Дифференциация лептоспир различных экологических групп на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL32 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Земская, Марина Сергеевна

• Земская, Марина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Земская, Марина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Современная классификация и таксономия лептоспир.

2. Экология лептоспир.

3. Строение генома лептоспир.

4. Строение клеточной стенки и наружной мембраны лептоспир.

5. Липопротеины наружной мембраны лептоспир.*.

5.1. Основной белок наружной мембраны лептоспир — 1лрЬ32.

5.2.1лрЬ41.

5.3. ЫрЬЗб.

6. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов.

6.1. Применение ПЦР в диагностике лептоспирозов.

7. Методы дифференциации патогенных лептоспир от сапрофитов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов, препараты ДНК.

2.1.2.Модельные образцы для определения чувствительности ПЦР тест-системы.

2.1.3.Клинический материал.

2.2. Методы.

2.2.1. Культивирование лептоспир.

2.2.2. Определение концентрации лептоспир в счетной камере Петрова-Хауссера.

2.2.3.Техника постановки реакции микроагглютинации (РМА) при лептоспирозах.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.2.4.1. Подготовка проб для ПЦР-анализа чистых культур.

2.2.4.2. Приготовление модельных образцов для ПЦР-анализа.

2.2.4.3. Приготовление и обработка проб для модельных систем.

2.2.4.4. Приготовление суспензий из органов лабораторных животных.

2.2.4.5. Подготовка образцов для ПЦР-анализа.

2.2.5. Праймеры для ПЦР.

2.2.6. Условия проведения ПЦР и регистрация результатов.

2.2.7. Определение аналитической чувствительности ПЦР тест системы.

2.2.8. Условия проведения nested- ПЦР.

2.2.9.Статистическая обработка результатов.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР LipL41.

3.1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров.

3.2. Результаты исследования с праймерами, Lep640up/ Lep894low и Lep476up/ Lep640low. t

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН

НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР LipL32.

4.1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров.

4.2. Подбор оптимальных условий проведений ПЦР с праймерами LEP21/LEP22.

4.3. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК.

4.4. Определение специфичности тест системы с использованием праймеров LEP21 и LEP22.

4.5. Определение аналитической чувствительности тест-системы.

4.6. Результаты ПЦР с использованием праймеров LEP2-351 и LEP2-534.

4.6.1. Специфичность тест системы с использованием праймеров LEP2-351 и

LEP2-534.

4.6.2.Определение аналитической чувствительности тест-системы.

4.6.3. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК.

4.7. Nested - вариант ПЦР тест-системы.

4.7.1. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК.

4.7.2.Специфичность тест системы.

4.7.3. Определение аналитической чувствительности тест-системы.

4.8.Определение распространенности гена, кодирующего 1лр132, у представителей различных таксономических групп.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ И КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР ПрЬ32.

5.1. Модельные образцы.

5.1.1 .Специфичность тест-системы.

5.1.2. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК.

5.1.3. Определение аналитической чувствительности.

5.2. Исследование клинических образцов (сыворотки).

5.2.1.Исследование сывороток крови больных во время вспышки лептоспироза в Краснодарском крае в 2002г.

5.2.2.Исследование сывороток крови больных во время вспышки лептоспироза в Краснодарском крае в 2003г.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дифференциация лептоспир различных экологических групп на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL32»

Лептоспирозы — группа нетрансмиссивных природно-очаговых инфекций, занимающая первое место в мире среди зоонозов по широте распространения природных и антропургических очагов [96]. Массовость заболеваний среди населения характерная для одних этиологических форм (Pomona, Grippotyphosa); тяжелое течение с высокой летальностью, отличающее другие (Icterohaemorrhagiae и Canicola), ставят эти инфекции в один ряд с особо опасными [19].

По ориентировочным оценкам международных экспертов ежегодно в мире более 100000 людей заболевают тяжелыми формами лептоспирозов, требующих госпитализации' [96]. Однако значительная часть случаев официально не регистрируется или проходит под другими диагнозами ввиду сложности клинической диагностики и ее лабораторного подтверждения. По этой причине лептоспирозы отнесены к группе так называемых «пренебрегаемых» (neglected) инфекций.

В Российской Федерации лептоспирозы также относятся к числу широко распространенных природно-очаговых инфекций человека, что обусловлено наличием почти на всех территориях, как в сельской местности, так и в городах, природных и хозяйственных очагов. Им принадлежит одно из первых мест среди зоонозов по тяжести клинического течения и частоте летальных исходов. При средних показателях летальности в Российской Федерации 3 - 4,5% на отдельных территориях эндемичных по лептоспирозам Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают 20% и более [12].

Убиквитарное распространение лептоспирозов в мире обусловлено широким спектром резервуарных хозяев патогенных лептоспир и восприимчивых к ним видов животных, равно как и высокой степенью биоразнообразия возбудителей - антигенного, экологического и генетического [42, 4, 159].

По данным современной филогенетики лептоспиры относятся к древнейшим эубактериям, находящимся в прикорневой развилке эволюцинных путей [72]. В пределах этого семейства имеются представители разнообразных экологических групп: свободноживущие непатогенные, включая галофилы, и патогенные - возбудители лептоспирозов людей и животных. Последние также отличаются по хозяинной и органной специфичности, способности к существованию во внешней среде и другим ' признакам, значимым в клинико-эпидемиологическом контексте.

Высказывалось мнение о принадлежности всех патогенных лептоспир [40, 20] или их отдельных представителей, например, grippotyphosa, к возбудителям сапронозов [4].

В течение многих десятилетий в пределах рода Leptospira выделяли два вида - Leptospira interrogans (паразитические) и Leptospira biflexa (свободноживущие), дифференцируемые на основе некоторых не вполне достоверных фенотипических признаков (патогенности для лабораторных t животных и культурально-биохимических тестов).

Современная видовая дифференциация лептоспир основана на концепции определения вида у бактерий, в соответствии с которой в один вид объединяются штаммы с ДНК-ДНК гомологией 70% и выше и более 98, 7% гомологии 16S рРНК [159, 153]. На ее основе в начале 90-х гг. зарубежными лептоспирологами была разработана, а впоследствии утверждена Международным подкомитетом по таксономии лептоспир (1991, Осака), альтернативная система их видовой дифференциации, в соответствии с которой выделено 17 геномных видов.

Однако при генотипировании значительного числа штаммов (более 300) в ряде случаев к одному виду относили как патогенные; так и свободноживущие лептоспиры, а практически идентичные по фенотипу t штаммы - к различным видам. Сапрофитические лептоспиры контаминанты питательных сред, «изолированные» от людей и животных в результате технических ошибок (!Turneria parva, L.inadai и пр.), 6 причислялись к новым родам и видам патогенных лептоспир [71] или к штаммам с неясным таксономическим статусом - status insertae sedis [96]. Очевидно, что включение последних в панели эталонов для реакции микроагглютинации (РМА - «золотой стандарт») значительно снижает достоверность лабораторной диагностики лептоспирозов людей и животных.

