Динамика показателей иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактариозах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Кочурко, Людмила Ивановна

• Кочурко, Людмила Ивановна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кочурко, Людмила Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Нормальная микрофлора кишечника человека

2.2. Дисбактериозы кишечника

2.3. Структура и биологическая активность эндотоксина грам-отрицательных бактерий

2.4. Факторы клеточного и гуморального иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий

2.5. Состояние антиэндотоксинового иммунитета при различных патологических процессах

2.6. Заключение по обзору литературы

3. Материалы и методы исследований

4. Результаты исследований

4.1. Микробиологическая характеристика дисбактериозов кишечника

4.1.1. Частота выявления различных форм дисбактериоза кишеч-

ника

4.1.2. Частота выявления различных видов дисбактериоза кишечника при дефиците бифидо- и лактобактерий

4.1.3. Частота выявления различных дисбактериозов кишечника у людей, различающихся по содержанию типичных эшерихий

4.1.4.Плазмидный контроль продукции гемолизина у штаммов Escherichia coli, выделенных при дисбактериозах кишечника

4.2. Состояние иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при дисбактериозах кишечника

4.2.1.Динамика показателй антиэндотоксинового иммунитетапри дисбактериозах кишечника

4.2.2.Изучение зависимости показателей антиэндотоксинового иммунитета от вида дисбактериоза кишечника

5. Обсуждение полученных результатов

6. Выводы

7. Работы, опубликованные по теме диссертации

8. Список литературы

-:-4---

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Динамика показателей иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактариозах»

1. Введение

Актуальность проблемы. В связи с ухудшением экологических и социальных условий, а также с неконтролируемым применением антибиотиков и других антибактериальных препаратов в последние годы в стране отмечается довольно широкое распространение дисбактериозов, особенно дисбактериозов кишечника. Кишечный дисбактериоз обусловливает увеличенное поступление эндотоксина грамотрицательных бактерий из кишечника в воротную вену и системный кровоток, что может приводить к снижению общей резистентности организма и утяжелению различных патологических процессов. Существенное значение в этой ситуации имеет напряженность антиэндотоксинового гуморального и клеточного иммунитета, в частности, содержание циркулирующих антиэндотоксиновых антител и лейкоцитов, способных связывать эндотоксин.

В настоящее время известно, что при многих вирусных и бактериальных инфекциях и других заболеваниях активность антиэндотоксинового иммунитета снижается [Рудик А.А., 1988; Малов В.А.и др.,1993,1996; Пермяков Н.К. и др.,1995; Дмитриева Е.В. и др.,1995; Ющук Н.Д. и др.,1996; Яковлев М.Ю.и др.,1998]. Однако состояние иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при

дисбактериозах кишечника изучено недостаточно. Имеются лишь данные о снижении антиэндотоксинового иммунитета и развитии дисбактериоза кишечника у мышей после проникающей радиации [Яковлев М.Ю.и др.,1993; Лиходед В.Г. и др.,1994]. Это обстоятельство обусловливает необходимость изучения показателей

антиэндотоксинового иммунитета при дисбактериозах кишечника у человека.

Цель исследования - изучить динамику показателей иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактериозах у человека.

Задачи исследования:

1) определить динамику титров антиэндотоксиновых антител (антител к Ле-гликолипиду, входящему в состав эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий) при обнаружении кишечного дисбактериоза и после его коррекции пробиотиками и препаратами бактериофагов;

2) установить содержание полиморфноядерных лейкоцитов, связавших эндотоксин в циркулирующем кровотоке, при кишечных дисбактериозах в динамике;

3) определить наличие резервов связывания эндотоксина полиморфноядерными лейкоцитами при кишечных дисбактериозах;

4) сравнить показатели антиэндотоксинового иммунитета при различных формах кишечных дисбактериозов.

Научная новизна.

1. Установлено, что у лиц с дисбактериозами кишечника имеют место следующие изменения показателей иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий:

а) снижение титров антител к гликолипиду хемотипа Re, нейтрализующих биологическую активность эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий;

б) уменьшение количества полиморфноядерных лейкоцитов, связывающих эндотоксин в циркулирующем кровотоке при помощи Fc-зависимого механизма;

в) отсутствие лейкоцитов, способных к Fc-опосредованному связыванию эндотоксина in vitro, то-есть, отсутствие резервов Fc-зависимого связывания эндотоксина лейкоцитами.

2. Снижение антиэндотоксинового иммунитета не зависит от разновидности дисбактериоза кишечника.

7

3. При излечении дисбактериозов препаратами пробиотиков и бактериофагов наблюдается улучшение всех показателей антиэндотоксинового иммунитета.

4. При дисбактериозах кишечника часто обнаруживаются бактерии Escherichia coli, несущие плазмидные детерминанты синтеза гемолизина и способные к их передаче при конъюгации.

5. Повышенное содержание в кишечнике условно патогенных энтеробактерий, стафилококков, энтерококков и грибов при дисбактериозах не зависит от развития дефицита бифидо- и лактобактерий. В то же время высокое содержание в кишечнике гемолитических эшерихий при дефиците бифидо- и лактобактерий наблюдается чаще, чем при нормальном содержании этих анаэробных микроорганизмов.

Практическая ценность. Определение показателей антиэндотоксинового иммунитета может быть использовано для оценки эффективности коррекции дисбактериозов кишечника.

Работа выполнена в Научно-производственном центре Тидробиос" Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Министерстве здравоохранения Российской

и

Федерации и в бактериологической лаборатории филиала 2 ЦВКГ имени П.В.Мандрыки Министерства обороны.

2. Обзор литературы

Человек живет в огромном мире различных микроорганизмов, которые не только составляют его микроокружение, но и заселяют его кожные покровы и открытые полости тела, формируя различные микробиоценозы. Микроорганизмы, заселяющие кожные покровы и открытые полости тела здорового человека, получили название нормальной микрофлоры человека. Нормальной микрофлоре тела человека посвящено достаточно большое количество публикаций, обобщенных в ряде обзорных работ отечественных и зарубежных авторов [ Перетц Л.Г., 1955; Чахава О.В., 1972; Петровская В.Г., О.П.Марко, 1976; Блохина И.Н., В.Г.Дорофейчук, 1979; Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М., 1984 ; Шендеров Б.А., 1998; Rosebury Т., 1962; Dubos R., 1966; Gall L.S., 1970; Freter R., 1974; Wilson G., 1974; Haenel H, Bendig J., 1975; Savage D., 1989].

Необходимо отметить, что в науке о микроорганизмах в последние годы появился новый термин - микробная экология. Как научное направление микробная экология рассматривает взаимоотношения микроорганизмов между собой и с окружающей средой, в том числе с организмом хозяина. В своей последней

монографии Б.А.Шендеров [1998] подчеркивает, что в настоящее время микробная экология по количеству публикаций и достижений переживает настоящий бум. Однако в данном обзоре внимание будет уделено лишь одному из разделов микробной экологии, а именно описанию микрофлоры кишечника.

2.1. Нормальная микрофлора кишечника человека

Микрофлора кишечника привлекала и привлекает пристальное внимание многих исследователей. Тем не менее единой классификации микроорганизмов, населяющих кишечник, до сих пор нет. Чаще всего нормальную микрофлору делят на индигенную (резидентную), характерную для данного вида животного, и случайную, временную [Чахава О.В., 1972]. Применяется также деление на облигатную, постоянную микрофлору и факультативную, временную [Петровская В.Г., О.П.Марко, 1976].Кроме того, при классификации микрофлоры кишечника могут быть использованы количественные характеристики: микроорганизмы, представленные в наибольшем количестве (около 90% микробиоценоза), относят к главной микрофлоре, микроорганизмы, представленные в значительно меньшем количестве (около 10%), называют сопутствующими, а микробы, составляющие менее 1% микробиоценоза, называют остаточными [Пинегин Б.В.и др. 1984].

-t

Наконец, в зависимости от локализации кишечную микрофлору делят на мукозную (М-микрофлору), ассоциированную со слизистой оболочкой кишечника, и полостную (П-микрофлору), локализованную в просвете кишки. Ассоциация М-микрофлоры со слизистой обусловлена в значительной мере способностью микроорганизмов к адгезии, которая может зависеть от свойств ряда поверхностных структур микробной клетки [Пинегин Б.В. и соавторы, 1984].

В состав микрофлоры пищеварительного тракта входит большое разнообразие анаэробных (облигатно-анаэробных и факультативно-анаэробных) и аэробных микроорганизмов. Общие представления о составе микрофлоры кишечника дает схема 1 из книги Б.В.Пинегина и соавторов [1984].

Анаэробы кишечника представлены главным образом семействами Bacteroidaceae (роды Bacteroides, Fusobacterium и Leptotrichia), Actinomycetaceae (роды Actinomyces, Bifidobacterium, Bacterionema, Rothia) и Lactobacillaceae (род Lactobacillus). По количественным показателям бактероиды и бифидобактерии представляют собой главную микрофлору. Они составляют около 90% всех микроорганизмов кишечника. Лактобактерии, эшерихии и энтерококки составляют около 10% от общего количества микробов кишечника и относятся к так называемой сопутствующей микрофлоре. Другие микрорганизмы, представленные в схеме 1 (условно патогенные

энтеробактерии, стафилококки, клостридии, аэробные бациллы, дрожжи и др.), составляют не более 1% от общего количества всех микробов, и относятся к остаточной микрофлоре [Пинегин Б.В. и др.,1980; Haenel П, Bendig J.,1975; Savage D., 1977].

