется так называемый «комплекс выживания» (surveillance conplex), который деградирует аберрантные мРНК, содержащие преждевременные стоп-кодоны [74]. В частности, именно Upflp отвечает за распознавание мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны. Фенотипы upflA и [PS7+] во многом похожи [151].

Таким образом фактор eRF3, видимо, является посредником между процессами терминации трансляции и деградации аберрантных РНК и/или ее реинициации, а присоединение ГТФ к eRF3 играет регуляторную роль.

Вообще, в клетке существует два типа деградации РНК: первая, запускаемая нонсенс-мутациями (nonsense-mediated), была поименована выше как деградация аберрантных РНК. Вторая, безостановочная (nonstop) деградация, запускается при достижении рибосомой 3'-конца транскрипта. При этом количество нормальной мРНК в клетке уменьшается, а вместе с ним - и количество соответствующего белка. Этот вид деградации зависит от белка Ski7p, узнающего «заторможенную» рибосому. Была выявлена связь между [Р57+]-зависимой супрессией терминации трансляции и безостановочной (nonstop) деградацией [151]. Исследователям удалось выявить генетическое взаимодействие между eRF3 и компонентами пути безостановочной деградации мРНК; фенотип ski7A усиливает фенотип [Р57+].

Таким образом, фактор eRF3 играет важную роль в обоих видах деградации мРНК. При этом прионное ([PS7+]) состояние стимулирует безостановочную (nonstop) деградацию правильных мРНК, и подавляет деградацию аберрантных мРНК (nonsensemediated) [151].

Оказалось, что функциональность белка Sup35p не ограничивается участием в процессах терминации трансляции. Было показано [17], что N-концевой регион Sup35p взаимодействует с белком Slal, участвующим в процессах формирования актиновых микрофиламентов. Также показано было, что Sup35p играет роль в формировании актинового цитоскелета [145]. При репрессии гена SUP35 происходила деполимеризация

актина, повреждение митотического веретена, и, как следствие, цито- и кариогенез протекал аномально [123].

Биохимические свойства белка Sup35p

Биохимически белок Sup35p состоит из двух доменов - N-концевого (аминокислотные остатки 1-253) и С-концевого. С-концевой домен (ак 254-685) отвечает за функцию белка в терминации трансляции.

N-концевой домен может быть подразделен на N-домен (ак 1-123), и М-домен (ак 124-253). NM-домен отличается необычным аминокислотным составом [60]. Хотя NM-домен не является ни консерватиным, ни жизненно необходимым, его функции эволюционно консервативны, и поэтому N-домены даже самых отдаленно-родственных родов дрожжей, таких, как Saccharomyces и Hemiascomycetes, имеют общие черты, а именно, высокое содержание остатков глутамина и аспрагина в N-домене, и большое количество заряженных аминокислот в М-домене.

N-домен белка Sup35p, состоящий из 123 N-концевых аминокислот, необходим для прионной конверсии и олигомеризации in vitro, поэтому иначе он называется прион-формирующим доменом, PrD. 51 из 123 аминокислотных остатков N-домена составляют глутамин или аспарагин. Именно этот регион является устойчивым к протеолизу, впоследствии сообщая это свойство прионной фибрилле в целом. Таким образом, неудивительно, что N-домен играет ключевую роль в индукции и поддержании детерминанта [PSI+], Более тонко, N-домен подразделяется на два региона: первый, NQ, включает аминокислотные остатки 1-41, особенно богат остатками глутамина и аспарагина, и участвует как в прионной конверсии, так и в детерминировании штаммовой специфичности прионных фибрилл. За регионом NQ следует регион NR, содержащий пять полных (R1-R5) и одну частичную (R6) копию несовершенного олигопептидного повтора с консенсусом PQGGYQQYN. Функция региона NR состоит в обеспечении стабильного наследования прионного состояния, вероятно, путем обеспечения фрагментации фибриллы шапероном Hspl04p [122]. Минимальными для поддержания детерминанта [Р57+] являются аминокислотные остатки 1-64, составляющие регион NQ полностью и два первых повтора региона NR.

М-домен является сильно заряженным участком белка Sup35p; например, у Saccharomyces cerevisiae количество заряженных остатков в этом домене составляет 42%. При этом все положительно заряженные аминокислотные остатки представлены лизином, сгруппированным на N-конце М-домена, а отрицательно заряженные - в основном глутаматом, собранным на С-конце домена.