Таким образом, новый подход к классификации и таксономии, основанный на произвольных количественных критериях, не подкрепленных фенотипическими и экологическими характеристиками таксонов, поставил и новую проблему - разработку надежных методов генетической демаркации основных экологических групп лептоспир.

В последние годы в практику молекулярно-генетических научных и диагностических исследований вошел метод секвенирования ДНК для ряда бактерий, в том числе и лептоспир [128, 118, 122],секвенированы полные геномы. Знание полногеномных последовательностей и информативность их сравнительного анализа позволяет найти новые подходы к решению многих проблем общей и медицинской микробиологии, а так же выявлять частные особенности геномов отдельных микроорганизмов, например, связанных с патогенностью и др.

Однако получение исчерпывающей информации о вариабельности геномов, которая необходима для однозначной идентификации не просто видов, а штаммов и изолятов бактерий, с помощью прямого секвенирования практически нереальна из-за чрезвычайной вариабельности микроорганизмов и наличии генов, функции которых неизвестны. Кроме того, наличие сиквенсов полных геномов в ряде случаев является, как бы «избыточной информацией» в научной и практической работе, например, при анализе определенных генов и диагностике возбудителей инфекций. Поэтому встает вопрос о развитии «несеквенирующих» методов анализа геномов, в которых можно использовать уже секвенированные геномы в качестве стандартного сравнения [1].

Использованиме метода мультилокусного секвенирования — 7 типирования* (MJICT или MLST) требует подбора маркерных генов. Для многих микроорганизмов, в том числе и для лептоспир, не существует рекомендаций, какие гены можно использовать в качестве маркерных.

Представляется целесообразным анализ возможности применния генов белков внешней мембраны в качестве маркерных, так как поверхностная структура бактериальной клетки по своей локализации занимает пограничное положение (interface) между клеткой и окружающей средой. Для многих грамотрицательных бактерий показана ведущая роль полиморфизма белков внешней мембраны в обеспечении патогенности и других свойств.

К моменту начала наших исследований у патогенных лептоспир были обнаружены белки наружной мембраны с различным уровнем экспрессии in vitro и in vivo, отсутствующие у сапрофитов [84, 83, 136]. Последнее дало основание предположить их важную роль в этиопатогенезе лептоспирозной инфекции. Особый интерес, с точки зрения разработки генетической дифференциации лептоспир различных экологических групп, представляет липопротеин LipL32 - основной белок наружной мембраны, демонстрирующий высокую степень экспрессии в организме инфицированного хозяина [117] и in vitro [83]. Установлена также его иммуногенность и связь с продукцией гемолизина — одного из факторов патогенности лептоспир [107].

Исходя из изложенного, основной целью нашей работы стала: Разработка метода дифференциации свободноживущих и паразитических лептоспир на основе детекции генов, кодирующих синтез липопротеинов внешней мембраны.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие Задачи исследования^

1. На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих липопротеины внешней мембраны LipL32 и LipL41, разработать тест-системы ПЦР для индикации лептоспир.

2. Изучить распространенность гена lipL32 в геноме лептоспир различных 8 таксонов, выделенных (1915-2004 гг.) от людей и животных и из объектов окружающей среды в различных географических регионах мира.

3. На основании полученных данных провести анализ современных таксономических схем лептоспир.

4. На модельных системах (биологический материал от людей и экспериментальных животных, вода, почва) изучить возможность применения разработанной тест-системы для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды, а также в организме людей и животных.

5. Оценить параметры диагностической эффективности ПЦР тест-системы на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир 1ЛрЬ32, на клиническом материале, полученном в очагах лептоспирозной инфекции.

Научная новизна

Впервые на репрезентативной выборке штаммов (90 в их числе 68 паразитических и 22 сапрофитных) различных надвидовых и подвидовых таксонов, изучена распространенность гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир 1лрЬ32. С этой целью на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена (размером 677 и 204 п.н.), кодирующего синтез липопротеина 1лрЬ32 — основного белка наружной мембраны - разработана ПЦР тест-система (в том числе пез1ес1-вариант).

В результате исследования «исторической» коллекции типовых и полевых штаммов, отличавшихся по месту, времени и источнику выделения, установлено, что ген, кодирующий синтез липопротеина 1лрЬ32, представлен в ДНК патогенных лептоспир всех известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям сапронозов {Ь.Ыгзскпеп, серовар рро1ур1ю8а).

Указанные фрагменты не определялись в ДНК лептоспир-сапрофитов

Ь.Ы/1еха , Ь.м>о1Ьаскп и др.), равно как и у ряда штаммов с неопределенным 9 таксономическим статусом — species insertae sedis.

Таким образом, показано, что lipL32 характеризутся высокой консервативностью среди паразитических лептоспир, включая возбудителей сапронозов. Детекция гена, кодирующего липопротеин LipL32, может быть рекомендована для дифференциации основных экологических групп лептоспир в таксономических целях.

Фрагмент гена (164 п.н.), кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL41, определялся в ДНК как паразитических, так и свободноживущих лептоспир. При этом в отличие от паразитических, у сапрофитов, а также штаммов со спорным таксономическим статусом, отмечен значительный полиморфизм длин ампликонов, проявлявшийся в индивидуальном для каждого штамма профиле.

Последнее подтверждает полученные ранее данные о выраженном геномном полиморфизме свободноживущих представителей Leptospiraceae.

Таким образом, нашло подтверждение мнение, основанное на изучении фенотипического профиля, о принадлежности типовых лептоспир родов Leptonema и Turneria и некоторых представителей видов L. inada и L. meyeri к свободноживущим [104]. Последнее свидетельствует о необходимости ревизии действующей классификации и номенклатуры лептоспир, принятой Международным подкомитетом по таксономии.

Практическая значимость

На различных модельных системах (моча, сыворотка крови людей, спинномозговая жидкость, паренхиматозные органы экспериментальных животных, вода, почва) показана возможность применения разработанного "nested"-варианта ПЦР для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды и биологических образцах.

На клиническом материале, полученном при расследовании вспышек лептоспирозов среди людей на юге России, определены параметры высокой

10 диагностической эффективности "nested" ПЦР - тест-системы, разработанной на основе гена lipL32 .

Таким образом, в перспективе сферами возможного применения ПЦР -тест-системы, разработанной на основе гена lipL32, могут стать:

- индикация патогенных лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциация от свободноживущих (в таксономических целях и при эпидемиологическом анализе);

- генодиагностика лептоспирозов людей, вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые (Sejroe, Icterohaemorrhagiae) и новые для РФ возбудители (например, серогруппа Austral is, серовар muenchen).