В разных отделах пищеварительного тракта представители микрофлоры распределены неравномерно. Полость рта является одним из главных путей контаминации макроорганизма микробами. В полости рта могут обнаруживаться свыше 300 видов микроорганизмолв [Sutter V., 1984]. К наиболее частым представителям микрофлоры полости рта здорового человека относятся стрептококки (так называемые "слюнные" стрептококки - S.salivarius), микрококки, стафилококки. Реже встречаются лактобактерии, бифидобактерии, коринебактерии, актиномицеты, бактероиды, вейлонеллы и другие микроорганизмы [Шендеров Б.А., 1998]. Иногда из полости рта могут быть высеяны эшерихии и другие энтеробактерии, однако отнесение этих бактерий к представителям нормальной микрофлоры полости рта является спорным [Петровская В.Г., Марко OIL, 1976].

В желудке здоровых людей обычно содержится незначительное количество микроорганизмов (менее 103 клеток/мл) ,что может быть связано с бактерицидным действием соляной кислоты и желудочного сока. Тем не ме-нее из желудка могут быть высеяны лактобактерии, стрептококки,грибы и некоторые другие микроорганизмы [Heyde Н.,

у

Henderix H.,1964; Ленцнер A.A. и ■ др.,1966; Krisk Е.,1995]. Имеются сообщения о том, что в мукозном слое желудка здоровых людей могут присутствовать бактерии Helycobacter pilori [Lee A., Hallel S.,1988].

Схема 1. Структура микрофлоры кишечника

Палочковидные

(коринебактерии,

лактобактерии)

Шарообразные (микрококки, стрептококки, стафилококки)

Бесспоровые

Дрожжи Бациллы

Палочковидные (провиденция, севдомонады,| энтеробактерии)

Спорообразующие Бесспоровые

"Грамположительные

Аэробы

Грамотрицательные

_I

Г

Микрофлора кишечника I

Анаэробы

Грамположительные I

Бесспоровые

Спорообразующие бациллы

Грамотрицательные I

Бесспоровые —

Палочковидные Шарообразные (актиномицеты, (пептококки, бифидобактерии, пептострепто-эубактерии, кокки)

лактобактерии, пропионобактерии)

Клостридии Палочко- Шарооб-

видные разные (бакте- (вейло-

роиды, неллы) фузобак-терии)

Извитые (кампило-бактер)

4U

В двенадцатиперстной, тощей и в верхнем отделе подвздошной кишки обычно содержится незначительное количество микроорганизмов (менее 104 клеток/мл). Чаще всего здесь обнаруживаются аэробные и анаэробные кокки, лактобациллы и бифидобактерии, реже бактериоды, вейлонеллы и энтеробактерии [Justesen I. и др., 1984; Finegold S.,1986], С приближением к слепой кишке количество бактерий в подвздошной кишке увеличивается,и грамположительная микрофлора сменяется грамотрицательной, причем облигатные анаэробы начинают преобладать над аэробами [Finegold S.,1986], Все перечисленные представители микробов встречаются как в М-микрофлоре, так и в П-микрофлоре тонкой кишки [Пинегин Б.В. и др.,1984].

Наиболее заселена микроорганизмами толстая кишка человека.

По расчетам, в толстой кишке человека содержится около 1,5 кг

микроорганизмов [Hill М., Drasar В.,1975]. В 1 грамме фекалий может

1

содержаться около 10 микроорганизмов. В толстой кишке обнаруживаются микроорганизмы, относящиеся к 17 различным семействам, 45 родам и более 400 видам, причем количество анаэробов в 100-1000 раз превышает количество аэробов [Boriello S.,1986; Finegold S.,1986; Savage D.,1989; Simon G., Gorbach S., 1984].

Качественный и количественный состав микрофлоры кишечника (фекальной микрофлоры) представлен в табл.1, которая взята из одного

из последних пособий, утвержденных Минздравом РФ [Коршунов В.М. и др.,1997].

Из перечисленных в табл.1 микроорганизмов к облигатным для человека относят бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, пептострептококки, эшерихии. Некоторые авторы [Петровская В.Г.,Марко О.П.,1976] к облиганой микрофлоре кишечника человека относят также энтерококки. Остальные микроорганизмы, перечисленные в табл.1, являются факультативными для микрофлоры кишечника человека.

Из облигатных бактерий следует выделить, прежде всего, бифидобактерии и лактобактерии. Бифидобактерии грамположительные, бесспоровые, плеоморфные, строго анаэробные микроорганизмы. Название этой группы микроорганизмов обусловлено наличием раздвоений (бифуркаций) концов клетки. Присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни человека. Обладают высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно патогенным микробам, что обусловлено выделением большого количества кислых продуктов, лизоцима и спиртов. Бифидобактерии синтезируют аминокислоты, белки и различные витамины. Они оказывают выраженное иммуностимулирующее действие [Коршунов В.М. и др.,1997].

Лактобактерии - грамположительные микроаэрофилы, обладающие высокой антибактериальной активностью, что приводит к подавлению гнилостных и гноеродных бактерий. Это связано с выработкой в процессе сбраживания углеводов молочной кислоты, спирта и лизоцима.

Бифидо- и лактобактерии вступают в тесный контакт со слизистой кишечника, образуя М-микрофлору, однако в мукозе находится меньше этих бактерий, чем в полости кишки [Шендеров Б.А.,1998]. Адгезия этих бактерий к слизистой предохраняет слизистую от возможного внедрения патогенных микробов, то-есть, обеспечивает так называемую колонизационную резистентность [Пинегин Б.В. и др., 1984].

Довольно многочисленными представителями кишечной микрофлоры являются бактероиды. Это грамотрицательные, неспорообразующие, полиморфные палочки, строгие анаэробы. Как и бифидо- и лактобактерии бактероиды могут ассоциироваться со слизистой кишечника, однако в отличие от бифидо- и лактобактерий некоторые представители бактероидов обладают факторами патогенности и при определенных условиях могут обусловливать развитие патологических процессов [Коршунов В.М. и др., 1997].

10

Пептострептококки - грамположительные кокки, строгие анаэробы, не образуют спор. При определенных условиях могут быть патогенными и вызывать гноеродные процессы. К строгим грамположительным анаэробам относятся и палочковидные эубактерии, представители которых также могут вызывать гноеродные процессы [Коршунов В.М. и др.,1997].

К облигатной микрофлоре кишечника относят также типичные по своим свойствам эшерихии, грамотрицательные палочки, количество которых составляет менее 1% от общего количества микроорганизмов кишечника. Различные представители эшерихий могут значительно различаться по серологическим признакам. Они также могут обладать факторами патогенности.

Наконец, к облигатной грамположительной микрофлоре кишечника относят иногда и энтерококки, основными представителями которых являются Е^аесаНБ и Е^аесшт. Они в процессе сбраживания углеводов вырабатывают молочную кислоту, тем самым способствуя поддержанию колонизационной резистентности кишечника.

Качественный и количественный составмикрофлоры

кишечника человека у здоровых людей

Наименование Дети первого Взрослые Люди пожилого

группы микроорганизмов года возраств

Бифидобактерии 1010-10и Ю9-Ю10 109-Ю10

Лактобактерии 106 -107 107-108 106-107

Бактероиды 107-109 Ю9-Ю10 Ю10-10п

Фузобактерии <10б 108-109 108-109

Вейлонеллы <105 105-10б 105-106

Эубактерии 106-107 Ю9-Ю10 ю9-ю10

Пептострептококки <105 109-Ю10 ю10

(лецитиназа+)

Клостридии <105 <105 <10б

Клостридии (ледитиназа-) <107 107-108 108"109

E.coli (с типичными свойст-

вами) 107-108 107-108 108-109

Другие энтеробактерии* <104 <104 <104

Энтерококки 106"107 107-108 10б-107

Стафилококки.

S.epidermidis <105 <104 <103

S. aureus 1

сЮ1 <102 <102

Аэробные бациллы <103 <105 <105

Дрожжеподобные грибы

рода Candida <103 <104 <104

40

К табл.1. * лактозоонегативные и гемолизинпродуцирующие E.coli, а также другие представители семейства Enterobacteriaceae (Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Serratia и др.)

Перечень факультативных представителей кишечной микрофлоры может быть достаточно великим. Наиболее часто обнаруживаются анаэробные фузобактерии, вейлонеллы, клостридии, а также стафилококки, аэробные бациллы, грибы рода Candida и различные условно патогенные энтеробактерии и нетипичные эшерихии, в частности, гемолитические эшерихии.

