Дизайн систем доставки лекарств на основе карбоната кальция с контролем морфологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Серов Никита Сергеевич

• Серов Никита Сергеевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Серов Никита Сергеевич

РЕФЕРАТ

SYNOPSIS

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование наноструктурированного CaC03 в качестве систем доставки

1.2. Влияние морфологии нано/микрочастиц неорганических материалов на биологическую активность

1.3. Механизмы и подходы к контролю морфологии неорганических систем доставки

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Характеристики исходных реактивов, приборов и материалов

2.2. Синтетические процедуры

2.3. Методы характеризации полученных образцов

2.4. Биологическое тестирование полученных образцов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Синтез, характеризация и изучение механизмов формирования анизометрических микрочастиц CaC03 природоподобных морфологий

3.2. Разработка одностадийного бестемплатного метода синтеза полых

АНИЗОМЕТРИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ НА ОСНОВЕ СаС03, ПОВТОРЯЮЩИХ ФОРМУ

БАКТЕРИЙ

3.3. Разработка системы доставки плазмина на основе сферических наночастиц СаС03 фазы ватерита с пролонгированным действием за счет РЕКРИСТАЛЛИЗАЦИИ

3.4. Моделирование взаимосвязи физико-химических и геометрических

ПАРАМЕТРОВ СИСТЕМ ДОСТАВКИ НА ОСНОВЕ НАНО/МИКРОЧАСТИЦ СаСОз С

ТОКСИЧНОСТЬЮ ДЛЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ТЕКСТЫ ПУБЛИКАЦИЙ

Реферат

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы.

Десятилетия развития нанотехнологий в области неорганического биоматериаловедения для создания систем доставки в организм лекарственных препаратов не привели к пропорциональному прогрессу в биомедицине. При этом морфология систем доставки лекарств на данный момент остается фактором, практически, не учитываемым при разработке. В то же время природа демонстрирует огромное разнообразие анизометрических неорганических структур, взаимодействие которых с биологическими системами в существенной степени определяется их формой, размерами и микроструктурой. Яркими примерами служат неорганические каркасы диатомей, позволяющие регулировать процессы фотосинтеза в зависимости от глубины обитания, антибактериальные и адгезивные структуры на поверхности кожи ящериц, неадгезивные структуры чешуи рыб, а также вирусы, форма капсида которых чрезвычайно сильно зависит от способа проникновения и вида организма-хозяина. Более того, недавние исследования показали, что форма систем доставки лекарств способна влиять на их поглощение клетками, распределение в организме и многие другие параметры. Неорганические системы доставки более стабильны и безопасны по сравнению с органическими, но их использование весьма ограничено Управлением по контролю за продуктами питания и лекарствами (БОА).

Выбор карбоната кальция СаС03 в качестве объекта исследования связан с одобренным БОА применением в медицине в качестве антацида. СаС03 обладает высокой биосовместимостью, проявляя малую токсичность для клеток человека и низкие пределы долгосрочного депонирования в органах и тканях. К тому же

материалы представленные пористыми микросферами кристаллической фазы ватерита и полыми микрокапсулами кристаллической фазы кальцита, уже широко используются в качестве систем доставки низко- и макромолекулярных лекарственных средств. В природе встречаются три кристаллические модификации карбоната кальция: кальцит, арагонит и ватерит.

Таким образом, разработка новых синтетических подходов к получению природоподобных анизометрических наноструктурированных материалов на основе СаС03 является одной из актуальных задач современного неорганического биоматериаловедения. Исследование формозависимого поведения новых материалов, изучение механизмов формирования морфологических признаков и спектра биологической активности создаст фундаментальные основы для их использования в качестве систем доставки лекарств.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дизайн систем доставки лекарств на основе карбоната кальция с контролем морфологии»

Цель работы.

Дизайн и синтез природоподобных неорганических систем на основе карбоната кальция с контролируемой морфологией и анизометрией, изучение механизмов их формирования, а также установление количественных взаимосвязей «структура-свойство».

Задачи работы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработка методов синтеза нано- и микрочастиц карбоната кальция различной анизометрии и пористости, определяющих их поведение в биологических системах;

2. Изучение процессов кристаллизации карбоната кальция в водных растворах для получения систем доставки лекарственных препаратов с заранее заданной природоподобной морфологией и текстурой;

3. Установление количественных взаимосвязей текстурных признаков

систем доставки на основе СаС03 с их потенциальным биологическим действием.

Научная новизна работы.

Впервые предложены следующие методики синтеза природоподобных анизометрических систем доставки на основе СаС03:

1. Методики одностадийного синтеза в водных растворах природоподобных стержневидных и ежеподобных форм микрочастиц карбоната кальция. Способность полученных микрочастиц проявлять механо-бактерицидную активность по отношению к бактериальным биопленкам была обоснована теоретически и подтверждена экспериментально. Впервые была показана прямая взаимосвязь степени анизометрии микрочастиц с эффективностью элиминирования биопленок.

2. Методика бестемплатного одностадийного синтеза стабильных полых микрокапсул карбоната кальция в водных растворах при соосаждении с ионами М§2+, позволяющая осуществлять тонкий контроль над формой, линейными размерами и размером полости получаемых микрокапсул. Была доказана способность микрокапсул поглощать и при определенных условиях одномоментно высвобождать инкапсулированные низко- и макромолекулярные соединения на примере антибиотика ампициллина, белковых молекул и молекул нуклеиновых кислот в слабокислой среде (в том числе в среде биопленок для ампициллина);

3. Методика синтеза системы доставки на основе сферического ватерита, отличительной характеристикой которого является постепенное высвобождение инкапсулированных биомолекул за счет процесса рекристаллизации ватерита в более стабильную кристаллическую фазу кальцита. Система доставки успешно применена для быстро инактивирующегося в организме тромболитического агента плазмина. Включение в систему магнитных наночастиц магнетита позволило изучить кинетику процесса, а также обеспечить локальное концентрирование системы доставки плазмина в место возникновения тромбоза.

Впервые разработаны подходы к моделированию биологической активности неорганических систем доставки на основе CaCO3 с учетом их морфологических параметров и физико-химических свойств.

Впервые продемонстрирована способность моделей машинного обучения прогнозировать клеточную токсичность новых неорганических систем доставки со средней ошибкой оценки жизнеспособности клеток в 13.5% на нескольких клеточных линиях человека по их физико-химическим и морфологическим параметрам (элементный состав, заряд поверхности, поверхностные химические модификации, форма и размеры).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Представленные результаты имеют как фундаментальный, так и практический интерес. Предложены пути установления взаимосвязи морфологических характеристик с биологической активностью неорганических систем доставки на основе карбоната кальция.

Сравнение анизометрических и изотропных микрочастиц методом мультифизического моделирования показало большую склонность анизометрических наноструктур к деструкции как грамположительных (Staphylococcus aureus), так и грамотрицательных (Escherichia coli) бактерий. Результаты моделирования были экспериментально подтверждены при изучении влияния частиц на планктонные бактерии и на биопленки в условиях in vitro и ex vivo. Практическая значимость подтверждена эффективностью действия наноструктурированных систем доставки биопрепаратов для лечения венозных тромбозов и борьбы с бактериальными биопленками. Эффективность действия системы на процесс растворения фибриновых сгустков была показана на модели ex vivo в сравнении с действием чистого плазмина, где последний демонстрировал низкую эффективность из-за быстрой инактивации. В ходе тестов на клеточных

линиях in vitro продемонстрирована безопасность разработанной системы доставки плазмина.

Методы исследования.

Каждая полученная природоподобная анизометрическая система доставки была охарактеризована комплексом физико-химических свойств и морфологических параметров. Воспроизводимость и точность определяемых параметров подтверждается статистической обработкой данных, полученных в нескольких повторностях экспериментов. Подробное описание методов исследования представлено в разделе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту.

1. Соосаждение микрочастиц карбоната кальция в присутствии ионов Mg2+ в соотношении с ионами Ca2+ 0.66:1 из водных растворов при температуре 75оС приводит к образованию анизометрического арагонита ежеподобной формы, способного понижать жизнеспособность бактерий E. coli и S. aureus в концентрации 25 мг/мл в условиях экспериментов ex vivo на бактериальных биопленках.

2. Образование микрочастиц карбоната кальция в присутствии ионов Mg 2+ в соотношении с ионами Ca2+ 1:1 из растворов этиленгликоль/вода (объемное соотношение 4:1) при температуре 25 оС приводит к кристаллизации полого анизометрического кальцита с объемом внутренней полости 30-50% об., демонстрирующего pH-зависимое высвобождение инкапсулированных молекул ампициллина в среде бактериальных биопленок E. coli и последующее двухкратное сокращение КОЕ бактерий в течение двух часов.

3. Образование наночастиц карбоната кальция в 0.1 и 0.01 М растворах карбоната кальция в смеси растворителей этиленгликоль/вода (объемное соотношение 4:1) при температуре 25 оС приводит к кристаллизации сферического ватерита со средним диаметром 332 ± 48 нм и временем полу- и полной

рекристаллизации в фазу кальцита равным 2 и 4.5 часа, соответственно, демонстрирующего пролонгированный тромболитический эффект в экспериментах ex vivo на модельных сгустках при инкапсуляции плазмина и таргетирующих наночастиц магнетита.

4. Построена модель машинного обучения, прогнозирующая жизнеспособность клеточных линий человека при инкубации с нано- и микрочастицами карбоната кальция по их линейным размерам, форме, типу покрытия, поверхностному заряду, а также условиям инкубации со средней ошибкой 13.5%.

Достоверность научных достижений и апробация работы.

Достоверность результатов обуславливается использованием современных физико-химических методов исследования, проведением биологических клеточных тестов в соответствии с государственными стандартами, применением общепринятых научным сообществом расчетных моделей и сравнением экспериментальных данных с описанными в научной литературе. Полученные результаты были изложены в научных статьях, которые рецензированы, получили экспертную оценку и опубликованы в научных журналах первого квартиля.

Работа была выполнена в рамках научных направлений химико-биологического кластера Университета ИТМО при поддержке следующих грантов: Грант Президента № МД-2177.2020.3, РНФ № 16-13-00041, РНФ № 18-79-00269, РФФИ № 20-53-76023, Приоритет 2030.

Результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на 12 российских и международных научных конференциях: Sol-Gel 2019, XLIX научная и учебно-методическая конференция НИУ ИТМО, X Всероссийский конгресс молодых ученых, XII Международная конференция по химии для молодых ученых МЕНДЕЛЕЕВ-2021, Bio-Inspired Nanomaterials (Сеул, Южная Корея), XI Конгресс молодых ученых, VII Всероссийская молодежная конференция

«Достижения молодых ученых: химические науки», XXIX всероссийская конференция молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины-2023», XII Конгресс молодых ученых, Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2023», XXXIII Российская молодежная научная конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения профессора В. Ф. Барковского, XXIV Международная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых «Химия и химическая технология в XXI веке».

Публикации.

Основные результаты по теме диссертации изложены в 5 публикациях в журналах первого квартиля (Q1), входящих в базы данных научного цитирования Scopus/Web of Science:

1. Protasiuk L., Serov N., Lokteva A., Kladko D., Koshel E., Vinogradov V. Mechano-bactericidal anisotropic particles for oral biofilm treatment // Journal of Materials Chemistry B. 2022. 10(25). pp.4867-4877.

IF = 6.3

2. Serov N., Darmoroz D., Lokteva A., Chernyshov I., Koshel E., Vinogradov V. One-pot synthesis of template-free hollow anisotropic CaCO3 structures: Towards inorganic shape-mimicking drug delivery systems // Chemical Communications. 2020. 56(80). pp.11969-11972.

IF = 6.1

3. Serov N., Prilepskii A., Sokolov A., Vinogradov V. Synthesis of Plasmin-Loaded Fe3O4@ CaCO3 Nanoparticles: Towards Next-Generation Thrombolytic Drugs // ChemNanoMat. 2019. 5(10). pp.1267-1271.

IF = 3.8

4. Shirokii N., Din Y., Petrov I., Seregin Y., Sirotenko S., Razlivina J., Serov N. and Vinogradov V. Quantitative Prediction of Inorganic Nanomaterial Cellular Toxicity via Machine Learning // Small. 2023. p.2207106.

IF = 15.2

5. Serov N., Vinogradov V. Inverse material search and synthesis verification by hand drawings via transfer learning and contour detection // Small Methods. 2022. 6(5). p.2101619.

IF = 15.4

Личный вклад автора.

В диссертационной работе рассмотрены экспериментальные и теоретические результаты научных исследований, осуществленных лично автором или при непосредственном участии автора на всех этапах исследования.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части, описывающей методики синтеза наночастиц и материалов на их основе, методы их исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 252 страницах печатного текста, содержит 6 таблиц и 69 рисунков. Список литературы включает 292 источника.

Диссертация изложена в соответствии с общими требованиями к оформлению , утвержденными в ГОСТ Р 7.0.11.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Вo введении обоснована актуальность темы исследования, поставлена цель и сформулированы задачи диссертационной работы, раскрыты научная и практическая значимость работы, ее достоверность. Приведены основные научные положения, выносимые на защиту, а также сведения об апробации результатов посредством публикаций статей и тезисов, а также устных докладов.

В первой главе описывается современное состояние использования наноструктурированного карбоната кальция в качестве систем адресной доставки лекарств, приводятся примеры использования различных полиморфных модификаций карбоната кальция, достоинства таких систем адресной доставки, возможности их модификации для диагностических, терапевтических и тераностических целей. Также рассматривается влияние морфологических и

кристаллических параметров неорганических нано- и микрочастиц на их взаимодействие с биологическими системами. Далее, изложены механизмы контроля морфологии неорганических систем доставки через селективный адсорбционный рост, блокирование кристаллических плоскостей, контроль кинетики диффузии ионов к поверхности кристаллов, контроль агрегации и агломерации кристаллов, использование затравок, направленное сращивание граней с высокой энергией, а также опосредованную сочетанием слабых и сильных взаимодействий самосборку. Помимо этого, рассмотрены синтетические методы получения неорганических нано- и микрочастиц заданной морфологии через контроль концентрации прекурсоров, влияющих на процессы зародышеобразования и роста, подбор системы растворителей, способных координировать прекурсоры и влиять на скорость протекания реакции, подбор оптимального рН и использование полимеров и поверхностно-активных веществ (ПАВ).