Последнее представляется особенно важным в контексте разработки методов контроля и снижения угрозы трансграничного завоза на территорию страны ранее неизвестных эндемичных лептоспир, антигены которых не представлены в отечественных диагностических тест-системах и вакцинных препаратах.

Универсальность разработанной тест-системы, позволяющей выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L.interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать испытание тест-системы не только в клинической, но и ветеринарной практике, в том числе для прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.

Результаты работы используются при чтении лекций для врачей бактериологов на кафедре инфектологии МПФ ПОО ММА им. И.М. Сеченова.

Публикации

1. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С., Ананьина Ю.В.

Генотипирование лептоспир: новые методические подходы. // Материалы конференции «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций». Москва. - 2004. - С.230

11

2. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С., Ананьина Ю.В.Изучение полиморфизма генов белков внешней мембраны в разработке схем типирования лептоспир. // Сборник трудов 5-й всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней. Москва. 2004. - С.32-34.

3. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С., Вышивкина Н.В., и др. Методические подходы к идентификации, лептоспир на. основе полиморфизма генов белков внешней мембраны. // Материалы Южнороссийской научно-практической конференции. Геленджик. 2005. - С. 114-116.

4. Земская М:С., Самсонова А.П. Методические4 подходы к разработке системы внутривидового генотипирования лептоспир. // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль. 2005. - С.342-344.

5. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С., Лебедев В.В., Лысенко И.В:, Ананьина Ю.В. Методический подход к генетическому типированию лептоспир на различных таксономических уровнях. // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. - №9 - С. - 38-39.

6. Самсонова А.П., Петров Е.М., Аляпкина Ю.С., Земская М.С., Ананьина Ю.В. Дифференциация лептоспир различных геномовидов на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны 1лрЬ32. // Материалы российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». Санкт-Петербург. 2006.-С. 267-268.

7. Самсонова А.П., Земская М.С., Петров Е.М., Ананьина Ю.В. Полиморфизм генов кодирующих белки наружной мембраны: новые возможности для индикации и дифференциации лептоспир. // Материалы Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней общих для людей и животных». Ульяновск. 2006.12

С.138 - 142.

8. Самсонова А.П., Петров Е.М., Аляпкина Ю.С., Земская М.С., Ананьина Ю.В. Распространенность гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL32, у лептоспир различных таксонов. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - №4 — С. 29-32.

9. Ananyina Yu.V., Petrov Е.М., Samsonova A.P., Zemskaya M.S., Shaginyan I.A. Ecological and genetic diversity within the Leptospiraceae family: implication for epidemiology // Molecular Biology of Spirochetes IOS,Press Science sériés, 2006, p.200-208.

10. Ананьина Ю.В., Самсонова А.П., Петров E.M., Земская М.С. Лептоспирозы в России: проблемы контроля и диагностики. // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Диагностика профилактика и лечение лептоспирозов людей и животных», М., 2007, с. 10-11.

11. Земская М.С., Самсонова А.П. индикация лептоспир в объектах окружающей среды на модельных системах с помощью ПЦР — тест-систем на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны // Там же, С. 26-27.

12. Ананьина Ю.В., Петров Е.М., Самсонова А.П., Земская М.С. Завоз возбудителей лептоспирозов: проблемы контроля и диагностики // МатерЛХ Всероссийского съезда н.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, М., «Санмедиа», 2007, с. 80.

13. Земская М.С., Самсонова А.П. Разработка системы генотипирования лептоспир различных экологических типов на основе детекции гена липопротеина наружной мембраны лептоспир LipL32. Матер. II Всероссийской научно-практической конференции. молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Рязань, 2007, с. 50 - 51.

14. Самсонова А.П., Петров Е.М., Аляпкина Ю.С., Алексеева Н.В., Земская

М.С., Терехов А.А., Гинцбург А.Л., Ананьина Ю.В. Ген, кодирующий липопротеин внешней мембраны LipL32 как генетическая мишень для

13 разработки схем генотипирования летпоспир// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 2008, №1 — С. 3-8.

15. Земская М.С., Самсонова А.П. Диагностические возможности ПЦР тест-систем на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32. //Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва. -2008 - С. 158.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах, иллюстрирована 11 рисунками и 21 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (164 источников, в их числе 46 отечественных и 118 иностранных).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Земская, Марина Сергеевна

7. ВЫВОДЫ

1. На основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена*(размером 677 и 204 п.н.), кодирующих синтез липопротеина LipL32 - основного белка наружной мембраны лептоспир - разработана ПЦР тест- система (в том числе nested-вариант) для индикации представителей семейства Leptospiraceae.

2. В результате исследования «исторической» коллекции типовых и полевых штаммов, отличавшихся по месту, времени и источнику выделения, установлено, что ген lipl32, представлен в ДНК патогенных лептоспир известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям сапронозов (L.kirschneri, серовар grippotyphosa). В ДНК лептоспир-сапрофитов (L.biflexa, L.wolbachii и др.)? равно как и у ряда штаммов с неопределенным таксономическим статусом (species insertae sedis) родов Leptonema и Turneria и некоторых представителей видов L. inadai (lyme,lichuan), L. meyeri (ranarum) фрагмент гена lipl32 размером 677 п.н. не определялся.

3. На различных модельных системах показано, что разработанная ПЦР тест-система (nested -вариант) может использоваться для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды (вода, почвенная вытяжка) и биологических материалах (моча, сыворотка крови людей, спинномозговая жидкость паренхиматозные органы экспериментальных животных).

4. На клиническом материале, полученном при расследовании вспышек лептоспирозов среди людей на юге России, показана высокая диагностическая эффективность "nested" ПЦР — тест-системы, разработанной на основе гена lipL32 на ранних строках заболевания (100% - первой неделе заболевания, 57% - на 2-й).

5. Универсальность и показатели диагностической эффективности разработанной тест-системы на основе гена lipL32, позволяющей выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L.interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать ее испытание как относительно простого метода для:

- индикации патогенных лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциации от свободноживущих (в таксономических целях и при эпидемиологическом анализе);

- генодиагностики лептоспирозов людей, вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые ^е^ое, IcterohaemoIтhagiae) и новые для РФ возбудители (например, серогруппа Аш^аНв, серовар тиепсЬеп)

- прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По определению ВОЗ (WHO Recommended Surveillance Standards, WHO, 2003) "Лептоспирозы относятся к зоонозам с мировым распространением; однако во многих странах они выявляются и регистрируются неполностью из-за сложности клинической диагностики и отсутствия возможности лабораторного подтверждения диагноза» [96].

