Дизайн и синтез изоформно-селективных ингибиторов карбоангидразы человека для биомедицинских приложений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.16, кандидат наук Калинин Станислав Алексеевич

• Калинин Станислав Алексеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Калинин Станислав Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ИЗОФОРМЫ КАРБОАНГИДРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И СОЗДАНИЕ ИХ ИНГИБИТОРОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Изоформы карбоангидразы человека и их ингибиторы

1.1.1 Классификация изоформ карбоангидразы человека

1.1.2 Механизм каталитической активности и строение активного центра карбоангидразы человека

1.1.3 Методы определения ингибиторного профиля соединений

1.1.4 Известные механизмы ингибирования активности карбоангидразы человека

1.1.5 Экспрессия изоформ карбоангидразы человека в тканях и органах и взаимосвязь с патологическими состояниями

1.2. Применение многокомпонентных синтетических подходов в области создания ингибиторов карбоангидразы человека

1.2.1 Трехкомпонентный синтез аминоцианопиразолов

1.2.2 Трехкомпонентый синтез сульфонамидсодержащих производных хромона

1.2.3 Ингибиторы карбоангидразы на основе продуктов реакции Биджинелли

1.2.4 Трехкомпонентный синтез сульфонамидсодержащих производных тиазолидина

1.2.5 Трехкомпонентный синтез акридинов по реакции Ганча

1.3 Применение инструментов рационального дизайна для создания ингибиторов угольной ангидразы

1.3.1 Дизайн ингибиторов IX изоформы карбоангидразы человека на основе фармакофорной гипотезы

1.3.2 Дизайн индолсодержащих ингибиторов II изоформы карбоангидразы человека на основе структуры мишени

1.3.3 Дизайн ингибиторов IX изоформы карбоангидразы человека на основе

структур мишени и известных лигандов

1.3.4 Количественный анализ взаимосвязи «структура-активность» для дизайна ингибиторов КАЧ IX

1.3.5 Сравнительный анализ активных сайтов различных изоформ

карбоангидразы человека для дизайна ингибиторов карбоангидразы человека

1.3.6 Фрагментный подход и т sШco приоретизация в ходе дизайна потенциальных ингибиторов IX изоформы карбоангидразы человека

1.3.7 Дизайн ингибиторов II изоформы карбоангидразы человека на основе структур известных лигандов

ГЛАВА 2. ДИЗАЙН И СИНТЕЗ ИЗОФОРМНО-СЕЛЕКТИВНЫХ ИНГИБИТОРОВ КАРБОАНГИДРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРИЛОЖЕНИЙ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

2.1 Создание ингибиторов карбоангидразы человека на основе производных 1,2,4-оксадиазола

2.1.1 Получение исходных амидоксимов для синтеза производных 1,2,4-оксадиазола

2.1.2 Получение производных 1,2,4-оксадиазола, содержащих арил(гетероарил)сульфонамидный фрагмент в положении 5 1,2,4-оксадиазольного цикла

2.1.3 Получение производных 1,2,4-оксадиазола, содержащих арил(гетероарил)сульфонамидный фрагмент в положении 3 1,2,4-оксадиазольного цикла

2.1.4 Изучение ингибиторного профиля производных 1,2,4-оксадиазола

2.2 Создание изоформно-селективных ингибиторов карбоангидразы человека на основе производных имидазолина

2.2.1 Изучение ингибиторной активности производных 1-(4-сульфамоилфенил)-2-арилимидазолина

2.2.2 Дизайн, синтез и изучение ингибиторного профиля производных 1-арил(гетероарил)-2-(4-сульфамоилфенил)-имидазолина

2.2.3 Докинг сульфонамидсодержащих производных 2-арилимидазолина

2.3 Дизайн и синтез селективных ингибиторов IV изоформы карбоангидразы человека

2.3.1 Синтез сульфонамидсодержащих лактамов, доступных по реакции Кастаньоли-Кушмана

2.3.2 Изучение ингибиторного профиля сульфонамидсодержащих лактамов, доступных по реакции Кастаньоли-Кушмана

2.3.3 Дизайн изоформно-селективных ингибиторов IV изоформы карбоангидразы человека на основе метил (2^^,3^5)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоксилата

2.3.4 Синтез амидных производных (2RS,3RS)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновой кислоты

2.3.5 Изучение ингибиторного профиля амидных производных (2RS,3RS)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновой кислоты

2.3.6 Докинг полученных селективных ингибиторов IV изоформы карбоангидразы человека

2.4 Исследование потенциала полученных соединений для биомедицинских приложений

2.4.1 Изучение противораковой активности полученных ингибиторов КАЧ IV

2.4.2 Определение уровня экспрессии .м-РНК КАЧ IV клеточной линией глиомы человека T98G в условиях гипоксии

2.4.3. Изучение противораковой активности полученных ингибиторов КАЧ IX

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Органический синтез

3.2 In silico моделирование

3.3 Исследование биологической активности полученных соединений

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AcOH уксусная кислота

BINAP 2,2'-бис(дифенилфосфин)-1,1'-бинафтил

н-BuOH бутан-1-ол

DMB 2,4-диметоксибензил

EtOH этанол

EtsN триэтиламин

IC50 концентрация полумаксимального ингибирования

Ki константа полуингибирования

МеOH метанол

NCS ^-хлорсукцинимид

TsOH п-толуолсульфоновая кислота

PDB Protein Data Bank

Pd(dba)2 бис-дибензилацетонат палладия

i-PrOH пропан-2-ол

SI индекс селективности

ГАФД глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа

ДМАА диметилацетамид

ДМФА #Д-диметилформамид

ДМСО диметилсульфоксид

ДЦК дициклогексилкарбодиимид

КАЧ карбоангидраза человека

КДИ #Д'-карбонилдиимидазол

.М-РНК матричная рибонуклеиновая кислота

ПЦР полимеразная цепная реакция

РСА рентгеноструктурный анализ

ТГФ тетрагидрофуран

ТСХ тонкослойная хроматография

ТФУК трифторуксусная кислота

ЦНС центральная нервная система

ЭДКИ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

ЯМР ядерный магнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дизайн и синтез изоформно-селективных ингибиторов карбоангидразы человека для биомедицинских приложений»

Актуальность темы

Металлофермент карбоангидраза человека (КАЧ), катализирующий фундаментальную реакцию конверсии диоксида углерода в бикарбонат анион, играет ключевую роль во многих физиологических и патологических процессах. В частности, активность наиболее значимых изоформ данного белка обеспечивает регуляцию внутри- и внешнеклеточного рН, секреции внутриглазной жидкости, кислотности желудочного сока, а также обуславливает адаптацию раковых клеток к гипоксическим условиям в структуре опухоли. В настоящий момент активно изучается роль отдельных типов КАЧ в заболеваниях ЦНС, механизмах активации подвижности сперматозоидов, ожирении и в других значимых терапевтических областях.

Основным вызовом при создании ингибиторов КАЧ является достижение изоформной селективности, т.к. неизбирательно действующие вещества неоптимальны для успешного решения биомедицинских задач. Сложность дизайна соединений с необходимым ингибиторным профилем обусловлена очень высокой схожестью первичной структуры и пространственного строения каталитических сайтов разных изоформ.

Известно, что снижение активности нецелевых изоформ, с которым сопряжено применение неселективных агентов в клинике, приводит к возникновению ряда нежелательных эффектов и снижает терапевтическое значение препаратов. Кроме того, использование неизбирательных ингибиторов в физиологических исследованиях серьезно ограничивает возможности установления роли отдельных изоформ в механизмах заболеваний и затрудняет процесс валидации новых терапевтических подходов.

Скрининг обширных библиотек малых молекул сегодня является единственным источником изоформно-селективных соединений. Высокие временные и материальные затраты на проведение кинетических экспериментов, низкая предсказуемость результатов - важнейшие факторы, сдерживающие развитие данной области медицинской химии.

В настоящей работе предложены новые эффективные подходы к созданию изоформно-селективных ингибиторов КАЧ, включающие использование многокомпонентной химии и рационального дизайна соединений. Кроме того, в работе уделено внимание созданию селективных ингибиторов сравнительно малоизученных изоформ фермента (IV, VII), необходимых для изучения потенциала данных типов КАЧ как терапевтических мишеней.

Степень разработанности темы исследования

Значительное количество работ описывает синтез и скрининг новых соединений в отношении ряда изоформ КАЧ. В редких случаях исследуемые вещества демонстрируют привлекательный ингибиторный профиль, проявляя селективность в отношении терапевтически значимого типа фермента и низкую активность в отношении нецелевых (off-target) изоформ. Кроме того, были предприняты немногочисленные попытки рационального предсказания активности соединений в отношении той или иной изоформы. В то же время успешных примеров целенаправленного рационального дизайна селективных ингибиторов КАЧ в литературе не обнаружено.

Применение такого современного и эффективного медицинско-химического инструмента как многокомпонентные реакции оказалось крайне ограниченным в области создания ингибиторов КАЧ.

Цель и задачи работы

Цель данной работы: продемонстрировать возможность применения рациональных подходов к созданию изоформно-селективных ингибиторов КАЧ для биомедицинских приложений.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• Провести дизайн и синтез скрининговых серий сульфонамидсодержащих соединений для поиска изоформно-селективных ингибиторов КАЧ на основе современных эффективных стратегий синтеза лекарственно-подобных соединений (в том числе с использованием многокомпонентной химии).

• Осуществить анализ наиболее значимых особенностей «структура-активность» при помощи компьютерного моделирования.

• Провести рациональный дизайн и синтез улучшенных серий сульфонамидсодержащих соединений на основании гипотезы о взаимосвязях «структура-активность», выдвинутой по результатам компьютерного моделирования.

• Изучить биологическую активность полученных соединений на релевантных моделях.

Научная новизна работы

Впервые успешно использованы инструменты рационального дизайна для создания селективных ингибиторов КАЧ. Раскрыт потенциал многокомпонентных подходов для дизайна, синтеза и оптимизации изоформно-селективных ингибиторов КАЧ. Получен и охарактеризован ряд ранее неописанных соединений, установлен их ингибиторный профиль в отношении терапевтически релевантных изоформ КАЧ, определены вероятные позы связывания с ферментом, показана in vitro противораковая активность.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы являются основой для развития более эффективных и предсказуемых с точки зрения результата подходов к созданию изоформно-селективных ингибиторов КАЧ. В ходе работы собрана и обобщена обширная информация о взаимосвязях «структура-активность» для синтезированных соединений. Получен ряд изоформно-селективных ингибиторов для терапевтически релевантных типов фермента, данные соединения протестированы на клеточных моделях заболеваний, выявлены соединения, являющиеся перспективными с точки зрения биомедицинских приложений.

Методология и методы

При выполнении диссертационного исследования применялись физико-химические методы идентификации и анализа чистоты полученных соединений, в

1 13

частности ЯМР - спектроскопия на ядрах H и C, методы масс-спектрометрии.

Для разделения и очистки полученных соединений использовались методы высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. Установление ингибиторного профиля полученных соединений проводилось кинетическим методом остановленной струи с использованием рекомбинантных белков. Анализ экспрессии .м-РНК отдельных изоформ КАЧ в клеточных культурах осуществлялся посредством проведения полимеразно-цепной реакции. Анализ выживаемости клеток в присутствии ингибиторов КАЧ проводился с использованием стандартного MTT-теста. Докинг соединений в активный сайт лиганда проводился с помощью программного обеспечения GOLD, Shrodinger.