Во второй главе описываются экспериментальные методы, использованные в диссертации, а также описана необходимость использования приведенных исследований для характеризации полученных образцов. Данная часть включает в себя: описание всех использованных в работе реактивов; синтетических процедур получения микрочастиц карбоната кальция ежеподобной, кубической, сферической, стержневидной и бактериеподобной форм; методов характеризации полученных образцов, а именно, их кристаллической структуры посредством рентгенофазового анализа, морфологии посредством сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, внутренней структуры посредством резки ионным пучком, пористости через сорбцию-десорбцию азота, загрузки и высвобождения малыми молекулами, белками и нуклеиновыми кислотами; методов изучения биологической активности полученных образцов.

В третьей главе описывается разработка нескольких синтетических методов получения природоподобных нано- и микрочастиц карбоната кальция

Рисунок 1. Высокопроизводительный синтез и морфологическая характеризация нано- и микрочастиц карбоната кальция различной анизометрии, получаемых соосаждением из водных растворов.

анизометрических морфологий, рассматриваются механизмы их формирования, а также демонстрируется влияние морфологии на биологическую активность разработанных неорганических систем; более того, описывается разработка подходов к моделированию неорганических частиц заданной морфологии и их биологических активностей.

Первая часть главы посвящена демонстрации формозависимой антибактериальной активности полученных анизометрических микрочастиц CaCO3 по отношению к биопленкам E. coli и S. aureus.

На первом этапе работы путем высокопроизводительного синтеза был проведен скрининг 216 синтетических процедур, приведший к получению более 20 уникальных морфологий нано- и микрочастиц карбоната кальция различной степени анизометрии (Рисунок 1), позволивший изучить морфологическое разнообразие карбоната кальция, получаемого растворными методами.

Тип микрочастицы Длина Ширина Доп. информация

Сфера 1,38 мкм 1,38 мкм Изотропная форма

Куб 5,25 мкм 5,25 мкм Угловая ориентация

Стержень 10,5 мкм 0,9 мкм Острые углы сглажены

Еж 4,1 мкм 0,2 мкм Расстояние между иглами 0.8 мкм

Таблица 1. Данные о линейных размерах набора микрочастиц карбоната кальция различной анизометрии.

Чтобы подтвердить гипотезу формозависимого действия микрочастиц карбоната кальция на клеточную стенку бактерий, из проведенных на предыдущем этапе синтезов был выбран набор синтетических процедур по получению микрочастиц карбоната кальция различной анизометрии (Рисунок 2, Таблица 1). Сферический СаСОз (диаметр 2,8 ± 0.9 мкм) был получен методом растворной химии при высокой степени пересыщения раствора в условиях кинетического контроля. Кубический СаСОз (грань 5,3 ± 2,6 мкм) был получен за счет способности метастабильного ватерита переходить в более термодинамически

стабильную фазу кальцита. Стрежневидный CaCO3 (длина 10,3 ± 7,0 мкм) был получен смещением термодинамического равновесия в сторону формирования фазы арагонита за счет проведения реакции при повышенных температурах (75 оС). Ежеподобный CaCO3 (диаметр 24,4 ± 5,8 мкм) был получен одновременным смещением равновесия в сторону растущего преимущественно в форме стержней арагонита и добавлением ионов магния Mg2+, играющих роль регулятора соотношения сторон итоговых кристаллов и встраивающихся в кристаллическую решетку арагонита с последующим разветвленным ростом и агрегации последнего.

Чтобы определить, достаточно ли механического воздействия синтезированных частиц микрометрового масштаба и заданной геометрии (сфера, куб, стержень, еж) на бактерии для разрыва клеточной стенки, было проведено мультифизическое моделирование. Схема и результаты мультифизического моделирования обобщены на Рисунке 3. Механическое воздействие на E. coli при вдавливании частиц показывает сопоставимую эффективность для всех анизометрических геометрий, однако сферические частицы продемонстрировали куда меньшую активность, недостаточную для разрыва клеточной стенки. В частности, наиболее выраженная бактерицидная активность наблюдалась для частиц кубической формы (13 МПа) с угловой ориентацией, стержнеподобных частиц (13 МПа), с незначительным снижением для сферических (10 МПа) и ежеподобных частиц (9 МПа). Эти результаты хорошо согласуются с последними теоретическими исследованиями бактерицидного действия частиц с высоким соотношением сторон и показывают, что стержневая геометрия может рассматриваться как наиболее перспективная для данной биоматериаловедческой задачи.

Следующим этапом была экспериментальная оценка бактерицидной активности синтезированных микрочастиц CaCO3 различной анизометрии как на

Рисунок 3. Численное моделирование механического разрыва бактерий для прогнозирования формы: А) упрощение геометрии частицы и бактерии, Б) мультифизическое моделирование клеточной стенки бактерии после вдавливания частицы, цветная полоса соответствует контактному давлению (зеленый градиент) и растягивающему напряжению фон Мисса (Па).

грамположительных, так и на грамотрицательных бактериях с различной структурой клеточной стенки, где были выбраны наиболее изученные штаммы S. aureus ATCC 209P и E. coli K12, соответственно (Рисунок 4).

На Рисунке 4А показаны изображения с флуоресцентного микроскопа после инкубации бактериальных клеток E. coli K12 и S. aureus ATCC 209P с частицами CaCO3 в условиях перемешивания, по которым можно сделать

Рисунок 4. Зависимый от формы механобактерицидный эффект микрочастиц CaCO3. А) Флуоресцентные микроскопические изображения E. coli и S. aureus после окрашивания акридиновым оранжевым / пропидий йодидом, которые показывают живые и мертвые клетки, соответственно, и Б) количество КОЕ для E. coli и S. aureus. Полученная смертность бактерий не демонстрирует заметного сильного эффекта для E. coli, в то время как для S. aureus наблюдается более высокая эффективность анизометрических микрочастиц по сравнению с изотропными, сферическими.

вывод о значительном протыкании клеточной стенки микрочастицами в форме стержней и ежей. Для дифференциации нелетального и летального протыкания клеточной стенки после эксперимента был проведен подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) для оценки жизнеспособности клеток (Рисунок 4Б для E. coli K12 и S. aureus ATCC 209P). Результирующая бактериальная смертность от частиц разных форм практически неотличима для E. coli K12 (эффективность 93%), что может быть связано с высокой концентрацией частиц, однако для S. aureus ATCC 209P наблюдается более

высокая эффективность анизометрических микрочастиц (около 90% для ежей и стержней и 80% для кубов) по сравнению с изотропной, сферической (50% эффективность уничтожения бактерий) для S. aureus ATCC 209P. Полученные результаты хорошо согласуются с моделированием in silico. Конструкция анизометрических частиц обладает выраженным инактивационным действием даже для жестких грамположительных бактерий, что очень перспективно для борьбы со стрептококками, актиномицетами и лактобактериями, формирующими биопленки полости рта.

Помимо уничтожения бактерий, другим не менее важным свойством разработанных материалов является удаление биопленок с поверхности, поскольку их внеклеточный матрикс представляет собой поддерживающую среду для роста и размножения новых бактерий. Для получения воспроизводимых результатов были проведены эксперименты in vitro с окрашенными биопленками, закрепленными на поверхности PDMS (Рисунок 5). Все типы частиц демонстрируют линейное дозозависимое увеличение эффективности, а именно, небольшой процент удаленных биопленок при концентрациях 1 мг/мл без значительного влияния формы (средняя эффективность 115%) и существенная элиминация биопленок при 25 мг/мл с четко прослеживающимся влиянием формы. Эффективность удаления биопленок достигла максимального уровня для микрочастиц в форме ежей 180 ± 14% и 169 ± 9,3% при максимальных концентрациях для E. coli K12 и S. aureus, соответственно. Сопоставимые результаты наблюдались для стержневидных микрочастиц (160 ± 8,5% и 146 ± 12%), тогда как кубические микрочастицы показали статистически достоверно более низкую эффективность (143±8,5% и 133+6,9%). Ожидаемо, наименьшую эффективность продемонстрировали сферические микрочастицы с максимальным значением 123 ± 11,6% и 117 ± 4,2%.

Рисунок 5. Механическое удаление биопленок с искусственной поверхности PDMS. А) Экспериментальная установка, основанная на удалении бактерий с поверхности зубной щеткой в присутствии анизометрических частиц, с последующим окрашиванием биопленки для оценки эффективности удаления; Б-В) Спектрофотометрическая оценка эффективности удаления биопленки для Б) E. coli и В) S. aureus. Представленные результаты являются средним значением трех независимых экспериментов (по три повтора в каждом) ± стандартное отклонение. * p < 0,1, ** p < 0,05, *** p < 0,025.

Значительная эффективность удаления биопленок с поверхности эмали в зависимости от формы частиц, сильно коррелирующая и почти в 2 раза превышающая предыдущие результаты, наблюдалась для обоих штаммов в экспериментах ex vivo (Рисунок 6). Наиболее выраженный формозависимый бактерицидный эффект наблюдался для микрочастиц в форме ежей и стержней как для E. coli K12 (227 ± 32,6% и 215 ± 33%), так и для S. aureus (210 ± 54,7% и 202 ± 55,5%) при концентрации 25 мг/мл, тогда как

Рисунок 6. Удаление биопленок ex vivo. А) Структура эксперимента. Б-В) Спектрофотометрическая оценка эффективности удаления биопленок для Б) E. coli и В) S. aureus. Значительная эффективность удаления биопленки с зубов в зависимости от формы, сильно коррелирующая и почти в 2 раза превышающая предыдущие результаты, наблюдалась для обоих штаммов. Наиболее выраженный механобактерицидный эффект наблюдался для микрочастиц в форме ежей и стержней как для E. coli (227 ± 32,6% и 215 ± 33%), так и для S. aureus (210 ± 55% и 202 ± 56%) при концентрации 25 мг/мл.

микрочастицы в форме кубов показали гораздо меньшую эффективность (151 ± 46,5% и 133 ± 9,6% для E. coli K12 и S. aureus, соответственно). Микрочастицы в форме сфер показали ту же эффективность около 125%, что и в предыдущем эксперименте на искусственных поверхностях PDMS, что почти в 2 раза хуже по сравнению с микрочастицами в форме ежей и стержней.

Для проверки биосовместимости был проведен тест на цитотоксичность синтезированных абразивных микрочастиц с помощью МТТ-теста. В экспериментах не наблюдалось значительной цитотоксичности и жизнеспособности эпителиальных клеток НСТ-116 ниже 90% даже при высоких концентрациях микрочастиц. Для оценки механического и, возможно, разрушающего воздействия разработанных материалов на целостность и структуру зубной эмали, была проведена очистка зубов микрочастицами с последующей оценкой образцов эмали из тех же областей с помощью СЭМ, где дистиллированная вода и осадок из коммерческой зубной пасты служили контрольными образцами. Было показано, что нет существенной разницы в механическом повреждении эмали после обработки частицами различных форм, а также в сравнении с чистой водой и осадком из коммерческой зубной пасты.

Таким образом, продемонстрирован высокий потенциал формозависимого антибактериального эффекта с использованием микрочастиц с контролируемой анизометрией формы для борьбы с биопленками.

Вторая часть главы описывает разработку нового бестемплатного одностадийного синтеза полых анизометрических микрочастиц СаСОз бактериеподобной формы, а также демонстрирует рН-зависимое высвобождение инкапсулированных антибиотических молекул из полученных микрокапсул в среде биопленок.

Помимо прямого механического действия, контроль морфологии частиц позволяет придавать системам доставки более сложные свойства. В данном разделе представлены результаты разработки бактериеподобных полых микрочастиц СаСОз (Рисунок 7), способных к одномоментному селективному высвобождению молекул антибиотика в среде бактериальных биопленок.

Рисунок 7. Предложенный механизм формирования полых анизометрических бактериеподобных микрочастиц карбоната кальция. Отражена эволюция формы и полости. Масштаб - 5 мкм.

В соответствии с разработанной методикой были получены анизотропные бактериеподобные микрочастицы (Рисунок 8А), где энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (Рисунок 8Б) показала присутствие в частицах магния, равномерно распределенного вдоль продольной оси (Рисунок 8С). Было показано, что полученные капсулы подвержены изменению морфологии поверхности со временем, обусловленному протеканием созревания Оствальда. Время синтеза не оказало влияния на размер и морфологию частиц, тогда как скорость перемешивания сильно повлияла как на размер, так и на форму частиц, что связывается с чувствительностью формы агрегатов АКК, формируемых на начальных этапах, к агитационному режиму.

Для изучения влияния иона М^2+ был проведен эксперимент с различными соотношениями М§2+/Са2+ (Рисунок 9). Когда в системе почти нет М§2+, происходит зарождение монокристаллов ватерита с последующей агрегацией в сферические частицы. Когда отношение М§2+/Са2+ низкое, наблюдается

т-1-■-I-I

1 2 3 4 5 Длина, мкм

Рисунок 8. Характеризация бактериоподобных микрочастиц СаС03. А) Изображение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Шкала - 20 мкм; Б) энергодисперсионный анализ; В) распределение элементов в одной частице (продольная ось). Шкала - 2.5 мкм.

