Динамика мембранных токов и потенциалов, индуцированных светом в пирамидальных нейронах гиппокампа мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Ерофеев Александр Игоревич

• Ерофеев Александр Игоревич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Ерофеев Александр Игоревич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История появления оптогенетики

1.2 Оптогенетика

1.3 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ ОПСИНОВ В СПЕЦИФИЧНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ НЕЙРОНОВ

1.3.1 В ИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ

1.3.2 Электропорация

1.3.3 Трансгенные мыши

1.3.4 СЯЕ-ЗАВИСИМЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ

1.4 СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

1.5 Быстрое возбуждение - каналородопсины (СиЯ)

1.6 Быстрое ингибирование- галородопсины (№ИЯ)

1.7 Инструменты для модуляции биохимического сигналинга

1.8 ВЫБОР ПАРАМЕТРОВ СВЕТОВОГО ПУЧКА И ДОСТАВКА СВЕТА

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Линии мышей

2.2 ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА ГИППОКАМПА

2.3 Кальций-фосфатная трансфекция

2.5 Оптогенетический МЕТОД

2.6 МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ

ГЛАВА 3. ПАРАМЕТРЫ СВЕТОВОЙ СТИМУЛЯЦИИ

3.1 ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ ЧАСТОТОЙ СВЕТОВОГО СТИМУЛА И ГЕНЕРАЦИЕЙ ПОТЕНЦИАЛОВ ДЕЙСТВИЯ

3.2 ЗАВИСИМОСТЬ АМПЛИТУДЫ МЕМБРАННОГО ТОКА ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИ СВЕТОВОГО СТИМУЛА

3.3 ЗАВИСИМОСТЬ АМПЛИТУДЫ МЕМБРАННОГО ТОКА ОТ ИНТЕНСИВНОСТИ СВЕТОВОГО СТИМУЛА

3.4. ВРЕМЯ ДОСТИЖЕНИЯ МАКСИМУМА амплитуды (т)

3.5. СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА МЫШЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ каналородопсин-2, дикого типа и мышей-модели Болезни Альцгеймера

3.6. ГЕНЕРАЦИЯ СВЕТОИНДУЦИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ ДЕЙСТВИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗЬЮ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ ДИСЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БА Болезнь Альцгеймера

ПД Потенциал действия

СИЯ2 Каналородопсин-2

КрИЯ Галородопсины

ББО Ступенчато-функциональные опсины

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Динамика мембранных токов и потенциалов, индуцированных светом в пирамидальных нейронах гиппокампа мыши»

Актуальность работы

Головной мозг состоит из различных областей и типов нейронов, формирующих нейронные связи и типы активности. Возрастное и генетическое нарушение связей между нейронами может приводить к возникновению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона и др. В связи с ростом среднего возраста населения во всем мире, связанного с новыми достижениями медицины и техники, проблема нейродегенеративных заболеваний становится актуальной для современного общества. Поэтому на передний план выдвигаются задачи поиска причин, механизмов и возможных путей восстановления нарушенных типов нейронной активности.

Традиционно для изучения механизмов активности нервной ткани используют стимуляцию электрическим током через электрод, помещенный во внеклеточное пространство. Несмотря на то, что этот метод позволяет легко контролировать временное разрешение, в большинстве случаев многие нейроны в электрическом поле стимулируются одновременно. Существенным недостатком электрической стимуляции является также невозможность избирательной стимуляции нейронов определенного типа, поскольку они имеют свой специфический характер активности [1-3]. Альтернативным вариантом является внутриклеточная стимуляция, которая имеет необходимое пространственное и временное разрешение. Однако применение такого метода обычно ограничено культурами клеток или срезами.

Таким образом, одной из основных проблем при изучении активности нейронов является трудность стимулирования специфической группы нейронов,

особенно in vivo. Эту проблему удалось решить, когда появились оптогенетика с методами оптической стимуляции нейронов. В последнее время методы оптической стимуляции привлекают пристальное внимание из-за таких преимуществ по сравнению с обычными методами стимуляции, как: высокое пространственное и временное разрешение, параллельная стимуляция (возбуждение или угнетение) определенных участков головного мозга [4,5].

Оптогенетика - биофизический метод исследования работы нервных клеток, основанный на генетической модификации клеточной мембраны, целью которой является внедрение в мембрану нервных клеток специальных ионных каналов -опсинов, реагирующих на световые воздействия определенной длины волны.

Одним из представителей семейства опсинов, который наиболее широко применяется в практике, является каналородопсин-2 (ChR2). Этот светочувствительный белок выделен из глазного пятна зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii [6,7]. Активация каналородопсинов-2 происходит при возбуждении синим светом с максимумом возбуждения 470 нм, что в свою очередь вызывает мгновенные фоторецепторные токи из-за неселективного прохождения в цитоплазму клетки катионов (Na+, K+, Ca2+, H+) [7]. В 2005 году была продемонстрирована быстрая фотостимуляция генетически модифицированных нейронов, содержащих ChR2 [8].

Каналородопсины-2 достаточно часто используется в экспериментах на отдельных участках головного мозга, например, на гиппокампе для изучения механизмов нарушения памяти, связанного с повреждением пирамидальных нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера [9] и Хантингтона [10,11]

Для неселективного прохождения катионов через каналы СИЯ2 обычно применяется световая стимуляция с параметрами, аналогичными внеклеточной и внутриклеточной электрической стимуляции. В некоторых случаях такой подход может быть оправдан, например, когда применяется однократная световая стимуляция, т.к. в этом случае вклад в суммарную нейрональную активность за счет ионов, поступающих в клетку через систему каналов СИЯ2, будет одинаковым. Однако при многократном световом воздействии ситуация может кардинально измениться, например, из-за десенсибилизации [7] части каналов при длительной световой стимуляции. С точки зрения биофизики важно понимать, как совокупность экспрессированных в клеточной мембране каналородопсинов-2 будет изменять активность нейрона в ответ на изменение параметров световой стимуляции.