Степень достоверности и апробация научных результатов

Достоверность положений, выносимых на защиту, а также выводов диссертации подтверждена выполнением экспериментов в контролируемых и воспроизводимых условиях, с использованием необходимого числа повторений. Проведение докинга и симуляции молекулярной динамики осуществлено с применением широко используемого программного обеспечения. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: IV Междисциплинарный Симпозиум по Медицинской, Органической и Биологической Химии и Фармацевтике (Новый Свет, 23-26 сентября 2018); 2 Международная научно-практическая конференция «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (Екатеринбург. 15-17 ноября - 2018); XXVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2019» (Москва 8-12 апреля 2019).

Положения, выносимые на защиту

- Подход к созданию изоформно-селективных ингибиторов КАЧ с использованием многокомпонентной химии и рационального дизайна

- Синтез серий сульфонамидсодержащих соединений

- Определение ингибиторного профиля полученных соединений

- Анализ взаимосвязей «структура-активность» для полученных ингибиторов КАЧ

- Исследование потенциала полученных соединений для биомедицинских приложений

Соответствие паспорту специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 02.00.16 -Медицинская химия - согласно пунктам: 1. Поиск, структурный дизайн и синтез соединений-лидеров - потенциальных физиологически активных (лекарственных) веществ, на основе: а) знания структурных параметров биомишени или особенностей патогенеза; б) анализа и модификации структур известных активных соединений; в) синтеза и биологического тестирования широкого разнообразия химических соединений. 3. Оптимизация структуры соединения-лидера с целью повышения его активности и селективности и использование для этих целей таких приемов, как изменение конформационной подвижности исходной молекулы, биоизостерическая замена, создание аналогов по принципу трехмерного фармакофорного подобия и др. 6. Биологическое и физиологическое (in vitro и in vivo) тестирование сконструированных и синтезированных соединений на предмет изучения особенностей их взаимодействия с молекулярными мишенями организма. 8. Физико-химические исследования лиганд-рецепторных взаимодействий с целью выявления фармакологической пригодности соединений. Использование методов докинга, рентгеноструктурного анализа, ЯМР спектроскопии, микрокалориметрии, поверхностного плазменного резонанса для установления структурно-функциональных взаимоотношений потенциальных лекарственных средств.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 13 статей в международных рецензируемых научных изданиях, индексируемых базами данных (Web of Science, Scopus) и рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных работ и 3 тезисов докладов.

Личный вклад автора

Автор принимал участие в постановке целей и задач исследования. Самостоятельно выполнил синтез соединений, содержащихся в скрининговых

сериях, произвел изучение ингибиторного профиля полученных веществ. Биологическое тестирование полученных соединений на клеточных линиях проведено автором собственноручно. Автор самостоятельно интерпретировал закономерности взаимосвязи «структура-активность» для полученных ингибиторов КАЧ. Автор принимал участие в проведении докинга и симуляции молекулярной динамики для полученных соединений в активном сайте фермента, а также в подготовке публикаций и апробации результатов исследования на научных конференциях различного уровня.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 200 страницах машинописного текста, содержат 44 рисунка, 29 схем, 8 таблиц, 1 приложение и 218 ссылок.

Благодарности

Автор благодарит к.х.н. А.А. Шетнева (ЯГПУ им. К.Д. Ушинского) и к.х.н. С.В. Байкова (СПбГУ), а также Т.В. Шаронову, С.В. Копылова и А.А. Коваленко (СПбГУ) за сотрудничество в ходе синтеза соединений для скрининга ингибиторной активности. Автор выражает признательность к.х.н. А.В. Сапегину (СПбГУ) за ценные консультации при оптимизации синтетических протоколов и установлении структуры полученных соединений. Автор благодарит д.б.н. В.В. Шаройко за руководство работой по изучению противораковой активности полученных соединений и определении уровня экспрессии .м-РНК целевых белков клеточными культурами. Автор благодарит профессора К.Т. Супурана (Флорентийский университет) за предоставление оборудования и материалов для определения ингибиторного профиля полученных соединений. Автор выражает благодарность профессору Т. Туччинарди (Университет г. Пизы) и доктору А. Ночентини (Флорентийский университет) за руководство работой по докингу и проведению молекулярной симуляции с целью установления поз связывания соединений в активном сайте ферментов.

ГЛАВА 1. ИЗОФОРМЫ КАРБОАНГИДРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И СОЗДАНИЕ ИХ ИНГИБИТОРОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Изоформы карбоангидразы человека и их ингибиторы

1.1.1 Классификация изоформ карбоангидразы человека

Металлофермент карбоангидраза, катализирующий фундаментальную реакцию обратимой конверсии диоксида углерода в гидрокарбонат анион и протон, играет ключевую роль во многих физиологических и патологических процессах [1-3].

В организме человека данный фермент представлен 15 изоформами, различающимися по каталитической активности, тканевой и субклеточной локализации. В частности, по субклеточной локализации изоформы карбоангидразы человека (КАЧ) классифицируют следующим образом [4]:

• Цитозольные: I, II, III, VII, VIII, X, XI, XII

• Митохондриальные: VA, VB

• Секретируемые: VI

• Поверхностные трансмембранные: IX, XII, XIV

• Поверхностные, связанные с гликозилфосфатидилинозитолом: IV Кроме того, по каталитической активности выделяют:

• Высокоактивные: II, IV, VII, IX, XII

• Умеренно активные: VI, XIII, XIV

• Низкоактивные: I, III

• Неактивные: VIII, X, XI

1.1.2 Механизм каталитической активности и строение активного центра

карбоангидразы человека

Важной особенностью ферментов семейства КАЧ является очень высокая

степень гомологии в строении активных центров различных изоформ, представляющих собой узкие полости, на дне которых находится простетическая группа - ион 7п2+, координированный тремя остатками гистидина [5]. Поверхность каталитического центра КАЧ подразделяется на две части, одна из

которых образована преимущественно гидрофобными аминокислотными остатками, другая - гидрофильными [6]. Такое строение характерно для всех изоформ КАЧ, вне зависимости от каталитической активности и субклеточной локализации [7], по этой причине, структура активного сайта фермента может быть рассмотрена на примере наиболее детально изученной изоформы КАЧ II.

Активный сайт распространенной во всех тканях и органах КАЧ II, представляет собой коническую щель глубиной около 15 А и объемом порядка 900 А3 (рисунок 1.1). В глубине полости находится ион играющий ключевую роль в процессе катализа. Ион металла координирован с тремя остатками гистидина (Н^94, His96, His119) и формирует тетраэдрический комплекс, четвертая координационная емкость в котором может быть занята молекулой растворителя или ингибитора [8-11].

Рисунок 1.1. А) Третичная структура КАЧ II (PDB код 1СА2); Б) Поверхность КАЧ II. Гидрофобная и гидрофильная области поверхности на границе каталитической полости выделены соответственно красным и синим цветами [11]. Отдельные неконсервативные аминокислотные остатки, отличающие

поверхности активных участков одной изоформы от другой, расположены, как

правило, вблизи границ каталитической полости, таким образом, активные

центры всех изоформ КАЧ имеют практически идентичное строение [12-15].

Реакцию гидратации углекислого газа можно представить в виде

следующего уравнения (уравнение 1) [16]:

к! н20 +

H2O + CO2 ^^ H2CO3 ^^ H+ + HCO3- (1)

k-,

Каталитический процесс данной реакции, происходящий в активном сайте КАЧ, включает в себя следующие стадии:

I) Координация молекулы воды с простетическим ионом Zn2+, приводящая к образованию комплекса Zn2+-OH2.

II) Удаление протона, приводящее к формированию комплекса Zn2+-OH-. Ион водорода переносится к границам каталитической полости посредством цепочки упорядоченных молекул растворителя, после чего выбрасывается за пределы активного сайта высокоподвижным остатком His64.

III) Связывание молекулы субстрата (CO2) в непосредственной близости от каталитического центра.

IV) Атака нуклеофильной частицы OH- по атому углерода молекулы CO2, приводящая к образованию гидрокарбонат аниона.

Впоследствии происходит диффузия продукта реакции в объем растворителя и регенерация комплекса Zn-OH2 (стадия I) (рисунок 1.2) [17-19].

Гидрофильная поверхность активного сайта

вШОб, ТЪг199

Гидрофобная поверхность активного сайта

(II)

-Н+

н+

Уа1121, Уа1143, Ьеи198

С1и106, ТЬг199

Уа1121, Уа1143, Ьеи198

нсо3--н2о

н2о

-НС03" "

-со.

С02 (III)

(iv)

Ни94 / Н18И9 Ш$96

Уа1121, Уа1143, Ьеи198

С1и106, ТЬг199

ОН £ ,

I ¿У Уа1121, Уа1143,

2п2+ — Ьеи198

1Ш94"/ ^НМ19 Шв9б

Рисунок 1.2. Стадии каталитического процесса внутри активного сайта КАЧ. Адаптировано из [19].

Скорость определяющей стадией каталитического процесса считается этап

удаления протона из активного сайта фермента [20-22].

В структуре КАЧ II выделяют два переходящих друг в друга гидрофобных кармана, один из которых расположен на границе каталитической полости (Phe131, Val135, Pro201, Pro202, Leu204), а другой в непосредственной близости от иона 7п (Val121, Val143, Leu198) [7, 23, 24]. Последний участок выполняет роль сайта связывания молекулы СO2 внутри активного сайта фермента[10, 25, 26].

Гидрофильная часть поверхности активного сайта КАЧ II (Asn62, His64, Asn67, Gln92, Glu106, Т^199) также может быть подразделена на отдельные области, в зависимости от роли в каталитическом процессе: Thr199 способствует отщеплению протона от молекулы растворителя при формировании комплекса 7п2+-ОН-, а также ориентирует неподеленную электронную пару цинк-связанной нуклеофильной частицы для атаки по углеродному атому субстрата. Glu106 взаимодействует с ТЫ"199, дополнительно активируя данный остаток в роли

акцептора водородной связи [27]. В свою очередь Туг7, Asn62, Asn67, Ткг199 и ТИг200 образуют направленную к границам каталитической полости сеть упорядоченных молекул воды, по которой осуществляется перенос иона водорода из активного сайта [28]. Наконец, высокоподвижный остаток His64 реализует выброс протона в объем растворителя (рисунок 1.3) [29, 30].

Т200 Т199

Рисунок 1.3. Сеть упорядоченных молекул воды (W1, W2, W3a, W3b), по которой осуществляется перенос протона от активного центра к границам каталитической полости. Подвижный остаток His64 показан в двух конформациях (in/out). DW (deep water) - молекула воды, находящаяся на дне каталитической полости. ZS -молекула воды, связанная с ионом Zn2+ [31].

Следует также отметить, что КАЧ могут катализировать некоторые другие

превращения, в частности, гидролиз некоторых сложных эфиров [31]. Информация о существенной биологической роли неосновных типов каталитической активности КАЧ на сегодняшний день отсутствует.