Точная функция М-домена неизвестна, хотя она может состоять во взаимодействии с Sup45p (eRFl) [60, 85]. Так или иначе, присутствие М-домена обеспечивает растворимость NM-фрагмента in vitro и in vivo. М-фрагмент сам по себе остается растворимым в течение долгого времени, и его полимеризация не может затравливаться готовыми фибриллами. N-фрагмент, напротив, сам по себе может поддерживаться в растворимом состоянии только в денатурирующих условиях. Для стабильного поддержания прионного [PSI+] состояния Sup35p, однако, просто растворимости белка недостаточно; важен именно М-домен, он не может быть заменен на любой другой заряженный участок. Гибридные белки только частично обладают свойствами Sup35p дикого типа. В любом случае, М-домен, без сомнения, поддерживает стабильность прионного состояния по нескольким механизмам; возможно, именно он отвечает за взаимодействие Sup35p с Hspl04p, поскольку известно, что Hspl04p связывает полилизин с высокой аффинностью, а в М-домене все положительно заряженные аминокислотные остатки представлены лизином [85].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сурина, Елизавета Рафаэлевна, 2013 год

Список литературы

1. Козлов Д.Г., Антипин А. А., Птицын Л.Р., Ищенко А.М., Машко С.В., Беневоленский С.В. Использование процедуры SELEX для создания одноцепочечных ДНК-аптамеров, специфически взаимодействующих с рекомбинантным интерлейкином-8 человека. Биотехнология - 2002, №4:49-60.

2. Кульбачинский А.В. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням. Успехи биол. Химии - 2006, №46:193-224

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир - 1984, 480 с.

4. Неврология: национальное руководство, под ред. Е.И. Гусева, А.Н. Коновалова, В.И. Скворцовой, А.Б. Гехт-М.: ГЭОТАР-Медиа - 2009. - 1040 с:1017-1028

5. Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг. Я. М.: Мир -1989, 160 с.

6. Птицын Л.Р., Котельников М.А., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Егоров А.М. Селекция олигодезоксирибонуклеотидов, связывающих тироксин. Доклады АН. -1999, 364 (2):260-263.

7. Решетников Р. В., Копылов А. М.,Головин А. В. Классификация G-квадруплексных ДНК по углу вращения квадруплекса и танарности G-квартетов. Acta Naturae -2010, 2(4):80-89.

8. Сурина Е. Р., Морозкина Е. В., Марченко А. Н., Антипин А. А., Митькевич О. В., Кушниров В. В., Беневоленский С. В., Тер-Аванесян М. Д. Селекция ДНК-аптамеров, специфически взаимодействующих с фибриллярной формой белка Sup35 дрожжей. Молекулярная биология - 2009,43(4):682-688.

9. Тер-Аванесян М.Д, Кушниров В.В. Прионы: инфекционные белки с генетическими свойствами. Биохимия - 1999, 64(12): 1638-1647.

10. Afanasieva, E.G., V.V. Kushnirov, V.V., Tuite, M.F., Ter-Avanesyan, M.D. Molecular Basis for Transmission Barrier and Interference between Closely Related Prion Proteins in Yeast. J. Biol. Chem. - 2011, 286:15773-15780.

11. Ahmad K.M., Oh S.S., Kim S., McClellen F.F., Xiao Y., Soh H.T. Probing the Limits of Aptamer Affinity with a Microfluidic SELEX Platform. PLoS One. - 2011, 6(1 l):e27051.

12. Alberti S., Halfmann R., King O., Kapila A., Lindquist S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell — 2009, 137(l):146-58.

13. Alper Т., Cramp W.A., Haig D.A., Clarke M.C. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature - 1967, 214(5090):764-6.

14. Antonyuk S., Trevitt C., Strange R., Jackson G., Sangar D., Batchelor M., Cooper S., Fraser C., Jones S., Georgiou T., Khalili-Shirazi A., Clarke A., Hasnain S., Collinge J. Crystal structure of human prion protein bound to a therapeutic antibody. Proc Natl Acad Sci USA.- 2009,106(8):2554-2558.

15. Bach S., Talarek N., Andrieu T., Vierfond J.M., Mettey Y., Galons H., Dormont D., Meijer L., Cullin C., Blondel M. Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay. Nat. Biotechnol. - 2003, 21(9):1075-81.

16. Bagriantsev S., Liebman S. Specificity of prion assembly in vivo. JBC. - 2004, 279(49):51042-51048.

17. Bailleul P.A., Newnam G.P., Steenbergen J.N., Chernoff Y.O. Genetic study of interactions between the cytoskeletal assembly protein slal and prion-forming domain of the release factor Sup35 (eRF3) in Saccharomyces cerevisiae. Genetics - 1999, 153(l):81-94.