кристаллизация кальцита, и степень анизометрии частиц увеличивается вместе с отношением М§2+/Са2+. В какой-то момент наблюдается резкое увеличение соотношения сторон, что приводит к ориентированному зарождению игольчатого кальцита из агрегатов АКК, образующих бактериеподобную форму. Дальнейшее увеличение соотношения М§2+/Са2+ устраняет этот эффект и приводит к образованию линейных некристаллических стержнеподобных структур за счет стабилизации АКК ионами М§2+. Увеличение количества этиленгликоля (ЭГ) приводит к снижению скорости диффузии и, таким образом, тормозит процессы растворения и кристаллизации. Этот процесс имеет тот же эффект, что и снижение плотности зародышеобразования, а изменение формы частиц в результате увеличения соотношения ЭГ/Н20 от 1:1 до 7:1 (Рисунок 10) коррелирует с

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Серов Никита Сергеевич, 2023 год

Список литературы

1. Acharya D. и др. Shape dependent physical mutilation and lethal effects of silver nanoparticles on bacteria // Sci Rep. 2018. Т. 8. № 1.

2. Addadi L., Raz S., Weiner S. Taking Advantage of Disorder: Amorphous Calcium Carbonate and Its Roles in Biomineralization // Advanced Materials. 2003. Т. 15. № 12. С. 959-970.

3. Agarwalla S. V. и др. Persistent inhibition of Candida albicans biofilm and hyphae growth on titanium by graphene nanocoating // Dental Materials. 2021. Т. 37. № 2. С. 370-377.

4. Albanese A., Chan W. C. W. Effect of gold nanoparticle aggregation on cell uptake and toxicity // ACS Nano. 2011. Т. 5. № 7. С. 5478-5489.

5. Alkjaersig N., Fletcher A. P., Sherry S. THE MECHANISM OF CLOT DISSOLUTION BY PLASMIN* // Journal of Clinical Investigation. 1959. Т. 38. № 7. С. 1086-1095.

6. Ambuchi J. J. и др. Response of anaerobic granular sludge to iron oxide nanoparticles and multi-wall carbon nanotubes during beet sugar industrial wastewater treatment // Water Res. 2017a. Т. 117. С. 87-94.

7. Ambuchi J. J. и др. Response of anaerobic granular sludge to iron oxide nanoparticles and multi-wall carbon nanotubes during beet sugar industrial wastewater treatment // Water Res. 2017b. Т. 117. С. 87-94.

8. An J. и др. Nanoenabled Disruption of Multiple Barriers in Antigen Cross-Presentation of Dendritic Cells via Calcium Interference for Enhanced Chemo-Immunotherapy // ACS Nano. 2020. Т. 14. № 6. С. 7639-7650.

9. Arnida, Malugin A., Ghandehari H. Cellular uptake and toxicity of gold nanoparticles in prostate cancer cells: A comparative study of rods and spheres // Journal of Applied Toxicology. 2010. Т. 30. № 3. С. 212-217.

10. Ashraf S. h gp. Protein-mediated synthesis, pH-induced reversible agglomeration, toxicity and cellular interaction of silver nanoparticles // Colloids Surf B Biointerfaces.

2013. T. 102. C. 511-518.

11. Augustine R. h gp. Cellular uptake and retention of nanoparticles: Insights on particle properties and interaction with cellular components // Mater Today Commun. 2020. T. 25.

12. Bai S. h gp. Connecting Calcium-Based Nanomaterials and Cancer: From Diagnosis to Therapy // Nanomicro Lett. 2022. T. 14. № 1. C. 145.

13. Begum G. h gp. In Situ Strategy to Encapsulate Antibiotics in a Bioinspired CaCO 3 Structure Enabling pH-Sensitive Drug Release Apt for Therapeutic and Imaging Applications // ACS Appl Mater Interfaces. 2016. T. 8. № 34. C. 22056-22063.

14. Bhattacharya D. h gp. Differential toxicity of rod and spherical zinc oxide nanoparticles on human peripheral blood mononuclear cells // J Biomed Nanotechnol.

2014. T. 10. № 4. C. 707-716.

15. Biacchi A. J., Schaak R. E. The solvent matters: kinetic versus thermodynamic shape control in the polyol synthesis of rhodium nanoparticles // ACS Nano. 2011. T. 5. № 10. C. 8089-8099.

16. Bibikova O. h gp. Plasmon-resonant gold nanoparticles with variable morphology as optical labels and drug carriers for cytological research // Optics InfoBase Conference Papers. , 2013.

17. Bom V. J. J., Bertina R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII // Biochemical Journal. 1990. T. 265. № 2. C. 327-336.

18. Boon M. h gp. Stabilization of Aragonite: Role of Mg2+and Other Impurity Ions // Cryst Growth Des. 2020. T. 20. № 8. C. 5006-5017.

19. Brecevic L. h gp. Effect of divalent cations on the formation and structure of calcium carbonate polymorphs // J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1996. T. 92. № 6. C. 1017-1022.

20. Brown S. C. h gp. Influence of shape, adhension and simulated lung mechanics on amorphous silica nanoparticle toxicity // Advanced Powder Technology. 2007. T. 18. № 1. C. 69-79.

21. Canaparo R. h gp. Recent developments in antibacterial therapy: Focus on stimuli -responsive drug-delivery systems and therapeutic nanoparticles // Molecules. 2019. T. 24. № 10.

22. Cartwright J. H. E. h gp. Calcium Carbonate Polyamorphism and Its Role in Biomineralization: How Many Amorphous Calcium Carbonates Are There? // Angewandte Chemie International Edition. 2012a. T. 51. № 48. C. 11960-11970.

23. Cartwright J. H. E. h gp. Calcium Carbonate Polyamorphism and Its Role in Biomineralization: How Many Amorphous Calcium Carbonates Are There? // Angewandte Chemie International Edition. 2012b. T. 51. № 48. C. 11960-11970.

24. Caswell K. K., Bender C. M., Murphy C. J. Seedless, surfactantless wet chemical synthesis of silver nanowires // Nano Lett. 2003. T. 3. № 5. C. 667-669.

25. Champion J. A., Mitragotri S. Role of target geometry in phagocytosis // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2006. T. 103. № 13. C. 4930-4934.

26. Cheeseman S. h gp. Broad-spectrum treatment of bacterial biofilms using magneto-responsive liquid metal particles // J Mater Chem B. 2020. T. 8. № 47. C. 10776-10787.

27. Chen C. h gp. Polyethyleneimine-modified calcium carbonate nanoparticles for p53 gene delivery // Regen Biomater. 2016. T. 3. № 1. C. 57-63.

28. Chen G. h gp. Regioselective surface encoding of nanoparticles for programmable self-assembly // Nat Mater. 2019. T. 18. № 2. C. 169-174.

29. Chen L. h gp. Recent developments of mesoporous silica nanoparticles in biomedicine // Emergent Mater. 2020. T. 3. № 3. C. 381-405.

30. Chen S. h gp. Efficient non-viral gene delivery mediated by nanostructured calcium carbonate in solution-based transfection and solid-phase transfection // Mol Biosyst. 2011. T. 7. № 10. C. 2841.

31. Chen T., Neville A., Yuan M. Assessing the effect of on scale formation-bulk precipitation and surface deposition // J Cryst Growth. 2005. T. 275. № 1-2. C. e1341-e1347.

32. Cheng A.-L. h gp. Challenges of combination therapy with immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma // J Hepatol. 2020. T. 72. № 2. C. 307-319.

33. Cheon J. Y. h gp. Shape-dependent antimicrobial activities of silver nanoparticles // Int J Nanomedicine. 2019. T. 14. C. 2773-2780.

34. Chernousova S., Epple M. Silver as antibacterial agent: Ion, nanoparticle, and metal // Angewandte Chemie - International Edition. 2013. T. 52. № 6. C. 1636-1653.

35. Chmielewska S. J. h gp. Bactericidal properties of rod-, peanut-, and star-shaped gold nanoparticles coated with ceragenin CSA-131 against multidrug-resistant bacterial strains // Pharmaceutics. 2021. T. 13. № 3.

36. Choi S.-J. h gp. The fate of calcium carbonate nanoparticles administered by oral route: absorption and their interaction with biological matrices // Int J Nanomedicine. 2015. C. 2273.

37. Chompoosor A. h gp. The role of surface functionality on acute cytotoxicity, ROS generation and DNA damage by cationic gold nanoparticles // Small. 2010. T. 6. № 20. C. 2246-2249.

38. Chopra D., Gulati K., Ivanovski S. Understanding and optimizing the antibacterial functions of anodized nano-engineered titanium implants // Acta Biomater. 2021. T. 127. C. 80-101.

39. Chu Z. h gp. Unambiguous observation of shape effects on cellular fate of nanoparticles // Sci Rep. 2014. T. 4.

40. Cruces E. h gp. Similar toxicity mechanisms between graphene oxide and oxidized multi-walled carbon nanotubes in Microcystis aeruginosa // Chemosphere. 2021. T. 265.

41. Cui Q. h gp. Validation of the mechano-bactericidal mechanism of nanostructured surfaces with finite element simulation // Colloids Surf B Biointerfaces. 2021a. T. 206.

42. Cui Q. h gp. Validation of the mechano-bactericidal mechanism of nanostructured surfaces with finite element simulation // Colloids Surf B Biointerfaces. 2021b. T. 206. C. 111929.

43. Cui X. h gp. Mechanism of the Mixed Surfactant Micelle Formation // J Phys Chem B. 2010. T. 114. № 23. C. 7808-7816.

44. Dayem A. A. h gp. The potential of nanoparticles in stem cell differentiation and further therapeutic applications // Biotechnol J. 2016a. T. 11. № 12. C. 1550-1560.

45. Dayem A. A. h gp. The potential of nanoparticles in stem cell differentiation and further therapeutic applications // Biotechnol J. 2016b. T. 11. № 12. C. 1550-1560.

46. Dayem A. A. h gp. The role of reactive oxygen species (ROS) in the biological activities of metallic nanoparticles // Int J Mol Sci. 2017. T. 18. № 1.

47. Deng Y., Sun M., Shaevitz J. W. Direct measurement of cell wall stress stiffening and turgor pressure in live bacterial cells // Phys Rev Lett. 2011. T. 107. № 15.

48. Ding Q. h gp. Microbial cell engineering to improve cellular synthetic capacity // Biotechnol Adv. 2020a. T. 45.

49. Ding Q. h gp. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production // Nat Commun. 2020b. T. 11. № 1.

50. Ding Q. h gp. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production // Nat Commun. 2020c. T. 11. № 1.

51. Dixit H. G. h gp. Massively-Parallelized, Deterministic Mechanoporation for Intracellular Delivery // Nano Lett. 2019. T. 20. C. 860-867.

52. Dolmans D. E. J. G. J., Fukumura D., Jain R. K. Photodynamic therapy for cancer // Nat Rev Cancer. 2003. T. 3. № 5. C. 380-387.

53. Dong L. h gp. Shape-dependent toxicity of alumina nanoparticles in rat astrocytes // Science of the Total Environment. 2019. T. 690. C. 158-166.

54. Dong Y. h gp. Magnetic Microswarm Composed of Porous Nanocatalysts for Targeted Elimination of Biofilm Occlusion // ACS Nano. 2021.

55. Dongni R., Yonghua G., Qingling F. Comparative study on nano-mechanics and thermodynamics of fish otoliths // Materials Science and Engineering C. 2013. T. 33. № 1. C. 9-14.

56. Dreaden E. C. h gp. The golden age: Gold nanoparticles for biomedicine // Chem Soc Rev. 2012. T. 41. № 7. C. 2740-2779.

57. Edwardson T. G. W. h gp. Transfer of molecular recognition information from DNA nanostructures to gold nanoparticles // Nat Chem. 2016. T. 8. № 2. C. 162-170.

58. Eguchi M. h gp. Simple reductant concentration-dependent shape control of polyhedral gold nanoparticles and their plasmonic properties // Langmuir. 2012a. T. 28. № 24. C. 9021-9026.

59. Eguchi M. h gp. Simple reductant concentration-dependent shape control of polyhedral gold nanoparticles and their plasmonic properties // Langmuir. 2012b. T. 28. № 24. C. 9021-9026.

60. Elbourne A. h gp. Antibacterial Liquid Metals: Biofilm Treatment via Magnetic Activation // ACS Nano. 2020. T. 14. № 1. C. 802-817.

61. Elder A. h gp. Testing Nanomaterials of Unknown Toxicity: An Example Based on Platinum Nanoparticles of Different Shapes // Advanced Materials. 2007. T. 19. № 20. C. 3124-3129.

62. Enea M. h gp. Gold nanoparticles induce oxidative stress and apoptosis in human kidney cells // Nanomaterials. 2020. T. 10. № 5.

63. Eroglu E. h gp. Enhanced accumulation of microalgal pigments using metal nanoparticle solutions as light filtering devices // Green Chemistry. 2013. T. 15. № 11. C. 3155-3159.

64. Falchevskaya A. S. h gp. Facile Synthesis of a Library of Hollow Metallic Particles through the Galvanic Replacement of Liquid Gallium // Chemistry of Materials. 2021a.

65. Falchevskaya A. S. h gp. Facile Synthesis of a Library of Hollow Metallic Particles through the Galvanic Replacement of Liquid Gallium // Chemistry of Materials. 2021b.

66. Fan J. H. h gp. Cytotoxicity and differentiation effects of gold nanoparticles to human bone marrow mesenchymal stem cells // Biomed Eng (Singapore). 2011. T. 23. № 2. C. 141-152.

67. Fatima H. h gp. Shape-controlled synthesis of magnetic Fe3O4 nanoparticles with different iron precursors and capping agents // RSC Adv. 2018. T. 8. № 41. C. 2291722923.

68. Feng Q. h gp. pH/Ultrasound Dual-Responsive Gas Generator for Ultrasound Imaging-Guided Therapeutic Inertial Cavitation and Sonodynamic Therapy // Adv Healthc Mater. 2018. T. 7. № 5. C. 1700957.

69. Ferrer-Miralles N. h gp. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals // Microb Cell Fact. 2009. T. 8. C. 1-8.

70. Forest V. h gp. Impact of cerium oxide nanoparticles shape on their in vitro cellular toxicity // Toxicology in Vitro. 2017. T. 38. C. 136-141.

71. Fujiwara M. h gp. Encapsulation of Proteins into CaCO 3 by Phase Transition from Vaterite to Calcite // Cryst Growth Des. 2010. T. 10. № 9. C. 4030-4037.