1.1.3 Методы определения ингибиторного профиля соединений

При температуре 37 °С и физиологических pH константа скорости псевдопервого порядка прямой реакции k1 соответствует 0,15 с-1, а обратной (k2) -50 с-1 (Уравнение 1) [32]. КАЧ II катализирует прямую реакцию с константой kcat, превышающей 106 с-1. Для обратной реакции kcat = 2,5*105 с-1 [33]. Таким образом, реакция гидратации углекислого газа в активном сайте КАЧ является одной из самых быстрых ферментативных реакций среди известных на сегодняшний день

[34]. Активность КАЧ является важным фактором, оказывающим влияние на многие биохимические процессы в организме, что обуславливает перспективность ингибирования данного фермента в терапевтических целях [35]. Следует отметить, что в связи с высокой стоимостью рекомбинантных ферментов, для определения ингибиторного профиля соединений, как правило, не используют панели белков, содержащие все известные изоформы КАЧ. Чаще всего, для изучения выбирают одну-две изоформы, представляющие интерес для исследователей в конкретной терапевтической области и дополняют панель наиболее активными типами фермента, способными играть роль побочных мишеней, ингибирование которых может быть связано с возникновением нежелательных эффектов (в большинстве случаев - КАЧ I и КАЧ II).

Наиболее распространенным методом определения К характеризующих влияние соединений на протекание быстрых ферментативных реакций, является кинетический метод остановленной струи [36]. При изучении КАЧ данным методом, буферный раствор, содержащий субстрат (С02), за доли секунды смешивается с раствором, содержащим фермент, после чего потоки растворов останавливаются и измеряется скорость протекания реакции. При известных кинетических параметрах фермента К определяется на основании начальных скоростей реакций в отсутствии и в присутствии ингибитора. Для измерения скорости реакции, катализируемой КАЧ, в большинстве случаев используются рН-индикатор и спектрометр [36,37].

Исторически применялся также подход, базирующийся на неосновном эстеразном типе каталитической активности КАЧ. В частности, в рамках данного метода при помощи УФ-спектрометра измерялось ингибирование реакции конверсии 4-нитрофенилацетата в 4-нитрофенолят [31, 38]. Было показано, что значения К определенные таким способом, часто существенно отличаются от таковых, полученных при помощи более надежного метода остановленной струи, базирующегося на измерении скорости основной реакции, катализируемой КАЧ [39].

Кроме того, недавно был предложен метод, позволяющий экспрессно вычислять К при помощи масс-спектрометрического определения концентрации комплекса фермент-ингибитор [40]. Сущность подхода заключается в ионизации и детекции комплексов лиганд-белок в растворах, поддерживающих нативное состояние фермента. Проблема подбора подходящих буферных растворов, лишенных денатурирующих компонентов и пригодных для использования в масс-спектрометрических исследованиях долгое время являлась ограничением данного подхода. Впоследствии специальные технологические усовершенствования, в частности, применение наноразмерных ионных эмиттеров, позволили преодолеть трудности, связанные с ионизацией ферментов в нативных растворах [41]. Таким образом, на современном этапе данный метод представляется весьма перспективным ввиду экономности, экспрессности и высокой точности определения К В будущем такой подход может основой для более производительного скрининга ингибиторов КАЧ в сравнении с существующими на сегодняшний день протоколами.

1.1.4 Известные механизмы ингибирования активности карбоангидразы

человека

2+

1.1.4.1 Ингибирование за счет связывание с ионом Zn простетической

группы

Наиболее детально изученный механизм ингибирования активности КАЧ заключается в связывании малых молекул с ионом 7п2+ простетической группы, в результате чего блокируется стадия образования комплекса и

нарушается процесс катализа. В частности, данный механизм инигбирования характерен для сульфонамидов, сульфаматов, карбоновых и гидроксамовых кислот, фосфонатов и некоторых других классов соединений, способных координироваться с металлами, находясь в депротонированной форме [42-44]. В структуре таких ингибиторов, как правило, выделяют металл-связывающий фрагмент, базовую структуру (чаще всего гетероциклическую), а также молекулярную периферию [45]. Зачастую, цинк-связывающая функциональная группа, помимо координации с ионом металла, способна образовывать

водородные связи с Thr199. В свою очередь базовая структура (скаффолд) взаимодействует с гидрофобной или гидрофильной поверхностями активного сайта, а молекулярная периферия формирует контакты с аминокислотными остатками на границе каталитической полости (рисунок 1.4) [12]. Наличие дополнительных взаимодействий с поверхностью активного сайта отличает органические ингибиторы от неорганических анионов, способных также связываться с ионом однако проявляющих довольно слабую ингибиторную активность (рисунок 1.4) [46].

Гидрофильная Гидрофобная

поверхность___\ поверхность

активного / | \ активного

центра Л / \ центра

)

Thrl99 ( - - р—^

V I J Vall21, Vall43,

Zn2+ —^ Leul98

His94 / His119 His96

Рисунок 1.4. Механизм ингибирования КАЧ за счет связывания с простетическим ионом Zn2+. ZBF = Zinc Binding Function (цинк-связывающая функциональная группа). Адаптировано из [47].

1.1.3.2 Ингибирование за счет координации с цинк-связанной молекулой

воды

Механизм ингибирования КАЧ, основанный на координации с молекулой

2+

воды, связанной с ионом Zn , был впервые предложен для фенолов [48, 49]. Для ингибиторов данного типа характерно взаимодействие со связанной с ионом Zn2+ простетической группы нуклеофильной частицей, в результате чего понижается ее способность к атаке атома углерода углекислого газа. В то же время, периферийная часть молекулы, как правило, интенсивно взаимодействует с гидрофобной частью поверхности каталитической полости, препятствуя диффузии субстрата [50, 51]. Помимо фенолов, данный механизм действия описан для полиамина спермина [52], сульфокислот [53], карбоновых кислот, сложных эфиров и некоторых других классов соединений [54]. В кристаллических

структурах комплексов таких ингибиторов с КАЧ не наблюдается взаимодействие ингибитора с ионом металла, однако фиксируются водородные связи с комплексом а также с остатком Ткг199. При этом скаффолды, на

которых располагается нуклеофил-координирующая группа, часто образуют контакты с гидрофобной или гидрофильной поверхностью активного центра, а молекулярная периферия во многих случаях достигает границ каталитической полости и способна взаимодействовать с аминокислотными остатками на поверхности белка (рисунок 1.5) [47].

Гидрофильная поверхность активного центра

Glu 106, Thrl99

Гидрофобная поверхность активного центра

Vall21, Vall43, Leul98

Zn2*

His94^Hisll9 His96

Рисунок 1.5. Механизм ингибирования КАЧ за счет координации с цинк-связанной молекулой воды/гидроксид ионом. NBF - Nucleophile Binding Function (функциональная группа, связывающаяся с нуклеофильной частицей). Адаптировано из [47].

1.1.3.3 Ингибирование за счет блокирования входа в каталитическую

полость

Еще одним возможным механизмом ингибирования КАЧ является блокирование входа в каталитическую полость, препятствующее диффузии субстрата и продуктов реакции. В этом случае сайт связывания ингибитора удален от иона Zn2+ простетической группы и располагается на границе активной полости фермента [55]. Как отмечалось выше, именно эта область каталитического центра насыщенна неконсервативными остатками, отличающими одну изоформу КАЧ от другой.

Структура ингибитора с данным механизмом активности зачастую включает фрагменты, способные к интенсивным липофильным взаимодействиям с гидрофобными аминокислотными остатками, например (гетеро)ароматический

цикл или объемный алифатический заместитель. Молекулярная периферия таких структур часто способна образовывать контакты с регионами, располагающимися за пределами активного сайта (рисунок 1.6А) [56, 57].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Калинин Станислав Алексеевич, 2019 год

// * „

4а в 0 _ О-М 6 О _ о-м

ч«*>н м г-\ / 11 г-1 / n

1е,х-я-- НоМ-ЭННе^АгЬ-К -- Н21Ч-5—I Не1,Аг I—(х и

й - О 61-79% й ^-'

а

5 Зш-аг

Условия: a) ЭДКИ (1,0 экв.), ацетон, комнатная температура, 12 ч.; б) KOH (1,0 экв.), ДМСО, комнатная температура, 0,5 ч.

Кроме того, нами были предложены условия получения производных 1,2,4-оксадиазола, не требующие ни выделения продукта О-ацилирования, ни дополнительного нагревания [196]. Для этого кислоту 4г, растворенную в непосредственно в ДМСО в присутствии КДИ, вводили в реакцию с амидоксимом 1а-г. Последующее прибавление NaOH к реакционной смеси приводило к циклизации, протекающей при комнатной температуре и получению производных 3ад-аи (схема 2.4) (Перечень заместителей R, Ar cм. в таблице 2.1 способ получения В).

Схема 2.4

о _ о

Н21Ч—в—[не!,Аг)—^ О ОН

4г 9 ,-, 0-м

1а-г -- Н21Ч—¡3—[Не1,Аг ]—^ |

а,б О м

59-75%

Зад-аи

Условия: а) КДИ (1,1 экв.), ДМСО, комнатная температура, 18 ч.; б) NaOH (1,2 экв.), ДМСО, комнатная температура, 2 ч.

Выходы целевых сульфонамидсодержащих производных 1,2,4-оксадиазола

3а-аи в зависимости от метода составили 11-79%.

2.1.3 Получение производных 1,2,4-оксадиазола, содержащих арил(гетероарил)сульфонамидный фрагмент в положении 3 1,2,4-

оксадиазольного цикла

Альтернативно замещенные производные 1,2,4-оксадиазола 6а-у, содержащие арил(гетероарил)сульфонамидный заместитель в положении 3 оксадиазольного цикла были получены способом, аналогичным описанному выше.

Синтез производных 6а-у был осуществлен с использованием коммерчески доступных карбоновых кислот 7а-г либо сложных эфиров 8а-д в ДМСО в присутствии NaOH при комнатной температуре. В частности соединения 6а-е были получены из карбоновых кислот 7а-г и сульфонамидсодержащих амидоксимов 1ж-и (Схема 2.5) (Перечень заместителей R, Ar cм. в таблице 2.2 способ получения В).

Схема 2.5

О _ N04

НгИ-Б—(АГ)—^

О N42

а,и

42-79%

7а-г ба-е

Условия: а) КДИ (1,1 экв.), ДМСО, комнатная температура, 18 ч.; б) NaOH (1,2 экв.), ДМСО, комнатная температура, 2 ч.

При использовании доступных сложных эфиров, к смеси 8а-д с

амидоксимом 1ж-и в ДМСО тажке прибавлялся NaOH, в результате чего при

комнатной температуре образовывались целевые продукты 6ж-р (схема 2.6)

(Перечень заместителей R, Ar cм. в таблице 2.2 способ получения Г).

Схема 2.6

о

1ЧОН

О

1ж-и

м

О

N

а

54-91%

8а-д

бж-р

Условия: а) NaOH (1,5 экв.), ДМСО, комнатная температура, 2-4 ч.

Кроме того, несколько тиофенсодержащих соединений 6с-у были синтезированы путем постконденсационного сульфохлорирования и дальнейшего сульфонамидирования производных 1,2,4-оксадиазола 9а-в (схема 2.7) (Перечень заместителей R см. в таблице 2.2 способ получения Д).

Условия: а) №ОН (1,5 экв.), ДМСО, комнатная температура, 2-4 ч.; б) Ш03С1 (20,0 экв.), комнатная температура, 4 ч.; КН3(водный) (5,0 экв.), ацетонитрил, 50 °С, 1

Таким образом, были получены две серии производных 1,2,4-оксадиазола 3а-аи и 6а-у, включающих сульфонамидсодержащий заместитель в положениях 5 и 3 гетероциклического ядра соответственно.