18. Balbirnie M., Grothe R., Eisenberg D.S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated fi-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci US A.-2000, 98(5):2375-2380.

19. Baxa U., Keller P.W., Cheng N., Wall J.S., Steven A.C. In Sup35p filaments (the [PSI+J prion), the globular C-terminal domains are widely offset from the amyloid fibril backbone. Mol. Microbiol. - 2011, 79(2):523-32.

20. Baxa U., Taylor K.L., Wall J.S., Simon M.N., Cheng N., Wickner R.B., Steven A.C. Architecture ofUre2p prion filaments. JBC. - 2003, 278(44):43717-43727.

21. Berezovski M., Drabovich A., Krylova S.M., Musheev M., Okhonin V., Petrov A., Krylov S.N. Nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures: A universal tool for development of aptamers. J Am Chem Soc. - 2005, 127:3165-3171.

22. Bessen R.A., Kocisko D.A., Raymond G.J., Nandan S., Lansbury P.T., Caughey B. Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein. Nature — 1995, 375(6533):698-700.

23. Bessen R.A., Marsh R.F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J Virol. - 1994, 68(12):7859-68.

24. Bianchini M., Radrizzani M., Brocardo M.G., Reyes G.B., Solveyra C.G., Santa-Coloma T.A. Specific oligobodies against ERK-2 that recognize both the native and the denatured state of the protein. JIM. - 2001, 252:191 -197.

25. Biraboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinantplasmidDNA. Nucleic Acids Res. - 1979,7(6):1513-23.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34

35,

36

37

38

Blank M., Weischenk T., Priemer M., Schluesener H. Systematic evolution of a DNA

aptamer binding to rat brain tumor microvessels. selective targeting of endothelial

regulatory protein pigpen. J Biol Chem. - 2001, 276(19):16464-16468

Bock C., Coleman M., Collins B., Davis J., Foulds G., Gold L., Greef C., Heil J., Heilig

J.S., Hicke B„ Hurst M.N., Husar G.M., Miller D., Ostroff R., Petach H., Schneider D.,

Vant-Hull B., Waugh S., Weiss A., Wilcox S.K., Zichi D. Photoaptamer arrays applied

to multiplexedproteomic analysis. Proteomics - 2004,4(3):609-18.

Bradford M.M. A dye binding assay for protein. Anal.Biochem. - 1976, 72:248-254.

Bunka D.H., Mantle B.J., Morten I.J., Tennent G.A., Radford S.E., Stockley P.G.

Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J.

Biol Chem. -2007, 282(47):34500-9.

Burke D.H., Scates L., Andrews K., Gold L. Bent pseudoknots and novel RNA inhibitors of type 1 human immunodeficiency virus (HIV-J) reverse transcriptase. J Mol Biol. -1996,264(4):650-66.

Calabrese M.F., Eakin C.M., Wang J.M., Miranker A.D. A regulatable switch mediates self-association in an immunoglobulin fold. Nat. Struct. Mol. Biol. - 2008, 15(9):965-971.

Castilla J., Saa P., Soto C. Detection of prions in blood. Nat. Med. - 2005, 11(9):982-985.

Cerchia L., Duconge F., Pestourie C., Boulay J., Aissouni Y., Gombert K., Tavitian B., de Franciscis V., Libri D. Neutralizing aptamer from whole-cell SELEX inhibit the RET receptor tyrosine kinase. PLoS Biol. - 2005, 3(4):el23:0697-0704. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+J. Science -1995, 268(5212):880-4.

Chiti F., Stefani M., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M. Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates. Nature - 2003, 424(6950):805-8. Ciesiolka J., Gorski J., Yarns M. Selection of an RNA domain that binds Zn2+. RNA -1995, l(5):538-550.

Collett J.R., Cho E.J., Ellington A.D. Production and processing of aptamer microarrays. Methods - 2005, 37(1):4-15.

Collin P., Beauregard P.B., Elagoz A., Rokeach, L.A. A non-chromosomal factor allows viability of Schizosaccharomyces pombe lacking the essential chaperone calnexin. J. Cell Sei.-2004,117:907-918.

39. Collins S.R., Douglass A., Vale R.D., Weissraan J.S. Mechanism of Prion Propagation: Amyloid Growth Occurs by Monomer Addition. PLoS Biol. - 2004, 2(10):e321.

40. Cooper T.G. The regulation of yeast gene expression by midtiple control elements. Basic Life Sci.-1982, 19:143-61.

41. Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci USA.- 1997, 94(18):9773-9778.