В значительной степени, указанные трудности связаны со значительным биоразнообразием лептоспир: экологическим, антигенным и генетическим.

В течение-многих десятилетий лептоспиры, подобно другим спирохетам, оставались «вне фарватера» фундаментальных молекулярно-генетических исследований. В .последние годы в связи с бурным развитием молекулярных технологий лептоспир стали рассматривать как перспективную модель для исследования молекулярных механизмов эволюции и видообразования у эубактерий, структурно-функциональных особенностей их геномов, разработки новых молекулярно-генетических подходов к классификации, таксономии и типированию.

По данным современной филогенетики, лептоспиры относятся к древнейшим эубактериям, находящимся в прикорневой развилке эволюцинных путей. В пределах этого семейства имеются разнообразные экологические группы: свободноживущие непаразитические формы, включая галофилы, представители сапронозов, паразитические - возбудители лептоспирозов людей и животных. Последние также отличны по хозяинной и органной специфичности, патогенности, способности к существованию во внешней среде и другим признакам, значимым в клинико-эпидемиологическом контексте.

Высказывалось мнение о принадлежности всех паразитических лептоспир [40, 20] или их отдельных представителей, например, grippotyphosa, [4] к возбудителям сапронозов.

В течение многих десятилетий в пределах рода Leptospira выделяли два

92 вида - Leptospira interrogans (паразитические) и Leptospira bißexa (свободиоживущие), дифференцируемые на основе некоторых фенотипических признаков (патогенности для лабораторных животных и культурально-биохимических тестов).

Современная видовая дифференциация лептоспир основана на концепции определения вида у бактерий, в соответствии с которой в один вид объединяются штаммы с ДНК-ДНК гомологией 70% и выше и более 98, 7% гомологии 16SpPHK [153]. На ее основе в начале 90-х гг. зарубежными лептоспирологами была разработана, а впоследствии утверждена Международным подкомитетом по таксономии лептоспир (1991, Осака), альтернативная система их видовой дифференциации, в соответствии с которой выделено 17 геномных видов.

Однако при генотипировании значительного числа штаммов (более 300) в ряде случаев к одному виду относили как паразитические, так и свободноживущие лептоспиры, а практически идентичные по фенотипу штаммы - к различным видам. Сапрофитические лептоспиры - контаминанты питательных сред, «изолированные» от людей и животных в результате технических ошибок (L.ranarum- лягушка, Leptonema illini - из мочи быка, L.inadai — из кожного биоптата больного Лайм-боррелиозом), причислялись к новым родам и видам паразитических лептоспир [71] или к штаммам с неясным таксономическим статусом — status insertae sedis [96]. Очевидно, что включение последних в панели эталонов для реакции микроагглютинации (РМА - «золотой стандарт») значительно снижает достоверность лабораторной диагностики лептоспирозов людей и животных. Более того, современная систематика и классификация лептоспир, по мнению многих исследователей, находится в состоянии близком к «таксономическому хаосу».

Таким образом, новый подход к классификации и таксономии, основанный на произвольных количественных критериях, не подкрепленных фенотипическими и экологическими характеристиками таксонов, поставил и

93 новую проблему - разработку надежных методов генетической демаркации основных экотипов лептоспир.

Представляет определенный интерес попытка использования нового молекулярно-таксономического подхода (количественная ПЦР в реальном времени на основе сегмента гена 16S рРНК размером 1200 — п.н. и сравнительный анализ сиквенсов 16S рРНК изолятов от людей и из воды) для исследования поверхностных вод на паразитические лептоспиры и оценки риска заражения человека [76]. Критически оценивая результаты своей работы, авторы отмечают, что предлагаемый ими подход имеет ряд ограничений. Первое. Технические трудности, связанные с культивированием лептоспир, которые не поволили им провести идентификацию сероваров лептоспир в пробах воды. Второе. Авторы использовали ПЦР (TaqMan) тест-систему в реальном времени, ранее разработанную Smithe L.D. et al. (2002) и предложенную для дифференциации паразитических лептоспир от свободноживущих [138]. По данным C.A.Ganoza et.al.(2006) эта тест-система оказалась недостаточно специфичной, так как с ее помощью были выявлялись лептоспиры неизвестные как патогенные -монофилетическая группа С (от себя добавим, что в группе паразитических оказались свободноживущие лептоспиры Ranarum). И наконец, к серьезным ограничениям предлагаемой методики ее авторы относят ее высокую стоимость и недоступность оборудования [76].

Разработка простных и надежных методов дискриминации лептоспир различных экологических групп представляет не только таксономический интерес, но и важна для проведения эпидемиологического анализа и подбора диагностических панелей.

К моменту начала наших исследований у патогенных лептоспир были изучены некоторые белки наружной мембраны с различным уровнем экспрессии in vitro и in vivo, играющие важдную роль в этиопатогенезе лептоспирозной инфекции. По ряду причин первоначальный выбор пал на ген липопротеина LipL32 - основного белка наружной мембраны лептоспир.

На первом этапе исследований нами были разработаны 2 варианта тест-системы на основе нуклеотидных последовательностей гена (размером 677 и 204 п.н)), кодирующего синтез липопротеина LipL32 - основного белка наружной мембраны лептоспир - разработаны ПЦР тест- системы (в том числе nested-вариант), а также LipL41( фрагменты 254 и 164 п.н.) для индикации представителей семейства Leptospiraceae. Изучение распространенности генов lipL32 и lipL41 среди представителей различных таксонов и экотипов лептоспир проводилась на хранящейся в лаборатории лепттоспирозов «исторической» коллекции штаммов лептоспир (67 патогенных и 23 сапрофита), относящихся к известным надвидовым, видовым таксонам патогенов и сапрофитов отличных по месту, времени и источнику выделения. Последнее обеспечивало статистическую1 поддержку исследования.

С помощью разработанных нами1 вариантов тест-системы ПЦР проведен анализ распространения гена, кодирующего липопротеин LipL32 в геноме представителей семейства Leptospiraceae. Установлено его наличие только у патогенных лептоспир всех известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям«сапронозов {L.kirschneri, серовар grippotyphosa), выделенных на территориях разных стран и континентов, в течение более 80 лет (1925 - 2004 гг.). Это дает основание для заключения, что данный участок в геноме патогенных лептоспир является консервативным. Указанные фрагменты не'определялись в ДНК свободноживущих лептоспир (L.biflexa , L.wolbachii и др.), равно как и у ряда штаммов с неопределенным таксономическим статусом (L.meyeri, геномовиды 3 и 5, Turneria parva и ДР-)- .