2.1.4 Изучение ингибиторного профиля производных 1,2,4-оксадиазола

При помощи кинетического метода остановленной струи нами был изучен ингибиторный профиль производных 1,2,4-оксадиазола 3а-аи в отношении ряда терапевтически значимых изоформ КАЧ. В частности, для исследования были выбраны цитозольные КАЧ I и II, а также мембранносвязанный IX типы фермента. Клинически используемый ингибитор КАЧ Ацетазоламид был использован в качестве референсного соединения (таблица 2.1).

Схема 2.7

54-91%

8а-в

9а-в

бс-у

Таблица 2.1. Выходы и ингибиторный профиль производных 1,2,4-оксадиазола арил(гетероарил)сульфонамидный фрагмент в положении 5 оксадиазольного цикла.

3а-аи, содержащих

Соединение Способ получения о р-м н2м^_ Аг О - 3

Аг R 8 £ ■д и К М

КАЧ I КАЧ II КАЧ IX

3а А я-Фенилен 2-С1СбНд 57 (6,3 ± 0,6) х 10-7 (4,8 ± 0,5) х 10-10 (1,1 ± 0,1) х 10-8

3б А я-Фенилен 4-МеС6Н4 48 (6,5 ± 0,6) х 10-7 (6,8 ± 0,7) х 10-10 (2,5 ± 0,2) х 10-9

3в А я-Фенилен /-Рг 35 (4,3 ± 0,4) х 10-8 (5,1 ± 0,5) х 10-10 (1,3 ± 0,2) х 10-8

3г А я-Фенилен 2-МеОСбН4 58 (1,9 ± 0,2) х 10-7 (5,1 ± 0,5) х 10-10 (2,1 ± 0,2) х 10-8

3д А я-Фенилен 3-МеОСбН4 45 (3,1 ± 0,3) х 10-8 (4,8 ± 0,5) х 10-10 (2,4 ± 0,2) х 10-7

3е А я-Фенилен 3-С1СбН4 59 (6,5 ± 0,6) х 10-7 (7,1 ± 0,7) х 10-10 (2,2 ± 0,2) х 10-7

3ж А я-Фенилен 3,4-(МеО)зСбНз 45 (3,8 ± 0,4) х 10-8 (4,6 ± 0,5) х 10-10 (2,8 ± 0,3) х 10-8

3з А я-Фенилен 2-МеС6Н4 43 (4,4 ± 0,4) х 10-8 (4,2 ± 0,4) х 10-10 (2,4 ± 0,2) х 10-8

3и А я-Фенилен 2-Ру 57 (6,8 ± 0,7) х 10-8 (7,2 ± 0,7) х 10-10 (2,2 ± 0,2) х 10-8

3к А я-Фенилен 4-/-ВиСбН4 51 (4,2 ± 0,4) х 10-7 (9,5 ± 0,9) х 10-10 (2,3 ± 0,2) х 10-9

3л А я-Фенилен 2-тиенил 47 (8,9 ± 0,9) х 10-8 (4,4 ± 0,4) х 10-8 (1,6 ± 0,2) х 10-9

3м А я-Фенилен Ph 55 (4,5 ± 0,4) х 10-8 (1,8 ± 0,2) х 10-9 (6,7 ± 0,7) х 10-9

3н А я-Фенилен 3-Ру 52 (3,0 ± 0,3) х 10-8 (4,2 ± 0,4) х 10-8 (1,6 ± 0,2) х 10-9

3о А я-Фенилен с-Рг 51 (2,7 ± 0,3) х 10-8 (3,6 ± 0,3) х 10-9 (1,4 ± 0,2) х 10-9

3п А я-Фенилен 3-МеС6Н4 56 (6,9 ± 0,7) х 10-8 (5,7 ± 0,6) х 10-9 (1,4 ± 0,2) х 10-9

3р А * л <4 2-CIC6H4 30 (2,4 ± 0,3) x 10-6 (3,8 ± 0,4) x 10-7 (2,5 ± 0,2) x 10-9

3с А * л <4 c-Pr 36 (3,9 ± 0,4) x 10-6 (5,0 ± 0,5) x 10-9 (2,9 ± 0,3) x 10-9

3т А * 3-(EtCONH)C6H4 34 (4,3 ± 0,4) x 10-6 (8,6 ± 0,8) x 10-10 (1,4 ± 0,2) x 10-8

3у А * <4 3-Py 43 (3,4 ± 0,3) x 10-6 (7,4 ± 0,7) x 10-10 (2,6 ± 0,3) x 10-7

3ф А * ид <4 t^Of 11 (8,3 ± 0,8) x 10-7 (4,8 ± 0,5) x 10-8 (2,1 ± 0,2) x 10-7

3х А * <4 3-FC6H4 53 (7,8 ± 0,8) x 10-7 (6,6 ± 0,7) x 10-10 (1,0 ± 0,1) x 10-8

3ц А * УЧ 3-MeOC6H4 47 (2,2 ± 0,2) x 10-7 (2,7 ± 0,3) x 10-9 (2,0 ± 0,2) x 10-9

3ч А ж-Фенилен 3-Py 54 (4,2 ± 0,4) x 10-7 (7,7 ± 0,8) x 10-10 (1,2 ± 0,1) x 10-9

3ш Б ж-Фенилен /-Pr 63 (7,7 ± 0,7) x 10-7 (7,1 ± 0,7) x 10-10 (2,4 ± 0,2) x 10-9

3щ Б ж-Фенилен 2-CIC6H4 78 (6,8 ± 0,7) x 10-7 (7,6 ± 0,8) x 10-10 (1,9 ± 0,2) x 10-9

3э Б w-Фенилен 4-Py 70 (8,5 ± 0,8) x 10-8 (4,2 ± 0,4) x 10-10 (2,7 ± 0,5) x 10-9

3ю Б w-Фенилен 3-(AcNH)C6H4 67 (4,6 ± 0,5) x 10-8 (4,0 ± 0,6) x 10-10 (1,5 ± 0,1) x 10-8

3я Б w-Фенилен ЧХС 65 (8,7 ± 0,9) x 10-7 (7,8 ± 0,8) x 10-9 (9,9 ± 0,9) x 10-9

3аа Б w-Фенилен * 79 (9,6 ± 0,9) x 10-7 (3,0 ± 0,3) x 10-8 (1,6 ± 0,2) x 10-8

3аб Б w-Фенилен 4-FC6H4 77 (2,1 ± 0,2) x 10-7 2,7 ± 0,3) x 10-9 (1,6 ± 0,2) x 10-8

3ав Б w-Фенилен 2-FC6H4 65 (1,6 ± 0,2) x 10-7 (6,5 ± 0,6) x 10-10 (1,7 ± 0,2) x 10-8

3аг Б w-Фенилен 3-тиенил 61 (2,9 ± 0,3) x 10-8 5,5 ± 0,5) x 10-9 (1,4 ± 0,2) x 10-9

3ад В •ЛХ. Ph 59 (8,9 ± 0,9) x 10-8 (1,7 ± 0,2) x 10-9 (2,4 ± 0,2) x 10-10

3ае В •ЛХ. 2-MeOC6H4 68 (1,6 ± 0,2) x 10-8 (6,4 ± 0,6) x 10-10 (1,3 ± 0,1) x 10-10

3аж В •лх. c-Pr 75 (9,3 ± 0,9) x 10-8 (7,5 ± 0,7) x 10-10 (8,9 ± 0,9) x 10-11

3аз В •лх. 2-Py 72 (2,5 ± 0,2) x 10-8 (4,3 ± 0,4) x 10-9 (3,9 ± 0,4) x 10-10

3аи В •ЛХ. 3-MeOC6H4 66 (5,4 ± 0,5) x 10-9 (8,2 ± 0,8) x 10-10 (2,2 ± 0,2) x 10-9

Ацетазоламид (2,5 ± 0,2) x 10-7 (1,2 ± 0,4) x 10-8 (2,5 ± 0,2) x 10-8

Проведенный эксперимент позволил установить следующие особенности взаимосвязи «структура-активность». Среди соединений 3 во многих случаях наблюдалась сравнительно низкая активность в отношении КАЧ I. В частности, соединения 3р-у и некоторые другие производные 1,2,4-оксадиазола, содержащие 2-метокси-4-сульфамоилфенильный заместитель в положении 5 гетероциклического ядра, проявили весьма низкую активность против данного типа фермента. Напротив, вещества 3л-п, включающие 4-сульфамоилфенильную группу, и особенно тиофенсодержащие производные 3ад-3аи, оказались весьма активны в отношении I изоформы КАЧ. Таким образом, природа линкера, соединяющего сульфонамидную группу с 1,2,4-оксадиазольным скаффолдом оказывала большое влияние на ингибиторную активность соединений, проявляемую в отношении КАЧ I.

В то же время практически все производные 3 оказались потентными ингибиторами II изоформы КАЧ, проявляя активность на уровне 10-9-10-10М. Исключением стало лишь соединение 3р (К (КАЧ II) = (3,8 ± 0,4) х 10- М): оба ароматических заместителя при 1,2,4-оксадиазольном цикле содержали сравнительно объемные группы в орто-положении, что могло накладывать конформационные ограничения, неблагоприятные для связывания с поверхностью активного сайта II изоформы КАЧ.

Наконец, активность большинства производных 3 в отношении мембранносвязанной изоформы КАЧ IX оказалась на уровне

10-9М. Менее

выраженным ингибиторным действием против КАЧ IX характеризовались два структурно близких соединения 3д и 3е (значения К (КАЧ IX) оказались на два порядка выше, в сравнении другими производными 3). Оба соединения содержали 3-замещенный фенильный радикал в положении 5 1,2,4-оксадиазольного ядра. Аналогичное понижение активности наблюдалось для производных 3у и 3ф. Следует отметить, что перечисленные вещества продемонстрировали селективный ингибиторный профиль по отношению к КАЧ II. В то же время соединение 3аж (К! (КАЧ IX) = (8,9 ± 0,9) х

10-11М), содержащее сульфамоилтиенильный и

циклопропильный заместители, напротив, проявило избирательную субнаномолярную активность в отношении IX изоформы фермента. Среди синтезированных веществ 3, производное 3аж оказалось наиболее потентным ингибитором изоформы IX КАЧ.

Соединения 6, включающие сульфонамидсодержащий заместитель в положении 3 1,2,4-оксадиазольного цикла также были изучены на предмет ингибиторной активности в отношении изоформ I, II, IX КАЧ (Таблица 2.2).

Таблица 2.2. Выходы и ингибиторный профиль производных 1,2,4-оксадиазола 6, содержащих арил(гетероарил)сульфонамидный фрагмент в положении 3 оксадиазольного ядра.