42. Cox B. PSI, a cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. Heredity - 1965, 20:505-521.

43. Cox J.C., Hayhurst A., Hesselberth J., Bayer T.S., Georgiou G., Ellington A.D. Automated selection of aptamers against protein targets translated in vitro: from gene to aptamer. Nucleic Acids Res. - 2001, 30(20):el08.

44. Crozet C., Lin Y.L., Mettling C., Mourton-Gilles C., Corbeau P., Lehmann S., Perrier V. Inhibition of PrPSc formation by lentiviral gene transfer of PrP containing dominant negative mutations. J. Cell Sci. - 2004, 117(Pt 23):5591-7.

45. Dassie J.P., Liu X.Y., Thomas G.S., Whitaker R.M., Thiel K.W., Stockdale K.R., Meyerholz D.K., McCaffrey A.P., McNamara J.O. 2nd, Giangrande P.H. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. - 2009, 27(9):839-49.

46. DePace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. A critical role for amino-terminal glutamine/ asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion. Cell -1998, 931241-1252.

47. Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V.L., Zadorsky S.P., Polozkov G.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Dependence and independence of fPSI+J and fPIN+J: a two-prion system in yeast? EMBO J. - 2000, 19(9): 1942-1952.

48. Derkatch I.L., Uptain S.M., Outeiro T.F., Krishnan R., Lindquist S.L., Liebman S.W. Effects of Q/N-rich, polyQ, and non-polyQ amyloids on the de novo formation of the [PSI+J prion in yeast and aggregation of Sup35 in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004, 101:12934-12939.

49. DeStefano J.J.,Cristofaro J.V. Selection of primer-template sequences that bind human immunodeficiency virus reverse transcriptase with high affinity. Nucl. Ac. Res. - 2006, 34(1):130-139.

50. Diaz-Avalos R., King C.-Y., Wall J., Simon M., Caspar D.L.D. Strain-specific morphologies of yeast prion amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci USA. — 2005, 102(29): 10165-10170.

51. Du Z., Park K.-W., Yu H., Fan Q., Li L. Newly identified prion linked to the chromatin-remodelitigfactor Swil in Saccharomyces cerevisiae. Nat Genet. - 2008,40(4): 460-465.

52. Eaglestone S.S., Cox B.S., Tuite M.F. Translation termination efficiency can be regulated in Saccharomyces cerevisiae by environmental stress through a prion-mediated mechanism. EMBO J. - 1999, 18(7): 1974-81.

53. Eaglestone S.S., Ruddock L.W., Cox B.S., Tuite M.F. Guanidine hydrochloride blocks a critical step in the propagation of the prion-like determinant fPSI(+)J of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sei USA.- 2000,97(l):240-4.

54. Edskes H.K., Gray V.T., Wickner R.B. The [URE3J prion is an aggregated form of Ure2p that can be cured by overexpression of Ure2p fragments. Proc Natl Acad Sei U S A. - 1999, 96(4): 1498-1503.

55. Elghetany M.T., Saleem A. Methods for staining amyloid in tissues: a review. Stain Technol. - 1988, 63(4):201-12.

56. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature - 1990, 346:818-822.

57. Eulberg D., Buchner K., Maasch C., Klussmann S. Development of an automated in vitro selection protocol to obtain RNA-based aptamers: identification of a biostable substance P antagonist. Nucleic Acids Res. - 2005, 33(4):e45.

58. Famulok M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Curr. Opin. Mol. Ther. - 2005, 7(2): 137-43.

59. Fay N., Redeker V., Savistchenko J., Dubois S., Bousset L., Melki R. Structure of the prion Ure2p in protein fibrils assembled in vitro. J Biol Chem. - 2005, 280:37149-58.

60. Glover J.R., Kowal A.S., Schrimer E.C., Patino M.M., Liu J.-J., Lindquist S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of fPSI+J, a heritable prion-like factor ofS. cerevisiae. Cell - 1997, 89:811-819.

61. Goodman S.D., Veltenm N.J., Gao Q., Robinson S., Segall A.M. In Vitro Selection of Integration Host Factor Binding Sites. J Bacterid. - 1999, 181:3246-3255.

62. Gopinath S.C.B., Misono T., Kawasaki K., Mizuno T., Imai M., Odagiri T., Kumar P.K.R. An RNA aptamer that distinguishes between closely related human influenza viruses and inhibits hemagglutinin-mediated membrane fusion. J. Gen. Virol. — 2006, 87:479-487.