Кишечная микрофлора играет очень важную роль в жизнедеятельности макроорганизма. Она оказывает морфокинетическое действие, участвует в регуляции газового состава полостей, в водно-солевом обмене, поддержании pH и регуляции анаэробиоза, в метаболизме углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот и других соединений, в рециркуляции желчных кислот, стероидов и других макромолекул, в детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов, в продукции витаминов и различных биологически активных соединений. Кроме того, она является довольно сильным иммуностимулятором и играет важную роль в обеспечении колонизационной резистентности кишечника [Шендеров Б.А.,1998].

/А

Понятие колонизационной резистентности было детально обосновано в работах D.van der Waaij [1984,1985,1988,1996]. Под этим термином подразумевают совокупность механизмов, обеспечивающих стабильность нормальной микрофлоры и предотвращающих заселение (колонизацию) хозяина посторонними микроорганизмами или распространение (транслокацию) представителей нормальной микрофлоры вне мест их естественного обитания [Шендеров Б.А.,1998]. Механизмы, обеспечивающие колонизационную резистентность, связаны с нормальной микрофлорой и иммунным статусом хозяина. Колонизационную резистентность обеспечивает, прежде всего, индигенная (облигатная) анаэробная микрофлора, причем протективное действие этой микрофлоры является более эффективным, чем защитный эффект иммунной системы [Шендеров Б.А.,1998; Freier R.,1984; Redondo-Lopez V. et al.,1990; ]. Антагонистическое действие микрофлоры обусловлено продукцией бактериоцинов, лизоцима и других антибиотикоподобных субстанций, а также различных органических кислот [Ленцнер A.A. и др.,1987; Freier R.,1984; Rolfe R.,1995 ; Van Saene H.,1988; Ramare F.1996],

Высокая антагонистическая активность индигенной микрофлоры,например, лактобактерий, обычно сочетается с их высокой адгезивностью. Цитоадгезивность стафилококков, стрептококков и энтеро бактерий в смешанных популяциях с лактобактериями

значительно снижается, что объясняется способностью лактобактерий блокировать соответствующие клеточные рецепторы [Ленцнер A.A., 1987]. Участие индигенной микрофлоры в колонизационной резистентности может быть обусловлено также конкуренцией за питательные субстраты и продукцией энзимов, расщепляющих муцин [Freter R.,1984; Rolfe R.,1995]. Кроме того, индигенная микрофлора может стимулировать защитные факторы хозяина, включая макрофаги, комплемент, лактоферин, различные бактерицидные субстанции лейкоцитов и клеток мононуклеарно-фагоцитарной системы, а также иммуноглобулины, прежде всего IgA, препятствующие адгезии и способствующие выведению чужеродных микроорганизмов во внешнюю среду [Beuth J. et al.,1990; Berg R.,1994; Hill M. et al.1982; Link-Amster H. et al.,1994; Mutai M.,Kawai Y.,1981; Namba Y. et al,1981; Savage D.,1984],

Участие иммунной системы, в частности, иммуноглобулинов класса А, в колонизационной резистентности было подтверждено в работе D.van der Waaij [1984], в которой было показано, что поверхность подавляющего большинства (99%) бактерий индигенной анаэробной микрофлоры не покрыта иммуноглобулинами класса А, тогда как энтеробактерии, энтерококки другие аэробы кишечной микрофлоры полностью покрыты IgA. Это позволило автору выдвинуть гипотезу, согласно которой представители индигенной микрофлоры уклоняются от контроля со стороны IgA в связи с наличием иммунологической

толерантности хозяина к этой микрофлоре p.van der Waaij [1984,1985,1988]. По экспериментальным данным [Ануфриева Р.Г. и др.,1989; Шендеров Б.А. и др.,1986], иммунологическая толерантность к представителям нормальной микрофлоры начинает формироваться в период внутриутробного развития плода.

2.2. Дисбактериозы кишечника

Кроме взаимоотношений между различными представителями микрофлоры, на состав и численность микрофлоры кишечника влияет целый ряд факторов хозяина: механических, химических, неспецифических и специфических иммунных [Пинегин Б.В. и др.,1984]. К механическим факторам относят перистальтику кишечника, баугиниеву заслонку, мукопротеиновое покрытие мембран кишечного эпителия, быстрое обновление эпителия слизистой кишечника. К числу химических факторов необходимо отнести соляную кислоту, пепсин, трипсин, желчные и жирные кислоты. Неспецифические факторы антимикробной устойчивости - комплемент, лизоцим, лактоферин, интерферон, бактерицидные субстанции фагоцитов. Иммунная защита обусловлена действием клеточных и гуморальных факторов, связанных с присутствием в пищеварительном тракте различных популяций иммунокомпетентных клеток.

Многочисленные наблюдения, подробно рассмотренные в книге В.Петровской и О.Марко [1976], показывают, что микрофлора и организм хозяина находятся в тесной взаимосвязи и взаимозависимости. Состав и численность кишечной микрофлоры может меняться в зависимости от возраста и условий жизни людей, от особенностей питания и климатических условий, при стрессовых состояниях, включая сильные эмоциональные воздействия, при действии различных физических и химических факторов, включая антибиотики, различные антибактериальные и лекарственные препараты, а также при различных патологических процессах. Эти изменения могут быть незначительными и временными, а могут быть более продолжительными и сопровождаться нарушениями здоровья человека. Последние состояния получили название "дисбактериозы кишечника".

Пожалуй, первое определение дисбактериоза как преобладание в фекальной флоре кишечной палочки с измененными биологическими и ферментативными свойствами было дано Л.Г.Перетцем [1955]. Однако дисбактериозы кишечника включают целый ряд изменений кишечной микрофлоры, которые, несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не поддаются четкой классификации. Так, предложено деление дисбактериозов по фазам [Пинегин Б.В.и др.Д984]:

¿ш

первая фаза (начальная) - увеличение количества симбионтов в местах их типичного обитания ;

вторая фаза - исчезновение некоторых симбионтов и увеличение количества других, а также появление таких представителей, которые в норме выявляются в незначительных количествах или совсем не определяются;

третья фаза - микроорганизмы могут расширить границы своей локализации, появляясь в тех участках пищеварительного тракта, где они в норме отсутствуют (например, энтеробактерии присутствуют в проксимальных отделах тощей кишки и в полости рта); часто эти изменения сопровождаются бактериемией в связи с проникновением микрофлоры кишечника в кровоток и лимфу;

четвертая фаза - увеличение удельного веса патогенных штаммов среди отдельных представителей нормальной микрофлоры или их ассоциаций.

Красноголовец В.Н.[1989] делит дисбактериозы на 4 степени выраженности, используя при этом характер роста кишечной микрофлоры на различных питательных средах, в частности, уменьшение или отсутствие роста кишечной палочки и увеличение роста

м

условно патогенных микробов, стафилококков, протея, дрожжеподобных грибов, лактозонегативных эшерихий.

Существует еще одно деление дисбактериозов по степеням [Марко О.П., Корнева Т.К.,1974]:

I степень (Д1) - отклонения от нормы в микрофлоре (количественные, видовые, качественные) констатируются либо в облигатной группе микроорганизмов, либо коснулись только факультативной ее части;

II степень (Д2) - изменения наступили в обеих группах микроорганизмов;

III степень (Дз) - сдвиги в микрофлоре кишечника сопровождаются заселением вышележащих отделов желудочно-кишечного тракта, снижается иммунологическая реактивность макроорганизма и возникают ответные его реакции на микрофлору;

IV степень (Д4) - имеются осложнения, обусловленные дисбактериозом, микроорганизмы выявляются в других органах и субстратах (кровь, моча и т.д.), появляются дополнительные локализации инфекционного процесса.

Блохина И.Щ1981] выделяет три степени выраженности дисбактериозов:

I степень (слабо выраженный дисбактериоз) - анаэробная флора преобладает над аэробной, бифидо- и лактобактерии или одна из этих форм выделяются в разведении 10"7-10"8, условно патогенные бактерии (не более двух видов) высеваются в разведении Ю^-Ю"4;

II степень - угнетение анаэробных бактерий (сумма их примерно равна содержанию аэробов), условно патогенные бактерии высеваются в разведениях 10"6-10"7, полноценные кишечные палочки заменяются атипичными (неподвижные, лактозонегативные, гемолитические);

III степень (выраженный дисбактериоз) - преобладает аэробная флора, вплоть до полного отсутствия бифидо- и лактобактерий, резко увеличено количество условно патогенных микробов, особенно часто встречаются патогенный стафилококк, протей, дрожжеподобные грибы рода Candida, клебсиеллы, реже - синегнойная палочка, клостридии.

Кузнецова Г.Г. [1972] предложила деление дисбактериозов по стадиям следующим образом:

I стадия - снижение количества или элиминация бифидо- и (или) лактобактерий;

II стадия - значительное увеличение или резкое снижение колибактериальной флоры, атипичные и ферментно неполноценные эшерихии;

ТТТ стадия - высокое содержание условно патогенной микрофлоры;

IV стадия - преобладание протея или синегнойной палочки.