Соединение Способ получения О N"0 Аг 0 - 6

*— Аг —* R Выход,% К М

КАЧ I КАЧ II КАЧ IX

6а В я-Фенилен 3-Тиенил 51 (8,9 ± 0,9) х 10-9 (5,9 ± 0,6) х 10-10 (1,8 ± 0,2) х 10-9

6б В я-Фенилен 2-Ру 79 (3,8 ± 0,4) х 10-8 (9,3 ± 0,9) х 10-10 (3,1 ± 0,3) х 10-10

6в В я-Фенилен 2-Тиенил 70 (7,9 ± 0,8) х 10-9 (3,9 ± 0,4) х 10-10 (3,6 ± 0,4) х 10-10

6г В ж-Фенилен 3-Тиенил 63 (8,3 ± 0,8) х 10-8 (3,8 ± 0,4) х 10-10 (8,8 ± 0,9) х 10-10

6д В .XX 3-Ру 42 (1,0 ± 0,1) х 10-6 (2,7 ± 0,3) х 10-7 (1,2 ± 0,1) х 10-8

6е В хс 2-Тиенил 63 (1,2 ± 0,1) х 10-6 (9,2 ± 0,9) х 10-8 (1,6 ± 0,2) х 10-8

6ж Г ,хх Ph 77 (4,6 ± 0,5) х 10-7 (8,8 ± 0,9) х 10-9 (1,3 ± 0,1) х 10-8

6з Г .XX 4-КССбНд 54 (7,8 ± 0,8) х 10-7 (5,9 ± 0,9) х 10-7 (2,7 ± 0,3) х 10-7

6и Г я-Фенилен с-Рг 87 (7,8 ± 0,8) х 10-9 (4,1 ± 0,4) х 10-9 (1,9 ± 0,2) х 10-9

6к Г я-Фенилен Ph 89 (6,5 ± 0,6) х 10-8 (7,4 ± 0,7) х 10-10 (7,7 ± 0,8) х 10-10

6л Г ^-Фенилен 4-Ру 71 (4,8 ± 0,5) х 10-8 (3,0 ± 0,3) х 10-10 (4,4 ± 0,4) х 10-10

6м Г ^-Фенилен 4-КСС6Н4 63 (8,8 ± 0,4) х 10-8 (4,4 ± 0,4) х 10-10 (6,0 ± 0,6) х 10-10

6н Г ^-Фенилен Ме 86 (3,8 ± 0,4) х 10-8 (4,8 ± 0,5) х 10-10 (5,3 ± 0,5) х 10-10

6о Г ^-Фенилен 3,4-а2СбНз 55 (8,2 ± 0,4) х 10-8 (1,3 ± 0,1) х 10-9 (6,2 ± 0,6) х 10-10

6п Г ж-Фенилен Ph 75 (3,4 ± 0,3) х 10-7 (2,1 ± 0,2) х 10-8 (3,7 ± 0,4) х 10-9

6р Г ж-Фенилен с-Рг 57 (7,6 ± 0,8) х 10-7 (8,9 ± 0,9) х 10-9 (9,2 ± 0,9) х 10-8

6с Д *лХ ^ * Ме 66* (8,1 ± 0,8) х 10-9 (9,1 ± 0,9) х 10-10 (1,6 ± 0,2) х 10-9

6т Д •ЛХ, с-Рг 50* (5,3 ± 0,5) х 10-8 (8,8 ± 0,9) х 10-10 (2,1 ± 0,2) х 10-9

бу Д •ЛХ, Ph 74* (4,5 ± 0,4) х 10-7 (6,9 ± 0,7) х 10-10 (1,1 ± 0,1) х 10-9

Ацетазоламид (2,5 ± 0,2) х 10-7 (1,2 ± 0,1) х 10-8 (2,5 ± 0,2) х 10-8

*Приведен общий выход для двух стадий

Тестирование соединений 6а-у показало, что многие производные данного типа (например, 6к-н) неселективно ингибируют КАЧ II и IX, проявляя субнаномолярный уровень активности. Также сравнительно высокая активность наблюдалась в отношении КАЧ I. Примечательным на наш взгляд является снижение активности в отношении всех трех изоформ, наблюдаемое для соединений 6д-6з, содержащих 2-метокси-4-сульфамоилфенильную группу. Интересно, что наиболее существенное падение активности данных веществ имело место в отношении КАЧ I (понижение К до уровня 10-6-10-7). Также в значительной степени изменялась способность к ингибированию КАЧ II. При этом изменение активности в отношении мембранносвязанной IX изоформы фермента оказалось заметно менее выраженным. В частности, данные тенденции иллюстрируются селективным действием соединения 6д по отношению к КАЧ IX.

В целом, можно видеть, что для обоих типов производных 3 и 6 природа линкера, соединяющего сульфонамидную группу с 1,2,4-оксадиазольным ядром существенно влияет на способность к ингибированию КАЧ I. Активность в отношении КАЧ II и КАЧ IX для большинства производных 3 и 6 находилась на уровне 10-9-10-10М, однако варьирование заместителей в некоторых случаях приводило к понижению активности в отношении данных изоформ. Обращает на себя внимание то, что зачастую существенное разнообразие заместителей в пределах одного типа соответствовало неизменному уровню активности/селективности ингибиторного действия. К примеру, среди соединений 3а-п, э-аг активность/селективность в отношении КАЧ II и КАЧ IX практически не изменялась в ряду аналогов, включающих такие заместители, как 2-С1С6Н4, 4-МеС6Н4, /-Рг, 3,4-(МеО)2С6Н3, 4-Ру, 3-(АсМН)С6Н4, и т.д. В то же время введение 3-метоксифенилильного/3-хлорфенильного радикалов приводило к выраженному снижению ингибиторного действия производных 3д, 3е на КАЧ IX, таким образом, среди всего разнообразия аналогов лишь вещества 3д и 3е проявили заметную селективность в отношении КАЧ II. Аналогичные

тенденции характерны и для других рядов близких по структуре ингибиторов, таким образом, полученные данные свидетельствуют о необходимости создания максимально разнообразных серий соединений для повышения шансов на идентификацию селективных агентов в ходе скринига.

Как можно видеть из таблиц 2.1. и 2.2, протестированные серии производных 1,2,4-оксадиазола включали в себя ряд соединений, являющихся изомерами и различающимися взаимным расположением заместителей относительно гетероциклического скаффолда. В ряде случаев ингибиторные профили таких изомерных соединений заметно отличались.

В частности, производное 3аж проявляло субнаномолярную активность в отношении IX изоформы фермента (К (КАЧ IX) (8,9 ± 0,9) х

10-11), в то

время как активность соединения 6т в отношении данного типа фермента оказалось на два порядка ниже. При этом существенных отличий в способности к ингибированию цитозольных КАЧ I и КАЧ II не наблюдалось (рисунок 2.1).

Заж 6т

К-, (КАЧ I) 5,3 ± 0,5) х 10"8М К, (КАЧ II) (8,8 ± 0,9) * Ю"10М К| (КАЧ IX) (2,1 ± 0,2) х Ю-9М

Рисунок 2.1. Структуры и ингибиторный профиль соединений 3аж и 6т.

Снижение ингибирования в отношении КАЧ IX наблюдалось также для соединений 3и и 6б. Как и в случае производных 3аж и 6т, активность данных веществ в отношении двух цитозольных изоформ оставалась на одном уровне и существенно изменялась лишь для мембраносвязанной IX изоформы (рисунок 2.2).

К, (КАЧ I) (9,3 ± 0,9) х 10"9М К, (КАЧ II) (7,5 ± 0,7) х Ю"10М К| (КАЧ IX) (8,9 ± 0,9) х 1р-11М

Kj (КАЧ I) (6,8 ± 0,7) x Ю"8М Kj (КАЧ II) (7,2 ± 0,7) x Ю"10М Ki (КАЧ IX) (2,2 ± 0,2) x Ю"8М

Ki (КАЧ I) (3,8 ± 0,4) x Ю"8М Kj (КАЧ II) (9,3 ± 0,9) x 10"10M ^ (КАЧ IX) (3,1 ± 0,2) x Ю-9М

Рисунок 2.2. Структуры и ингибиторный профиль соединений 3и и 6б.

Кроме этого, мы обратили внимание на факт обращения селективности между II и IX изоформами КАЧ, наблюдающийся для производных 3у и 6д. Так, соединение 3у обладало субнаномолярной активностью в отношении цитозольной КАЧ II. При этом значение К (КАЧ IX) для данного соединения соответствовало (2,6 ± 0,3) х 10-7М, а Ki (КАЧ I) - (3,4 ± 0,3) х 10-6М. В то же время, изомерное соединение 6д продемонстрировало селективность в

о

отношении IX изоформы фермента (К (КАЧ IX) (1,2 ± 0,1) х и в этом

случае К (КАЧ II) и К (КАЧ I) находились в области 10-7-10-6М (рисунок 2.3).

К| (КАЧ I) (3,4 ± 0,3) х Ю"6М К; (КАЧ II) (7,4 ± 0,7) х 10ИОМ К| (КАЧ IX) (2,6 ± 0,3) х Ю"7М

К; (КАЧ I) (1,0 ± 0,1) х Ю"6М К; (КАЧ II) (2,7 ± 0,3) х Ю_7М К| (КАЧ IX) (1,2 ± 0,1) х 10"8М

Рисунок 2.3. Структуры и ингибиторный профиль соединений 3у и 6д.

Приведенные случаи свидетельствуют о том, что изучение серий соединений, характеризующихся изомерным расположением заместителей вокруг одной базовой структуры, может предоставлять дополнительную информацию о специфике взаимосвязи «структура-активность» в отношении отдельных типов КАЧ, а также повысить шансы на идентификацию изоформно-селективных ингибиторов данного фермента. Создание серий соединений с использованием такого рода изменения скаффолда (scaffold

hopping) может быть одним из принципов дизайна скрининговых библиотек для поиска ингибиторов КАЧ.

Таким образом, дизайн, синтез и скрининг разнообразных сульфонамидсодержащих производных 1,2,4-оксадиазола с целью создания изоформно-селективных ингибиторов КАЧ позволил обнаружить ряд потентных избирательных ингибиторов II и IX типов фермента, которые являются валидированными мишенями для терапии ряда заболеваний. Сравнение двух типов структур, характеризующихся различным расположением заместителей вокруг 1,2,4-оксадиазольного цикла, позволило обнаружить ряд интересных особенностей взаимосвязи «структура-активность». В частности, на основании полученных результатов, нами был сделан вывод о целесообразности дизайна скрининговых серий с включением соединений, изомерных с точки зрения взаимного расположения заместителей вокруг базовой структуры. Использование данного приема в дизайне скрининговых серий может способствовать наиболее полной реализации потенциала того или иного скаффолда в области создания изоформно-селективных ингибиторов КАЧ.

2.2 Создание изоформно-селективных ингибиторов карбоангидразы человека на основе производных имидазолина

В продолжение поиска изоформно-селективных ингибиторов КАЧ, нами была изучена серия полученных ранее в нашей группе производных 2-арилимидазолина 10а-о, содержащих 4-сульфамоилфенильный заместитель при атоме азота [197].

2.2.1 Изучение ингибиторной активности производных 1-(4-сульфамоилфенил)-2-арилимидазолина

Выбранные соединения 10а-о содержали первичную сульфонамидную группу, способную выступать в качестве цинк-связывающего фрагмента, а также два варьируемых заместителя в положениях 2 и 4 имидазолинового цикла. Серия была протестирована на панели из четырех изоформ КАЧ, включающей КАЧ I и КАЧ II, а также КАЧ IV и КАЧ VII, которые распространены в головном мозге и привлекают внимание в связи с их вовлеченностью в ряд патологических процессов (Таблица 2.3).

Таблица 2.3. Ингибиторный профиль производных имидазолина 10а-о, содержащих арилсульфонамидный фрагмент в положении 1 гетероциклического ядра.