Таким образом, нашло подтверждение, высказанное нами .ранее мнение на основе анализа фенотипических признаков [4] о принадлежности представителей родов Leptonema и Turneria и видов L. inadai, и L. meyeri

95 к свободноживущим лептоспирам. Последнее свидетельствует о необходимости ревизии действующей классификации и номенклатуры этих спирохет.

Поскольку «первый» вариант тест-системы (с праймерами ЬЕР21/ЬЕР22) не обладала достаточной чувствительностью (100-1000 клеток в пробе) нами была синтезирована внутренняя пара праймеров -ЬЕР2-351/ЬЕР2-534, которая позволила повысить аналитическую чувствительность до 10-100 клеток в пробе. На основе двух вариантов был разработан пе81е<1-вариант (1-10 клеток в пробе) с целью применения в диагностике и эпидемиологическом анализе.

Фрагмент гена (164 п.н.), кодирующий липопротеин наружной мембраны 1лрЬ41, определялся в ДНК паразитических и свободноживущих лептоспир. При этом в отличие от паразитических лептоспир, у сапрофитов, а также штаммов со спорным таксономическим статусом, отмечен значительный полиморфизм длин ампликонов, проявлявшийся в индивидуальном для каждого штамма профиле.

Следующий этап работы включал исследование на модельных ; системах (биологического материала от экспериментальных животных, вода, почва). Была изучена возможность применения, разработанной тест-системы для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды, а также в организме людей и животных. При обработке образцов модельных систем, чувствительность на порядок была ниже, чем в чистых культурах, поэтому при исследовании клинических образцов наиболее пригоден вариант пе81ес1-ПЦР и II метод выделения ДНК. ' Таким образом, разработанная нами тест-система может быть использована для индикации лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциации, от свободноживущих, что может быть использовано, как в таксономических целях, так и при эпидемиологическом анализе;

Задачей третьего этапа работы стала оценка параметров диагностической эффективности ПЦР тест-систем на основе гена,

96 кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32, на клиническом материале, полученном в очагах лептоспирозной инфекции.

Аналитическая чувствительность nested-варианта ПЦР, по крайней мере, на порядок превышает таковую ранее разработанной ПЦР тест-системы с праймерами G1/G2, что позволяет повысить диагностическую эффективность методов диагностики лептоспироза в целом. При исследовании сывороток больных в зависимости от сроков^ с момента заболевания показано, что диагностическая эффективность nested-ПЦР (100%) на ранних сроках заболевания (1 неделя) почти в 2 раза превышает таковую РМА (57%). Поэтому nested-ПЦР позволяет еще более повысить эффективность диагностики лептоспирозов, прежде всего в ранние сроки с момента заболевания при небольших концентрациях возбудителя в биологических материалах.

Диагностическиме возможности разработанных ранее ПЦР тест-систем [79, 30] ограничивались их относительно узкой таксономической специфичностью. Например, Самсоновой А.П. (1994) был разработан вариант тест-системы (с праймерами G1/G2) на основе родоспецифичной тест-системы ПЦР Gravekamp С. et al. (1990) авторам удалось осуществить индикацию патогенных лептоспир большинства эпидемически значимых серогрупп. Ее использование дает возможность в короткие сроки при относительно несложной методике обнаружить наличие патогенных лептоспир в исследуемом материале. Однако к недостаткам разработанной тест-системы ПЦР следует отнести невозможность выявления ДНК лептоспир ряда серогрупп и прежде всего одной из наиболее распространенных Grippotyphosa и Australis [79].

На территории РФ циркулируют представители 3 геномовидов: L. interrogans, L, kirschneri и L. borgpeterseni. Однако нельзя исключить возможность завоза на территорию страны новых ранее неизвестных возбудителей. Преимущество предлагаемой нами ПЦР тест-системы является ее универсальность- возможность ПЦР диагностики лептоспирозов людей,

97 вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые (Sejroe, leterohaemorrhagiae) и «новые» возбудители, по нашим данным недавно завезенные на территорию России (серогруппа Australis, серовар muenchen) [25].

Последнее представляется особенно важным в контексте разработки методов контроля и снижения угрозы трансграничного перемещения на территорию страны ранее неизвестных эндемичных лептоспир, антигены которых не представлены в диагностических тест-системах и вакцинных препаратах. Универсальность разработанной тест-системы, позволяющей i выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L.interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать испытание разработанной тест-системы не только в клинической, но и в ветеринарной .практике, в том числе для прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.

Завершенные в последние годы проекты по секвенированию полных геномов патогенных и сапрофитных лептоспир,, а также множества отдельных генов, создали основу для сравнения межвидовых и. внутривидовых особенностей лептоспир различных экологических групп и таксонов на основе объективных критериев.

Для лептоспир пока не разработаны рекомендации по набору маркерных генов для мультилокусного типирования. В этих целях могут быть использованы гены липопротеинов наружной мембраны лептоспир, «репертуар» которых хорошо изучен, и которые играют важную роль во взаимоотношениях лептоспир с окружающей средой и иммунном ответе при лептоспирозах.

Сравнительный анализ структурных особенностей генов, кодирующих липопротеины наружной мембраны свободноживущих и паразитических лептоспир, даст возможность получить новые данные о структурнофункциональных особенностях генома лептоспир, отличающихся по экологическим признакам и патогенности, а также разработать новые методы видовой дифференциации и внутривидового генотипирования, том числе, с

98 целью геномной паспортизации коллекций

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Земская, Марина Сергеевна, 2009 год

1. Ажикина Т.Л., Монастырская Г.С., Свердлов Е.Д. Полногеномные сравнительные анализы патогенов-неотъемлемый компонент мероприятий биобезопасности// Молекул, мед. 2004.-№3. - С.33-42.

2. Ананьина Ю.В. Межвидовое и внутривидовое разнообразие лептоспир: молекулярно-генетические и экологические аспекты// Вестник РАМН. -2000. №1. - С.18-21.

3. Ананьина Ю.В. Молекулярно- генетические и биологические аспекты экологии патогенных лептоспир (Leptospira interrogans)// Журн. эпидемиол., микробиол: и иммунобиол. — 1996. - №3 — С. 19 - 21.

4. Ананьина Ю.В. Проблемы экологии патогенных лептоспир: Автореф. дисс. докт. мед. наук.- Москва.- 1993.-25с.

5. Ананьина Ю.В., Самсонова А.П., Вышивкина НВ. Видовое разнообразие лептоспир: экологическая и эпидемиологическая характеристика геномных видов// Материалы VIII Съезда ВОЭМП. Москва. - 2002.-№1. - С.294-296.

6. Ананьин В.В. Резервуары патогенных лептоспир в природе и их роль в эпидемиологии.лептоспир // Журн. микробиол. 1955. - №4.- С. 331-340

7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. М., Медгиз. - 1962.