Так как активность нейронов, экспрессирующих СИЯ2, может изменяться при различных параметрах световой стимуляции (длительность, частота, интенсивность), актуальной задачей становится определение зависимостей между активностью нейрона и параметрами светового стимула, особенно при многократном воздействии.

Цель и задачи исследования Целью диссертационного исследования явилось определение параметров светового стимула, при которых электрофизиологический ответ пирамидальных нейронов гиппокампа в культуре, экспрессирующих каналородопсин-2, в ходе длительного воздействия будет стабильным.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Настройка экспериментального оборудования и разработка соответствующих протоколов для проведения оптогенетических исследований.

2. Освоение оптогенетического метода на первичной культуре нейронов гиппокампа мышей.

3. Определение частоты светового стимула, при которой будут генерироваться потенциалы действия на протяжении всего периода стимуляции.

4. Определение зависимости амплитуды мембранного тока от длительности и интенсивности светового стимула.

5. Определение зависимости времени достижения максимума амплитуды мембранного тока (т) от длительности светового стимула.

6. Выбор рабочих параметров светового стимула на основе полученных зависимостей.

7. Применение полученных параметров светового стимула в эксперименте.

Основные положения выносимые на защиту

На защиту выносятся следующие положения:

1. Частота следования светового импульса, вызывающая стабильную генерацию потенциалов действия у нейронов гиппокампа в культуре, находится в диапазоне от 1 Гц до 5 Гц.

2. Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа, экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимула при многократно повторяющихся воздействиях является нелинейной.

3. Величина амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа, экспрессирующих каналородопсин-2, возрастает при увеличении

интенсивности светового стимула в ходе многократно повторяющегося воздействия.

4. Время, необходимое для достижения максимума амплитуды мембранного тока (т), при увеличении длительности светового стимула изменяется нелинейно.

5. Электрофизиологическая активность пирамидальных нейронов гиппокампа при выбранных рабочих параметрах светового стимула у трансгенной линии PS1-M146V knock-in (KI) модели БА отличается от контрольной линии при светоиндуцированной активации.

6. Определенные в предварительных экспериментах параметры светового стимула позволяют генерировать потенциал действия в эксперименте с биологической обратной связью.

Научная новизна работы

Научная новизна диссертационного исследования определяется тем, что в нем представлены результаты, полученные при помощи поставленного и апробированного автором диссертации современного метода исследования работы нервных клеток - оптогенетики. Впервые исследована работа системы светочувствительных каналов в динамике в режиме длительной световой стимуляции. Определены зависимости между активностью гиппокампальных мышиных пирамидных нейронов, экспрессирующих светочувствительный (длина волны возбуждения 470нм) каналородопсин-2, и параметрами световой стимуляции при многократном воздействии. В работе впервые установлено, что:

1. Частота следования светового импульса, вызывающая стабильную генерацию потенциалов действия у нейронов гиппокампа в культуре, находится в диапазоне от 1 Гц до 5 Гц.

2. Зависимость величины амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа, экспрессирующих каналородопсин-2, от длительности светового стимула при многократно повторяющихся воздействиях является нелинейной.

3. Величина амплитуды мембранного тока нейронов гиппокампа, экспрессирующих каналородопсин-2, возрастает при увеличении интенсивности светового стимула в ходе многократно повторяющегося воздействия.

4. Время, необходимое для достижения максимума амплитуды мембранного тока (т), при увеличении длительности светового стимула изменяется нелинейно.

5. Электрофизиологическая активность пирамидальных нейронов гиппокампа при выбранных рабочих параметрах светового стимула у трансгенной линии PS1-M146V knock-in (KI) модели БА отличается от контрольной линии при светоиндуцированной активации.

6. Определенные в предварительных экспериментах параметры светового стимула позволяют генерировать потенциал действия в эксперименте с биологической обратной связью.

Научно-практические значение работы

Полученные результаты позволяют более глубоко понять работу системы

светозависимых ионных каналов ChR2, а также подобрать условия для стабильной

активации нейронов, экспрессирующих каналородопсины-2, в ходе многократной

световой стимуляции. Это даёт возможность оптимизировать проведение оптогенетических экспериментов с учетом минимального нагрева тканей, а также регулировать минимальный и максимальный клеточный ответ при световой стимуляции в экспериментах in vitro и в перспективе in vivo, например, при оценке синаптических связей между нейронами коры и стриатума при болезни Хантингтона или при исследовании механизмов памяти [12] и др.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: 3-й международной школе-конференции «Saint-Petersburg OPEN 2018» по Оптоэлектронике, Фотонике, Нано- и Нанобиотехнологиям (Санкт-Петербург, 2016); «Volga Neuroscience Meeting 2016» (Санкт-Петербург -Нижний-Новгород, 2016); Конференции с международным участием XLV «НЕДЕЛЯ НАУКИ СПбПУ» (Санкт-Петербург, 2016); на 4-й международной школе-конференции «Saint-Petersburg OPEN 2017 по Оптоэлектронике, Фотонике, Нано- и Нанобиотехнологиям» (Санкт-Петербург, 2017); нейрофоруме «Возможности для развития НейроНет на глобальном рынке» (Санкт-Петербург, 2017); Конференции с международным участием XLVI «НЕДЕЛЯ НАУКИ СПбПУ» (Санкт-Петербург, 2017); Всероссийской конференции с международным участием «Оптогенетика и оптофармакология» (Санкт-Петербург, 2018); «FENS Forum 2018» (Берлин, 2018).