Каждая из этих классификаций имеет те или иные недостатки и не охватывает полностью различные варианты дисбактериозов, встречающихся в диагностической практике. Попытку А.Ф.Билибина [1967] классифицировать дисбактериозы по видам (стафилококковый, протейный, дрожжевой, ассоциированный) также нельзя считать удачной, така как эта классификация практически не учитывает количественные характеристики микрофлоры.

Следует отметить еще одну классификацию дисбактериозов по этиологическим эндогенным или экзогенным факторам [Беюл Е.А., Куваева И.Б.,1986]. Авторы выделяют следующие виды дисбактериозов.

I. По эндогенным факторам:

а) дисбактериоз функциональный, возникающий вследствие пониженной секреции соляной кислоты в желудке, недостаточности внешнесекреторной функции поджелудочной железы и печени, дискинетических расстройств различных отделов кишечника;

б) дисбактериоз нутритивный, возникающий при диспепсии, диарее, синдроме малабсорбции;

в) дисбактериоз воспалительный, сопровождающий неинфекционное воспаление тонкой кишки (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит);

г) дисбактериоз иммунодефицитный, возникающий у некоторых больных с недостаточностью специфических и неспецифических защитных факторов в локальной и общей иммунной системе.

II. По экзогенным факторам:

а) дисбактериоз алиментарный, возникающий при употреблении нетрадиционных продуктов питания или при нефизиологических формах питания (например, белки одноклеточных водорослей, продолжительное парентеральное питание);

б) дисбактериоз постоперационный, возникающий в результате резекции желудка, обширной резекции тонкой кишки, синдрома приводящей петли, синдрома "слепой петли", тотальной ваготомии и т.д.;

¿А

в) дисбактериоз постинфекционный, после перенесенных кишечных инфекций (брюшной тиф,сальмонеллез, шигеллез, амебная дизентерия и др.);

г) дисбактериоз лекарственный, развивающийся после длительного приема антибактериальных препаратов;

д) дисбактериоз стрессорный, причиной которого может явиться эмоциональный и физиологический стресс при биоизоляции и в условиях космического полета;

е) дисбактериоз пострадиационный.

Эта классификация учитывает, по-видимому, большинство возможных этиологических факторов дисбактериоза кишечника, однако необходимо отметить определенную условность деления на эндо- и экзогенные факторы, так как действие экзогенных факторов может приводить к запуску собственно эндогенных факторов.

Таким образом, дисбактериозы возникают вследствие действия самых разнообразных факторов. В этом плане необходимо учитывать, что состояние кишечной микрофлоры является достаточно чувствительным индикатором общего состояния макроорганизма. Поэтому при обнаружении дисбактериоза врач должен искать его истинные причины. При этом лечение дисбактериоза должно быть

м

направлено на устранение этих причин и восстановление нормальной микрофлоры путем приема так называемых эубиотиков - препаратов типа бифидумбактерина, лактобактерина, бификола, колибактерина и других аналогичных препаратов, перечень которых в настоящее время значительно расширился. Кроме того, для подавления нежелательной микрофлоры необходимо применять препараты соответствующих бактериофагов.

2.3. Структура и биологическая активность эндотоксина грамотрицателъных бактерий

Одним из нежелательных последствий дисбактериоза яавляется транслокация грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов из кишечника в кровоток. Это, в свою очередь, может приводить к возникновению ряда эффектов, обусловленных действием эндотоксина, уникального по своей биологической активности.

Эндотоксину Гр" бактерий посвящено множество экспериментальных исследований, клинических наблюдений, обзоров и монографий, в частности, фундаментальное четырехтомное руководство, вышедшее под редакцией РгокШг К.,[1984].

Эндотоксином называют _ липополисахарид (ЛПС), являющийся структурным компонентом внешней мембраны клеточной стенки Гр"

сИ-

бактерий. В отличие от экзотоксинов эндотоксин выделяется во внешнюю среду лишь при разрушении бактериальных клеток.

Макромолекула эндотоксина состоит из трех областей^- или Оцепи, R-кор и липид А. Структурная модель одного из видов ЛПС (ЛПС Salmonella) схематически представлена на схеме 2.

Схема 2 [Westphal О.,1975]

I I II жирные

Р Р \ \ кислоты

I I II

(а-Ь-с)„—Glc-Gal-Glc-Hept-Hept-KDO-KDO-KDO—Glcn-Glcn

Glc Gal P / P / жирные

I \ I \кислоты \-----/ \------------------------------------------------------/\---------------------/

О-цепи R-кор Липид A

Примечания:

(a-b-c)n - повторяющиеся звенья углеводов

Glc - глюкоза

Gal - галактоза

Hept - гептоза

Glen - глюкозамин

KDO - кетодезоксиоктонат

P - остаток фосфорной кислоты

IX

Внешняя по отношению к клеточной стенке бактериальной клетки О-цепь представляет собой полисахарид, построенный из повторяющихся олигосахаридных звеньев, которые состоят из 3-4 простых Сахаров. Эта область определяет специфичность О-антигена бактерий и значительно отличается у разных видов и сероваров Гр" бактерий. Средняя область, Я-кор, представлена центральным олигосахаридом, структура которого менее изменчива у разных видов бактерий, чем структура О-цепей. Наиболее консервативной частью 11-кора являются так называемые глубокие сахара, прилегающие к липидной части ЛПС. Например, кетодезоксиоктонат (КДО), непосредственно связанный с липидом А, встречается у большинства изученных Гр" бактерий, в частности у энтеробактерий. Наиболее глубоко расположенной областью эндотоксина является липид А. Это очень сложная структура, в состав которой входят, в основном, жирные кислоты, глюкозамин и остатки фосфорной кислоты. Липид А одинаков у энтеробактерий и подавляющего большинства Гр" бактерий. Именно эта область обусловливает токсичность ЛПС, которая привлекает внимание своими разнообразными проявлениями.

Перечень видов биологической активности эндотоксина очень обширен [Лиходед В.Г.и др.Д996с]. Он вызывают следующие эффекты:

- активация лейкоцитов и макрофагов

- стимуляция продукции эндогенного пирогена, антагониста глюкокортикоидов, интерферона, интерлейкинов, туморнекротизирующего фактора (кахексина) и других медиаторов

- активация синтеза белков острой фазы, в том числе амилоидного белка

- митогенный эффект

- активация миелопоеза

- поликлональная активация В-клеток

- индукция развития провирусов

- подавление тканевого дыхания

- развитие гиперлипидемии

- активация системы комплемента

- активация тромбоцитов и факторов свертывания крови

- местный и генерализованный феномен Шварцмана

- диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови

- эндотоксиновый шок.

¿о

Нужно отметить, что среди других природных соединений пока не известны вещества, обладающие таким огромным спектром биологической активности.

Хотя проявления биологической активности эндотоксинов столь разнообразны, в основе их действия на различные клетки и системы макроорганизма лежат, по-видимому, одинаковые механизмы, суть которых обусловлена выраженным сродством липида А к биологическим мембранам. Своей липидной частью ЛПС может взаимодействовать практически со всеми клетками макроорганизма. Липид А способен, вероятно, непосредственно взаимодействовать с липидным компонентами мембран, встраиваться в мембраны и вызывать дезорганизацию их функций. В системе in vitro, например, липид А и ЛПС легко встраиваются в липосомы, искусственные липидные мембраны [Kataoka T.et al.,1971],

В то же время имеются данные о наличии на поверхности клеток млекопитающих специфичных для эндотоксина белковых рецепторов, связанных с мембранами [Lynn W.A. Golenbook D.Т., 1992]. Так, эндотоксин может связываться на поверхности лейкоцитов с рецепторным белком CD 18, причем такое связывание не ведет к активации лейкоцитов. Кроме того, эндотоксин связывается с так называемым LBP-белком (lipopolysaccharid binding protein) плазмы крови,

л

а затем в комплексе с этим белком взаимодействует с рецептором СБ 14 на поверхности клетки. Такое связывание ведет к активации лейкоцитов.

В настоящее время известен еще один механизм связывания эндотоксина некоторыми клетками, в частности, Гс-зависимое связывание эндотоксина лейкоцитами [Лиходед В.Г. и др., 1996Ь], однако этот феномен мы рассмотрим в следующем разделе.

Связываясь с клетками,эндотоксин взаимодействует с их мембранами, и исход этого взаимодействия зависит, прежде всего, от концентрации эндотоксина. При низких дозах эндотоксина имеет место умеренная активация клеток и систем. С увеличением концентрации эндотоксина ситуация меняется, и умеренная активация переходит в гиперактивацию, что ведет к усиленной продукции кахексина (туморнекротизирующего фактора) и других медиаторов, усиленной активации системы комплемента и факторов свертывания крови. Эти процессы могут сопровождаться развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания и эндоток'синового шока, самого грозного осложнения системной эндотоксинемии [Лиходед В.Г. и др., 1996с].

Следует учитывать также, что гиперактивация при больших дозах эндотоксина может вызывать накопление в клетках продуктов перекисного окисления липидов и гибель клеток. Гибелью клеток может

заканчиваться также взаимодействие сорбированного на поверхности клеток эндотоксина с антителами и комплементом. Эти механизмы могут приводить к развитию многих событий, имеющих место при действии эндотоксина, в частности, к возникновению локальных повреждений эндотелия, уменьшению количества лейкоцитов и тромбоцитов, а также к развитию гломерулонефрита и другой органопатологии [Kataoka T.et all971; Wilson M.l985].