63. Gopinath S.C. Methods developed for SELEX. Anal Bioanal Chem. - 2007, 387(1): 17182.

64. Hara H., Okemoto-Nakamura Y., Shinkai-Ouchi F., Hanada K., Yamakawa Y., Hagiwara K. Mouse prion protein (PrP) segment 100 to 104 regulates conversion of PrP(C) to PrP(Sc) in prion-infected neuroblastoma cells. J Virol. - 2012, 86(10):5626-36.

65. He Y.-Y., Stockley P.G., Gold L. In vitro evolution of the DNA binding sites of Escherichia coli methionine repressor, MetJ. J Molec Biol. - 1996, 255(1 ):55-66.

66. Hicke B.J., Watson S.R., Koenig A., Lynott C.K., Bargatze R., Chang Y.-F., Ringquist S., Moon-McDermott L., Jennings S., Fitzwater T., Han H.-L., Varki N., Albinana I., Willis M.C., Varki A., Parma D. DNA aptamers block L-selectin in vivo, J. Clin Invest. -1996, 98(12):2688-2692.

67. Hybarger G., Bynum J., Williams R.F., Valdes J.J., Chambers J.P. A microfluidic SELEX prototype. Anal Bioanal Chem. - 2006, 384:191-198.

68. Inoue Y., Kishimoto A., Hirao J., Yoshida M., Taguchi H. Strong growth polarity of yeast prion fiber revealed by single fiber imaging. J Biol Chem. - 2001, 276(38):35227-35230.

69. Inoue Y., Taguchi H., Kishimoto A., Yoshida M. Hspl04 binds to yeast Sup35 prion fiber but needs other factor(s) to sever it. J Biol Chem. - 2004, 279(50):52319-52323.

70. Jarrett J.T., Lansbury P.T. Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: A pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell - 1993, 73:1055-1058.

71. Kaneko K„ Zulianello L., Scott M., Cooper C.M., Wallace A.C., James T.L., Cohen F.E., Prusiner S.B. Evidence for protein X binding to a discontinuous epitope on the cellular prion protein during scrapie prion propagation. Proc Natl Acad Sci USA.- 1997, 94(19): 10069-74.

72. King C.-Y., Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three yeast prion strains. Nature - 2004,428:319-323.

73. King D.J., Safar J.G., Legname G., Prusiner S.B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J Mol Biol. - 2007, 369:10011014.

74. Kobayashi T., Funakoshi Y., Hoshino S., Katada T. The GTP-binding factor eRF3 is a key mediator coupling translation termination to mRNA decay. J Biol Chem. - 2004, 279(44):45693-45700.

75. Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Valouev I.A., Kushnirov V.V., Smimov V.N., Ter-Avanesyan M.D. [PSI(+J] prion generation in yeast: characterization of the 'strain'difference. Yeast - 2001, 18:489-497.

76. Komar A.A., Lesnik T., Cullin C., Mer rick W.C., Trachsel H., Altmann M. Internal initiation drives the synthesis of Ure2 protein lacking the prion domain and affects [URE3J propagation in yeast cells. EMBO J. - 2003, 22:1199-1209.

77. Krishnan R., Lindquist S.L. Structural insights into a yeast prion illuminate nucleation and strain diversity. Nature - 2005,435(9):765-772.

78. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D. Yeast [PSI+J prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04. J Biol Chem. -2003,278(49):49636-49643.

79. Kushnirov V.V., Alexandrov I.M., Mitkevich O.V., Shkundina I.S., Ter-Avanesyan M.D. Purification and analysis of prion and amyloid aggregates. Methods - 2006, 39:50-5.

80. Lacroute F. Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast. J Bacterid. - 1971,106(2):519-22.

81. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature - 1970, 227:680-685.

82. Lauren J., Gimbel D.A., Nygaard H.B., Gilbert J.W., Strittmatter S.M. Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers. Nature -2009,457(7233): 1128-32.

83. Li A., Christensen H.M., Stewart L.R., Roth K.A., Chiesa R., Harris D.A. Neonatal lethality in transgenic mice expressing prion protein with a deletion of residues 105-125. EMBO J. - 2007, 26(2):548-58.

84. Lindquist S. Mad Cows Meet Psi-chotic Yeast: The Expansion of the Prion Hypothesis. Cell - 1997, 89:495—498.

85. Liu J.J., Sondheimer N., Lindquist S.L. Changes in the middle region of Sup35 profoudly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion [PSI+J. Proc Natl Acad Sci USA.- 2002, 99(4), 16446-16453.