Основные результаты по теме диссертационного исследования опубликованы в 16 научных работах. Из них 8 статей в изданиях, входящих в перечень ВАК, где 3 статьи опубликованы по материалам конференций и 8 статей в изданиях, не вошедших в перечень ВАК, из них 6 по материалам конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, указателя литературы и приложений. Глава 1 - обзор литературы - представляет собой анализ данных литературы о том, что такое оптогенетика, основные ее направления, каким образом можно доставить генетическую информацию, кодирующую опсины в специфических нейронах объекта исследования, а также о ее современном положении и тонкостях применения. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Глава 3 представляет изложение собственных результатов о зависимости активности пирамидных нейронов гиппокампа, экспрессирующих каналородопсин-2, от параметров световой стимуляции, применении выбранных параметров на основе определенных ранее зависимостей для исследования активности нейронов гиппокампа мышей дикого типа и мышей-моделей БА, а также обсуждение полученных результатов. В конце главы 3 приводятся данные о применении выбранных параметров световой стимуляции в экспериментах с биологической обратной связью. Текст диссертации изложен на 91 странице, содержит 6 таблиц, иллюстрирован 34 рисунками. Список литературы содержит 68 источников, из них отечественных - 2, зарубежных - 66.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История появления оптогенетики

В 1979 первооткрыватель структуры ДНК Фрэнсис Крик высказал предположение, что одной из главных задач в области нейронаук является избирательный контроль одного типа клеток в мозге при условии, что остальные клетки будут оставаться нетронутыми [13]. Так как электродами невозможно возбудить определенную область с необходимой точностью, а различные лекарства действуют слишком медленно, то Крик предположил, что видимый свет обладает всеми свойствами, чтобы использовать его в качестве инструмента контроля. Однако в то время не было никаких методов, чтобы сделать определенные клетки чувствительными к свету.

Положение изменилось с открытием опсинов - специфического класса светочувствительных ионных каналов (рис. 1).

ChR

HR

оооооооо оооооооо

оооооооо оооооооо

роооооооо\ оооооооо сГо

Рис. 1. Типы опсинов. СНаппе1гНос1орктк (СИИ) - светоактивируемый катионный канал.

OptoXR

Opsin TMs

intracellular domain from GPCR

На1огЬоёорв1м (НЯ) и бактериородопсины (БЯ) светоактивируемый хлорный канал и протонная помпа. Ор1оХЯ8 - опсины, связанные с О-белками, которые влияют на внутриклеточный сигналинг [14].

В 1971 Стокениус и Остерхельт установили, что бактериородопсин является ионным насосом, который может быть быстро активирован фотонами видимого света [15]. Позднее были найдены и другие представители этого семейства -

галородопсин (1977) и каналородопсин (2002) [6]. Опсины - специфический класс светочувствительных ионных каналов.

Тем не менее, долгое время считалось, что подобное объединение оптических и генетических методов не даст желаемого эффекта. Во-первых, по причине того, что чужеродные мембранные белки, встроенные в клетку, могут быть токсичными. С другой стороны, считалось, что индуцированные светом токи будут слишком малы. К тому же бактериальным опсинам для поглощения фотонов необходим еще и химический кофактор - полностью-трансретиналь (all-trans-ретиналь).

Летом 2005 была опубликована работа, в которой была продемонстрирована возможность использования бактериального опсина без добавления каких-либо других частей, компонентов или реагентов [8]. При этом нейроны становились чувствительными к свету. В следующие несколько лет в других работах было показано, что, как и каналородопсин, бактериородопсин и галородопсин также способны включать или выключать нейроны быстро и безопасно для клеток в ответ на облучение светом различного спектра. Ткани позвоночных уже содержат полностью-трансретиналь, и таким образом оптогенетический контроль возможен в интактных тканях мозга и даже в свободно передвигающихся животных.

1.2 Оптогенетика

Оптогенетика - методика, основанная на внедрении в клеточную мембрану светочувствительных ионных каналов, реагирующих на возбуждение светом определенной длиной волны.

Оптогенетика позволяет контролировать с помощью света электрическую активность определённого вида нейронов, клеточный сигналинг и другие процессы.

1.3 Генетические методы доставки генов опсинов в специфичные

популяции нейронов

Гены опсинов могут селективно экспрессироваться в определенном, выбранном заранее типе нейронов в мозге. Для этого необходимо использовать следующие генетические методы доставки:

1. Трансгенные технологии

2. Лентивирусы

3. Аденоассоциированные вирусы

4. Сге-зависимые системы экспрессии AAV

Рассмотрим основные стратегии, эффективность которых была доказана для достижения экспрессии in vivo (Таблица 1).

Таблица 1

Генетические методы доставки генов опсинов

Метод Типы клеток Время Свойства

Трансгенные технологии Любой тип клеток при использовании молекулярных маркеров От 6 месяцев до года Можно добиться высокой специфичности, используя бактериальные специфичные хромосомы.

Лентивирусы Клеточно-специфичные промоторы. СаМК11а - глутаматергические нейроны, вБАР -астроциты, гипокретин-секретирующие нейроны. 2 недели после введения для достижения необходимого уровня экспрессии, 2 недели для создания рекомбинантного вируса. Легко достигается высокий уровень экспрессии. Экспрессия сохраняется несколько лет. Невозможно использовать большие фрагменты промоторов. Как следствие - недостаточная специфичность. Недостаточная точность стереотаксического введения. Некоторое количество клеточно-специфичных промоторов характеризуется низким уровнем экспрессии. В настоящее время используется почти во всех экспериментальных животных-млекопитающих.