В повреждении различных органов при действии эндотоксина могут участвовать также гиперактивированные эндотоксином гранулоциты [Пермяков и др., 1989; Яковлев М.Ю.,1988,1993;Яковлев М.Ю.и др.,1987].

Следовательно, эндотоксин Гр" бактерий при попадании в макроорганизм может индуцировать целый ряд реакций, которые ведут к развитию тяжелых патологических процессов. Такая картина обычно развивается при генерализованных инфекциях, вызванных Гр" бактериями, в частности, при брюшном тифе, менингите, грамотрицательном сепсисе. Тяжесть клинического течения при этих заболеваниях в значительной мере обусловлена действием эндотоксина [DuerdenB.,1988; Bergman О.. 1988].

В сравнительно недавно опубликованном обзоре Лихо дед В.Г. и соавторы [1996с] указывают, что значимость эндотоксина в различной

патологии человека не ограничивается лишь его ведущей ролью при острых инфекционных заболеваниях, вызванных Гр" бактериями. Как уже было отмечено в предыдущем разделе, толстая кишка человека содержит огромное количество анаэробных и аэробных Гр" бактерий, часть клеток которых постоянно разрушается. Это приводит к выделению в просвет кишки большого количества эндотоксина. Неповрежденная слизистая толстой кишки здорового человека является, по всей вероятности, достаточно надежным барьером, который предотвращает попадание эндотоксина в кровоток в больших количествах. Однако в условиях практической нормы небольшое количество эндотоксина все же может проникать в кровь [Пермяков Н.К. и др., 1995]. Этот процесс усиливается при повреждениях слизистой кишечника и при дисбактериозах, которые сопровождаются транслокацией бактерий и продуктов их жизнедеятельности в тонкую кишку. Поэтому в эволюции сложились клеточные и гуморальные системы защиты от эндотоксина, проникающего в кровь.

2.4. Факторы клеточного и гуморального иммунитета к эндотоксину грамотрицателъных бактерий

Эндотоксин, проникший в кровь из кишечника и попавший в систему воротной вены, захватывается и подвергается разрушению в клетках РЭС, преимущественно в клетках Купфера, и подвергается затем детоксикации в клетках печени. В связи с этим наличие эндотоксина в воротной вене не обязательно приводит к патологическим эффектам [Яковлев М.Ю., 1988]. Однако при нарушении функций печени и РЭС ситуация может значительно меняться. Блокада клеток РЭС различными веществами значительно усиливает действие эндотоксина [АН М., Nolan J. 1967]. У больных циррозом печени свободный эндотоксин легко обнаруживается в периферической крови [Clemente C.et al. 1977; Simjee A.et al. 1975; Tarao K.et al.1977].

Следовательно, на пути проникновения эндотоксина из кишечника в общий кровоток вторым барьером после неповрежденной слизистой кишечника являются клетки печени и фиксированные макрофаги печени. Однако в небольших количествах эндотоксин все-таки может проникать в системный кровоток. Это подтверждается, в частности, данными о том, что у практически здоровых людей в мазках периферической крови обнаруживаются полиморфноядерные лейкоциты (около 3,5%), связывающие эндотоксин при помощи так называемого Fe-

опосредованного связывания, то есть, при помощи антител, фиксированных на Fc-рецепторах лейкоцитов [Лиходед В.Г. и др., 1996b]. Такие лейкоциты играют важную роль в детоксикации эндотоксина, и их можно рассматривать в качестве факторов клеточного антиэндотоксинового иммунитета.

В детоксикации эндотоксина, проникшего в кровоток, активное участие принимают также гуморальные факторы. Кроме клеток печени, довольно большое количество эндотоксина может детоксицировать также плазма крови: 1 мл нормальной плазмы может детоксицировать 510 мкг ЛПС в течение 1 часа, а 1 г печени детоксицирует в течение того же времени 1-5 мкг эндотоксина [Yamaguchi К.et all982]. У животных, толерантных к эндотоксину, детоксицирующая способность 1 мл плазмы достигает даже 13-15 мкг эндотоксина в час.

Способностью связывать эндотоксин обладает целый ряд компонентов плазмы крови. Это, прежде всего, ряд острофазных реактантов, в частности, некоторые арилэстеразы, С-реактивный белок и амилоид А, а также фактор, вызывающий дезагрегацию макромолекул ЛПС, которые из-за наличия в своей структуре гидрофильных и гидрофобных концов обычно образуют сфероидные структуры [BogHansen T.et al.1978; Tobias P.et al. 1982].

После дезагрегации с ЛПС взаимодействуют липопротеины высокой удельной плотности (ЛВП), которые способны связать более половины эндотоксина в течение нескольких минут после его внутривенного введения [Аполлонин A.B. и др. 1990; Freudenberg M.et al.l 985]. Связывание с ЛВП приводит к значительному снижению токсичности ЛПС [Mathison J.,Ulevitch R.1979; Mathison J.,Ulevitch R.1981], Комплексы эндотоксина с ЛВП могут циркулировать в кровотоке в течение 24 часов, поглощаются тканями и постепенно выводятся. Наибольшая концентрация этих комплексов обнаружена в надпочечниках [Ulevitch R.et а1.1979;1981]. Не исключено, что концентрация описанных комплексов в надпочечниках имеет защитное значение, так как комплексы стимулируют продукцию антистрессовых гормонов [Mathison J.,Ulevitch R.1979]. У адреналэктомированных животных значитенльно повышается чувствительность к эндотоксину [Chedid 1. et al.l966]. В то же время при чрезмерной концентрации комплексов в надпочечниках возможно повреждение их функций. По-видимому, в связи с этим одним из частых осложнений системной эндотоксинемии при перитонитах является недостаточность надпочечников.

Связывание ЛВП с ЛПС играет важную роль в защите от эндотоксина. У животных с повышенной естественной резистентностью к эндотоксину повышено содержание ЛВП [Аполлонин A.B. и др. 1990].

¿у-

Инъекция эндотоксина приводит к увеличению содержание ЛВП в плазме крови [Freudenberg М. et al.l985]. Недавно было показано, что у больных перитонитами значительно снижается эндотоксинсвязывающая активность ЛВП, причем тяжесть патологического процесса, частота возникновения осложнений и длительность пребывания в клинике коррелировали со степенью снижения способности ЛВП связывать эндотоксин [Аполлонин A.B. и др. 1990].

Очень важным гуморальным фактором, связывающим эндотоксин, являются антитела. Высокая антиэндотоксиновая активность характерна для антител к О-цепям ЛПС, но большое разнообразие антигенных детерминант О-цепей у Гр" бактерий обусловливает очень низкую вероятность встречи О-специфических антител и соответствующих ЛПС. В связи с этим важная роль принадлежит антителам к глубоким детерминантам R-кора ЛПС, в частности, антителам к Re-гликолипиду. Этот гликолипид состоит из КДО и липида А, которые входят в состав ЛПС большинства Гр" бактерий. При оппортунистических инфекциях, вызванных грамотрицательными бактериями, выживаемость больных прямо зависит от величины титров антител к Re-гликолипиду [Glumeck N.et al. 1980]. При брюшном тифе отмечена зависимость между показателями титров Re-антител и тяжестью клинического течения [Гремякова Т.А.и др. 1982]. У больных перитонитами имела место корреляция между степенью

¿¿г

снижения титров антител к Ке-гликолипиду и частотой развития осложнений и длительностью пребывания в стационаре [Аполлонин А.В.и др. 1990,].

Эти данные обусловливают целесообразность применения плазмы крови с повышенными титрами антител к Ке-гликолипиду для иммунотерапии. Такая плазма, с успехом была применена при перитонитах у взрослых и гнойно-септических заболеваниях у недоношенных новорожденных [Аполлонин А.В.и др. 1990; Лукина Л.И. и др. 1988].

Имеются данные о том, что антитела к 11-кору ЛПС могут играть важную роль в формировании и поддержании нормального микробиоценоза кишечника. Иммунизация убитыми клетками Яе-мутанта 8.тшпе8о1а подавляла последующее развитие экспериментального дисбактериоза кишечника у мышей [Гладько И.А.и др. 1983]. Для большинства здоровых новорожденных детей характерно повышенное содержание Яе-антител [Галдавадзе М.А.и др. 1987]. Кроме того, в лаборатории профессора В.Г.Лиходеда недавно было показано, что у новорожденных при сниженных титрах Ке-антител развивается кишечный дисбактериоз [материалы будут опубликованы в Ж.микробиологии,1998,Ш], К этому необходимо добавить, что антитела к Ке-гликолипиду, нейтрализующие эндотоксины различных

У

грамотрицательных бактерий, выявлены у большинства здоровых людей [Т.А.Гремякова, 1983].