72. Galluzzi L. h gp. Molecular mechanisms of cell death: Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018 // Cell Death Differ. 2018. T. 25. № 3. C. 486-541.

73. Ganendra G. h gp. Formate Oxidation-Driven Calcium Carbonate Precipitation by Methylocystis parvus OBBP // Appl Environ Microbiol. 2014a. T. 80. № 15. C. 46594667.

74. Ganendra G. h gp. Formate Oxidation-Driven Calcium Carbonate Precipitation by Methylocystis parvus OBBP // Appl Environ Microbiol. 2014b. T. 80. № 15. C. 46594667.

75. Ganjian M. h gp. Nature Helps: Toward Bioinspired Bactericidal Nanopatterns // Adv Mater Interfaces. 2019a. T. 6. № 16.

76. Ganjian M. h gp. Nature Helps: Toward Bioinspired Bactericidal Nanopatterns // Adv Mater Interfaces. 2019b. T. 6. № 16.

77. Gao D., Zhang X., Gao W. Formation of bundle-shaped ß-NaYF4 upconversion microtubes via ostwald ripening // ACS Appl Mater Interfaces. 2013. T. 5. № 19. C. 9732-9739.

78. Gao G. h gp. Shape-controlled synthesis and magnetic properties of monodisperse Fe 3O4 nanocubes // Cryst Growth Des. 2010. T. 10. № 7. C. 2888-2894.

79. Gao J., Bender C. M., Murphy C. J. Dependence of the Gold Nanorod Aspect Ratio on the Nature of the Directing Surfactant in Aqueous Solution // Langmuir. 2003. T. 19. № 21. C. 9065-9070.

80. Gatoo M. A. h gp. Physicochemical properties of nanomaterials: Implication in associated toxic manifestations // Biomed Res Int. 2014. T. 2014.

81. Giannini M., Soares C. J., Carvalho R. M. De. Ultimate tensile strength of tooth structures // Dental Materials. 2004. T. 20. № 4. C. 322-329.

82. Gregurec D. h gp. Magnetic Vortex Nanodiscs Enable Remote Magnetomechanical Neural Stimulation // ACS Nano. 2020. T. 14. № 7. C. 8036-8045.

83. Grzelczak M. h gp. Directed self-assembly of nanoparticles // ACS Nano. 2010. T. 4. № 7. C. 3591-3605.

84. Gul G., Yildirim R., Ileri-Ercan N. Cytotoxicity analysis of nanoparticles by association rule mining // Environ Sci Nano. 2021. T. 8. № 4. C. 937-949.

85. Guo J. h gp. Light-driven fine chemical production in yeast biohybrids // Science (1979). 2018. T. 362. № 6416. C. 813-816.

86. Gupta G. K., Jain V., Mishra P. R. Templated Ultrathin Polyelectrolyte Microreservoir for Delivery of Bovine Serum Albumin: Fabrication and Performance Evaluation // AAPS PharmSciTech. 2011. T. 12. № 1. C. 344-353.

87. Ha T. H., Koo H. J., Chung B. H. Shape-controlled syntheses of gold nanoprisms and nanorods influenced by specific adsorption of halide ions // Journal of Physical Chemistry C. 2007. T. 111. № 3. C. 1123-1130.

88. Habas S. E. h gp. Shaping binary metal nanocrystals through epitaxial seeded growth // Nat Mater. 2007. T. 6. № 9. C. 692-697.

89. Hameed S. h gp. Shape-dependent significant physical mutilation and antibacterial mechanisms of gold nanoparticles against foodborne bacterial pathogens (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus) at lower concentrations // Materials Science and Engineering C. 2020. T. 108. № April 2019. C. 110338.

90. Han Y. J., Aizenberg J. Effect of magnesium ions on oriented growth of calcite on carboxylic acid functionalized self-assembled monolayer // J Am Chem Soc. 2003a. T. 125. № 14. C. 4032-4033.

91. Han Y.-J., Aizenberg J. Effect of Magnesium Ions on Oriented Growth of Calcite on Carboxylic Acid Functionalized Self-Assembled Monolayer // J Am Chem Soc. 2003b. T. 125. № 14. C. 4032-4033.

92. Harris A. R., Jreij P., Fletcher D. A. Mechanotransduction by the Actin Cytoskeleton: Converting Mechanical Stimuli into Biochemical Signals // Annu Rev Biophys. 2018. T. 47. № 1. C. 617-631.

93. He X. h gp. Calcium carbonate nanoparticle delivering vascular endothelial growth factor-C siRNA effectively inhibits lymphangiogenesis and growth of gastric cancer in vivo // Cancer Gene Ther. 2008. T. 15. № 3. C. 193-202.

94. Higgins S. G. h gp. High-Aspect-Ratio Nanostructured Surfaces as Biological Metamaterials // Advanced Materials. 2020. T. 32. № 9. C. 1-44.

95. Hihara H. h gp. Effectiveness and safety of a new dental plaque removal device utilizing micro mist spray for removing oral biofilm in vitro // BMC Oral Health. 2021. T. 21. № 1. C. 286.

96. Hortin G. L., Gibson B. L., Fok K. F. a2-antiplasmin's carboxy-terminal lysine residue is a major site of interaction with plasmin // Biochem Biophys Res Commun. 1988. T. 155. № 2. C. 591-596.

97. Hu Q. h gp. Growth process and crystallographic properties of ammonia-induced vaterite // American Mineralogist. 2012. T. 97. № 8-9. C. 1437-1445.

98. Hu Y., He L., Yin Y. Magnetically Responsive Photonic Nanochains // Angewandte Chemie. 2011. T. 123. № 16. C. 3831-3834.

99. Huang B. X., Kim H.-Y., Dass C. Probing three-dimensional structure of bovine serum albumin by chemical cross-linking and mass spectrometry // J Am Soc Mass Spectrom. 2004. T. 15. № 8. C. 1237-1247.

100. Huang H. h gp. Smart responsive-calcium carbonate nanoparticles for dual-model cancer imaging and treatment // Ultrasonics. 2020. T. 108. C. 106198.

101. Huang L. H., Sun X. Y., Ouyang J. M. Shape-dependent toxicity and mineralization of hydroxyapatite nanoparticles in A7R5 aortic smooth muscle cells // Sci Rep. 2019a. T. 9. № 1.

102. Huang L. H., Sun X. Y., Ouyang J. M. Shape-dependent toxicity and mineralization of hydroxyapatite nanoparticles in A7R5 aortic smooth muscle cells // Sci Rep. 2019b. T. 9. № 1.

103. Huang X. h gp. Cancer Cell Imaging and Photothermal Therapy in the Near-Infrared Region by Using Gold Nanorods // J Am Chem Soc. 2006. T. 128. № 6. C. 2115-2120.

104. Huang X. h gp. The effect of the shape of mesoporous silica nanoparticles on cellular uptake and cell function // Biomaterials. 2010. T. 31. № 3. C. 438-448.

105. Huang Y. W., Cambre M., Lee H. J. The Toxicity of Nanoparticles Depends on Multiple Molecular and Physicochemical Mechanisms // Int J Mol Sci. 2017a. T. 18. № 12.

106. Huang Y. W., Cambre M., Lee H. J. The Toxicity of Nanoparticles Depends on Multiple Molecular and Physicochemical Mechanisms // Int J Mol Sci. 2017b. T. 18. № 12.

107. Hwang G. h gp. Catalytic antimicrobial robots for biofilm eradication // Sci Robot. 2019. T. 4. № 29. C. 1-14.

108. In M. h gp. Quaternary Ammonium Bromide Surfactant Oligomers in Aqueous Solution: Self-Association and Microstructure // Langmuir. 2000. T. 16. № 1. C. 141148.

109. Ivask A. h gp. Size-dependent toxicity of silver nanoparticles to bacteria, yeast, algae, crustaceans and mammalian cells in vitro // PLoS One. 2014. T. 9. № 7.

110. Jain T. h gp. Anisotropic growth of gold nanoparticles using cationic gemini surfactants: effects of structure variations in head and tail groups // J. Mater. Chem. C. 2014. T. 2. № 6. C. 994-1003.

111. Jana N. R. Shape Effect in Nanoparticle Self-Assembly // Angewandte Chemie. 2004. T. 116. № 12. C. 1562-1566.

112. Jang H. J., Lee H. Y. Size control of aggregations via self-assembly of amphiphilic gold nanoparticles // Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 2018. T. 538. C. 574-582.

113. Jiang J. h gp. Does nanoparticle activity depend upon size and crystal phase? // Nanotoxicology. 2008. T. 2. № 1. C. 33-42.

114. Jiao L. h gp. Facile synthesis of high-quality graphene nanoribbons // Nat Nanotechnol. 2010. T. 5. № 5. C. 321-325.

115. Jurney P. h gp. Unique size and shape-dependent uptake behaviors of non-spherical nanoparticles by endothelial cells due to a shearing flow // Journal of Controlled Release. 2017. T. 245. C. 170-176.

116. Kalicke T. h gp. Effect on infection resistance of a local antiseptic and antibiotic coating on osteosynthesis implants: An in vitro and in vivo study // Journal of Orthopaedic Research. 2006. T. 24. № 8. C. 1622-1640.

117. Kandadai M. A. h gp. Plasmin-Loaded Echogenic Liposomes for UltrasoundMediated Thrombolysis // Transl Stroke Res. 2015. T. 6. № 1. C. 78-87.

118. Kar S. h gp. Periodic table-based descriptors to encode cytotoxicity profile of metal oxide nanoparticles: A mechanistic QSTR approach // Ecotoxicol Environ Saf. 2014. T. 107. C. 162-169.

119. Kedia A., Kumar P. S. Solvent-adaptable poly(vinylpyrrolidone) binding induced anisotropic shape control of gold nanostructures // Journal of Physical Chemistry C. 2012. T. 116. № 44. C. 23721-23728.

120. Keller H., Plank J. Mineralisation of CaCO3 in the presence of polycarboxylate comb polymers // Cem Concr Res. 2013. T. 54. C. 1-11.

121. Khalavka Y., Becker J., Sonnichsen C. Synthesis of rod-shaped gold nanorattles with improved plasmon sensitivity and catalytic activity // J Am Chem Soc. 2009. T. 131. № 5. C. 1871-1875.

122. Khan M. I., Shin J. H., Kim J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products // Microb Cell Fact. 2018a. T. 17. № 1.

123. Khan M. I., Shin J. H., Kim J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products // Microb Cell Fact. 2018b. T. 17. № 1.

124. Kim M. h gp. Nanosized Ultrasound Enhanced-Contrast Agent for in Vivo Tumor Imaging via Intravenous Injection // ACS Appl Mater Interfaces. 2016. T. 8. № 13. C. 8409-8418.

125. Kim S. K., Foote M. B., Huang L. Targeted delivery of EV peptide to tumor cell cytoplasm using lipid coated calcium carbonate nanoparticles // Cancer Lett. 2013. T. 334. № 2. C. 311-318.

126. Kim T. W., Chung P. W., Lin V. S. Y. Facile synthesis of monodisperse spherical MCM-48 mesoporous silica nanoparticles with controlled particle size // Chemistry of Materials. 2010. T. 22. № 17. C. 5093-5104.

127. Kim T.-H. h gp. Size-dependent cellular toxicity of silver nanoparticles // J Biomed Mater Res A. 2012. T. 100A. № 4. C. 1033-1043.

128. Kinnear C. h gp. Form Follows Function: Nanoparticle Shape and Its Implications for Nanomedicine // Chem Rev. 2017. T. 117. № 17. C. 11476-11521.

129. Kitamura M. h gp. Controlling factors and mechanism of reactive crystallization of calcium carbonate polymorphs from calcium hydroxide suspensions // J Cryst Growth. 2002. T. 236. № 1-3. C. 323-332.

130. Kladko D. V., Zakharzhevskii M. A., Vinogradov V. V. Magnetic Field-Mediated Control of Whole-Cell Biocatalysis // Journal of Physical Chemistry Letters. 2020.

131. Knusel P. N. h gp. Experimental Evidence for Two-Dimensional Ostwald Ripening in Semiconductor Nanoplatelets // Chemistry of Materials. 2020. T. 32. № 7. C. 33123319.

132. Ko Y. S. h gp. Tools and strategies of systems metabolic engineering for the development of microbial cell factories for chemical production // Chem Soc Rev. 2020a. T. 49. № 14. C. 4615-4636.

133. Ko Y. S. h gp. Tools and strategies of systems metabolic engineering for the development of microbial cell factories for chemical production // Chem Soc Rev. 2020b. T. 49. № 14. C. 4615-4636.

134. Kolodziej S. J. h gp. Three-Dimensional Structure of the Human Plasmin a2-Macroglobulin Complex // J Struct Biol. 1998. T. 123. № 2. C. 124-133.

135. Kong F. h gp. Biodegradable Photothermal and pH Responsive Calcium Carbonate@Phospholipid@Acetalated Dextran Hybrid Platform for Advancing Biomedical Applications // Adv Funct Mater. 2016. T. 26. № 34. C. 6158-6169.

136. Kumar R. h gp. Polymeric Delivery of Therapeutic Nucleic Acids // Chem Rev. 2021. T. 121. № 18. C. 11527-11652.

137. Labouta H. I. h gp. Meta-Analysis of Nanoparticle Cytotoxicity via Data-Mining the Literature // ACS Nano. 2019. C. acsnano.8b07562.

138. Lai W. H. h gp. Morphology tuning of inorganic nanomaterials grown by precipitation through control of electrolytic dissociation and supersaturation // Nat Chem. 2019. T. 11. № 8. C. 695-701.

139. Lammers T. h gp. Theranostic Nanomedicine // Acc Chem Res. 2011. T. 44. № 10. C. 1029-1038.

140. Lamont R. J., Koo H., Hajishengallis G. The oral microbiota: dynamic communities and host interactions // Nat Rev Microbiol. 2018. T. 16. № 12. C. 745-759.