8. Беляков. В.Д., Голубев Д.Б., Каминский., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем. Молекулярно-генетические механизмы// Л., Медицина., 1987.-239 С.

9. Бернасовская Е.П., Назарова О.Г., Могирева Л.А. Выявление антигенов лептоспир в биологических жидкостях и окружающей среде//Тезисы докл. VIILBcecoio3H. конф. по лептоспирозам. Тбилиси. - 1983. - С.270-271.

10. Волина Е.Г., Быченко Б.Д., Бочарова Н.Г. Применение реакции энзиммеченых антител для'диагностики лептоспироза // Журн. микробиол. — 1981. -№10 С.45-48.

11. Зайцев С.В., Чернуха Ю.Г. Возможность переживания патогенных102лептоспир в почве природного очага/ В.Ю. Литвин (ред.). Экология возбудителей сапронозов. — М., 1988. — С. 85-94.

12. Иктерогеморрагический лептоспироз /Лебедев В.В., Авдеева М.Г., Шубич Ю.В. и др. // Краснодар: «Советская Кубань», 2001. 208с.

13. Каримова З.Х. Лептоспирозы татарской АССР: Автореф. дисс.докт. мед. наук. — Казань. 1967. - 40с.

14. Киктенко B.C., Власова Н.П., Гирич B.C. К вопросу о дифференциации патогенных и сапрофитных лептоспир//Сборник трудов «Актуальные проблемы лептоспироза». — Москва, 1979. — С.14-15.

15. Крепкогорская Т.А. Лептоспирозы в Казахстане. Автореф. дисс. д-ра мед. наук. Алма-Ата, 1965 г.

16. Лакин Г.Ф. Биометрия// М., Высшая школа, 1980, 293 с.

17. Ленартович Л.С. Ранняя диагностика лептоспироза// Тезисы докл. VI респ. научно-практ. конф. «зоонозные инфекции». Киев. - 1985. - С.53-54.

18. Лептоспироз/ Бернасовская Е.П., Угрюмов Б.Л., Вовк А.Д. и др.// Киев. -«Здоровья». — 1983. — 152 с.

19. Лептоспирозы людей и животных / Гл. ред. В.В. Ананьин.// — М. -«Медицина». 1971. - 352 с.

20. Литвин В.Ю. Сапрофетическая фаза в экологии возбудителей инфекционных заболеваний// Журн. микробиология. — 1985. №6. — С.98-103.

21. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах// В сб. «Экология возбудителей сапронозов».М., 1988, С.20-30.

22. Меньшиков В.В. О клинической ценности лабораторных исследований// Клиническая лабораторная диагностика. 1996. - №5 - С.4-9.

23. Назарова О.Г. Применение эритроцитарного диагностикума в РИГА для выделения лептоспирозов // Врач. дело. 1979. - №1 - С.104-106.

24. Першина М.Ю., Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Прозоровский C.B.

25. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепнойреакции с произвольными праймерами// Молекул, генетика, микробиол.103вирусол. — 1998. JNb 1. — С.29 — 32.

26. Петров Е.М., Захарчук Л.И., Самсонова А.П., Петрова Н;Д. Редкий случай желтушной формы лептоспироза Australis у человека в России // Матер. 10-й всеросс. н.-практ. конф. по лептоспирозу. Анапа. — 2003. — С.38-40.

27. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии/Гинцбург А.Л., Романова Ю.М.// М., 2006. 143 с.

28. Прозоров А.А. Дополнительные хромосомы бактерий:свойства и происхождение // Журн. микробиол. 2008. - т.77. - №4. - С.437-447.

29. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция// Анализ генома. Методы. М., Мир, 1990. С. 176-190.

30. Самсонова А.П., Аксенов М.Ю., Ананьина Ю.В. и др. Разработка тест-системы для выявления Leptospira interrogans методом полимеразной цепной реакции // Мол. ген., микробиол., вирусол. 1994.-№1. - С. 15 - 19.

31. Самсонова А.П:, Ананьина Ю.В., Аксенов М.Ю. и др. Метод полимеразной цепной реакции в изучении гостальной персистенции лептоспир//Журн. молекул, ген., микробиол. и вирусол. 1994. -№1. - С.19 -23.

32. Самсонова А.П., Ананьина Ю.В. Современные методы диагностики лептоспирозов//Сборник трудов «Проблемы инфектологии в Тульской области». Тула. 1997. - вып.4. - С.45-48.

33. Самсонова А.П., Лю Чжун Фу, Петров Е.М. и соавт. Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для индикации лептоспир в политипичных очагах лептоспирозов// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1997.-№ 41 - С. 15 - 19.

34. Самсонова А.П. Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для изучения гостальной персистенции лептоспир и диагностики лептоспирозов: Автореф. дисс. .канд. мед. наук. — Москва. 1995.-24с.

35. Самсонова А.П. с соавт. Завоз возбудителей лептоспирозов: проблемы контроля и диагностики// Материалы 9-го всероссийского съезда общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. — Москва, 2007. т.З. — С.

36. Сергеев A.A., Чернуха Ю.Г., Шаханина K.JL, и др. Диагностика противолептоспирозных антител у людей методом твердофазного иммуноферментного анализа //Журн. микробиол. — 1989 №7 - С.66-71.

37. Серебрякова Т.Л., Кондратенко В.Н., Ленартович Л.С. Лабораторно-клинические параллели в диагностике лептоспироза// Тезисы докл. VII Всесоюзн. конф. по лептоспирозам. Тбилиси. - 1983 - С. 248-250.

38. Терских В.И. Сапронозы (о болезнях людей и животных, вызываемых микробами способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания)// Журн. микробиол. 1958. - №8. - С. 118-122.

39. Тюрина И.Н., Белоусов В.И., Быкова H.H., Артюшин С.А. ДНК-зонд для идентификации и дифференциации лептоспир/ЛЗетеренария. 1993.-№8. -С.22-24.

40. Чернуха Ю.Г., Евдакимова O.A., Ананьина Ю.В. Различия в воспреимчивости подевых мышей Алтайского края »и Московской области к лептоспирам серовара mozdok серогруппы Pomona // Журн. Микробиол. -1985.-№2. С.45-49.

41. Чернуха Ю.Г., Корн М.Я., Кульберг А.Я. К вопросу о выявлении лептоспир с помощью люминисцентно-серологического метода // Люминесцирующие антитела в микробиологии. — М. — «Медицинская литература». 1972. — С.181-186.

42. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н. и др. Геномная дактилоскопия возбудителей сапронозов//Журн. микробиол. 1991.-№6. — С. 25 - 29.

43. Эпидемиология,, диагностика, клиника и профилактика лептоспироза: Методические указания. — М. Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002.-44 с.