Все эти материалы позволили В.Г.Лиходеду и соавторам [1996с] сделать заключение о том, что в нормальных экологических условиях многочисленные клеточные и гуморальные факторы достаточно надежно защищают организм здорового человека от действия эндотоксина. Тем не менее в ряде случаев барьерные и нейтрализующие функции этих факторов могут быть нарушены, и это может приводить к проникновению эндотоксина не только в воротную вену, но и в системный кровоток, то есть, к развитию системной эндотоксинемии. Возможные причины развития системной эндотоксинемии будут рассмотрены в следующем разделе.

2.5. Состояние антиэндотоксинового иммунитета при различных патологических процессах

Различные причины развития системной эндотоксинемии достаточно подробно рассмотрены в обзоре В.Г. Лихо деда и соавторов [1996с]. К таким причинам относятся, прежде всего, различные повреждения слизистой кишечника. Такие повреждения могут возникать при многих патологических состояниях (болезнь Крона, хронический язвенный колит, различные острые кишечные инфекции, вызванные Гр" и Гр+ бактериями, а также вирусами, нарушения кровоснабжения

кишечника вследствие оперативных вмешательств, развитие опухолей, сердечно-сосудистая недостаточность, замедление и шунтирование портального кровотока, острая и хроническая алкогольная интоксикация, а также стрессовые реакции).

Развитию системной эндотоксинемии способствуют также заболевания печени, различные воспалительные заболевания кишечника, холецистит, острый деструктивный панкреатит, сахарный диабет, шок, общий наркоз и другие состояния, которые обусловливают угнетение функций фиксированных макрофагов печени, а также повреждения выделительных функций легких и почек при различных заболеваниях дыхательных путей, острых и хронических нефритах и других патологических процессах [Яковлев М.Ю., 1988,1993; Яковлев М.Ю.и др. 1990].

Системная эндотоксинемия наблюдается также при патологии беременности, реакциях неонатальной адаптации, обширных кровопотерях, гипербарии и других процессах [В.Г.Лиходед и др., 1996с].

Наконец, нужно особо подчеркнуть возможность проникновения ЛПС в общий кровоток при кишечных дисбактериозах. Резкое увеличение общего количества микроорганизмов в толстой кишке при дисбактериозе может сопровождаться достаточно интенсивным размножением Гр" бактерий в тонкой кишке, слизистая которой более

У f

проницаема для эндотоксина и более ранима, чем слизистая толстой кишки [Lang Ch.,Alteveer R.1986; Reinolds D.,Swan К. 1972].

В настоящее время известно, что многие состояния, способствующие развитию системной эндотоксинемии, характеризуются угнетением функций клеточных и гуморальных факторов антиэндотоксинового иммунитета. Снижение антиэндотоксинового иммунитета отмечено при перитонитах [Рудик A.A. 1988], при брюшном тифе и острых кишечных инфекциях [Гремякова Т.А.и др.1982; Карлыев Чарымырат.1992; В.А.Малов и др., 1993, 1996а, 1996b], при гнойных менингитах [Ющук Н.Д.и др., 1996], при вирусных гепатитах А и В [Дмитриева Е.В., 1995], при лучевых поражениях и экспериментальном дисбактериозе [Яковлев М.Ю. и др.,1993].

Характерны при этом изменения состояний клеточного антиэндотоксинового иммунитета. Недавно В.Г. Лихо дед и соавторы [1996а] разработали новый иммуноферментный способ оценки антиэндотоксинового иммунитета по наличию в тонких мазках крови лейкоцитов, связавших эндотоксин. В этом способе использованы антитела к гликолипиду хемотипа Re, конъюгированные с пероксидазой. Эти антитела в тонком мазке крови связываются с различными ЛПС, локализованными на поверхности лейкоцитов, и позволяют таким образом выявлять лейкоциты, несущие эндотоксин. Путем применения

'^"цъточжь.

различных антисывороток авторы доказали, что таким способом выявляются лейкоциты, связавшие эндотоксин при помощи Fc-опосредованного механизма, то есть, при помощи антител, фиксированных своим Fc-концом на Fc-рецепторах лейкоцитов. При этом выявляются лейкоциты, связавшие эндотоксин in vivo, то есть, в кровотоке обследуемого. Если приготовить два мазка крови и один из них обработать конъюгатом антител с ферментом сразу, а второй - после предварительной обработки мазка эндотоксином (солюбилизированным Re-гликолипидом), то можно выявить лейкоциты, способные связывать эндотоксин in vitro, то есть, определить наличие резервов связывания эндотоксина лейкоцитами. Применение этих методик позволило получить следующие показатели содержания ЛПС-позитивных лейкоцитов в мазках крови практически здоровых людей (табл.2).

Эти материалы показывают, что в норме эндотоксин в небольших количествах проникает в кровоток, где связывается лейкоцитами. Кроме того, у здоровых людей имеются резервы связывания эндотоксина лейкоцитами. Иными словами, организм здорового человека надежно защищен факторами клеточного антиэндотоксинового иммунитета от действия эндотоксина, проникающего в кровоток.

Показатели содержания ЛПС-позитивных полиморфноядерных лейкоцитов в крови практически здоровых людей (п=35) [Лиходед В.Г.и др.,1996Ь]

NN п/п Условия обработки и связывания Содержание лейкоцитов, связавших эндотоксин ( %%, М + ш)

1 Без предварительной обработки Re-гликолипидом ( связывание ЭТ in vivo, в организме обследуемого) 3,5 ± 0,4

2 После предварительной обработки Re-гликолипидом (суммарное связываний in vivo и in vitro) 8,4 ± 0,6

По содержанию полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ), связывающих ЛПС, можно наблюдать следующие шесть состояний антиэндотоксинового иммунитета [Лиходед В.Г.и др.,1996а; Ющук Н.Д.и др.,1996]:

1 - нормальное состояние (нормальное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в крови и наличие ПЯЛ, способных связывать новый эндотоксин in vitro);

/у

2 - активированное состояние с компенсированной эндотоксинемией (увеличенное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в крови и наличие ПЯЛ, способных ¿вязывать новый эндотоксин in vitro);

3 - активированное состояние с декомпенсированной эндотоксинемией (увеличенное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в крови, отсутствие ПЯЛ, способных связывать новый эндотоксин in vitro);

4 - состояние истощения иммунитета (нормальное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в крови, но отсутствие ПЯЛ, способных связывать новый эндотоксин in vitro);

5 - состояние глубокого подавления иммунитета (сниженное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в крови и отсутствие ПЯЛ, способных связывать новый эндотоксин in vitro);

6 - состояние восстановления иммунитета (сниженное содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ в крови и наличие ПЯЛ, способных связывать новый эндотоксин in vitro).

Следует подчеркнуть, что состояния 1,2 и 6 характеризуются наличием ПЯЛ, способных связывать ЛПС in vitro, т.е. наличием резервов связывания эндотоксина, в то время как при состояниях 3,4 и 5 резервы связывания ЛПС лейкоцитами отсутствуют.

10

Схема 3. Состояния антиэндотоксинового иммунитета

активация иммунитета на фоне активация иммунитета на фоне

компенсированной эндотоксинемии декомпенсированной эндотоксинемии восстановление иммунитета глубокое угнетение иммунитета

t + А

f -

3

норма истощение иммунитета > ■—

e ó

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кочурко, Людмила Ивановна

6. Выводы

1. При дисбактериозах кишечника снижаются следующие показатели иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий: а) титры антител к гликолипиду хемотипа Re, нейтрализующие биологическую активность эндотоксинов различных грамотрицательных бактерий; б) количество полиморфноядерных лейкоцитов, связывающих эндотоксин в циркулирующем кровотоке при помощи Fc-зависимого механизма; в) количество лейкоцитов, способных к Fc-опосредованному связыванию эндотоксина in vitro, что ведет практически к полному отсутствию резервов Fc-зависимого связывания эндотоксина лейкоцитами.

2. Снижение антиэндотоксинового иммунитета не зависит от разновидности микробиологической формы дисбактериоза кишечника.

3. При излечении дисбактериозов препаратами пробиотиков и бактериофагов наблюдается улучшение всех показателей антиэндотоксинового иммунитета.

4. При дисбактериозах кишечника часто обнаруживаются бактерии Escherichia coli, несущие плазмидные детерминанты синтеза гемолизина и способные к их передаче при конъюгации.

5. Повышенное содержание в кишечнике условно патогенных энтеробактерий, стафилококков, энтерококков и грибов при дисбактериозах не зависит от развития дефицита бифидо- и лактобактерий.

6. Высокое содержание в кишечнике гемолитических эшерихий при дефиците бифидо- и лактобактерий наблюдается чаще, чем при нормальном содержании этих анаэробных микроорганизмов. юз

7. Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Кочурко Л.И., В .Г. Лихо дед, Е.А.Лобова. Показатели иммунитета к эндотоксину грамотрицательных бактерий при кишечных дисбактериозах. Ж.микробиологии, 1998, N5 , стр.