Аденоассоциирован ные вирусы Клеточно-специфичные промоторы. 8упар8т1 - нейрон- специфичный, ррББТ- ББТ-нейроны 3 недели после введения для достижения необходимого уровня экспрессии, 2 недели для создания рекомбинантного вируса. Легко достигается высокий уровень экспрессии. Экспрессия сохраняется несколько лет. Невозможно использовать большие фрагменты промоторов. Как следствие - недостаточная специфичность. Недостаточная точность стереотаксического введения. Некоторое количество клеточно-специфичных промоторов характеризуется низким уровнем экспрессии.

3 недели после введения

Специфичность для достижения

Сге-зависимые определяется необходимого уровня

системы экспрессии выбором линии экспрессии, Совпадают с AAV

AAV трансгенных мышей 3 недели для создания

Сге. рекомбинантного

вируса.

1.3.1 Вирусные системы

В отличие от большинства генетических методов, вирусные векторы, основанные на лентивирусах и аденоассоциированных вирусах (AAY), не требуют использования трансгенных животных-моделей. Подобные методы позволяют достичь высокого уровня экспрессии генов опсинов и в грызунах, и в приматах в период до нескольких месяцев. Векторы, основанные на лентивирусах и аденоассоциированных вирусах, используемые в экспериментах, обладают следующими параметрами: >109 трансдуцирующих единиц для лентивирусов и >1012 геномных копий для AAY. В общем случае, экспрессия генов опсинов в мозге грызунов достигает необходимого уровня спустя 3 недели после введения AAY и 2 недели - после введения лентивируса. Для достижения стационарного уровня экспрессии в дистальных частях аксонов может понадобиться уже более 6 недель. При выборе варианта доставки генетического материала по средством вирусной конструкции, например, аденоассоциированного вируса важно правильно выбирать промотор и серотип1. В статье [16] авторы проводили сравнение AAY с различным серотипом (1, 2, 5, 8, 9). В результате, вирусная конструкция AAV2 показала самую низкую эффективность, по сравнению с AAY других серотипов (рис. 2.). Авторы отметили также большую токсичность конструкций AAV, содержащих CMY, по отношению к остальным промоторам. Было отмечено, что по сравнению с промотором Synl промотор СаМКП демонстрировал более диффузный характер, что предполагает однородную трансдукцию нейронов. В других исследованиях [16,17] авторами была отмечена лучшая эффективность AAV имеющих 5 и 9 серотипы. Таким образом, при выборе доставки генетического материала по средством аденоассоциированных вирусов важно выбирать

1 антигенная характеристика вируса, установленная на основе взаимодействия с антителами

оптимальное сочетание между серотипом и промотором в зависимости от цели и задач исследования.

AAV1

AAV2

AAV5

AAV8

AAV9

CL

LL

О

-С

О

500um

«к

CL LL

О

то О

CL

LL

о

с >.

СО

N.D.

Рис. 2. Экспрессия GFP упакованного в капсиды AAV1, 2, 5, 8 и 9 введенных в кору головного мозга примата. Конструкции AAV, содержали CMV, CaMKII и SynI промоторы [16].

1.3.2 Электропорация

Для достижения экспрессии в некоторые типах клеток можно использовать метод электропорации in utero в определенные дни развития эмбриона. С помощью этого метода можно обеспечить адресную доставку гена в корковые слои II и III, в нейроны стриатума и гиппокампа [18-20]. В отличие от вирусных методов, с помощью электропорации можно доставлять ДНК любого размера с большими промотерными сегментами для достижения большей клеточной специфичности. Электропорация также позволяет внедрить большее количество копий гена.

1.3.3 Трансгенные мыши

Необходимую экспрессию генов опсинов можно достичь, используя трансгенные кассеты, несущие рекомбинантные промоторы, и трансгенные конструкции, основанные на бактериальных искусственных хромосомах. Было получено несколько линий трансгенных мышей без изменений репродуктивных свойств и без заметных изменений в поведении, экспрессирующих СИЯ2 под ТИу-1 промотором [21,22].

1.3.4 Сге-зависимые системы экспрессии

Хотя клеточно-специфичные промоторы эффективны для достижения необходимого уровня экспрессии в определенных типах нейронов, некоторые промоторы обладают слабой транскрипционной активностью. С их помощью невозможно достичь экспрессии, при которой опсины смогут эффективно создавать потенциал действия. Для увеличения транскрипционной активности были созданы специальные Сге-зависимые ЛЛУ-векторы. Такие векторы содержат трансгенные кассеты, которые активируются только в присутствии Сге в трансгенных линиях животных. Таким образом, для увеличения экспрессии в определенном типе клеток необходимо выбрать нужную линию мышей.

1.4 Современные достижения

За прошедшие годы с помощью новой технологии был проведен ряд интереснейших экспериментов. Разрабатываются новые опсины с целью применения оптогенетики в многообразных исследованиях на различных организмах. В 2008 году, например, из водоросли УоЬохеаПвп был выделен каналородопсин УСИШ, который чувствителен к желтому, а не синему цвету [23]. Таким образом, используя параллельно несколько типов каналородопсинов, можно

одновременно контролировать смешанные популяции клеток - одни команды будут отдаваться желтым светом первому типу клеток, синим - второму. Генетически были также созданы так называемые "быстрые" и "медленные" опсины, которые позволяют осуществлять временной контроль над потенциалом действия. Первые из них способны создавать потенциал действия до 200 раз в секунду [24]. Уже существуют опсины, чувствительные к свету, частота которого находится на границе видимого и инфракрасного диапазонов. Свет с данной частотой проникает глубже внутрь ткани и легче фокусируется.