141. Lee J. H. h gp. Rod-shaped iron oxide nanoparticles are more toxic than sphere-shaped nanoparticles to murine macrophage cells // Environ Toxicol Chem. 2014. T. 33. № 12. C. 2759-2766.

142. Lee J. S. Deep eutectic solvents as versatile media for the synthesis of noble metal nanomaterials // Nanotechnol Rev. 2017. T. 6. № 3. C. 271-278.

143. Lee J. uk h gp. Non-contact long-range magnetic stimulation of mechanosensitive ion channels in freely moving animals // Nat Mater. 2021.

144. Li J. h gp. Gold nanoparticle size and shape influence on osteogenesis of mesenchymal stem cells // Nanoscale. 2016. T. 8. № 15. C. 7992-8002.

145. Li M., Schnablegger H., Mann S. Coupled synthesis and self-assembly of nanoparticles to give structures with controlled organization // Nature. 1999. T. 402. № 6760. C. 393-395.

146. Li W. h gp. Manganese Dioxide Nanozymes as Responsive Cytoprotective Shells for Individual Living Cell Encapsulation // Angewandte Chemie - International Edition. 2017. T. 56. № 44. C. 13661-13665.

147. Li X. Bactericidal mechanism of nanopatterned surfaces // Physical Chemistry Chemical Physics. 2015. T. 18. № 2. C. 1311-1316.

148. Li X. h gp. Untargeted Metabolic Pathway Analysis as an Effective Strategy to Connect Various Nanoparticle Properties to Nanoparticle-Induced Ecotoxicity // Environ Sci Technol. 2020. T. 54. № 6. C. 3395-3406.

149. Liao H. G. h gp. Shape-controlled synthesis of gold nanoparticles in deep eutectic solvents for studies of structure-functionality relationships in electrocatalysis // Angewandte Chemie - International Edition. 2008a. T. 47. № 47. C. 9100-9103.

150. Liao H. G. h gp. Shape-controlled synthesis of gold nanoparticles in deep eutectic solvents for studies of structure-functionality relationships in electrocatalysis // Angewandte Chemie - International Edition. 2008b. T. 47. № 47. C. 9100-9103.

151. Lijnen H., Collen D. Interaction of Plasminogen Activators and Inhibitors with Plasminogen and Fibrin // Semin Thromb Hemost. 1982. T. 8. № 01. C. 2-10.

152. Linklater D. P. h gp. High Aspect Ratio Nanostructures Kill Bacteria via Storage and Release of Mechanical Energy // ACS Nano. 2018. T. 12. № 7. C. 6657-6667.

153. Linklater D. P., Juodkazis S., Ivanova E. P. Nanofabrication of mechano-bactericidal surfaces // Nanoscale. 2017. T. 9. № 43. C. 16564-16585.

154. Liu D. h gp. Inhibition of proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells by carboxylated carbon nanotubes // ACS Nano. 2010. T. 4. № 4. C. 2185-2195.

155. Liu H. H. h gp. Analysis of nanoparticle agglomeration in aqueous suspensions via constant-number Monte Carlo simulation // Environ Sci Technol. 2011. T. 45. № 21. C. 9284-9292.

156. Liu L. h gp. Synthesis of porous SnO2 hexagon nanosheets loaded with Au nanoparticles for high performance gas sensors // Mater Lett. 2017. T. 201. C. 211-215.

157. Liu X., Sui B., Sun J. Size- and shape-dependent effects of titanium dioxide nanoparticles on the permeabilization of the blood-brain barrier // J Mater Chem B. 2017. T. 5. № 48. C. 9558-9570.

158. Liu Y. h gp. Nanotechnology-based antimicrobials and delivery systems for biofilm-infection control // Chem Soc Rev. 2019. T. 48. № 2. C. 428-446.

159. Lizandara-Pueyo C. h gp. Shape anisotropy influencing functional properties: Trigonal prismatic ZnO nanoparticles as an example // Adv Funct Mater. 2011. T. 21. № 2. C. 295-304.

160. Lyu Z. h gp. Methanogenesis // Current Biology. 2018. T. 28. № 13. C. R727-R732.

161. Maillard F. h gp. Influence of particle agglomeration on the catalytic activity of carbon-supported Pt nanoparticles in CO monolayer oxidation // Physical Chemistry Chemical Physics. 2005. C. 375-383.

162. Maksimuk S., Teng X., Yang H. Roles of twin defects in the formation of platinum multipod nanocrystals // Journal of Physical Chemistry C. 2007. T. 111. № 39. C. 1431214319.

163. Maleki Dizaj S. h gp. Calcium carbonate nanoparticles as cancer drug delivery system // Expert Opin Drug Deliv. 2015. T. 12. № 10. C. 1649-1660.

164. Manoli F. h gp. The effect of aminoacids on the crystal growth of calcium carbonate // J Cryst Growth. 2002. T. 236. № 1-3. C. 363-370.

165. Marder V. h gp. Plasmin Induces Local Thrombolysis without Causing Hemorrhage: A Comparison with Tissue Plasminogen Activator in the Rabbit // Thromb Haemost. 2001. T. 86. № 09. C. 739-745.

166. Matias V. R. F. h gp. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa // J Bacteriol. 2003. T. 185. № 20. C. 6112-6118.

167. Mendell J. R. h gp. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs // Molecular Therapy. 2021. T. 29. № 2. C. 464-488.

168. Min K. H. h gp. pH-Controlled Gas-Generating Mineralized Nanoparticles: A Theranostic Agent for Ultrasound Imaging and Therapy of Cancers // ACS Nano. 2015. T. 9. № 1. C. 134-145.

169. Ming H. h gp. Size- and shape-controlled synthesis of Prussian Blue nanoparticles by a polyvinylpyrrolidone-assisted crystallization process // CrystEngComm. 2012. T. 14. № 10. C. 3387-3396.

170. Mortimer M. h gp. Multiwall Carbon Nanotubes Induce More Pronounced Transcriptomic Responses in Pseudomonas aeruginosa PG201 than Graphene, Exfoliated Boron Nitride, or Carbon Black // ACS Nano. 2018a. T. 12. № 3. C. 2728-2740.

171. Mortimer M. h gp. Multiwall Carbon Nanotubes Induce More Pronounced Transcriptomic Responses in Pseudomonas aeruginosa PG201 than Graphene, Exfoliated Boron Nitride, or Carbon Black // ACS Nano. 2018b. T. 12. № 3. C. 2728-2740.

172. Mortimer M. h gp. Physical Properties of Carbon Nanomaterials and Nanoceria Affect Pathways Important to the Nodulation Competitiveness of the Symbiotic N2-Fixing Bacterium Bradyrhizobium diazoefficiens // Small. 2020a. T. 16. № 21.

173. Mortimer M. h gp. Physical Properties of Carbon Nanomaterials and Nanoceria Affect Pathways Important to the Nodulation Competitiveness of the Symbiotic N2-Fixing Bacterium Bradyrhizobium diazoefficiens // Small. 2020b. T. 16. № 21.

174. Mouras R. h gp. Image-Based Tracking of Anticancer Drug-Loaded Nanoengineered Polyelectrolyte Capsules in Cellular Environments Using a Fast Benchtop Mid-Infrared (MIR) Microscope // ACS Omega. 2018. T. 3. № 6. C. 6143-6150.

175. Murphy C. J. h gp. Surfactant-Directed Synthesis and Optical Properties of One-Dimensional Plasmonic Metallic Nanostructures // MRS Bull. 2005. T. 30. № 5. C. 349355.

176. Myers R. Asbestos-related pleural disease // Curr Opin Pulm Med. 2012. T. 18. № 4. C. 377-381.

177. Nagai H., Toyokuni S. Biopersistent fiber-induced inflammation and carcinogenesis: Lessons learned from asbestos toward safety of fibrous nanomaterials // Arch Biochem Biophys. 2010. T. 502. № 1. C. 1-7.

178. Niu M. h gp. Shape-dependent genotoxicity of mesoporous silica nanoparticles and cellular mechanisms // J Nanosci Nanotechnol. 2016. T. 16. № 3. C. 2313-2318.

179. Niu W. h gp. Selective synthesis of single-crystalline rhombic dodecahedral, octahedral, and cubic gold nanocrystals // J Am Chem Soc. 2009. T. 131. № 2. C. 697703.

180. Niu W., Zhang L., Xu G. Shape-controlled synthesis of single-crystalline palladium nanocrystals // ACS Nano. 2010. T. 4. № 4. C. 1987-1996.

181. Ogino T., Suzuki T., Sawada K. The formation and transformation mechanism of calcium carbonate in water // Geochim Cosmochim Acta. 1987. T. 51. № 10. C. 27572767.

182. Oh W. K. h gp. Shape-dependent cytotoxicity and proinflammatory response of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) nanomaterials // Small. 2010. T. 6. № 7. C. 872-879.

183. Orrenius S., McCabe M. J., Nicotera P. Ca2+-dependent mechanisms of cytotoxicity and programmed cell death // Toxicol Lett. 1992. T. 64-65. C. 357-364.

184. Pal S., Tak Y. K., Song J. M. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the gram-negative bacterium Escherichia coli // Appl Environ Microbiol. 2007. T. 73. № 6. C. 1712-1720.

185. Palmer L. C. h gp. Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel // Chem Rev. 2008. T. 108. № 11. C. 4754-4783.

186. Parakhonskiy B. h gp. The influence of the size and aspect ratio of anisotropic, porous CaCO3 particles on their uptake by cells // J Nanobiotechnology. 2015. T. 13. № 1. C. 53.

187. Parakhonskiy B. V., Haase A., Antolini R. Sub-Micrometer Vaterite Containers: Synthesis, Substance Loading, and Release // Angewandte Chemie. 2012. T. 124. № 5. C. 1221-1223.

188. Pavlov M., Siegbahn P. E. M., Sandstrom M. Hydration of Beryllium, Magnesium, Calcium, and Zinc Ions Using Density Functional Theory // J Phys Chem A. 1998. T. 102. № 1. C. 219-228.

189. Penders J. h gp. Shape-dependent antibacterial effects of non-cytotoxic gold nanoparticles // Int J Nanomedicine. 2017. T. 12. C. 2457-2468.

190. Peralta-Yahya P. P. h gp. Microbial engineering for the production of advanced biofuels // Nature. 2012. T. 488. № 7411. C. 320-328.

191. Pittenger M. F. h gp. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science (1979). 1999. T. 284. № 5411. C. 143-147.

192. Pogodin S. h gp. Biophysical model of bacterial cell interactions with nanopatterned cicada wing surfaces // Biophys J. 2013. T. 104. № 4. C. 835-840.

193. Polavarapu L. h gp. Galvanic Replacement Coupled to Seeded Growth as a Route for Shape-Controlled Synthesis of Plasmonic Nanorattles // J Am Chem Soc. 2016. T. 138. № 36. C. 11453-11456.

194. Polowczyk I., Bastrzyk A., Fiedot M. Protein-Mediated Precipitation of Calcium Carbonate // Materials. 2016. T. 9. № 11. C. 944.

195. Qi C. h gp. Calcium-based biomaterials for diagnosis, treatment, and theranostics // Chem Soc Rev. 2018. T. 47. № 2. C. 357-403.

196. Qiu N. h gp. Calcium carbonate microspheres as carriers for the anticancer drug camptothecin // Materials Science and Engineering: C. 2012. T. 32. № 8. C. 2634-2640.

197. Rao A. h gp. Regulation of Interparticle Forces Reveals Controlled Aggregation in Charged Nanoparticles // Chemistry of Materials. 2016. T. 28. № 7. C. 2348-2355.

198. Riley R. S. h gp. Delivery technologies for cancer immunotherapy // Nat Rev Drug Discov. 2019. T. 18. № 3. C. 175-196.

199. Rohde M. The Gram-Positive Bacterial Cell Wall // Microbiol Spectr. 2019. T. 7. № 3.

200. Sajanlal P. R. h gp. Anisotropic nanomaterials: structure, growth, assembly, and functions // Nano Rev. 2011. T. 2. № 1. C. 5883.

201. Samei M., Sarrafzadeh M. H., Faramarzi M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata // Environmental Science and Pollution Research. 2019. T. 26. № 3. C. 24092420.

202. Sathya Raj D. h gp. Impact of n-heptane as surfactant in the formation of CdO nanowires through microwave combustion // Appl Surf Sci. 2013. T. 266. C. 268-271.

203. Schliehe C. h gp. Ultrathin PbS sheets by two-dimensional oriented attachment // Science (1979). 2010. T. 329. № 5991. C. 550-553.

204. Sekkal W., Zaoui A. Nanoscale analysis of the morphology and surface stability of calcium carbonate polymorphs // Sci Rep. 2013. T. 3. № 1. C. 1587.

205. Serov N. h gp. One-pot synthesis of template-free hollow anisotropic CaCO3structures: Towards inorganic shape-mimicking drug delivery systems // Chemical Communications. 2020a. T. 56. № 80. C. 11969-11972.

206. Serov N. h gp. One-pot synthesis of template-free hollow anisotropic CaCO3structures: Towards inorganic shape-mimicking drug delivery systems // Chemical Communications. 2020b. T. 56. № 80. C. 11969-11972.

207. Sharma S. h gp. An insight into functionalized calcium based inorganic nanomaterials in biomedicine: Trends and transitions // Colloids Surf B Biointerfaces. 2015. T. 133. C. 120-139.

208. Shen X. S. h gp. Nanospheres of silver nanoparticles: Agglomeration, surface morphology control and application as SERS substrates // Physical Chemistry Chemical Physics. 2009. T. 11. № 34. C. 7450-7454.

209. Sims K. R. h gp. Enhanced design and formulation of nanoparticles for anti-biofilm drug delivery // Nanoscale. 2019. T. 11. № 1. C. 219-236.

210. Singamaneni S. h gp. Magnetic nanoparticles: Recent advances in synthesis, self-assembly and applications // J Mater Chem. 2011. T. 21. № 42. C. 16819-16845.