2. Синилов С.К., Л.И.Кочурко. Частота выявления штаммов Escherichia coli с плазмидами, детерминирующими продукцию гемолизина, при дисбактериозах кишечника. Сб. трудов молодых ученых Московского медицинского стоматологического института. М.1998, стр. 7

3. Кочурко Л.И. Различные формы дисбактериозов кишечника при дефиците бифидо- и лактобактерий. Сб. трудов молодых ученых Московского медицинского стоматологического института. М.1998, стр. 29 ~3 О

4. Лиходед В.Г., М.Ю.Яковлев, А.Е.Мосежный, Л.И.Кочурко. Антиэндотоксиновый иммунитет в физиологии и патологии человека. Медицина экстремальных ситуаций, 1998, N , стр. w

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кочурко, Людмила Ивановна, 1998 год

8. Список литературы

1. Ануфриева Р.Г. и др. Изменение в экологии и морфологии биопленки толстой кишки белых крыс под влиянием рифампицина. Антибиотики. 1989, т.34.

2. Аполлонин A.B. и др. Применение плазмы крови с повышенными титрами антител к гликолипиду Re при перитонитах. Ж.микробиол. 1990,4,64.

3. Аполлонин A.B. и др. Эндотоксинсвязывающие системы крови. Ж.микробиол. 1990,11,100.

4. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медицина. JI.1962.

5. Беюл Е.А., Куваева И.Б. Дисбактериозы кишечника и их клиническое значение. Клин.мед. 1986,64,11,37.

6. Билибин А.Ф. Проблемы джисбактериоза в клинике. Терапевт, архив. 1967, 11,21.

7. Блохина И.Н. Дисбактериоз и его профилактика.Педиатрия. 1981, 10,6.

40

8. Блохина И.Н., В.Г.Дорофейчук. Дисбактериозы. Л. Медицина.

1979

9. Галдавадзе М.А. и др. Содержание и свойства антител к Ые-гликолипиду внешней мембраны энтеробактерий у матерей и новорожденных. Ж.микробиол. 1987,7,53.

10. Гладько И.А.и др. Влияние активной иммунизации на микрофлору кишечника при дисбактериозе. Иммунология, 1983,2,56.

11. Гремякова Т. А.. Выявление эндотоксинов грамотрицательных бактерий и связывающих их белков. Автореф. дисс.канд. М.1983.

12. Гремякова Т.А.и др. Антиэндотоксиновая активность сывороток крови больных брюшным тифом. Ж.микробиол.,1982,9,103.

13. Дмитриева Е.В., В.Г. Лихо дед и др. Функциональная активность антиэндотоксиновых факторов при вирусных гепатитах А и В. Вестник РАМН, 1995, 12, 38.

14. Зацепин Н. Иммунология колиэнтеритов. В кн.Колиэнтериты.Под редакцией О.В.Барояна. Медгиз.М.1962. стр.122.

JPG

15. Карлыев Чарымырат. Состояние антиэндотоксических гуморальных систем при острых кишечных инфекциях. Автореф.дисс.канд.М. 1992.

16. Коршунов В.М. и др. Микробиологическая диагностика дисбактериозов кишечника. Пособие для врачей и студентовю. МЗ РФ. М.1997.

17. Коршунов В.М. и др. Нормальная микрофлора кишечника. Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника. Пособие для врачей и студентов. МЗ РФ. М.1997.

18. Т.А.Котова и др. Способ получения эритроцитарного диагностикума.Авт.св-во N1017339,1983, Бюлл.изобр. N18.

19. Красноголовец В.Н. Дисбактериозы кишечника.М.Мед.

1989.

20. Кузнецова Г.Г. Сов.мед. 1972,11,62 (цитир.по Беюл Е.А. и КуваеваИ.Б. 1986).

21. Ленцнер A.A. и др. О видовой принадлежности лактобацилл желудка. В кн. Сборник докладов VI научной конференции. Таллин. 1966, 44.

22. Ленцнер А.А. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность. Антибиотики и химиотерапия, 1987, N3.

23. Лихо дед В.Г., М.Ю.Яковлев, и др. Способ оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета в отношении грамотрицательных бактерий (ЛПС-Тест-ИФА). Патент РФ N2088936 на изобретение с приоритетом от 18 апреля 1994 г. 1996а.

24. Лиходед В.Г.и др. Бс-зависимое связывание эндотоксинов грамотрицательных бактерий полиморфноядерными лейкоцитами крови человека. Журн.микробиол., 1996Ь, 2, 76.

25. Лиходед В.Г.и др. Роль эндотоксина грамотрицательных бактерий в инфекционной и неинфекционной патологии. Арх.Патол. 1996с,58,8.

26. Лукина Л.И. и др. Применение плазмы крови доноров,иммунизированных энтеро бактериальной вакциной, в комплексном лечении сепсиса у новорожденных Педиатрия. 1988,3,56.

27. Малов В.А. и др. Состояние некоторых гуморальных антиэндотоксических систем у больных острыми кишечными инфекциями. Терапевт, архив, 1993, 11.

ш

28. Малов В.А. и др. Функциональная активность печени и ЛПС-позитивные нейтрофилы периферической крови у больных острой дизентерией.Клинич.медицина 1996а, 7, 52.

29. Малов В.А. и др. Динамика уровней некоторых белков острой фазы и ЛПС-связывающая активность нейтрофилов периферической крови у больных с острыми кишечными инфекциями. Терапевт, архив, 1996Ь, 11,23.

30. Марко О.П., Корнева Т.К. К вопросу о кишечном дисбактериозе. Сов. мед. 1974,5,88.

31. Перетц Л.Г., Значение нормальной микрофлоры для

I

организма человека.М. 1955

32. Пермяков Н.К. и др. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита.Арх.патол. 1989,5,3.

33. Пермяков Н.К. и др. Иммуноморфологическая оценка резервов связывание эндотоксина полиморфноядерными лейкоцитами. Архив патологии, 1995, 2,3.

34. Петровская В.Г., О.П.Марко. Микрофлора человека в норме и патологии. М. Медицина. 1976

SO 9

35. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М., Дисбактериозы кишечника. М. Медицина. 1984.

36. Пинегин Б.В., Коршунов В.М. Иконникова Т.Е. Количественная и ..качественная характеристика представителей энтеробактерий при постлучевом дисбактериозе кишечника. Ж.Микробиол. 1980, 8, 46.

37. Рахимов А. Характеристика гемолизинов эшерихий, выделенных у детей здоровых и при кишечных расстройствах. В кн. Дизентерия и острые кишечные инфекционные заболевания. Ташкент, 1979, с.55-56

38. Рахимов А. и др. Экспериментальное изучение вирулентности эшерихий разного происхождения. В кн.Актуальные вопросы кишечных и зоонозныхинфекций. Ташкент. 1979.с. 108.

39. Рудик A.A. Состояние гуморальных эндотоксинсвязываюгцих факторов при распространенных перитонитах и возможность их коррекции. Автореферат дисс.канд. Хабаровск, 1988.

40. Чахава О.В. Гнотобиология. М. Медицина. 1972 Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.1. М. 1998;

т

41. Шендеров Б.А. и др. Колонизационная резистентность крыс, родившихся от животных с экспериментальным дисбактериозом. Антибиотики и медюбиотехнология.1986,Ж.

42. Ющук Н.Д., В.Г.Лиходед и др. Титры антител к гликолипиду хемотипа Яе и связывание эндотоксина лейкоцитами при гнойных менингитахю Журн.микробиол. 1996, 6, 50.

43. Яковлев М.Ю. и др. Диагностическая информативность иммуноморфологической идентификации эндотоксин-положительных гранулоцитов в клинике и эксперименте.Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии.Механизмы противоинфекционного иммунитета. М. 1987,128.

44. Яковлев М.Ю. Роль кишечной микрофлоры и недостаточности барьерной функции печени в развитии эндотоксинемии и воспаления.Казан. мед.журн. 1988,5,353.

45. Яковлев М.Ю. и др. Альвеолярные макрофаги в физиологии и патологии легких. Арх.пат. 1991,4,3.

46. Яковлев М.Ю. Системная эндотоксинемия в физиологии и патологии человека. Автореф.дис.д-ра мед.наук.М.1993.

47. Яковлев М.Ю. и др. Иммуноферментные эндотоксин-тест-системы в оценке неблагоприятных экологических воздействий. Актуальные проблемы общей и частной патологии. Сб.трудов. НЕЙ морфыологии человека. М. 1993,14.

48. Яковлев М.Ю., В.Г.Лиходед и др. Использование показателей антиэндотоксинового иммунитета для объективной оценки сопротивляемости организма и эффективности терапии. Медицинский журнал России, 1998, 1-2, 139.

49. Ali М., Nolan J. J.Lab.Clin.Meth. 1967,70,295. Цитировано по Лиходед В.Г. и др. 1996с.

50. Beuth J. et al. Lectins: Mediators of Adhesion for Bacteria in Infectious Diseases and Tumor Cells in Metastasis. Zbl.Bakt. 1990, vol.274.

51. Berg R. Bacterial translocation from the gastrointestinal tract. In Medical Aspects of Microbial Ecology. Editor B.Shenderov. M. 1994, vol.78.