Одной из самых интересных возможностей применения онтогенетических методов является контроль не только за электрическими явлениями в нейроне, но и за определенными биохимическими событиями. Как известно, большое количество медицинских препаратов действует через взаимодействие с семейством мембранных рецепторов - вРСЯ. Эти рецепторы действуют по принципу передачи сигнала от какого-либо соединения (лекарства) извне внутрь клетки, тем самым изменяя внутриклеточный сигналинг, например, уровень ионов кальция. Если добавить светочувствительный домен от родопсина к вРСЯ, можно получить рецепторы, чувствительные к зеленому свету. Такие рецепторы получили название орШХЯ [25]. При доставке с помощью вируса однокомпонентного гена орШХЯ в мозг лабораторных животных удалось осуществить клеточно-специфичный контроль светом определенных биохимических путей передачи сигнала [25].

Разработка новых оптоволоконных приборов позволила осуществить доставку светового пучка в любую область мозга свободно двигающихся животных. Была также создана методика, позволяющая одновременно исследовать оптическое возбуждение и регистрацию электрических импульсов. В настоящее время возможно, например, напрямую измерять электрическую активность в нейронных

ансамблях, ответственных за моторную деятельность, одновременно контролируя их с помощью опсинов.

Первые оптогенетические исследования, выполненные на свободно двигающихся животных, были направлены на исследования нейронов, синтезирующих нейротрансмиттер гипокретин [26]. Эти клетки считаются ответственными за одно из нарушений сна - нарколепсию. Именно в этих клетках были обнаружены специфические типы электрической активности, которые в совокупности приводят к пробуждению. С помощью оптогенетики было также показано, как допамин-синтезирующие нейроны отвечают за чувство радости [27].

Одними из самых известных экспериментов с применением оптогенетики являются опыты по исследованию новейших методов лечения болезни Паркинсона [28,29]. Данная патология характеризуется нарушением передачи информации в substantia nigra parscompacta - в нейронах, ответственных за моторную деятельность. Для лечения болезни Паркинсона с начала 90-х годов применяется глубокая стимуляция мозга. При этой методике переменный электронный импульс подается в определенные отделы мозга с помощью имплантируемых инструментов. Тем не менее, потенциально эффективная стратегия лечения сильно ограничена, так как электродами стимулируются отдельные клетки мозга не выборочно. Фундаментальное понимание данного метода лечения было получено с применением оптогенетики. При переключении различных типов нейронов у лабораторных мышей (моделей болезни Паркинсона) были обнаружены неожиданные результаты. Наибольший терапевтический эффект достигается не стимуляцией определенного вида клеток, а воздействием на активность соединительных аксонов.

1.5 Быстрое возбуждение - каналородопсины (СИК)

Рассмотрим основные стратегии, с помощью которых может достигаться оптический контроль с использованием опсинов.

В некоторых случаях ген микробного родопсина, например СИЯ2 (рис. 3), встроенный в нейроны, может привести к светоиндуцированному фототоку.

inside cell

Т eYFP ^ 'd\\-trans retinal Na+ О COOH

Рис. 3. Схематичное изображение ChR2, экспрессированного в клеточной мембране [30].

В настоящее время в основном используются модифицированные виды опсинов. В частности, некоторые кодоны водорослей были заменены на кодоны млекопитающих, что значительно повысило экспрессию данных генов. Безусловно, изменение кодонов может привести к непредвиденным эффектам, когда наряду с повышенной экспрессией в нейронах млекопитающих наблюдается также снижение других функций или экспрессии в других типах клеток. Например, внедрение аминокислотной замены H134R в ChR2 привело к увеличению фототока в два раза при длительной стимуляции, однако временная точность резко снизилась на фоне уменьшения скорости закрытия каналов [31].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ерофеев Александр Игоревич, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hutcheon B., Yarom Y. Resonance, oscillation and the intrinsic frequency preferences of neurons // Trends in Neurosciences. 2000. Vol. 23, № 5. P. 216222.

2. Pike F.G. et al. Distinct frequency preferences of different types of rat hippocampal neurones in response to oscillatory input currents // J. Physiol. 2000. Vol. 529, № 1. P. 205-213.

3. Somogyi P., Klausberger T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus // Journal of Physiology. 2005. Vol. 562, № 1. P. 9-26.

4. Callaway E.M., Yuste R. Stimulating neurons with light // Current Opinion in Neurobiology. 2002. Vol. 12, № 5. P. 587-592.

5. Miesenböck G. Genetic methods for illuminating the function of neural circuits // Curr Opin Neurobiol. 2004. Vol. 14, № 3. P. 395-402.

6. Nagel G. et al. Channelrhodopsin-1: A light-gated proton channel in green algae // Science (80-. ). 2002. Vol. 296, № 5577. P. 2395-2398.

7. Nagel G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. Vol. 100, № 24. P. 1394013945.

8. Boyden E.S. et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity // Nat. Neurosci. 2005. Vol. 8, № 9. P. 1263-1268.

9. Liu X. et al. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall // Nature. 2012. Vol. 484, № 7394. P. 381-385.

10. Ramirez S., Tonegawa S., Liu X. Identification and optogenetic manipulation of memory engrams in the hippocampus // Front. Behav. Neurosci. 2014. Vol. 7.