44. Ananyina Yu.V., Korver H., Terpstra W.P. Monoclonal antibody analysis of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa isolated in diversed geographical areas// Leptospirosis. VII European Res.Conf.Abstr. Moscow. - 1990. - P.51.

45. Artushin S., Belousov V., Bykova N., Turina I. Development of DNA-gibridization on probe for identification of Leptospira interrogans serovar pomona// In: Leptospirosis. VII European and IX USSR Conference. Moscow. -1990.-P.53.

46. Bakoss P. Paradoxical reaction in the diagnostics of leptospiroses// Zoonoses Brno. 1988.-P.7-12.

47. Baranton, G. and Old, I. G. The spirochaetes: a different way of life // Bull. Inst. Pasteur. 1995.- Vol. 93. - №2. - P.63-95.

48. Barnett J.K., Barnett D., Bolin C.A. et al. Expression and distribution of leptospiral outer membrane components during renal infection of hamsters//Infect. Immun. 1999. - Vol.67. - P.853-861.

49. Bergy's mannual of determinative bacteriology. The Spirochetes / J.G.Holt, N.R.Krieg//Baltimore. 1994. - 159 p.

50. Billard S.A., Segers R.P.M.A., Bleumink-Pluym N., Fyfe J., Fain S., Adler B. Molecular analysis of the hsp (groß) operon of Leptospira interrogans serovar copenhageni //Mol. Microbiol. 1993. - Vol.8. - P.739-751.

51. Blanco D.R., Reimann K., Skare J. et al. Isolation of the outer membranes from Treponema pallidum and Treponema vincentii// J.Bacteriol. 1994. - Vol.176. — P.6088-6099.

52. Blocker A., Baranton G., Saint Girons I. Detection of leptospira specific 16S rDNA sequences using polymerase chain reaction // Leptospirosis. Moscow. -1990.-P.54.

53. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. Rapid andsimpl method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiology. 1989. - Vol.28i - P.494-503.

54. Boursaux-Eude C, Saint Girons I., Zuerner R. IS 1500, an IS3-like element from Leptospira interrogans/'/J. Microbiol. 1995. - Vol.141. - №9. - P. 21652173.

55. Branger C., Chatrenet* B., Gauvrit A. et al. Protection against Leptospira interrogans sensu lato challenge by DNA immunization with the gene encoding hemolysin-associated protein l//J.Infect. Immun. 2005. — Vol:73. -№7. - P.4062 - 4069.

56. Branger C., Sonrier C., Chatrenet B. et al. Identification of the hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination// Infect. Immun. 2001. - Vol.69. - P.6831— 6838.

57. Brown P.D., Gravekamp C., Carrington D.G., Van de Kemp., Levett P.N. Evoluation of the polymerase chain reaction for early diagnosis of Ieptospirosis//J.Med.Microbiol. 1995. - Vol.43. - P.l 10-114.

58. Brown P.D., Levett P.N. Differentiation of Leptospira species and serovars by PCR- restriction endonucleas analysis, arbitrarily primed PCR and low-stringency PCR//J. Med. Microbiol. 1997. - Vol.46. - P.173-181.

59. Canale-Parola E. Motility and Chemotaxis of spirochetes// Annu Rev Microbiol. 1978. - Vol.32. - P.69-99.

60. Cinco M. Identification to species level and differentiation of saprophytic and patogenic leptospira// The present State of Leptospirosis Diagnosis and Control. -1986.-P. 45-51.

61. Cinco M., Tomaro M., Cociancich L. Taxonomical, cultural and metabolic characteristics of halophilic leptospirae// Zbl Bakt. Hyg. I. Orig. 1975. - A233. -P.400-405.

62. Cullen P.A., Cordwell S.J., Bulach D.M. et al. Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira interrogans serovar Lai!I Ibid. — 2002. -Vol.70.-P.2311 -2370.

63. Cullen P. A., Haake D.A., Adler B. et al. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes// FEMS Microbiol. Rev. 2004. - Vol.28. - P.291—318.

64. Cullen P.A., Xu X., Matsunaga J. et al. Surfaceome of Leptospira spp. //Infect. Immun. 2005. - Vol.73. - P.4853 - 4863.

65. Czekalowski J.W., Eaves G. J. The structure of leptospirae as revealed by electron microscopy//J. Pathol Bacteriol. 1955. - Vol.69. - P.129-132.

66. Ding H., Yelton B. Cloning and analysis of the leuB gene of Leptospira interrogans serovarpomona II J.Gen.Microbiol. 1993. - Vol.139. - P.1093-1103.

67. Eys van G.J.J.M., Gravekamp C., Gerritsen M.J. et al. Detection of leptospires in urine by polimerase chaine reaction //J.clin. Microbiol. 1989. - Vol.27. -№10.-P. 2258-2262.

68. Faine S., Adler B., Bolin C. et al. Leptospira and leptospirosis// McdiSci. -Melbourne. Victoria. - Australia. - 1999.

69. Fox. G.E., Strackebrandt E., Hespell R.B. The phylogeny of prokaryotes// Science 1980. - Vol.209. - P.457-463.

70. Fukanaga M., Horie I., Mifuchi I., Takemoto M. Cloning, characterization and taxonomic significance of genes for the 5S ribosomal RNA of Leptonema illini strain 3055//J. Gen. Microbiol. 1991. - Vol.137. - P. 1523-1528.

71. Fukanaga M., Horie I.,Okuzako N., Mifuchi I. Nucleotide sequence of a 16S rRNA gene for Leptospira interrogans serovar canicola strain Moulton //Nucleic Acids Res. 1990.-Vol. 18.-P.366.108t

72. Ganoza C.A., Matthias M.A., Collins-Richards D., Brower K.C. Determining risk for severe Leptospirosis by molecular analysis of environmental surface waters for pathogenic Leptospira// PLoS ONE. 2006. - Vol.3. - P. 1329-1340.

73. Goelz S.E., Hemilton S.R., Vogelstein B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue// Biochem. Biophys. Res. Comm. 1985. - Vol.130. - №1. -P.l 18-126.

74. Gravekamp C., Kemp H. v. d., Carrington D. et al.Detection of leptospiral DNA by PCR in serum from patients with copenhageni-infection//VII European and IX USSR Conference. Moscow. - 1990. - P.57

75. Guerreiro H., Groda J., Flannery B. et al. Leptospiral proteins recognized during the humoral« immune response to leptospirosis in humans//Infect. Immun. — 2001. Vol.69. - P. 4953—4968.

76. Guidelines for the control of leptospirosis /Faine S. (td) // WHO offset Publication. Geneva. - 1982. - n.67.-P. 171.

77. Haake D. A., Champion C. I., C. Martinich C. et al. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpLI, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.// J. Bacteriol. 1993. - Vol.175. - P.4225-4234.