86. Lou X., Qian J., Xiao Y., Viel L., Gerdon A.E., Lagally E.T., Atzberger P.,Tarasow T.M., Heeger A.J., Soh H.T. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels, Proc Natl Acad Sci USA.- 2009, 106(9):2989-2994.

87. Mashima T., Matsugami A., Nishikawa F., Nishikawa S., Katahira M. Unique quadruplex structure and interaction of an UNA aptamer against bovine prion protein. Nucleic Acids Res. - 2009, 37(18):6249-58.

88. Mashima T., Nishikawa F., Kamatari Y.O., Fujiwara H., Saimura M., Nagata T., Kodaki T., Nishikawa S., Kuwata K., Katahira M. Anti-prion activity of an RNA aptamer and its structural basis. Nucleic Acids Res. - 2013,41(2):1355-1362.

89. Mendonsa S.D., Bowser M.T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. - 2004, 126:20-21.

90. Mercey R., Lantier I., Maurel M.C., Grosclaude J., Lantier F., Marc D. Fast, reversible interaction of prion protein with RNA aptamers containing specific sequence patterns. Arch Virol.-2006, 151:2197-214.

91. Meriin A.B., Zhang X., He X., Newnam G.P., Chernoff Y.O., Sherman M.Y. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnql. J Cell Biol. - 2002, 157(6):997-1004.

92. Misono T.S., Kumar P.K. Selection of RNA aptamers against human influenza virus hemagglutinin using surfaceplasmon resonance. Anal Biochem. - 2005, 342(2):312-7.

93. Missailidis S., Thomaidou D., Borbas K.E., Price M.R. Selection of aptamers with high affinity and high specificity against C595, an anti-MUCl IgG3 monoclonal antibody, for antibody targeting. J Immunol Methods - 2005, 296(l-2):45-62.

94. Mitkevich O.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Surina E.R., Benevolensky S.V., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. DNA aptamers detecting generic amyloid epitopes. Prion - 2012, 6(4):400-6.

95. Murakami K., Nishikawa F., Noda K., Yokoyama T., Nishikawa SAnti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant prion protein and its b isoform with high affinity. Prion - 2008, 2(2):73-78.

96. Murphy M.B., Fuller S.T., Richardson P.M., Doyle S.A. An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification. Nucl Ac. Res. - 2003,31(18):ell0.

97. Nutiu R., Li Y. Aptamers with fluorescence-signaling properties. Methods - 2005, 37(1): 16-25.

98. Ogasawara D., Hasegawa H., Kaneko K., Sode K., Ikebukuro K. Screening of DNA aptamer against mouse prion protein by competitive selection. Prion - 2007, 1(4):248— 254.

99. Osherovich L.Z., Cox B.S., Tuite M.F., Weissman J.S. Dissection and design of yeast prions. Plos Biol. - 2004, 2(4):0442-0451.

100. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. Support for the prion hypotesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science - 1996, 273:622-626.

101. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smimov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Propagation of the yeast prion-like fPSI+J determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor. EMBO J. - 1996, 15:3127-3134.

102. Pendergrast P.S., Marsh H.N., Grate D., Healy J.M., Stanton M. Nucleic acid aptamers for target validation and therapeutic applications. J Biomol Tech. - 2005, 16(3):224-234.

103. Perutz M.F., Finch J.T., Berriman J., Lesk A. Amyloid fibers are water-filled nanotubes. Proc Natl Acad Sci USA.- 2002, 99(8):5591-5.

104. Petach H., Gold L. Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in protein microarrays. Curr Opin Biotechnol. - 2002, 13(4):309-14.

105. Proske D., Gilch S., Wopfner F., Schatzl H.M., Winnacker E.L., Famulok M. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. Chembiochem. - 2002, 3(8):717-25.

106. Prusiner S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science - 1982, 216(4542): 136-144.

107. Prusiner S. B. Molecular biology of prion diseases. Science - 1991, 252(5012):1515-1522.

108. Prusiner S.B. Prions. Proc Natl Acad Sci U.S.A. - 1998, 95(23):13363-13383.

109. Prusiner S.B., Garfin D.E., Cochran S.P., Baringer J.R., Hadlow W.J., Eklund C.M., Race R.E. Evidence for hydrophobic domains on the surface of the scrapie agent. Trans. Am. Neurol. Assoc. - 1978,103:62-64.

110. Prusiner S.B., Scott M., Foster D., Pan K.M., Groth D., Mirenda C., Torchia M., Yang S.L., Serban D., Carlson G.A. et al. Transgenetic studies implicate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication. Cell. - 1990, 63(4):673-86.