11. Hodges J.R., Salmon D.P., Butters N. Differential impairment of semantic and episodic memory in Alzheimer's and Huntington's diseases: A controlled prospective study // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1990. Vol. 53, № 12. P. 1089-1095.

12. Vann K.T., Xiong Z.G. Optogenetics for neurodegenerative diseases // International Journal of Physiology, Pathophysiology and Pharmacology. 2016. Vol. 8, № 1. P. 1-8.

13. Crick F.H. Thinking about the brain. // Sci. Am. 1979. Vol. 241, № 3. P. 219-232.

14. Mei Y., Zhang F. Molecular tools and approaches for optogenetics // Biological Psychiatry. 2012.

15. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium // Nat. New Biol. 1971. Vol. 233, № 39. P. 149-152.

16. Watakabe A. et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex // Neurosci. Res. 2015.

17. Aschauer D.F., Kreuz S., Rumpel S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain // PLoS One. 2013.

18. Gradinaru V. et al. Targeting and Readout Strategies for Fast Optical Neural Control In Vitro and In Vivo // J. Neurosci. 2007. Vol. 27, № 52. P. 14231-14238.

19. Adesnik H., Scanziani M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits // Nature. 2010. Vol. 464, № 7292. P. 1155-1160.

20. Petreanu L. et al. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections // Nat. Neurosci. 2007. Vol. 10, № 5. P. 663-668.

21. Arenkiel B.R. et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2 // Neuron. 2007. Vol. 54, № 2. P. 205-218.

22. Zhao S. et al. Improved expression of halorhodopsin for light-induced silencing of neuronal activity // Brain Cell Biol. 2008. Vol. 36, № 1-4. P. 141-154.

23. Zhang F. et al. Red-shifted optogenetic excitation: A tool for fast neural control derived from Volvox carteri // Nat. Neurosci. 2008. Vol. 11, № 6. P. 631-633.

24. Gunaydin L.A. et al. Ultrafast optogenetic control // Nat. Neurosci. 2010. Vol. 13, № 3. P. 387-392.

25. Airan R.D. et al. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling // Nature. 2009. Vol. 458, № 7241. P. 1025-1029.

26. Adamantidis A.R. et al. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons // Nature. 2007. Vol. 450, № 7168. P. 420-424.

27. Tsai H.C. et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning // Science (80-. ). 2009. Vol. 324, № 5930. P. 1080-1084.

28. Kravitz A. V. et al. Regulation of parkinsonian motor behaviours by optogenetic control of basal ganglia circuitry // Nature. 2010. Vol. 466, № 7306. P. 622-626.

29. Gradinaru V. et al. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry // Science (80-. ). 2009. Vol. 324, № 5925. P. 354-359.

30. G N. et al. Channelrhodopsins: Visual regeneration and neural activation by a light switch // New Biotechnology. 2013.

31. Nagel G. et al. Light activation of Channelrhodopsin-2 in excitable cells of caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses // Curr. Biol. 2005. Vol. 15, № 24. P. 2279-2284.

32. Kleinlogel S. et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the

Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh // Nat. Neurosci. 2011. Vol. 14, № 4. P. 513-518.

33. Zhang Y.P., Oertner T.G. Optical induction of synaptic plasticity using a lightsensitive channel // Nat. Methods. 2007. Vol. 4, № 2. P. 139-141.

34. Gradinaru V. et al. Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics // Cell. 2010. Vol. 141, № 1. P. 154-165.

35. Berndt A. et al. Bi-stable neural state switches // Nat. Neurosci. 2009. Vol. 12, № 2. P. 229-234.

36. Bamann C. et al. Structural guidance of the photocycle of channelrhodopsin-2 by an interhelical hydrogen bond // Biochemistry. 2010. Vol. 49, № 2. P. 267278.

37. Diester I. et al. An optogenetic toolbox designed for primates // Nat. Neurosci. 2011. Vol. 14, № 3. P. 387-397.

38. Yizhar O. et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction // Nature. 2011. Vol. 477, № 7363. P. 171-178.

39. Berndt A. et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 108, № 18. P. 7595-7600.

40. Sato M. et al. Role of putative anion-binding sites in cytoplasmic and extracellular channels of Natronomonas pharaonis halorhodopsin // Biochemistry. 2005. Vol. 44, № 12. P. 4775-4784.

41. Scharf B., Engelhard M. Blue Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis: Wavelength Regulation by Anions // Biochemistry. 1994. Vol. 33, № 21. P. 6387-6393.

42. Lanyi J.K., Oesterhelt D. Identification of the retinal-binding protein in

halorhodopsin // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, № 5. P. 2674-2677.

43. Zhang F. et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry // Nature. 2007. Vol. 446, № 7136. P. 633-639.

44. Han X., Boyden E.S. Multilpe-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution // PLoS One. 2007. Vol. 2, № 3.

45. Gradinaru V., Thompson K.R., Deisseroth K. eNpHR: A Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications // Brain Cell Biol. 2008. Vol. 36, № 1-4. P. 129-139.

46. Sohal V.S. et al. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance // Nature. 2009. Vol. 459, № 7247. P. 698-702.

47. Busskamp V. et al. Genetic reactivation of cone photoreceptors restores visual responses in retinitis pigmentosa // Science. 2010. Vol. 329, № 5990. P. 413-417.

48. Aravanis A.M. et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. // J. Neural Eng. 2007. Vol. 4, № 3.

49. Li X. et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. Vol. 102, № 49. P. 17816-17821.

50. Melyan Z. et al. Addition of human melanopsin renders mammalian cells photoresponsive // Nature. 2005. Vol. 433, № 7027. P. 741-745.