Соединение Аг ° /=\ Н НгМ-Э—(\ /)—N 1 о ю к

Аг R К м

КАЧ I КАЧ II КАЧ IV КАЧ VII

10а 4^СбН4 Н (2,3 ± 0,2) х 10-6 (7,6 ± 0,8) х 10-8 (9,7 ± 0,9) х 10-6 (3,0 ± 0,3) х 10-7

10б 4-С1С6Н4 Н (9,6 ± 0,9) х 10-7 (4,7 ± 0,5) х 10-8 (8,1 ± 0,8) х 10-6 (2,7 ± 0,3) х 10-7

10в 4-FC6H4 Ме (8,2 ± 0,8) х 10-7 (5,3 ± 0,5) х 10-8 (8,7 ± 0,9) х 10-6 (8,7 ± 0,9) х 10-8

10г 4-С1С6Н4 Ме (9,0 ± 0,9) х 10-7 (5,4 ± 0,5) х 10-8 (6,8 ± 0,7) х 10-6 (7,0 ± 0,7) х 10-7

10д 3-ВгСбН4 Н (1,8 ± 0,2) х 10-6 (5,3 ± 0,5) х 10-8 (5,0 ± 0,5) х 10-6 (2,1 ± 0,2) х 10-7

10е 3-ВгСбН4 Ме (1,3 ± 0,1) х 10-6 (5,5 ± 0,5) х 10-8 (5,2 ± 0,5) х 10-6 (4,6 ± 0,5) х 10-7

10ж 3-FC6H4 Н (3,2 ± 0,3) х 10-6 (7,6 ± 0,8) х 10-8 >10,0 х 10-6 (3,1 ± 0,3) х 10-7

10з 3-МеС6Н4 Н (3,9 ± 0,4) х 10-6 (1,1 ± 0,1) х 10-7 (9,8 ± 0,9) х 10-6 (9,1 ± 0,9) х 10-7

10и 3-С1СбН4 Н (1,7 ± 0,2) х 10-6 (1,9 ± 0,2) х 10-7 (5,7 ± 0,6) х 10-6 (2,0 ± 0,2) х 10-7

10к 3-F-4-MeOC6Hз Н (1,2 ± 0,2) х 10-6 (8,1 ± 0,8) х 10-8 (8,3 ± 0,8) х 10-6 (7,1 ± 0,7) х 10-7

10л 4-F-3-MeOC6Hз Н (2,2 ± 0,2) х 10-6 (6,2 ± 0,6) х 10-8 (4,3 ± 0,2) х 10-6 (2,6 ± 0,3) х 10-7

10м 3-С1-4-МеОС6Н3 Н (4,0 ± 0,4) х 10-6 (2,3 ± 0,2) х 10-7 >10,0 х 10-6 (1,0 ± 0,1) х 10-6

10н 3,4^6^ Н (7,5 ± 0,7) х 10-7 (3,5 ± 0,3) х 10-8 (5,4 ± 0,5) х 10-6 (7,1 ± 0,7) х 10-8

10o 4-CI-3-CF3C6H3 H (3,7 i 0,2) х l0-6 (8,4 i 0,8) х l0-8 (3,9 i 0,4) х l0-6 (3,3 i 0,3) х l0-8

Ацетазоламид (2,5 i 0,2) х l0-7 (l,2 i 0,l) х l0-8 (7,4 i 0,9) х l0-8 (6,0 i 0,6) х l0-9

Результаты тестирования показали, что изученные соединения 10а-о проявляют низкую активность в отношении КАЧ IV. Так, для всех протестированных производных 10 К (КАЧ IV) лежали в области 10-6М и выше. Кроме того, большинство исследованных веществ проявили микромолярную, либо, в некоторых случаях (10б-г, 10н), субмикромолярную активность в отношении КАЧ I. Напротив, ингибиторная активность

протестированных соединений против КАЧ II оказалась в основном на

-о

уровне 10" М. Следует отметить понижение значений К (КАЧ II) в ряду соединений 10ж-и, содержащих соответственно 3-фтор-, 3-метил- и 3-хлорфенильный заместители, а также еще более низкую активность производного 10м, включающего 4-метокси-3-хлорфенильный фрагмент. Наиболее разнообразный ингибиторный профиль изученные соединения проявили в отношении КАЧ VII. В частности, только данный тип фермента оказался чувствительным к присутствию метильной группы в положении 4 имидазолинового цикла ингибиторов. Это проявилось в возрастании на один порядок активности соединений 10г, 10в и 10е, по сравнению с аналогами

10а, 10б, 10д, не содержащмим данного заместителя. Кроме того,

-о

активностью на уровне 10 М обладали вещества 10н и 10о (Аг = 3,4-Р2С6Н3 и 4-Q-3-CF3C6H3 соответственно). В целом, из результатов тестирования можно видеть, что изученная серия содержала соединения, проявляющие сравнительно высокую активность в отношении цитозольных изоформ КАЧ II и КАЧ VII, в некоторых случаях проявляющих избирательность в отношении II изоформы фермента. Также для изученных производных имидазолина 10 характерно низкое ингибиторное действие на цитозольную КАЧ I и мембранносвязанную КАЧ IV.

2.2.2 Дизайн, синтез и изучение ингибиторного профиля производных 1-арил(гетероарил)-2-(4-сульфамоилфенил)-имидазолина

Опираясь на выводы, сделанные нами в ходе изучения производных 1,2,4-оксадиазола, мы приняли решение применить прием изменения скаффолда и получить выборку альтернативно замещенных производных

имидазолина 11, с целью исследования возможного изменения ингибиторного профиля соединений (рисунок 2.4).

10 11

Рисунок 2.4. Дизайн серии альтернативно-замещенных производных имидазолина 11 с использованием приема изменения скаффолда.

Для получения структур типа 11, в которых арилсульфонамидный

фрагмент расположен в положении 2 гетероциклического ядра, был выбран

недавно предложенный нашей научной группой протокол ^-арилирования

имидазолинов бороновыми кислотами по Чену-Эвансу-Ламу [198].

Исходный имидазолин 12, содержащий (бис)диметоксибензил-

защищенную сульфонамидную группу был получен в три стадии, согласно

схеме 2.8.

Схема 2.8

13 14 12

Условия: а) фМВ)2МН, СН2С12, комнатная температура, 12ч.; б) CS2, 120 °С, 2ч.

^-Арилирование имидазолина 12 различными арилбороновыми кислотами по Чену-Эвансу-Ламу проводилось в открытом сосуде в растворе ДМСО, в присутствии Си(ОАс)2 и К2С03. Продукты арилирования 15а-и далее обрабатывались ТФУК в растворе СН2С12 с целью снятия бис-диметоксибензильной защитной группы и получения целевых соединений 11а-и, содержащих первичную сульфонамидную группу (схема 2.9) (Перечень заместителей Аг, Het см. в таблице 2.4) [199].

О,

<\ 1\1(0МВ)2

Схема 2.9 „мн,

О л

(НеОАгВ(ОН)2

6

52-68%

а

33-43%

Аг(Не1) 15а-и

Аг(Не1)

11а-и

Условия: а) Си(ОАс)2 (1,5 экв), К2С03 (2,5 экв.), ДМСО, комнатная температура, 24ч. б) ТФУК, СН2С12, 0 °С, 0,5ч.

Ингибиторная активность полученных таким образом соединений 11а-

и была изучена на панели четырех изоформ КАЧ, включавшей изоформы I,

II, IV, VII (таблица 2.4).

Таблица 2.4. Выходы и ингибиторный профиль производных имидазолина 11а-и, содержащих арилсульфонамидный фрагмент в положении 2 гетероциклического ядра.

Соединение О 4—/ N (НеЦАг 11

(Ш)Лг Выход,% К М

КАЧ I КАЧ II КАЧ IV КАЧ VII

11а 4-FC6H4 60 (4,6 ± 0,5) х 10-7 (7,4 ± 0,7) х 10-7 (1,0 ± 0,1) х 10-6 (9,4 ± 0,9) х 10-9

11б 4-С1С6И4 65 (4,5 ± 0,5) х 10-7 (1,9 ± 0,2) х 10-7 (6,1 ± 0,6) х 10-7 (9,6 ± 0,9) х 10-10

11в Ph 53 (4,7 ± 0,5) х 10-7 (3,8 ± 0,4) х 10-7 (3,9 ± 0,4) х 10-6 (6,8 ± 0,7) х 10-9

11г 4-МеОС6И4 64 (3,2 ± 0,3) х 10-7 (5,4 ± 0,5) х 10-8 (3,6 ± 0,4) х 10-6 (9,7 ± 0,9) х 10-10

11д 3,4-(МеО)2СбИ4 68 (8,5 ± 0,8) х 10-7 (7,2 ± 0,7) х 10-7 (8,3 ± 0,8) х 10-6 (8,7 ± 0,9) х 10-10

11е 2-МеС6И4 63 (7,1 ± 0,7) х 10-8 (6,2 ± 0,6) х 10-8 (9,6 ± 0,9) х 10-7 (9,3 ± 0,9) х 10-10

11ж 2-ЕЮСбИ4 52 (2,2 ± 0,2) х 10-7 (8,7 ± 0,9) х 10-7 (2,3 ± 0,2) х 10-6 (8,4 ± 0,8) х 10-10

11з 3-Ру 58 (3,2 ± 0,3) х 10-7 (8,5 ± 0,9) х 10-7 (1,8 ± 0,1) х 10-6 (8,4 ± 0,8) х 10-10

11и Пиримидин-5-ил 64 (2,8 ± 0,3) х 10-7 (7,0 ± 0,7) х 10-7 (2,3 ± 0,2) х 10-6 (8,3 ± 0,8) х 10-10

Ацетазоламид (2,5 ± 0,2) х 10-7 (1,2 ± 0,1) х 10-8 (7,4 ± 0,7) х 10-8 (6,0 ± 0,6) х 10-9

Полученные результаты позволили установить, что активность соединений 11а-и в отношении КАЧ IV оказалась на уровне 10-6М, как и в случае веществ 10а-о. Способность к ингибированию КАЧ II для многих соединений 11а-и снизилась по сравнению с аналогами из серии 10а-о: ряд производных обладал К в области концентраций 10" М. Аналогичный уровень активности соединения 11а-д, 11ж-и продемонстрировали в отношении изоформы I КАЧ. Наиболее же примечательным является тот факт, что синтезированные соединения 11б-и являются субнаномолярными ингибиторами КАЧ VII. Активность 11б-и в отношении этого типа фермента существенно превышает таковую для аналогов из серии 10. Таким образом, полученные вещества обладают выраженной селективностью в отношении КАЧ VII, являющейся перспективной мишенью для терапии ряда заболеваний ЦНС [93, 94].

Привлекает внимание факт обращения селективности между производными, характеризующимися изомерным расположением заместителей вокруг имидазолинового ядра. В частности, для соединений 10а,б и альтернативно замещенных 11а,б наблюдается существенное изменение профиля селективности (Рисунок 2.5).

Рисунок 2.5. Структуры и индексы селективности SI в отношении КАЧ VII для некоторых производных 10 и 11.

Так, из Рисунка 2.5 видно, что при переходе от 10а к альтернативно

замещенному производному имидазолина 11а наблюдается рост

селективности в отношении к КАЧ VII, в особенности заметно падение

активности против КАЧ II. Еще более выраженное изменение ингибиторного

профиля можно отметить при переходе от 10б к аналогу 11б. Следует

подчеркнуть, что целый ряд соединений типа 11 продемонстрировал

избирательное действие в отношении КАЧ VII, в том числе еще большими

индексами селективности характеризовались соединения 11д и 11ж.