211. Song B. h gp. Involvement of Programmed Cell Death in Neurotoxicity of Metallic Nanoparticles: Recent Advances and Future Perspectives // Nanoscale Res Lett. 2016. T. 11. № 1. C. 484.

212. Soto F. h gp. Medical Micro/Nanorobots in Precision Medicine // Advanced Science. 2020. T. 7. № 21.

213. Steckiewicz K. P. h gp. Impact of gold nanoparticles shape on their cytotoxicity against human osteoblast and osteosarcoma in in vitro model. Evaluation of the safety of use and anti-cancer potential // J Mater Sci Mater Med. 2019a. T. 30. № 2.

214. Steckiewicz K. P. h gp. Impact of gold nanoparticles shape on their cytotoxicity against human osteoblast and osteosarcoma in in vitro model. Evaluation of the safety of use and anti-cancer potential // J Mater Sci Mater Med. 2019b. T. 30. № 2.

215. Stewart M. P., Langer R., Jensen K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts // Chem Rev. 2018a. T. 118. № 16. C. 7409-7531.

216. Stewart M. P., Langer R., Jensen K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts // Chem Rev. 2018b. T. 118. № 16. C. 7409-7531.

217. Straney P. J., Andolina C. M., Millstone J. E. Seedless initiation as an efficient, sustainable route to anisotropic gold nanoparticles // Langmuir. 2013. T. 29. № 13. C. 4396-4403.

218. Sultana S. h gp. Comparative toxicity evaluation of flower-shaped and spherical gold nanoparticles on human endothelial cells // Nanotechnology. 2015. T. 26. № 5.

219. Svenskaya Yu. I. h gp. Calcium carbonate microparticles containing a photosensitizer photosens: Preparation, ultrasound stimulated dye release, and in vivo application // Nanotechnol Russ. 2014. T. 9. № 7-8. C. 398-409.

220. Svenskaya Yu. I. h gp. Ultrasonically assisted fabrication of vaterite submicron -sized carriers // Advanced Powder Technology. 2016. T. 27. № 2. C. 618-624.

221. Tan W. F. h gp. Shape evolution synthesis of monodisperse spherical, ellipsoidal, and elongated hematite (a-Fe2O3) nanoparticles using ascorbic acid // Cryst Growth Des. 2014. T. 14. № 1. C. 157-164.

222. Tang T. C. h gp. Materials design by synthetic biology // Nat Rev Mater. 2020.

223. Thambi V. h gp. Synthesis of Complex Nanoparticle Geometries via pH-Controlled Overgrowth of Gold Nanorods // ACS Omega. 2019. T. 4. № 9. C. 13733-13739.

224. Thirumalairajan S. h gp. Controlled synthesis of perovskite LaFeO3 microsphere composed of nanoparticles via self-assembly process and their associated photocatalytic activity // Chemical Engineering Journal. 2012. T. 209. C. 420-428.

225. Thwaites J. J., Surana U. C. Mechanical properties of Bacillus subtilis cell walls: Effects of removing residual culture medium // J Bacteriol. 1991. T. 173. № 1. C. 197203.

226. Trofimov A. h gp. Porous Inorganic Carriers Based on Silica, Calcium Carbonate and Calcium Phosphate for Controlled/Modulated Drug Delivery: Fresh Outlook and Future Perspectives // Pharmaceutics. 2018. T. 10. № 4. C. 167.

227. Truong N. P. h gp. The importance of nanoparticle shape in cancer drug delivery // Expert Opin Drug Deliv. 2015. T. 12. № 1. C. 129-142.

228. Vakkila J., Lotze M. T. Inflammation and necrosis promote tumour growth // Nat Rev Immunol. 2004. T. 4. № 8. C. 641-648.

229. Valiei A. h gp. Hydrophilic mechano-bactericidal nanopillars require external forces to rapidly kill bacteria // Nano Lett. 2020a.

230. Valiei A. h gp. Hydrophilic Mechano-Bactericidal Nanopillars Require External Forces to Rapidly Kill Bacteria // Nano Lett. 2020b. T. 20. № 8. C. 5720-5727.

231. Vanzha E. h gp. Cell culture surfaces with immobilized gold nanostars: a new approach for laser-induced plasmonic cell optoporation // Saratov Fall Meeting 2016: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVIII. , 2017. C. 103360L.

232. Vargas-Estrada L. h gp. Role of nanoparticles on microalgal cultivation: A review // Fuel. 2020. T. 280.

233. Vavaev E. S. h gp. CaCO 3 Nanoparticles Coated with Alternating Layers of Poly-L-Arginine Hydrochloride and Fe 3 O 4 Nanoparticles as Navigable Drug Carriers and Hyperthermia Agents // ACS Appl Nano Mater. 2022. T. 5. № 2. C. 2994-3006.

234. Villanueva-Flores F. h gp. Understanding cellular interactions with nanomaterials: Towards a rational design of medical nanodevices // Nanotechnology. 2020a. T. 31. № 13.

235. Villanueva-Flores F. h gp. Understanding cellular interactions with nanomaterials: Towards a rational design of medical nanodevices // Nanotechnology. 2020b. T. 31. № 13.

236. Volodkin D. V. h gp. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation // Langmuir. 2004. T. 20. № 8. C. 3398-3406.

237. Wan C. h gp. Effect of Carbon Nanoparticles on the Crystallization of Calcium Carbonate in Aqueous Solution // Nanomaterials. 2019. T. 9. № 2. C. 179.

238. Wang h gp. CaCO3/CaIP6 composite nanoparticles effectively deliver AKT1 small interfering RNA to inhibit human breast cancer growth // Int J Nanomedicine. 2015. C. 4255.

239. Wang C. h gp. Lipase-Triggered Water-Responsive "Pandora's Box" for Cancer Therapy: Toward Induced Neighboring Effect and Enhanced Drug Penetration // Advanced Materials. 2018. T. 30. № 14. C. 1706407.

240. Wang J. h gp. Magneto-Based Synergetic Therapy for Implant-Associated Infections via Biofilm Disruption and Innate Immunity Regulation // Advanced Science. 2021. T. 8. № 6. C. 1-12.

241. Wang L. h gp. Polydopamine nanocoated whole-cell asymmetric biocatalysts // Chemical Communications. 2017. T. 53. № 49. C. 6617-6620.

242. Wang Y. h gp. Piezo-catalysis for nondestructive tooth whitening // Nat Commun. 2020. T. 11. № 1. C. 1328.

243. Wang Y.-W. h gp. In Situ Study of the Precipitation and Crystallization of Amorphous Calcium Carbonate (ACC) // Cryst Growth Des. 2012. T. 12. № 3. C. 12121217.

244. Wang Z. h gp. PH-dependent evolution of five-star gold nanostructures: An experimental and computational study // ACS Nano. 2013. T. 7. № 3. C. 2258-2265.

245. Watson G. S., Watson J. A., Cribb B. W. Diversity of Cuticular Micro- and Nanostructures on Insects: Properties, Functions, and Potential Applications // Annu Rev Entomol. 2017. T. 62. C. 185-205.

246. Wei M. h gp. Gold nanoparticles enhance the differentiation of embryonic stem cells into dopaminergic neurons via mTOR/p70S6K pathway // Nanomedicine. 2017. T. 12. № 11. C. 1305-1317.

247. Wiley B., Sun Y., Xia Y. Synthesis of silver nanostructures with controlled shapes and properties // Acc Chem Res. 2007. T. 40. № 10. C. 1067-1076.

248. Wolf S. E. h gp. Early Homogenous Amorphous Precursor Stages of Calcium Carbonate and Subsequent Crystal Growth in Levitated Droplets // J Am Chem Soc. 2008. T. 130. № 37. C. 12342-12347.

249. Wozniak A. h gp. Size and shape-dependent cytotoxicity profile of gold nanoparticles for biomedical applications // J Mater Sci Mater Med. 2017a. T. 28. № 6.

250. Wozniak A. h gp. Size and shape-dependent cytotoxicity profile of gold nanoparticles for biomedical applications // J Mater Sci Mater Med. 2017b. T. 28. № 6.

251. Wu J., Sun J., Xue Y. Involvement of JNK and P53 activation in G2/M cell cycle arrest and apoptosis induced by titanium dioxide nanoparticles in neuron cells // Toxicol Lett. 2010. T. 199. № 3. C. 269-276.

252. Wu S. h gp. Biocatalysis: Enzymatic Synthesis for Industrial Applications // Angewandte Chemie - International Edition. 2021. T. 60. № 1. C. 88-119.

253. Wu Z., Yang S., Wu W. Shape control of inorganic nanoparticles from solution // Nanoscale. 2016a. T. 8. № 3. C. 1237-1259.

254. Wu Z., Yang S., Wu W. Shape control of inorganic nanoparticles from solution // Nanoscale. 2016b. T. 8. № 3. C. 1237-1259.

255. Xia Y. h gp. Shape-controlled synthesis of metal nanocrystals: Simple chemistry meets complex physics? // Angewandte Chemie - International Edition. 2009. T. 48. № 1. C. 60-103.

256. Xiao J., Qi L. Surfactant-assisted, shape-controlled synthesis of gold nanocrystals // Nanoscale. 2011a. T. 3. № 4. C. 1383-1396.

257. Xiao J., Qi L. Surfactant-assisted, shape-controlled synthesis of gold nanocrystals // Nanoscale. 2011b. T. 3. № 4. C. 1383-1396.

258. Xie W. h gp. Gallium-Based Liquid Metal Particles for Therapeutics // Trends Biotechnol. 2020.

259. Xie X. h gp. Mechanical model of vertical nanowire cell penetration // Nano Lett. 2013. T. 13. № 12. C. 6002-6008.

260. Xiong Y. h gp. Size-dependence of surface plasmon resonance and oxidation for Pd nanocubes synthesized via a seed etching process // Nano Lett. 2005. T. 5. № 7. C. 12371242.

261. Xiong Y. h gp. Synthesis and mechanistic study of palladium nanobars and nanorods // J Am Chem Soc. 2007. T. 129. № 12. C. 3665-3675.

262. Xu Z. h gp. Effects of four types of hydroxyapatite nanoparticles with different nanocrystal morphologies and sizes on apoptosis in rat osteoblasts // Journal of Applied Toxicology. 2012. T. 32. № 6. C. 429-435.

263. Xue P. h gp. Calcium-carbonate packaging magnetic polydopamine nanoparticles loaded with indocyanine green for near-infrared induced photothermal/photodynamic therapy // Acta Biomater. 2018. T. 81. C. 242-255.

264. Yamada S. h gp. Development of Magnesium and Siloxane-Containing Vaterite and Its Composite Materials for Bone Regeneration // Front Bioeng Biotechnol. 2015. T. 3.

265. Yang X. h gp. Impacts of carbon-based nanomaterials on nutrient removal in constructed wetlands: Microbial community structure, enzyme activities, and metabolism process // J Hazard Mater. 2021. T. 401.

266. Yang Z. h gp. Surfactant-assisted chemical vapour deposition of high-performance small-diameter GaSb nanowires // Nat Commun. 2014. T. 5. № 1. C. 5249.

267. Yang Z., Zhang L. Magnetic Actuation Systems for Miniature Robots: A Review // Advanced Intelligent Systems. 2020. T. 2. № 9. C. 2000082.

268. Yeh Y. C., Creran B., Rotello V. M. Gold nanoparticles: Preparation, properties, and applications in bionanotechnology // Nanoscale. 2012. T. 4. № 6. C. 1871-1880.

269. Yi C. h gp. Gold nanoparticles promote osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through p38 MAPK pathway // ACS Nano. 2010. T. 4. № 11. C. 6439-6448.

270. Yi C. h gp. Anisotropic self-assembly of hairy inorganic nanoparticles // Acc Chem Res. 2017. T. 50. № 1. C. 12-21.

271. Yi Z. h gp. In Vivo Tumor Visualization through MRI Off-On Switching of NaGdF 4 -CaCO 3 Nanoconjugates // Advanced Materials. 2019. T. 31. № 37. C. 1901851.

272. Yuan Z. h gp. Remote eradication of biofilm on titanium implant via near-infrared light triggered photothermal/photodynamic therapy strategy // Biomaterials. 2019. T. 223.

273. Yun S. h gp. Enhanced direct interspecies electron transfer with transition metal oxide accelerants in anaerobic digestion // Bioresour Technol. 2021. T. 320.

274. Zeng Y. h gp. Insights into the Confined Crystallization in Microfluidics of Amorphous Calcium Carbonate // Cryst Growth Des. 2018. T. 18. № 11. C. 6538-6546.

275. Zhang B. h gp. Shape dependent cytotoxicity of PLGA-PEG nanoparticles on human cells // Sci Rep. 2017. T. 7. № 1.

276. Zhang H. h gp. Bacteria photosensitized by intracellular gold nanoclusters for solar fuel production // Nat Nanotechnol. 2018. T. 13. № 10. C. 900-905.

277. Zhang L., Wang H. Interior structural tailoring of Cu2O shell-in-shell nanostructures through multistep Ostwald ripening // Journal of Physical Chemistry C. 2011. T. 115. № 38. C. 18479-18485.

278. Zhang Q., Zhang C. Chronic Exposure to Low Concentration of Graphene Oxide Increases Bacterial Pathogenicity via the Envelope Stress Response // Environ Sci Technol. 2020. T. 54. № 19. C. 12412-12422.

279. Zhang W. Nanoparticle aggregation: Principles and modeling // Adv Exp Med Biol. 2014. T. 811. C. 20-43.

280. Zhang Y. h gp. Cytotoxicity effects of graphene and single-wall carbon nanotubes in neural phaeochromocytoma-derived pc12 cells // ACS Nano. 2010. T. 4. № 6. C. 31813186.

281. Zhao L. h gp. Formation and stability of gold nanoflowers by the seeding approach: The effect of intraparticle ripening // Journal of Physical Chemistry C. 2009. T. 113. № 38. C. 16645-16651.