111. Rahimi F., Bitan G. Selection of aptamers for amyloid beta-protein, the causative agent of Alzheimer's disease. J Vis Exp. - 2010, (39):1955

112. Rhie A., Kirby L., Sayer N., Wellesley R., Disterer P., Sylvester I., Gill A., Hope J., James W., Tahiri-Alaoui A. Characterization of 2 '-fluoro-aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J Biol Chem. - 2006, 278(41):39697-39705.

113. Ripaud L., Maillet L., Immel-Torterotot F., Durand F., Cullin C. The [URE2J yeast prion results from protein aggregates that differ from amyloid filaments formed in vitro. J Biol Chem. - 2004, 279(49):50962-50968.

114. Ritter C„ Maddelein M..-L., Siemer A.B., Luhrs T., Ernst M., Meier B.H., Saupe S.J., Riek R. Correlation of structural elements and infectivity of the HET-s prion. Nature -2005, (435):844-848.

115. Ross E.D., Baxa U., Wickner R.B. Scrambled Prion Domains Form Prions and Amyloid. Mol Cell Biol. - 2004, 24(16):7206-7213.

116. Ross E.D., Edskes H.K., Terry M.J., Wickner R.B. Primary sequence independence for prion formation. Proc Natl Acad Sci USA.- 2005, 102(36):12825-12830.

117. Saborio G.P., Permanne B., Soto C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature - 2001,411:810-813.

118. Salnikova A.B., Kryndushkin D.S., Smirnov V.N., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Nonsense suppresiion in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3') is caused by its non-heritable amyloids. J Biol Chem. - 2005, 280:8808-12.

119. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier. Cell - 2000, 100(2):277-88.

120. Sayer N.M., Cubin M., Rhie A., Bullock M., Tahiri-Alaoui A., James W. Structural determinants of conformationally selective, prion-binding aptamers. J Biol Chem. -2004, 279:13102-13109.

121. Serio T.R., Cashikar A.G., Kowal A.S., Sawicki G.J., Moslehi J.J., Serpell L., Arnsdorf M.F., Lindquist S.L. Nucleated conformational conversion and the replication of conformational information by a prion determinant. Science - 2000, 289(5483): 1317-21.

122. Shkundina I.S., Kushnirov V.V., Tuite M.F., Ter-Avanesyan M.D. The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast Sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants. Genetics - 2006,172:827-35.

123. Shkundina I.S., Ter-Avanesyan M.D. Prions. Biochemistry (Mosc). - 2007, 72(13): 151936.

124. Schirmer E.C., Lindquist S. Interactions of the chaperone Hspl04 with yeast Sup35 and mammalian PrP. Proc Natl Acad Sci USA.- 1997, 94(25): 13932-13937.

125. Song Y., Song Y., Chen X. The yeast prion case: could there be a uniform concept underlying complex protein folding? J Biomol Struct Dyn. - 2011, 28(4):663-5.

126. Soto C., Kascsak R.J., Saborio G.P., Aucouturier P., Wisniewski T., Prelli F., Kascsak R., Mendez E., Harris D.A., Ironside J., Tagliavini F., Carp R.I., Frangione B. Reversion of prion protein conformational changes by synthetic beta-sheet breaker peptides. Lancet -2000, 355(9199): 192-7.

127. Stanker L., Serban A., Cleveland E., Hnasko R„ Lemus A., Safar J., DeArmond S., Prusiner S.B. Conformation-dependent high-affinity mAbs to prion proteins. J Immunol. -2010, 185(l):729-737.

128. Stansfield I., Jones K.M., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R., Poznyakovski A.I., Paushkin S.V., Nierras C.R., Cox B.S., Ter-Avanesyan M.D., Tuite M.F. The products of the SUP45 (eRFl) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae.EMBO J. - 1995, 14:4365-4373.

129. Stoltenburg R., Nikolaus N.. Strehlitz B. Capture-SELEX: Selection of DNA Aptamers for Aminoglycoside Antibiotics J Anal Methods Chem. - 2012; 2012:415697.

130. Syed M.A., Pervaiz S. Advances in aptamers. Oligonucleotides - 2010, 20(5):215-24.

131. Takemura K., Wang P., Vorberg I., Surewicz W., Priola S.A., Kanthasamy A., Pottathil R., Chen S.G., Sreevatsan S. DNA aptamers that bind to PrPc and not PrP& show sequence and structure specificity. Exp. Biol. Med. - 2006, 231:204-214.

132. Tanaka M., Chien P., Naber N., Cooke R., Weissman J.S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature - 2004,428:323-328.