2.2.3 Докинг сульфонамидсодержащих производных 2-арилимидазолина

С целью объяснить влияние смены положения заместителей на ингибиторный профиль соединений, нами был проведен докинг молекул 10а,б и 11а,б в активные сайты соответствующих изоформ фермента. На Рисунке 2.6 показано взаимодействие молекулы 10б с изоформами КАЧ I, II, IV и VII. Из результатов докинга можно видеть близкие ориентации

соединения 10б в активных центрах соединение всех четырех изоформ: сульфонамидная группа координирована с простетическим ионом Zn2+, а также образует две водородные связи с остатком Thr; имидазолиновый цикл в активных центрах КАЧ I, IV VII расположен одинаковым образом и контактирует с гидрофобными остатками Leu (в случае КАЧ IV - Ile) и Leu (рисунок 2.6А-В). В активном центре КАЧ II вследствие присутствия Ile91 и Phe130 имидазолиновое ядро соединения 10б сдвинуто на 3Â в сторону данных аминокислотных остатков; 4-хлорфенильный заместитель ориентирован в объем растворителя (рисунок 2.6Г).

Рисунок 2.6. Полученные в результате докинга структуры комплексов А) КАЧ I-106, Б) КАЧ II-106, В) КАЧ IV-106, Г) КАЧ VII-106.

Вероятная ориентация соединения 11а в комплексах с КАЧ I, II и IV близка к таковой для ингибитора 10a с тем отличием, что липофильные контакты с аминокислотными остатками гидрофобной поверхности активных сайтов ослаблены за счет присутствия в этом случае атома N(3) на позиции

алифатической части цикла (рисунок 2.7А-В). Однако, в случае КАЧ VII (рисунок 2.7Г) поза связывания 11а в активном сайте отличается от 10а кардинальным образом. Это объясняется доступностью атома N(3) гетероциклического ядра для образования водородной связи с неконсервативным остатком Gln69. Следствием такого дополнительного взаимодействия с поверхностью белка является переориентация 4-хлорфенильного остатка в направлении липофильной полости в структуре активного центра, образованной остатками Leu143, Leu200 и Phe133 и существенно более выраженное сродство 11а к VII изоформе фермента (Рисунок 2.7).

Рисунок 2.7. Полученные в результате докинга структуры комплексов А) КАЧ !-11б, Б) КАЧ П-11б, В) КАЧ ^-11б, Г) КАЧ ШЫ1б.

Справедливость данного суждения была подтверждена при помощи симуляции молекулярной динамики для комплекса КАЧ УП-Иа. Эксперимент показал, что структура комплекса оказалась стабильной в пределах отклонений 0.2 - 0.5 А в ходе симуляции 11 нсек молекулярной динамики, при этом водородная связь между атомом азота N(3) имидазолинового цикла и остатком Gln69 сохранялась в течение более 90% моделируемого периода (рисунок 2.8).

А / ; Б

4oi 1200/ 81 Зв

—■—I—'—|—'—| ■ |—■—г—•—|—'—I—■—1—■—|—■—т—■— 012)456789 10 11

Время, наносск

Рисунок 2.8. Результаты симуляции молекулярной динамики комплекса КАЧ VII-11а. A) структура комплекса КАЧ VII-11а с минимальной энергией. Б) Анализ молекулярной динамики тяжёлых атомов рецептора и лиганда в ходе симуляции.

Таким образом, изменение расположения заместителей относительно базовой структуры позволило соединению 11а занять внутри активного сайта целевой изоформы положение, при котором атом азота N(3) способен связываться с неконсервативным аминокислотным остатком, отличающим данный тип КАЧ. В совокупности с переориентацией гидрофобного хлорфенильного заместителя в направлении липофильной полости, это привело к повышению селективности в отношении КАЧ VII на несколько порядков.

Результат предпринятого дизайна и синтеза альтернативно замещенной серии сульфонамидсодержащих производных имидазолина представляется весьма ценным, поскольку в подавляющем большинстве случаев ингибирование КАЧ VII малыми молекулами при субнаномолярных и наномолярных концентрациях сопровождается побочным действием на I и II

изоформы фермента [93]. Высокая избирательность соединений 11 подтвердила целесообразность использованного подхода к дизайну скрининговых серий для поиска изоформно-селективных ингибиторов КАЧ.

2.3 Дизайн и синтез селективных ингибиторов IV изоформы

карбоангидразы человека

Результаты, описанные в разделах 2.1 и 2.2, свидетельствуют о наличии для ингибиторов КАЧ характерных сложных взаимосвязей «структура-активность», которые затруднительно проанализировать a priori. С другой стороны, невысокая предсказуемость результатов при применении подхода к созданию ингибиторов КАЧ, базирующегося на скрининге серий сульфонамидсодержащих соединений, является весьма существенным фактором, сдерживающим развитие данной области медицинской химии. Выше нами было показано, что помимо варьирования молекулярной периферии, прием изменения скаффолда может быть продуктивным для поиска веществ, избирательно действующих на тот или иной тип КАЧ, однако очевидно, что его использование никоим образом не снижает актуальности внедрения рациональных инструментов дизайна изоформно-селективных ингибиторов.

На наш взгляд наиболее надежные результаты рационального дизайна могут быть получены в пределах хемотипа, для которого уже накоплены данные о взаимосвязи «структура-активность» в отношении целевой изоформы. Информация такого рода может быть собрана в результате исследования даже весьма небольшой серии соединений и использована для моделирования производных, формирующих дополнительные контакты с неконсервативными аминокислотными остатками в активном сайте соответствующего типа фермента. Необходимые для улучшения свойств структурные модификации в этом случае могут быть определены на основе поз связывания наиболее активных соединений. При этом следует помнить, что после определения направления желательных модификаций неизбежно возникает проблема их синтетической реализуемости.

Многие типы структур, включая рассмотренные выше производные 1,2,4-оксадиазола (3, 6) и имидазолина (10, 11), предоставляют весьма ограниченное пространство для видоизменения молекулы с целью

улучшения заданных свойств. Существенно более привлекательными с этой точки зрения, по нашему мнению, являются продукты многокомпонентных реакций, т.к. синтетические подходы, используемые для их получения, позволяют независимо варьировать различные элементы, как молекулярной периферии, так и самой базовой структуры.

Руководствуясь данными соображениями мы рассмотрели возможность создания новых серий соединений на основе реакции Кастаньоли-Кушмана, представляющей собой взаимодействие аминов и альдегидов (часто, в составе основания Шиффа) с циклическими ангидридами дикарбоновых кислот, приводящее к соответствующим лактамам [200]. На Рисунке 2.9 приведен возможный дизайн двух изомерных серий сульфонамидсодержащих лактамов 16 и 17, для одной из базовых структур показано разнообразие точек, доступных для структурной модификации.

бсычн,

Рисунок 2.9. Сульфонамидсодержащие лактамы доступные по реакции Кастаньоли-Кушмана и фрагменты структуры, доступные для модификации.

Очевидно, что дизайн скрининговой серии на основе данного синтетического подхода с учетом получения альтернативно замещенных структур, позволил бы получить два типа соединений, в каждом из которых возможно независимо варьировать не менее 5 элементов, включая размер лактамного цикла, природу гетероатомов, и заместителей. Структуры, обладающие столь обширными возможностями для вариации, способны предоставить существенную свободу для рационального конструирования изоформно-селективных ингибиторов и по этой причине были выбраны нами для создания новой серии, целью которой стало получение информации о

5

4

з

16

17

взаимосвязи структура активность в отношении мембранносвязанной КАЧ IV.

2.3.1 Синтез сульфонамидсодержащих лактамов, доступных по реакции

Кастаньоли-Кушмана

Прямое введение сульфонамидсодержащих аминов или альдегидов в

составе оснований Шиффа типа 18а,б в реакцию с циклическими

ангидридами дикарбоновых кислот оказалось нереализуемо, по-видимому, в

связи с выраженными электронакцепторными свойствами сульфонамидного

заместителя, неблагоприятными для протекания процесса [201] (схема 2.10).

Схема 2.10

Условия: а) 180 °С, сплавление, 12ч.; б) Толуол, 150 °С, 12ч, в) ДМФА, микроволновое инициирование, 150 °С, 12ч.

По этой причине получение целевых сульфонамидсодержащих

производных 16, 17 было осуществлено в результате постконденсационного введения сульфонамидной группы в соответствии со схемами 2.11, 2.12. Для этого основания Шиффа 22а-е, 26а-е содержащие меркаптобензильную группу и получаемые по литературной методике [201] с использованием соответствующих альдегидов 20, 25а-е и аминов 21а-е, 24, (см. приложение 1) вводились в реакцию Кастаньоли-Кушмана за счет сплавления с соответствующими ангидридами 19а-в. Для удобства выделения, карбоксильная группа в образующихся лактамах переводилась в

сложноэфирную кипячением в метаноле в присутствии SOQ2 с получением продуктов 23а-з, 27а-з. Меркаптобензильная группа в соединениях 23а-з, 27а-з окислялась до сульфохлорида под действием ^-хлорсукцинимида в уксусной кислоте. Дальнейшая обработка аммиаком позволяла получить

сульфонамидсодержащие лактамы 16а-з, 17а-з (схемы 2.11, 2.12) (Перечень

1 2

заместителей Я1, Я см в таблице 2.5).

Схема 2.11

А

1Ч1МН2 СГ^О^О Ме02С Ме02С

N

21а-е М 19а-в

а II \ 6,в

87-98% Вп 16-31%

Т К 34-49% П К

О о

22а-ж 23а-з 16а-з

Условия: а) г-РгОН, TsOH, 60°С, 4ч.; б) расплав, 150 °С, 16ч.; в) SOa2 (2,5 экв.), МеОН, 0^-60 °С, 12ч.; г) ^-хлорсукцинимид (3,0 экв.), АсОН, комнатная температура, 1ч.; д) КН3(водный), МеСК, комнатная температура, 1ч.

Схема 2.12

ми , о2 Ме02с Ме02С

25а-е „ ^ ^а-в хЛ ^ Х^ ^

а II А 6,в г,д 1М

87-98% ВпБ ^^ 17-33% п Н .1 41-48% г,

26а-е 27а-з 17а-з

Условия: а) /-РгОН, TsOH, 60 °С, 4ч.; б) расплав, 150 °С, 16ч.; в) SOa2 (2,5 экв.), МеОН, 0^60 °С, 12ч.; г) ^-хлорсукцинимид (3,0 экв.), АсОН, комнатная температура, 1ч.; д) КН3(водный), МеСК, комнатная температура, 1ч.

2.3.2 Изучение ингибиторного профиля сульфонамидсодержащих лактамов, доступных по реакции Кастаньоли-Кушмана

Полученные таким образом серии соединений 16а-з, 17а-з выделенных

в виде рацемической смеси транс-изомеров, были протестированы на панели

терапевтически релевантных изоформ КАЧ, включающих I, II, IV и VII типы

фермента (таблица 2.5).

Таблица 2.5. Выходы и ингибиторный профиль сульфонамидсодержащих лактамов, полученных по реакции Кастаньоли Кушмана.