282. Zhao P. h gp. MiR-375 delivered by lipid-coated doxorubicin-calcium carbonate nanoparticles overcomes chemoresistance in hepatocellular carcinoma // Nanomedicine. 2017. T. 13. № 8. C. 2507-2516.

283. Zhao P. h gp. Enhancing anti-tumor efficiency in hepatocellular carcinoma through the autophagy inhibition by miR-375/sorafenib in lipid-coated calcium carbonate nanoparticles // Acta Biomater. 2018. T. 72. C. 248-255.

284. Zhao Y. h gp. Tumor Microenvironment-Responsive Cu/CaCO 3 -Based Nanoregulator for Mitochondrial Homeostasis Disruption-Enhanced Chemodynamic/Sonodynamic Therapy // Small. 2022. T. 18. № 38. C. 2204047.

285. Zheng P. h gp. Ultrasound-Augmented Mitochondrial Calcium Ion Overload by Calcium Nanomodulator to Induce Immunogenic Cell Death // Nano Lett. 2021. T. 21. № 5. C. 2088-2093.

286. Zhou C. h gp. Aptamer CaCO 3 Nanostructures: A Facile, pH-Responsive, Specific Platform for Targeted Anticancer Theranostics // Chem Asian J. 2015. T. 10. № 1. C. 166-171.

287. Zhou J. h gp. The effects of surface topography of nanostructure arrays on cell adhesion // Physical Chemistry Chemical Physics. 2018. T. 20. № 35. C. 22946-22951.

288. Zhou W. h gp. The co-effect of ampicillin and multi-walled carbon nanotubes on activated sludge in sequencing batch reactors: microbial status, microbial community structure and ARGs propagation // Environ Sci Nano. 2021. T. 8. № 1. C. 204-216.

289. Zhu L. P., Xiao H. M., Fu S. Y. Template-free synthesis of monodispersed and single-crystalline cantaloupe-like Fe2O3 superstructures // Cryst Growth Des. 2007. T. 7. № 2. C. 177-182.

290. Zhu X. h gp. Impact of metallic nanoparticles on anaerobic digestion: A systematic review // Science of the Total Environment. 2021a. T. 757.

291. Zhu X. h gp. Impact of metallic nanoparticles on anaerobic digestion: A systematic review // Science of the Total Environment. 2021b. T. 757.

292. Microbial Cell Factories // Microb Cell Fact. 2018.

Тексты публикаций

WlLEY-VCH

COMMUNICATION

Synthesis of Plasmin-Loaded Fe3O4@CaCO3 Nanoparticles: Towards Next Generation of Thrombolytic Drugs

Nikita Serov [a], Artur Prilepskii [a], Alexey Sokolov [b,c], and Vladimir Vinogradov

*[a]

Abstract: A major obstacle in the development of next-generation of thrombolytic drugs has been the fact that plasmin - a serine protease that dissolves fibrin in blood clots - despite being the only enzyme suitable for the clot cleavage, is still not used in practice due to its rapid inactivation. Here we point to a potential solution to this problem by developing a magnetically-controlled system for targeted delivery and recrystallization-driven release of plasmin showing tremendous therapeutic potential.

Conventional thrombolytic therapy involves the use of drugs mediating the transfer of plasminogen (zymogen) into plasmin. Currently, only several thrombolytics are FDA approved, including first (urokinase, streptokinase) and second/third-generation drugs (tissue plasminogen activators and their recombinant variants). Most of the ongoing studies are focused on the ways to enhance their specificity and to reduce side effects (allergic reactions, internal bleeding, hemorrhagic syndrome, etc.). It should be noted that the therapeutic window for the use of thrombolytics usually does not exceed four hours since the formation of a blood clot. It is mainly due to the formation of plasminogen-fibrin complexes decreasing the activation energy needed for plasminogen activation.'11

Next step further in the successful treatment of thrombosis can be the use of plasmin itself. Indeed, it allows avoiding certain limitations related to conventional thrombolytics, and the most important is the broadening of the therapeutic window. Plasmin acts faster and directly on thrombus, thus avoiding the plasminogen activation step. However, proper delivery of plasmin into the desired occlusion site is a challenging objective due to rapid inactivation of plasmin by a2-antiplasmin and a2-macroglobulin in less than 100 ms.'21 The idea of using plasmin as a thrombolytic drug had originated about 60 years ago.'31 However, its practical applications have yet to be carried out. A few studies on this topic suggest intravenous delivery of plasmin via catheter near occlusion site (which cannot be considered as non-invasive therapy) or use only for venous thrombosis.'41 In some studies, liposomes loaded with plasmin were obtained, but therapeutic efficacy was low.'51

Here we report first steps towards the creation of injectable plasmin-loaded Fe3O4@CaCO3 nanoparticles (for shortness designated as mcVNPs (magnetically-controlled vaterite nanoparticles)) having clear magnetic response (Figure 1a),

[a] N.S. Serov, Dr. A.Y. Prilepskii, and Dr. Vladimir Vinogradov International Institute "Solution Chemistry of Advanced Materials and Technologies" (SCAMT)

ITMO University

9, Lomonosova str., Saint Petersburg, 191002, Russian Federation E-mail: [e-mail]

[b] Dr. A.V. Sokolov

Institute of Experimental Medicine

12, Akademika Pavlova str., Saint Petersburg, 197376, Russian Federation

[c] Dr. A.V. Sokolov

Centre of Preclinical Translational Research Almazov National Medical Research Centre 2, Akkuratova str., Saint Petersburg, 197341, Russian Federation

Supporting information for this article is given via a link at the end of the document.

focusing on (I) obtaining VNPs with desirable size and recrystallization rate; (II) demonstrating that recrystallization rate depends on the drug loading method; (III) showing that mcVNPs are highly porous, and their size can be controlled by the synthesis time; (IV) developing a procedure for the preparation of a plasmin-loaded mcVNPs, which is entirely recrystallized and releases the drug; (V) showing that obtained mcVNPs don't affect blood coagulation and have no cytotoxic effect; (VI) assessing thrombolysis rates via two different test systems proving that fabricated plasmin-loaded mcVNPs can be used as an effective thrombolytic drug.

Vaterite is a metastable polymorph of calcium carbonate.'61 Being water-soluble, vaterite tends to transform into more stable forms like, for example, calcite in the process of Ostwald ripening.'71 Two main chemical VNPs synthesis methods exist: precipitation reaction '81 and the emulsion technique.'91 It has been shown that many factors affect the resulting size of VNPs: type and ratio of the reagents, pH, temperature, ionic strength, chemical structure, viscosity and dielectric permittivity of the solvent, stirring rate and time, surfactants, etc., '7c101 allowing VNPs with specified porosity, size, pore, surface content, and

form can be obtained.'10f,111

Since it has such promising properties, including high biocompatibility, several research groups have studied VNPs-based micro/nanocomposites with inorganic NPs,'121 LMW

compounds,'131 proteins,'8b,9a,141 polyelectrolytes'151 and nucleic

acids'161 as a drug delivery system.'11,13a171 There are several ways to load the molecules into the VNPs, and the recrystallization rate highly depends on the loading methodology used.

In this work, we examined several variations in synthetic conditions and drug loading techniques. First, the ratio of CaCl2 and Na2CO3 was varied. Other things being equal, the conventional method gave us VNPs with the average size of 1.17 |jm when the Ca2+/CO32- ratio was 10:1, and the stirring time was two minutes. The ratio of 1:1 gave us much bigger VNPs (d=1.71 jm), while a further increase of ratio resulted in a calcite form due to the rapid dissolution of the VNPs formed (Figure 1S). Given the effect of viscosity on the size of the resulting VNPs, the optimal solvent, ethylene glycol (EG), has been selected.

Figure 1. (a) Picture of a plasmin-loaded mcVNPs without (left) and under (right) magnetic field; (b) The SEM image of mcVNPs; (c) The TEM image of mcVNPs; (d) The size distribution of mcVNPs based on SEM images; (e) The TEM image of a single mcVNP; (f) The enlarged TEM image of the surface area of a single mcVNP. On inset: crystal structure of Fe3Û4 magnetite nanoparticles (MNPs) the lattice fringes (~0.3nm) observed on this image agree well with the separation between the (220) lattice planes.

COMMUNICATION

10.1002/cnma.201900359

Wl LEY-VCH

The larger amount of EG was in the system the smaller VNPs were obtained after 5 minutes of stirring (Figure 2S). Optimal water/EG ratio is turned out to be 1:4, while the increase in the amount of EG resulted in both the smaller yield of precipitate and much longer stirring time needed for the obtaining of smaller VNPs. System with the water/EG ratio of 1:4 and Ca2+/CO32" ratio of 10:1 being stirred for 10 minutes (1000 rpm) gave us spherical VNPs with the average size of 332±68 nm (Figure 1b,c,d, Figure 3S), narrow size distribution and recrystallization time of 4 hours (Figure 4S) being optimal for the thrombolysis application due to so-called thrombolytic window, when the drug is capable of dissolving the thrombus only within 4 hours since it has been formed.

The dependency of loaded VNPs recrystallization kinetics on the loading method has also been studied with MNPs being entrapped (Figure 4S). Successful loading of MNPs into VNPs has been proved by transmission electron microscopy (TEM) (Figure 1e, f, inset showing crystalline lattice for magnetite). Also, the whole structure of mcVNPs has been investigated. Single mcVNP consists of smaller oval nanoparticles (30-50 nm in length) with pores of about 10-20 nm (Figure 1f). Post-synthetic loading demonstrates almost immediate release (after 30 minutes, Figure 2a), while half-recrystallization occurs within ~2.4 hours and full recrystallization after 4.5 hours (Figure 2b) in comparison with 4 hours for pure VNPs. Loading during synthesis leads to less than 1% release within the first 1.5 hours and then rapid and uniform release, having 50% recrystallization rate after 3 hours and full recrystallization time of 5 hours.

Since we require short-delayed release (plasmin-loaded mcVNPs need some time to get to the target site of thrombus formation and to accumulate there) and faster recrystallization rate (due to contraction of the clot and formation of cross-linked fibrin strands), the post-synthetic methodology of loading has been chosen.

Cytotoxicity of fabricated mcVNPs has been investigated using MTT assay (Figure 5S). The maximum and minimum concentrations were 0.4 mg/mL and 0.025 mg/mL, respectively. The slight decrease in metabolic activity ranged from 20 to 30% was observed. We attribute this to the well-known fact that perturbation of Ca2+ ions homeostasis can activate several cytotoxic mechanisms.'181 However, no visible damage to cells was observed upon regular examination via an optical microscope (data is not presented).

In this study, it was also essential to prove the ability of VNPs to act as carriers of macromolecules. To assess loading capacity, FITC-labeled BSA was used. BSA has a slightly lower molecular weight (66 kDa) than plasmin (85 kDa), but according to the dimensional structure, their sizes are close,'191 which is an essential fact for the estimation of the drug release rate.

Using confocal microscopy, we have obtained multiple optical slices of the single cell (with a single step of 1 pm), the cell nucleus was visualized with propidium iodide (red fluorescence). From Figure 6S a-d, it is seen that VNPs are distributed around the nucleus inside the cytoplasm. It is a promising result for targeted intracellular delivery of other drugs. Additionally, to visualize whether BSA was evenly distributed inside mcVNPs, an optical cross-section through the mcVNPs aggregate was obtained (Figure 7S d, inset). The fluorescence intensity was uniformly distributed along with mcVNPs thickness, confirming BSA was incorporated not only in the surface-close area but also all over the crystal structure.

2 2.5 3 3.5 4 Time, hours

Figure 2. (a) Recrystallization kinetics of mcVNPs post-synthetically loaded with MNPs. The recrystallization starts approximately at 0.5 hours after redispersion. Full recrystallization occurs within 4.5 hours; (b) The TEM image of the calcite crystal with released MNPs on its surface.

It was essential to find out whether mcVNPs affect blood coagulation due to Ca2+ ions because it is well-known that Ca2+ ions are essential for fibrin polymerization and formation of the clot.'201 In order to get this information and also to estimate the thrombolytic activity of plasmin-loaded mcVNPs, we have performed clot formation and lysis (CloFAL) assay (Figure 7S). This method allows investigating the kinetics of clot formation/dissolution, which is characterized by coagulation parameters such as coagulation index (CI) and fibrinolytic index (FI) (Table 1S). We have detected no impact of pure mcVNPs on the plasma coagulation within 20 minutes even after mixing 4 mg/mL mcVNPs with plasma in equal parts (Figure 7s, inset).

CloFAL curves for pure plasmin and post-synthetically plasmin-loaded mcVNPs have also been obtained and analyzed (Figure 7S). In the case of pure plasmin, dissolution of the clot starts after 6 minutes. Curve reaches the plateau at the 15th minute. In the case of plasmin-loaded mcVNPs, this data is 10 and 24 minutes, respectively. According to this data, the release of the plasmin starts 4 minutes after redispersion of mcVNPs. The dissolution rate itself (decreasing slope) was just a bit slower than that for the pure plasmin, which is surprisingly good due to much smaller amounts of the drug inside the mcVNPs. Our preliminary data obtained for the other thrombolytic (urokinase) show that the loading capacity of mcVNPs is close to 23% wt. Assuming full release of the drug upon recrystallization occurs, we can estimate that thrombolytic activity of mcVNPs to be ca. 75% lower than for stock plasmin solution (which concentration is 1 mg/mL). However, according to CloFAL assay, thrombolysis process (both start and end points of the lysis process) only 40% less effective than for pure plasmin. It needs to be taken into account, also, that when some amount of plasmin is released from mcVNPs, it may increase the local concentration of the drug, dissolves part of the clot, then be deactivated, and the new portion of active plasmin is again released from the mcVNPs. This process slows down dissolution compared to the full simultaneous release of plasmin but crucial for shielding plasmin from inhibitors. mcVNPs play the role of a physical barrier between plasmin and factors in the bloodstream which deactivates it. Also, mcVNPs increase the local pH, while plasmin works better at higher pH values. So, we believe that this remarkable effectiveness can be partly explained by abovementioned factors.