52. Bergman O. J.Clin.Microbiol. 1988,26,2105. Цитировано no Лиходедл В.Г. и др. 1996c.

53. Bog-Hansen T.et al. FEBS Lett. 1978,93,86. Цитировано no Лиходед и др. 1996c.

54. Boriello S. Microbial flora of the gastrointestinal tract. In Microbial Metabolism in the Digestive Tract. Ed.M.Hill. 1986.

55. demente С. et al.Gut,1977,18,556. Цитировано по Лиходед В.Г.и др. 1996с.

56. Chedid 1. et al. Localization and fate of 51Cr-labeled somatic antigens of smooth and rough Salmonellae. Ann.N. Y.Acad. Sei., 1966, 133, 712.

57. Dubos R. The microbiota of gastrointestinal tract. Gastroenterology, 1966, 51,5,868.

58. Duerden B. J.Med.Microbiol. 1988,26,161. Цитировано no Лиходед В.Г. и др. 1996c.

59. Emody L. et al. Antitoxoc immunity against the so-called lung toxin produced by Escherichia coli. Acta microbiol.Acad.Sci.hung.1979, 26,233.

60. Emody L.et al. Alpha-haemolysin: an additive virulence factor in Escherichia coli. Actamicrobiol.Acad.Sci.hung.,1980,27,4,333.

61. Finegold S. Normal Human Intestinal Flora. Ann.Ist.Super.Sanita, 1986, vol.22, N3.

Ml

62. Freter R. Interactions between mechanisms controlling the in-restinal microflora. Am J. Clin. Nutr. 1974, 24, 12, 1409.

63. Freter R. Interdependence of mechanisms that controll bacteria colonization of the large intestinale. Microecol.and Therapy, 1984 vol.14.

64. Freudenberg M. et al. Path.res. Pract.1985,26,137. Цитировано по Лиходед В.Г. и др. 1996c.

65. Gale L. Normal faecal flora of man. Am. J. Clin. Nutr. 1970, 23, 11,1157.

66. Glumeck N. et al. Bacterial endotoxins and host respons. Amsterdam,1980,p.79.

67. Haenel H, Bendig J. Intestinal flora in health and disease. Progr.Food.Nutr.Sei. 1975, 1, 21.

68. Hayes W. The Genetics of Bacteria and their viruses. 2 Ed.PxfordEdinburgh. 1968.

69. Hey de H., Henderix H. Eine einfache Methode mit Ringplatten zur quantitativen Bestimmung von Anaerobiern. Zbl.Bact.I.Orig. 1964, 195,1,80.

70. Hill M., DrasarB. Bacterial flora. Gut. 1975,16,4,318.

т

71. Hill М. et al. Factors controlling the intestinal flora. Eur J.Chemotherap.Antibiot. 1982, vol.2.

72. Justesen I. и др. The normal cultivable microflora in upper jejunal fluid in healthy adults. Scand.J.Gastroenterolog., 1984, 19, 2, 279.

73. Kataoka T. et al. Antibody and complement dependent damage to liposomes prepared with bacterial lipopolysaccharides. Eur.J.Biochem. 1971,21,80. 75.

74.Krisk E. et al. Microorganisms of the gastric antrum in Helicobacter pylori infection. Microecol.Therapy, 1995, vol.25.

75. Lang Ch.,Alteveer R.Amer. J.Physiol. 1986.251,3,341. Цитировано по Лиходед В.Г. и др. 1996c.

76. Lee A., Hallel S. Campylobacter pylori in health and diease: an ecological perspective. Microbial Ecology Health and Disease. 1988, vol.1, 1.

77. Link-Amster H. et al. Modulation of a specific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through fermented milk intake. FEMS Immunol.Med.Microbiol. 1994, vol. 10,N 1.

78. Lynn W.,Golenbook D. Immunol.Today.l992,13, 271. Цитировано по Яковлев М.Ю. и др. Эндотоксининдуцированные повреждения эндотелия. Архив патологии. 1996, 586 2, 41.

79. Mathison J., Ulevitch R. The clearance, tissue distribution and cellular localization of intravenouslyJinjected.lipopolysaccharide in rabbits. Immun. 1979,123,2133.

80. Mathison J.,Ulevitch R. J.Immun. In vivo interaction of bacterial lipopolysaccharide (LPS) with rabbit plateles: modulation by C3 and density lipoproteins. 1981,126,1575.

81. Mutai M.,Kawai Y. Factors influencing Bacterial Colonisation. In Recent Advances in Germfree Research. Editors Sasaki S. et al. Tokai Univer .Press. 1981.

82. Namba Y. et al. Effect of oral administration of Lysozyme or digested bacterial cell wall on immunostimulation in guinea pigs. In-fect.Immun. 1981, vol.31, N2.

83 Proctor R. Editor. Handbook of Endotoxin. Amsterdam. 1984.

84. Ramare F. et al. Colonization resistence against Clostridium perfritiges: involvement of an antimicrobial substances produced in vivo. Abstr.Intern.CongressMicrob.Ecol.Disease.Paris.28-30 October, 1996.

85. Redondo-Lopez V. et al. Emerging Role of Lactobacilli in the Control and Maintaince of the vaginal Bacterial Microflora. Rev.Infect.Dis., 1990, vol.12, N.5.

//¿г

86. Remolds D.,Swan К. Gastroenterology. 1972,63,4,601. Цитировано по Лиходед В.Г. и др. 1996с.

87. Rolfe R. Probiotics: prospects foruse in Clostridium difficile -associated intestinal disease. In Old Herborn University Seminar Monograph.N.8. Probiotics: Prospects of use in Opportunistic Infections. Editors Fuller R. et al. 1995.

88. Rosebury T. Microorganisms indigenous to man. N.Y.1962.

89. Savage D. The normal microflora composition. In The regularory and protective role of the normal microflora. Editors Grubb R. et al. M-Stocton Press, N.Y. 1989.

90. Savage D. Microbial ecology in the gastrointestinal tract. Ann.Rev.Microbiol.1977, 393.

91. Simjee A., et al. Gut, 1975, 16, 871. Цитировано по Лиходед В.Г. и др. 1996с.

92. Simon G., Gorbach S. Intestinal Flora in Health and Disease. Gastroenterology, 1984, vol.86.

93. Smith H.The haemolysins of Escherichia coli.J.Path.Bact.,1963,

85,197.

94. Smith H.W., S.Halls. The transmissible nature of the genetic factor in Escherichia coli that controls haemolysin production. J.Gen. Microbiol., 1967, 47, 153.

95. Smith H.W., M.A.Linggood. Observations on the pathogenic properties of the K88, Hly and Ent plasmids of Escherichia coli with particular reference to porcine diarrheas. J.Med.Microbiol., 1971,4, 467.

96. Sutter V. Anaerobes as normal oral flora. Rev.Infect.Dis. 1984, vol.6, suppl.l.

97. Tarao K.et al. Gastroenterology, 1977, 73, 539. Цитировано no Лиходед В.Г. и др. 1996c.

98. Tobias P. et al. Interactions of bacterial lipopolysaccharide with acute-phase rabbit serum and isolation of two forms of rabbit serum amyloid. Am.J.Immunol. 1982.128.1420.

99. Ulevitch R. et al. New function for high density lipoproteins: their participation in intravascular reactions of bacterial lipopoly-saccharides .J.Clin.Invest. 1979,64,1516.

100. Ulevitch R.J. et al. New function for high density lipoproteins. Isolation and characterization of a bacterial lipopolysaccharide - high density lipoprotein complex formed in rabbit plasma. J. Clin. Invest. 1981 .-67.-827.

101. Van Saene H. et al. Effect of Amoxicillin on colonization resistance in human volunteers. Microbiol.Ecol.Health Dis. 1988, vol.1.

102. Van der Waaij D. The Immunoregulation of the Intestinal Flora: experimental investigations on the development and the composition of the microflora in normal and tymusless mice. Microecol.Therapy., 1984,vol. 14.

103. Van der Waaij D. The Immunoregulation of the Intestinal Microflora: Consequences of Decreased Thymus Activity and Broad Spectrum Antibiotic Treatment. Zbl.Bact.Suppl.1985, Suppl.13.

104. Van der Waaij D. Evidence of immunoregulation of the composition of intestinal microglora and its practical consequwnces. Eu-rop J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 1988, vol.7.

105. Van der Waaij D. Colonozation Resistance of the Digestive Tract; An importance first barrier of defense to opportunistic infections in man and animals. Abstr.XII Intern.Sympos.Gnotobiology. Honolulu, June 2328, 1996.

106. Westphal O. Bacterial Endotoxins. Int.Arch.Allergy Appl.Immu-nol.1975,49,1.

/-/у

107. Wilson G. The normal flora of man: introduction, general cin-siderations and importance. In: The normal microflora of man. Skinner F., Carr J. (editors), London, Acad.Press, 1974, 1.

108. Wilson M. Rev.Infect.Dis.,1985, 7, 404. Цитировано no Лиходед В.Г. и др.1996c.

109. Yamaguchi K.et al.J.Reticuloendothel. Soc.1982,32,409. Цитировано по Лиходед В.Г. и др. 1996с.