Соединение x Rl R2 Выход, % К М

КАЧ I КАЧ II КАЧ IV КАЧ VII

16а Отсутствует 4-МеОС6Н4 - 43 (4,4 ± 0,4) х 10-7 (1,8 ± 0,2) х 10-8 (8,9 ± 0,9) х 10-7 (4,3 ± 0,4) х 10-8

16б Отсутствует 4-С1С6Н4 - 49 (5,0 ± 0,5) х 10-7 (1,6 ± 0,2) х 10-7 (8,7 ± 0,9) х 10-6 (2,9 ± 0,3) х 10-8

16в Отсутствует 4-вгс6н4 - 37 (8,0 ± 0,8) х 10-7 (8,7 ± 0,9) х 10-9 (9,7 ± 0,9) х 10-7 (3,0± 0,3) х 10-8

16г Отсутствует Et - 39 (7,6 ± 0,8) х 10-7 (3,8 ± 0,4) х 10-8 (5,4 ± 0,5) х 10-7 (4,8 ± 0,5) х 10-8

16д Отсутствует /-Рг - 46 (7,3± 0,7) х 10-7 (2,8 ± 0,3) х 10-8 (4,3 ± 0,4) х 10-7 (5,6 ± 0,6) х 10-8

16е ^Мя /-Рг - 44 (4,8 ± 0,5) х 10-7 (9,4 ± 0,9) х 10-8 (4,3 ± 0,4) х 10-7 (8,5 ± 0,8) х 10-8

16ж ^Мя 3,4-а2СбНз - 46 (8,2 ± 0,8) х 10-7 (5,2 ± 0,5) х 10-9 (5,2 ± 0,5) х 10-7 (8,5 ± 0,8) х 10-8

16з О /-Рг - 34 (6,2 ± 0,6) х 10-7 (9,1 ± 0,9) х 10-6 (9,7 ± 0,9) х 10-6 (5,5 ± 0,5) х 10-8

17а Отсутствует - 4-МеС6Н4 44 (5,1 ± 0,5) х 10-8 (4,8± 0,5) х 10-9 (7,2 ± 0,7) х 10-8 (4,9 ± 0,5) х 10-8

17б Отсутствует - Ph 41 (8,2 ± 0,8) х 10-8 (6,1 ± 0,6) х 10-8 (9,6 ± 0,9) х 10-7 (7,9 ± 0,8) х 10-8

17в Отсутствует - 4-МеОС6Н4 43 (9,1 ± 0,9) х 10-9 (4,9 ± 0,9) х 10-9 (4,4 ± 0,4) х 10-7 (8,2 ± 0,8) х 10-8

17г Отсутствует - 4-С1С6Н4 48 (9,2 ± 0,9) х 10-9 (3,7 ± 0,4) х 10-9 (9,6 ± 0,9) х 10-9 (3,4 ± 0,3) х 10-8

17д Отсутствует - 4-FC6H4 45 (3,5 ± 0,3) х 10-7 (2,6 ± 0,3) х 10-9 (8,1 ± 0,8) х 10-8 (8,6 ± 0,9) х 10-8

17е ^Мя - 3,4-СЬСбНз 44 (5,1 ± 0,5) х 10-7 (6,5 ± 0,6) х 10-8 (7,1 ± 07) х 10-7 (6,5 ± 0,6) х 10-8

17ж ^Мя - 4-МеС6Н4 42 (9,1 ± 0,9) х 10-8 (5,6 ± 0,6) х 10-8 (7,8 ± 0,8) х 10-7 (7,9 ± 0,8) х 10-8

17з О - 4-МеС6Н4 42 (8,9 ± 0,9) х 10-9 (3,8 ± 0,4) х 10-9 (6,1 ± 0,6) х 10-7 (7,9 ± 0,8) х 10-8

Ацетазоламид (2,5 ± 0,2) х 10-7 (1,2 ± 0,1) х 10-8 (7,4 ± 0,7) х 10-8 (6,0 ± 0,6) х 10-9

Из таблицы 2.5 видно, что полученные соединения продемонстрировали разнообразный профиль активности. Так, структуры 16а-з проявили выраженное ингибиторное действие против II и VII изоформ КАЧ. В частности, соединения 16в и 16е обнаружили ингибиторную активность против II изоформы КАЧ в области 10-9М. К! КАЧ VII соединений 16а-з оказались на уровне 10 М. Активность против I и IV изоформ для соединений данного типа лежала в пределах 10"6-10"7М.

Альтернативно замещенные соединения 17а-з продемонстрировали более высокую активность против всех четырех изоформ. Среди них были идентифицированы наномолярные ингибиторы КАЧ I (17в, 17г, 17з), и КАЧ II (17а, 17д, 17з). Активность против VII изоформы фермента, как и для соединений 16а-з оказалась на уровне 10 М. Наконец, особенно выделяется соединение 17г (Метил (2^^,3^5)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоксилат), обладающее наномолярной ингибиторной активностью в отношении целевой IV изоформы КАЧ. Данное соединение мы сочли привлекательным для использования в качестве структуры-прототипа в ходе рационального дизайна ингибиторов КАЧ, обладающих селективностью по отношению к данному типу фермента.

2.3.3 Дизайн изоформно-селективных ингибиторов IV изоформы карбоангидразы человека на основе метил (2^^,3^5)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоксилата

Для определения направлений структурной модификации неселективного прототипа 17г с целью повышения избирательности и активности в отношении КАЧ IV, был предпринят докинг R,R- и S,S-энантиомеров 17г в активный сайт данного фермента. Результаты исследования показали, что вблизи сайтов связывания обоих энантиомеров 17г располагается гидрофильная область поверхности каталитической полости, сложенная остатками Lys91, Glu132, Glu140, Lys206, Аяр204 и ТЫ"202. Данный полярный регион характерен именно для целевой IV изоформы КАЧ и не встречается в других изоформах (рисунок 2.10).

/

СШ140 * С1Ш23

\ ' ь

Г Б

ОиМО

Ои123

в

Рисунок 2.10 . Поза связывания внутри активного сайта КАЧ IV а) б) 5,,5'-17г; в) характерная гидрофильная область поверхности активного сайта КАЧ IV.

Было предположено, что введение в структуру хит-соединения дополнительных полярных или ионизирующихся центров может привести к образованию дополнительных связей с указанным регионом активного сайта. В качестве точки вариации для проведения данной модификации была выбрана сложноэфирная группа. Замена последней на карбоксамидную функцию предположительно позволяла сориентировать вводимые заместители в направлении целевого региона поверхности белка в случае как R,R-, так и ^-энантиомера 17г.

Таким образом, дизайн и синтез скрининговой серии сульфонамидсодержащих лактамов, доступных по реакции Кастаньоли-Кушмана, позволил получить ряд разнообразных соединений, активных в отношении КАЧ и предоставляющих обширную информацию об особенностях взаимосвязи «структура-активность» для данной области химического пространства, на основании которой оказалось возможным выдвинуть гипотезу о необходимых структурных модификациях, способных привести к улучшению целевой биологической активности молекулы.

2.3.4 Синтез амидных производных (2R5,,3R5)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-карбоновой кислоты

Для проверки гипотезы, сформулированной на основании результатов докинга соединения 17г в активный сайт КАЧ IV, была синтезирована серия

амидных производных 28а-ч. С этой целью предварительно была получена кислота 29. Сочетание последней с различными аминами с использованием КДИ в ДМФА приводило к получению амидов 28а-т. Кроме того, некоторые производные 28и-н, в структуре которых присутствовали простые и сложные эфирные группы были подвергнуты гидролизу с целью получения

соединений 28у-ч, содержащих гидрофильные и ионизирующиеся

1 2

функциональные группы (Схема 2.13) (Перечень заместителей см. в

таблице 2.6).

Схема 2.13

С1

а

73-88%

т

МК1К2 28И-Н

28у, X =

*—N14 ОН

н

28ф, X = „М^^ОН

28х' х= ,.М^/С02Н 28ц, X = ._мн С02Н

28ч, X =

Условия: а) LiOH (3,0 экв.), МеОН, 50 °С, 5ч. б) КДИ (1,15 экв.), ДМФА, комнатная температура, 12 ч.

2.3.5 Изучение ингибиторного профиля амидных производных (2&$,,3&$)-5-оксо-1-(4-сульфамоилфенил)-2-(4-хлорфенил)пирролидин-3-

карбоновой кислоты

Ингибиторная активность полученных содеинений 28a-ч была изучена

на панели ферментов, включающей изоформы I, II, IV, VII КАЧ. Результаты

тестирования приведены в таблице 2.6.

Таблица 2.6. Выходы и ингибиторный профиль соединений 28а-ч.

Соединение Ш.Д2 Выход, % К м

КАЧ I КАЧ II КАЧ IV КАЧ VII

28а мн2 45 (9,4 ± 0,9) х 10-7 (5,7 ± 0,6) х 10-8 (6,9 ± 0,7) х 10-8 (6,9 ± 0,7) х 10-8

28б чо 59 (3,3 ± 0,3) х 10-6 (3,0 ± 0,3) х 10-8 (8,5 ± 0,9) х 10-8 (9,6 ± 0,9) х 10-8

28в 56 (3,1 ± 0,3) х 10-7 (7,8 ± 0,8) х 10-9 (3,1 ± 0,3) х 10-8 (3,4 ± 0,3) х 10-8

28г о« 40 (2,6 ± 0,3) х 10-7 (4,6 ± 0,5) х 10-9 (2,2 ± 0,2) х 10-8 (1,9 ± 0,2) х 10-8

28д 65 (8,2 ± 08) х 10-7 (4,5 ± 0,4) х 10-9 (4,7 ± 0,5) х 10-9 (5,8 ± 0,6) х 10-8

28е *-МН /=х 60 (2,1 ± 0,3) х 10-6 (1,6 ± 0,2) х 10-9 (2,1 ± 0,2) х 10-9 (5,8 ± 0,6) х 10-9

28ж . 1 н 42 (2,9 ± 0,3) х 10-7 (2,0 ± 0,2) х 10-8 (1,2 ± 0,1) х 10-9 (1,8 ± 0,2) х 10-8

28з * Н 1 64 (9,6 ± 0,9) х 10-7 (8,9 ± 0,7) х 10-9 (5,2 ± 0,5) х 10-10 (9,5 ± 0,9) х 10-9

28и *—N14 оД 4—/ О 66 (1,1 ± 0,1) х 10-6 (1,3 ± 0,1) х 10-8 (5,9 ± 0,6) х 10-10 (4,7 ± 0,5) х 10-8

28к н О 66 (5,1 ± 0,5) х 10-6 (8,5 ± 0,8) х 10-9 (1,8 ± 0,2) х 10-9 (8,6 ± 0,9) х 10-8

28л н и 54 (5,0 ± 0,5) х 10-7 (3,4 ± 0,3) х 10-9 (2,4 ± 0,2) х 10-9 (4,8 ± 0,5) х 10-9

28м *—NH 0 54 (6,5 ± 0,6) x 10-7 (7,5 ± 0,7) x 10-9 (1,0 ± 0,1) x 10-9 (4,6 ± 0,5) x 10-8

28н н N 49 (1,1 ± 0,1) x 10-7 (3,5 ± 0,3) x 10-8 (6,5 ± 0,7) x 10-9 (6,9 ± 0,7) x 10-8

28о H о> 64 (5,2 ± 0,5) x 10-7 (5,9 ± 0,6) x 10-9 (6,1 ± 0,6) x 10-10 (5,6 ± 0,6) x 10-9

28п Ч/О 58 (1,0 ± 0,1) x 10-7 (6,7 ± 0,7) x 10-9 (1,5 ± 0,1) x 10-9 (7,0 ± 0,7) x 10-8

28р Y^O 60 (7,2 ± 0,7) x 10-7 (4,1 ± 0,4) x 10-8 (8,9 ± 0,9) x 10-10 (1,8 ± 0,2) x 10-7

28с Н г^м 63 (7,8 ± 0,8) x 10-6 (3,3 ± 0,3) x 10-8 (6,6 ± 0,7) x 10-10 (3,0 ± 0,3) x 10-7

28т Н ON. 58 (7,5 ± 0,7) x 10-7 (9,5 ± 0,9) x 10-9 (3,9 ± 0,4) x 10-10 (3,5 ± 0,3) x 10-8