CloFAL curve, however, cannot provide information related to the ability of mcVNPs to penetrate a clot, which probably plays a crucial role in mcVNPs-assisted thrombolysis. We have tested our plasmin-loaded mcVNPs nanocomposite on fibrin clots made up from human plasma as described in the Experimental section. Example of clot dissolution process (under static conditions) is presented in Figure 3. For mcVNPs targeting with the magnetic field, neodymium magnet was placed within 0.5 cm of the clot. After 30 minutes from the formation of a clot, the minor contraction was observed indicated by increased clot opacity (Figure 3b).

WlLEY-VCH

COMMUNICATION

a 90 min|e 120 min|f150 min

Figure 3. Microscopic images of the dissolution process of the fibrin clot with plasmin and plasmin-loaded mcVNPs. (a) Image of the clot before the addition of the plasmin-loaded mcVNPs; (b-f) After incubation with mcVNPs for the specified time. Position of the magnet is shown schematically. (g-i) Images of the fibrin clot after incubation with stock plasmin solution for (g) 0 min, (h) 10 min, (i) 20 min.

Start of a dissolution process is clearly seen after 60 minutes. The clot edges become more transparent on the upper border of a clot. After 90 minutes, about 20% of the upper part of the clot is already dissolved. Almost complete dissolution of the clot occurs within 2.5 hours. We observed completely different kinetics of clot lysis under the action of pure plasmin (Figure 3 g-i). The clot starts to dissolve immediately, and no contraction process was observed. This results in increasing of the clot size and breaking of the clot into smaller fragments, which are may cause severe side effects. It is quite intriguing that the clot starts to dissolve from the surface, without breaking down into smaller parts using mcVNPs. We assume that it happens due to the two factors: i) penetration of mcVNPs into the surface layers of a clot, and ii) delayed lysis, that allows the clot to contract. Also, movements of the clot in the magnetic field were observed (data is not presented), which indirectly confirms our assumptions on clot penetration by nanoparticles.

Summarizing above, robust and straightforward synthesis method for submicron vaterite nanoparticles with the average size of 332±68 nm has been developed by varying both the Ca2+/CO32-ratio and viscosity of the solvent system. Magnetite nanoparticles have been successfully incorporated into the VNPs by two different methods. Influence of the loading method has been studied through the analysis of recrystallization rates. Structures of obtained VNPs and mcVNPs was analyzed using SEM and TEM. Control of mcVNPs by magnetic field was also demonstrated. Both cytotoxicity study and cellular uptake have been implemented using MTT assay and confocal microscopy, respectively. The thrombolytic activity has been demonstrated by CloFAL assay and thrombolysis of the clot under the microscope. Compared to the previously described liposomal delivery systems,'51 our nanoparticles have several advantages, such as i) it needs no use of ultrasound, ii) it has a smaller size compared to liposomes, and iii) controlled release is provided within a specific time. Also, we consider mcVNPs to have low toxicity. MNPs are already widely used both as a drug or contrast agent

for MRI, '221 and vaterite is a native component of the human organism which undergoes biotransformation.'231 Nevertheless, further in vivo investigation will be conducted in the future.

Experimental Section

Synthesis of plasmin-loaded mcVNPs: 80 Ml of ethylene glycol (EG) was mixed and stirred for 5 minutes with 20 Ml of 1M water solution of anhydrous CaCl2 (solution 1). Following the same principle, 0.02M water/EG solution of anhydrous Na2CÜ3 was prepared using a 0.1M stock solution of Na2CO3 (solution 2). While stirring on 1000 rpm, solution 2 was added to the solution 1. The reaction proceeded at the room temperature (25°C) with the constant stirring (1000 rpm) for 10 minutes. Immediately afterward, 200 mL of distilled water was added to the reaction mixture followed by centrifugation (6000 rpm, 5 minutes). After that supernatant was carefully removed, followed by re-suspension of "wet" precipitate in 200 Ml of distilled water and centrifugation under the same conditions, and this procedure was repeated 2 times. Then the precipitate was re-suspended in 100 Ml of distilled water, centrifuged and dried. That precipitate was re-suspended in 89.5 Ml of distilled water followed by adding 0.5 Ml 2% wt. MNPs water solution and 10 Ml of 1 mg/mL plasmin water solution and then stirred on 1500 rpm for 15 minutes. The washing procedure was repeated 3 times (re-suspending in 100 Ml of distilled water, centrifugation at 6000 rpm). The final product was dried under the vacuum.

Thrombolytic activity assessment: the thrombolytic activity on a model fibrin clot was assessed by mixing the normal human plasma prepared from lyophilized powder with thrombin (500 IU) in ratio 1:2. Formation of the fibrin clot was finished within 1 minute. Fibrin clot was placed in the humidified chamber between two glasses, 70 Ml of plasmin-loaded mcVNPs were poured on the top of it, magnet was placed right above the clot, and the thrombolysis process was observed via optical microscope at x200 magnification until the full dissolution of a clot. The CloFAL curve was plotted as described.1211 Briefly, 50 Ml of normal human plasma was mixed in UV-transparent cuvette with 20 Ml PBS solution (100 mM) and 5 Ml of plasmin-loaded mcVNPs. Pure plasmin solution of the same quantity was used as control. 25 Ml of thrombin solution was added to the mixture to initiate clot formation, and optical density was immediately measured on UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu, Japan) at 340 nm in kinetics mode. For assessment of the possible effect of Ca2+ ions on thrombus formation, 50 Ml of normal human plasma was mixed with 50 Ml of mcVNPs, and optical density of resulted mixture was measured as described above. The CloFAL curve was analyzed using ImageJ software (NIH, USA).

Supporting Information

Supporting Information is available from Willey Online Library or from the authors.

Acknowledgements

Work of Prilepskii A.Y. on plasmin purification and thrombolysis studies was supported by Russian Science Foundation Grant №18-73-00119, the work of Serov N.S.,

COMMUNICATION

10.1002/cnma.201900359

Wl LEY-VCH

Vinogradov V.V. on the synthesis of nanoparticles and characterization studies was supported by Russian Science Foundation Grant №16-13-00041. We are also grateful to Saint Petersburg State University Scientific Park for providing confocal microscopy investigations ("Chromas" Core Facility). TEM images were obtained at Center for the Collective Use of Research Equipment «Simbioz», IBPPM RAS. Authors also thank Vladislav Vasilichin for helping with cell experiments.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

Keywords: Drug delivery • Magnetic properties • Medicinal chemistry • Nanoparticles • Organic-inorganic hybrid composites

[16] [17]

References

[i]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6] [7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

H.R. Lijnen, D. Collen, Semin. Thromb. Hemostasis, 1982, 8(1), 210.

D. Collen, Eur. J. Biochem., 1976, 69, 209-216.

N. Alkjaersig, A.P. Fletcher, S. Sherry, J. Clin. Investig, 1959, 38(7),

1086-1095.

a) V.J. Marder, K. Landskroner, V. Novokhatny, T.P. Zimmerman, M. Kong, J.J. Kanouse, G. Jesmok, Thromb. Haemostasis, 2001, 86(09), 739-745; b) V.J. Marder, Thromb. Res., 2001, 122, 9-15. M.A. Kandadai, J.M. Meunier, K. Hart, C.K. Holland, G.J. Shaw, Transl. Stroke Res., 2015, 6(1), 78-87. W. Sekkal, A. Zaoui, Sci. Rep., 2013, 3, 1587. a) T. Ogino, T. Suzuki, K. Sawada, Geochim. Cosmochim. Acta, 1987, 51(10), 2757-2767; b) K. Sawada, Pure Appl. Chem., 1997, 69(5), 921-928; c) M. Kitamura, H. Konno, A. Yasui, H. Masuoka, J. Cryst. Growth, 2002, 236, 323-332.

a) B. Parakhonskiy, A. Haase, R. Antolini, Angew. Chem., 2012, 124, 1221-1223; b) G. Ganendra, W. De Muynck, A. Ho, E.C. Arvaniti, B. Hosseinkhani, J.A. Ramos, H. Rahier, N. Boon, Appl. Environ. Microbiol., 2014, 80(15), 4659-4667; c) I. Polowczyk, A. Bastrzyk, M. Fiedot, Materials, 2016, 9(11), 944; d) Y. Svenskaya, H. Fattah, A. Zakharevich, D. Gorin, G. Sukhorukov, B. Parakhonskiy, Adv. Powder Technol., 2016, 27(2), 618-624.

a) S. Maleki Dizaj, M. Barzegar-Jalali, M. Zarrintan, K. Adibkia, F. Lotfipour, Expert Opin. Drug Delivery, 2015, 12(10), 1649-1660; b) M. Fujiwara, K. Shiokawa, M. Araki, N. Ashitaka, K. Morigaki, T. Kubota, Y. Nakahara, Cryst. Growth Des., 2010, 10(9), 4030-4037. a) D. Volodkin, A. Petrov, M. Prevot, G. Sukhorukov, Langmuir, 2004, 20, 3398-3406; b) L. Brecevic, V. Nothig-Laslo, D. Kralj, S. Popovic, J Chem. Soc., 1996, 92(6), 1017-1022; c) Q. Hu, J. Zhang, H. Teng, U. Becker, American Mineralogist, 2012, 97, 1437-1445; d) W. Yang, C. Yao, Z. Cui, D. Luo, I.-S. Lee, J. Yao, C. Chen, X. Kong, Int. J. Mol. Sci., 2016, 17(5), 639; e) Y. Jao, W. Du, L. Sun, L. Yu, J. Jiao, R. Wang, ColloidPolym Sci, 2013, 291, 2191-2202; f) B. Parakhonskiy, M. Zyuzin, A. Yashchenok, S. Carregal-Romero, J. Rejman, H. Mohwald, W.J. Parak, A.G. Skirtach, J. Nanobiotechnol., 2015, 13(1), 53.

a) A. Trofimov, A. Ivanova, M. Zyuzin, A. Timin, Pharmaceutics, 2018, 10(4), 167; b) L. Costa, G. de Olyveira, R. Solmao, Adv Tissue Eng Regen Med Open Access, 2017, 3(2), 336-340. a) C. Wan, L.-T. Wang, H.-H. Ge, Nanomaterials (Basel), 2019, 9(2), 179; b) S. Yamada, A. Obata, H. Maeda, Y. Ota, T. Kasuga, Front. Bioeng, Biotechnol., 2015, 3, 195.

a) N. Qiu, H. Yin, B. Ji, N. Klauke, A. Glidle, Y. Zhang, H. Song, L. Cai, L. Ma, G. Wang, L. Chen, W. Wang, Mater. Sci. Eng. C., 2012, 32, 2634-2640; b) H. Zhou, J. Wei, Q. Dai, L. Wang, J. Luo, T. Cheang, S. Wang, Int J Nanomedicine, 2015, 10, 4255-4266; c) F. Manoli, J. Kanakis, P. Malkaj, E. Dalas, J Cryst. Growth, 2002, 236, 363-370.

Y. Liu, Y. Cui, H. Mao, R. Guo, Cryst. Growth Des., 2012, 12(10), 4720-4726.

a) G.K. Gupta, V. Jain, P.R. Mishra, AAPS PharmSciTech, 2011, 12(1), 344-353; b) R. Mouras, M.R. Noor, L. Pastorino, E. Bagnoli, A. Mani, E. Durack, A. Antipov, F. D'Autilia, P. Bianchini, A. Diaspro,

[18] [19]

[20] [21]

[22] [23]

T. Soulimane, C. Silien, C. Ruggiero, S.A.M. Tofail, ACS Omega, 2018, 3(6), 6143-6150.

S. Chen, F. Li, R.-X. Zhuo, S.-X. Cheng, Molecular BioSystems, 2011, 7(10), 2841.

a) J.-A. Lee, M.-K. Kim, H.-Mi Kim, J.K. Lee, J. Jeong, Y.-R. Kim, J.-M. Oh, S.-J. Choi, International Journal of Nanomedicine, 2015, 10(1), 2273-2293; b) O. Gusliakova, E. Atochina-Vasserman, O. Sindeeva, S. Sindeev, S. Pinyaev, N. Pyataev, V. Revin, G. Sukhorukov, D. Gorin, A.J. Gow, Frontiers in Pharmacology, 2018, 9, 559; c) L. Zhang, W. Zhu, Q. Lin, J. Han, L. Jiang, Y. Zhang, Int J Nanomedicine, 2015, 10, 3291-3302; d) W. Wei, G.-H. Ma, G. Hu, D. Yu, T. Mcleish, Z.-G. Su, Z.-Y. Shen, Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(47), 15808-15810. e) G. Sukhorukov,

D. Volodkin, A. Gunther, A. Petrov, D. Shenoy, H. Mohwald, J. Matter. Chem., 2004, 14, 2073-2081; f) D. Trushina, T. Bukreeva, M. Kovalchuk, M. Antipina, Mat. Sci. & Engin. C, 2014, 45, 644-658. S. Orrenius, M.J. McCabe Jr, P. Nicotera, Toxicol. Lett., 1992, 64, 357-364.

a) S.J. Kolodziej, H.U. Klueppelberg, N. Nolasco, W. Ehses, D.K. Strickland, J.K. Stoops, J. Struct. Biol., 1998, 123(2), 124-133; b) B.X. Huang, H.Y. Kim, C. Dass, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2004, 15(8), 1237-1247.

V.J. Bom, R.M. Bertina, Biochem. J., 1990, 265(2), 327-336. A. Ilich, I. Bokarev, N.S. Key, Int. J. Lab. Hematol., 2017, 39(5), 441447.

R.A. Revia, M. Zhang, Mater. Today, 2016, 19(3), 157-168.

E. Tolba, W.E. Müller, B.M.A. El-Hady, M. Neufurth, F. Wurm, S. Wang, H.C. Schröder, X. Wang, J. Mater. Chem. B, 2016, 4(3), 376386.

COMMUNICATION

WlLEY-VCH

Entry for the Table of Contents

COMMUNICATION