51. Kim J.M. et al. Light-driven activation of ß2-adrenergic receptor signaling by a chimeric rhodopsin containing the ß2-adrenergic receptor cytoplasmic loops // Biochemistry. 2005. Vol. 44, № 7. P. 2284-2292.

52. Moorman D.E., Aston-Jones G. Optical control of reward // Nature. Nature

Publishing Group, 2009. Vol. 458. P. 980.

53. Bruegmann T. et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo // Nat. Methods. 2010. Vol. 7, № 11. P. 897-900.

54. Nikolic K. et al. Photocycles of channelrhodopsin-2 // Photochem. Photobiol. 2009. Vol. 85, № 1. P. 400-411.

55. Hegemann P., Ehlenbeck S., Gradmann D. Multiple photocycles of channelrhodopsin // Biophys. J. 2005. Vol. 89, № 6. P. 3911-3918.

56. Bamann C. et al. Spectral Characteristics of the Photocycle of Channelrhodopsin-2 and Its Implication for Channel Function // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 375, № 3. P. 686-694.

57. Chen X. et al. Dantrolene is neuroprotective in Huntington's disease transgenic mouse model // Mol. Neurodegener. 2011. Vol. 6, № 1.

58. Jiang M., Chen G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 2. P. 695-700.

59. Ishizuka T. et al. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels // Neurosci. Res. 2006. Vol. 54, № 2. P. 85-94.

60. Grossman N. et al. The spatial pattern of light determines the kinetics and modulates backpropagation of optogenetic action potentials // J. Comput. Neurosci. 2013. Vol. 34, № 3. P. 477-488.

61. Halling D.B., Aracena-Parks P., Hamilton S.L. Regulation of voltage-gated Ca2+ channels by calmodulin. // Science's STKE : signal transduction knowledge environment. 2006. Vol. 2006, № 318.

62. Catterall W. a. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. // Annu Rev Cell Dev Biol. 2000. Vol. 16. P. 521-555.

63. Wang R. et al. Presenilin 1 familial Alzheimer's disease mutation leads to defective associative learning and impaired adult neurogenesis // Neuroscience.

2004. Vol. 126, № 2. P. 305-312.

64. Sun X. et al. Hippocampal spatial memory impairments caused by the familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 M146V mutation // Neurodegener. Dis.

2005. Vol. 2, № 1. P. 6-15.

65. Bezprozvanny I., Mattson M.P. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer's disease // Trends in Neurosciences. 2008. Vol. 31, № 9. P. 454-463.

66. Stutzmann G.E. The Pathogenesis of Alzheimers Disease—Is It a Lifelong "Calciumopathy"? // Neurosci. 2007. Vol. 13, № 5. P. 546-559.

67. Berridge M.J. Neuronal calcium signaling. // Neuron. 1998. Vol. 21, № 1. P. 1326.

68. Zhang H. et al. Calcium Signaling, Excitability, and Synaptic Plasticity Defects in a Mouse Model of Alzheimer's Disease // J. Alzheimer's Dis. 2015. Vol. 45, № 2. P. 561-580.

1 мкг ДНК 3 мкл 2М СаС12 XX мкл Н20 Общий объем 25 мкл

Добавить А к Б

25 мкл 2Х НВБЗ

Добавить А к Б. Добавлять по Ул объема А по каплям при мягком помешивашш в течение 2-3 сек на мешалке

Инкубировать смесь растворов А+Б при комнатной температуре в течение 5мин (можно пропустить этот шаг)

Добавить смесь растворов А+Б (25 мкл) по каплям на 1 стекло/1 лунку

Инкубировать клетки в течение 45 мин - 3 часа в 5% С02 инкубаторе при 37°С

Инкубировать клетки в присутствии «закисленной среды» в течение 5-15 мин в 5% С02 инкубаторе при 37°С

I

Отобрать «закисленную среду», добавить по 0,5 мл «свежей ростовой среды» и 0,5 мл «старой среды»

Рис. 22. Протокол кальций-фосфатной ко-трансфекции

В растворе А в случае кальций-фосфатной ко-трансфекции вместо одной плазмиды в концентрации 1мкг/мкл добавляли две плазмиды: целевую БСК-СИК^-ОБР и маркерную рСБСМУМТотаШ таким образом, чтобы суммарная концентрация составляла 1мкг/мкл. При этом соотношение целевой и маркированной плазмиды составляло 3:1. Концентрацию плазмиды БСК-СЬЯ2-ОБР умножали на коэффициент 0,75, а концентрацию рСБСМУМТотаШ на 0,25.

Таблица 4

Состав искусственной спинномозговой жидкости (ЛС8Е)

Сток 1

№ Наименование мМ Мг (г/моль) Объем, мл масса, г х10

1 №С1 127 58,44 1000 7,42 74,22

2 КС1 1,0 74,55 0,07 0,75

3 КН2РО4 1,2 136,09 0,16 1,63

4 №НСОз 26 84,01 2,18 21,84

5 Э-глюкоза 10 180,16 1,80 18,02

Сток 2 (1М сток)

6 СаС12 1000 110,98 50 5,5490

Сток 3 (1М сток)

7 MgCl2 1000 95,21 100 9,5211

После взвешивания солей растворяли их дистиллированной водой в нужном

объеме, не доводя до конечного значения. После того, как все соли были растворены, насыщали раствор ЛСББ карбогеном (95% О2 / 5% СО2) в течение 1520 минут для стабилизации рН до уровня 7,3-7,4. После чего добавляли необходимый объем 1М СаСЪ и 1М MgCl2 доводя раствор до конечной концентрации: 2,4 мМ СаСЪ, 1,3 мМ MgCl2.