133. Tanaka M., Chien P., Yokenura K., Weissman J.S. Mechanism of cross-species prion transmission: an infectious conformation compatible with two highly divergent yeast prion proteins. Cell - 2005,121:49-62.

134. Tcherkasskaya O., Davidson E.A., Schmerr M.J., Orser C.S. Conformational biosensor for diagnosis of prion diseases. Biotech Let. - 2005, 27:671-675.

135. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant fpsi+J in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics - 1994, 137(3):671-6.

136. Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R., Didichenko S.A., Chemoff Y.O, Inge-Vechtomov S.G., Smirnov V.N. Deletion analysis of the SUP35 gene of yeast Saccharomyces cerevisiae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein. Mol. Microbiol. - 1993, 7:683-92.

137. Thiel K.W., Giangrande P.H. Therapeutic applications of DNA and RNA aptamers. Oligonucleotides - 2009, 19(3):209-22.

138. Trieshmann L., Santos A.N., Kaschig K., Torkler S., Maas E., Schatzl H., Bohm G. Ultra-sensitive detection of prion protein fibrils by flow cytometry in blood from cattle affected with bovine spongiform encephalopathy. BMC Biotechnol. - 2005, 5:26.

139. Toombs J. A., Petri M., Paul K.R., Kan G.Y., Ben-Hur A., Ross E.D. De novo design of synthetic prion domains. Proc Natl Acad Sci USA.- 2012, 109(17):6519-6524.

140. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science - 1990, 249:505-510.

141. Tuerk C., MacDougal S., Gold L. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci USA.- 1992, 89(15):6988-92.

142. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from [psi+] to fpsi-] in Saccharomyces cerevisiae. Genetics - 1981, 98(4):691-711.

143. Uptain S. M., Sawicki G. J., Caughey B., Lindquist S. Strains of [PSI+J are distinguished by their efficiencies of prion-mediated conformational conversion. EMBO J.-2001, 20:6236-6245.

144. Urakov V.N., Vishnevskaya A.B., Alexandrov I.M., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Interdependence of amyloid formation in yeast: Implications for polyglutamine disorders and biologicalfunctions. Prion - 2010,4(l):45-52.

145. Valouev I.A., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Cell Motil. Cytoskeleton - 2002, 52(3): 161-73.

146. Vater A., Jarosch F., Buchner K., Klussmann S. Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: Tailored-SELEX. Nucleic Acids Res. - 2003, 31(21):el30.

147. Vuyisich M., Beal P. A. Controlling protein activity with ligand-regulated RNA aptamers. Chem Biol. - 2002, 9(8):907-13.

148. Weiss S., Proske D., Neumann M., Groschup M.H., Kretzschmar H.A., Famulok M., Winnacker E. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J Virol. -1997, 71(11):8790-8797.

149. Wei F., Ho C.M. Aptamer-based electrochemical biosensor for Botulinum neurotoxin. Anal Bioanal Chem. - 2009, 393(8): 1943-8.

150. Wickner R.B. [URE3] is an altered Ure2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science - 1994, 264:566-569.

151. Wilson M.A., Meaux S., Parker R., van Hoof A. Genetic interactions between [PSI+] and nonstop mRNA decay affect phenotypic variation. Proc Natl Acad Sci USA.- 2005, 102(29): 10244-10249.

152. Wu Y.X., Greene L.E., Masision D.C., Eisenberg E. Curing of yeast fPSI+J prion by guanidine inactivation of Hspl04 does not require cell division. Proc Natl Acad Sci U S A. -2005, 102(36): 12789-12794.

153. Yang X., Li X., Prow T.W., Reece L.M., Bassett S.E., Luxon B.A., Herzog N.K., Aronson J., Shope R.E., Leary J.F., Gonestein D.G. Immunofluorescence assay andflow-cytometry selection of bead-bound aptamers. Nucleic Acids Res. - 2003, 31(10):e54.

154. Zeiler B., Adler V., Kiyukov V., Grossman A. Concentration and removal of prion proteins from biological solutions. Biotechnol Appl Biochem. - 2003, 37(Pt 2): 173-82.

155. Zhang Y., Chen Y., Han D., Ocsoy I., Tan W. Aptamers selected by cell-SELEX for application in cancer studies. Bioanalysis - 2010, 2(5):907-18.

156. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., Inge-Vechtomov S., Kisselev L., Philippe M. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. EMBO J. - 1995, 14:4065-4072.

157. Zimmermann B., Bilusic I., Lorenz C., Schroeder R. Genomic SELEX: a discovery tool for genomic aptamers. Methods - 2010, 52(2):125-32.