Ниже приведены расчеты необходимых объемов 1М СаСЪ и 1М MgCЪ на 15

мл ЛСББ.

Таблица 5

Необходимый объем 1М СаСЬ и 1М MgCl2 для ЛС8Е

Итоговая концентрация в растворе (мМ) Объем стока 1 (ЛС8Е), мл Необходимый объем, цл

СаСЪ 2,4 15 36

М§СЬ 1,3 19,5

Таблица 6

Состав раствора для заполнения стеклянного микроэлектрода

№ Наименование Мг (г/моль) мМ грамм на 15 мл грамм на 50 мл

1 K-глюконат 234,25 140 0,4919 1,6397

2 MgCl2 95,21 2 0,0029 0,0095

3 ша 58,44 2 0,0018 0,0058

4 ATP-Na2 551,15 2 0,0165 0,0551

5 GTP- Mg 547,49 0,3 0,0025 0,0082

6 HEPES 238,30 10 0,0357 0,1192

среднее из 10 измерений

Время[1од 10], мс

Рис. 23. Зависимость значения амплитуды мембранного тока одного нейрона гиппокампа от длительности светового стимула при разных интенсивностях света (ось абсцисс указана в логарифмическом масштабе, максимальное значение 1тах=35 мВ-мм-2 принималось за 1).

* первый стимул

500л

т

0.9

0.8

0.7 0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

о о

X

со ^

0

1

ф

о; го

I

л §

о о

X

10 100 Время[1од 10], мс

1000

Рис. 24. Зависимость значения амплитуды мембранного тока одного нейрона гиппокампа от длительности светового стимула для первых ответов* при разных интенсивностях света (ось абсцисс указана в логарифмическом масштабе, максимальное значение 1тах=35 мВ-мм2 принималось за 1).

1тах 1=2мс

1тах 1=3мс

§ Г

с

с <

Номер стимула

¡1 100

С 50 С

5 <

5 10

Номер стимула

с 140-

га"

5 120 р

5 100

с с

5 80 <

5 10

Номер стимула

1тах 1=4мс

1тах 1=Ьм(;

1тах 1=1 Оме

га

3140

Р

5 120 с

5 юо <

Номер стимула

200

<

с 180'

га

а то

Р

14(1

С

С

7 120

<

100'

Номер стимула

~ 350-

га

Р'зоо-5 С

С 250г <

200

Номер стимула

|тах 1-30мС

|тах 1=40мС

I

5 С С

Е <

Номер стимула

500

<

С 400

га

4 зоо

Р

3 200 С

5 юо <

5 10

Номер стимула

400

< С

- зооН га

р200-

г <

5 10

Номер стимула

1тах 1=50мс

1тах1=100мс

|тах 1=200мс

400

<

С

. 300

га

р200

г <

- 300 га

^200 ^

С 100

г <

о

5 10

Номер стимула

|тах 1=300мс

5 10

Номер стимула

- 300

га

Р 200

2 <

-300

га

^ 200

5 <

5 10

Номер стимула

|тах 1=400мс

5 10

Номер стимула

- 300

га

Р 200

г <

га

2 <

5 10

Номер стимула

|тах 1=500мс

5 10

Номер стимула

Рис. 25. Динамика амплитуды мембранного тока при максимальной интенсивности (1тах) и

разных длительностях светового импульса

80-1

<

<

0-1-,-1-1

О 5 10 15

Номер стимула

1=0.9 1=2мс

Номер стимула

110П

<

с юо-

с

5 70-<

60-1-,-,-

О 5 10

Номер стимула

1=0.9 <=4мс

1=0.9 (=5мс

1=0.9 1=1 Оме

5 10

Номер стимула

- 140-ГО

^120

с;

С 100-1

5 <

5 10

Номер стимула

га

3 240?

5 220-

с;

С

5 200-<

180

5 10

Номер стимула

1=0.9 1=20мс

1=0.9 1=30мс

1=0.9 1=40мс

5 10

Номер стимула

я

3 220-Р

5 200-

с;

С

5 180-<

160

5 10

Номер стимула

-2505 р200

с;

с 150-1

5 <

100

5 10

Номер стимула

1=0.9 1=50мс

1=0.9 1=100мс

1=0.9 1=200мс

5 10

Номер стимула

И 180-р160 140-

С

2 120-<

100

5 10

Номер стимула

- 160-го

^140

ц

С 120-1

5 <

100

5 10

Номер стимула

1=0.9 (=300мс

Номер стимула

1=0.9 1=400мс

0 5 10 15

Номер стимула

1=0.9 1=500мс

200-,

5

с;

5 <

0-1-,-,-,

О 5 10 15

Номер стимула

1=0.8 1=4мс

1=0.8 1=5мс

1=0.8 1=1 Оме

5 10

Номер стимула

- 140-

га Ц

С 100

г <

5 10

Номер стимула

ГО 220Ц 200-

С <

5 10

Номер стимула

1=0.8 1=20мс

1=0.8 1=30мс

1=0.8 1=40мс

5 10

Номер стимула

220-

СО

^200

I-

5 180 С

5 160 <

140

5 10

Номер стимула

лз

^ 200-

ь

5 180Ц

| 160-<

140

5 10

Номер стимула

1=0.8 1=50 мс

1=0.8 1=1 ООмс

1=0.8 1=200мс

5 10

Номер стимула

га

4 160 Г

5 140 С

С

5 120-<