78. Haake D.A., Chao G., Zuerner R.L. et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection//Ibid. 2000. - Vol.68. - №4. - P. 2276 - 2285.

79. Haake D.A., Martinich C., Summers T.A. et al. Characterization ofleptospiral outer membrane lipoprotein LipL36: downregulation associated withlate- log- phase growth and mammalian infection//Ibid. 1998. - Vol.66. - №4.109-P.1579- 1587.

80. Haake D: A., Mazel M. K., McCoy A.M. et. al. Leptospiral outer membrane proteins Omp and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection// Infect. Immun. -1999. Vol.67. - P.6577- 6582.

81. Haake D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis//Microbiol. 2000. -Vol.146.-P.1491—1504.

82. Haake-D.A., Suchard M.A., Kelley M.M. et al. Molecular evolution and mosaicism of ieptospiral outer membrane proteins involves horizontal DNA transfer// J. Bacteriol. 2004. - Vol. 12. - P.2318—2828.

83. Haake D.A., Walker E.M., Blanco D.R. et al. Changes in, the surface of Leptospira interrogans serovar grippotifosa during in vitro cultivation//Infect. Immun. 1991. - Vol.59. - P. 1131-1140.

84. Hanson L., Tripathy D.N., Kvane L.B., Alexander A.D. Leptospira serotype illini (a new serotype) // Int. J. Syst.Bacteriol. 1974. - Vol.24.-№3. - P.355-357.

85. Haysh S., Wu H.C. Lipoproteins in bacteria//J. Bioenerg. Biomembr. 1990. -Vol.22.-P. 451-471.

86. Hermann J.L., Baril C., Belienger E., Perolat P., Baranton G., Girons I. S. Genome conservation in isolates of Leptospira interrogans//.!. Bacteriol. 1991. -Vol.173.-P.7582-7588.

87. Hermann J.L., Belienger E., Perolat P., Baranton G., Girons I. S. Pulsed-field gel electrophoresis of Notl digests of leptospiral DNA a new rapid method of serovars identification// J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. - P. 1696-1702.

88. Hookey J.V. The detection of genetic variation in Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae by ribosomal RNA gene restriction fragment patterns// FEMS Microbiol. Letters. 1990. - Vol.72. - №4. -P.329-336.

89. Hookey J.V., Bryden J., Gatehouse L. The use of 16s rDNA sequence analysis to investigate the phylogeny of Leptospiraceae and related spirochaetes//J. gen. microbiol. 1993. - Vol.139. - P.2585-2590.

90. Hookey J.V., Waitkins S.A., Jackman P.J.H. Numerical analysis of leptospira

91. DNA-restriction endonuclease patterns// FEMS Microbiol. Letters. 1985.110

92. Vol.29.-.N«1/2-P.l 85-188.

93. Human leptospirosis: guidance for diagnosis, surveillance and control/ TerpstraW.J://Bull. WHO. 2003. - 109p.

94. Hyde F.W., Johnson R.C. Genetic relationship of lyme disease spirochetes to Borrelia, Triponema, and Liptospira spp. // J. Clin. Microbiol. —1984. Vol.20. -P. 151-154.

95. Ivinsion A.J., Taylor G.R; PCR in genetic diagnosis PCR. A Practical Approach (éd. M. J. Mcphersin). -Oxford University Press. Oxford. - N.Y. -Tokyo.- 1991.-P. 15-27.

96. Johnson R.C., Harris V.G. Antileptospiral: activity of serum. II Leptospira! virulence factor//J;.Bacterioli 1967. - Vol. 93.-№2i - P. 513-519:

97. Kelly T.J., Smith H.O. II Base sequence of recombination site// J.Molecul.Bioli 1970. - Vol.51. - №2. -Pi 393-409:

98. Kikuchi N., Haramune T., Takahashi T., Yanagava R. Detection of leptospiral plasmid and comporision- of plasmid profiles between- virulent and avirulent leptospires//J. Vet: Med. Sci. 1996. - Vol.58.-№ 9. - P.915-917.

99. Kmety E., Dikken H. Revised list of leptospira serovars// University Press. — Groningen. 1988.

100. Kolsto A.B. Dynamic bacterial genome organization// J. Mol Microbiol. -1997.-V. 24. №2. - P.241-248.

101. Krawiec S., Riley M. Organizatiomof the-bacterial chromosome //Microbiol. Rew. 1990:-Vol.54; - №4; — P: 502-539.,

102. Lee S.H:, Kim K.A., Park Y.G., Seong I.W., Kim MJ:, Lee Y.J:1.entification and partial characterization of a novel hemolysin from Leptospirainterrogans,serovar lai//Gene. 2000. - Vol. - №22. - P. 19-28.1.l

103. Le Febvre R.B. DNA probe for detection of the Leptospira interrogans serovar hardjo genotype hardjo-bovis// J.Clin. Microbiol. 1987. - Vol.25. -P.2236-2238.

104. Majed Z., Bellenger E., Postic D., Pourcel C., Baranton G., Picardeau M. Identification of variable-numbertandem-repeat loci in Leptospira interrogans sensu strict// J. Clin. Microbiol. 2005, - Vol.43. - P. 539-545.

105. Marmur I.A. A procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms//J.Molec.Biol. 1961. - Vol.3. -P.208-219.

106. Marshall R.B., Wilton B.E., Robinson A.J. Identification of Leptospira serovars by restriction-endonuclease analysis// J.Med.Microbiol. — 1981. Vol.14. -P. 163-166.

107. Masuzawa T.R., Nakamura R.,Shimizu T. et al. Heat stability of protective antigen of Leptospira interrogans serovar lai.// J. Clin. Microbiol. — 1990. — Vol.28.-P.660-663.

108. Mazzonelli J., Castellani M. Effecto del Bicarbonato de sodio on la Differenciacion de Leptospiras Saprofitas y pathogenas//Veterinaria. 1968. — Vol.4.-P. 3-30.

109. Messer W. The bacterial replication initiator DnaA. DnaA and oriC, the bacterial mode to intiate DNA replication// FEMS Microbiology Reviews. — 2002. Vol.26. -P.355-374.

110. Millar B.D. Detection of leptospires in biological fluids using DNA hybridization// Veterin. Microbiol. 1987. - Vol.15. - P.71-78.

111. Murgia R., Riquelme N., Baranton G., Cinco M. Oligonucleotides specific for pathogenic and saprophytic leptospira occurring in water// FEMS Microbiol Lett. -1997.-Vol.1.-P.27-34.

112. Nally J.E., Whitelegge J.P., Bassilian S., Blanco D.R. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection// Infect. Immun. 2007. - Vol.75. - P.766-773.

113. Nascimento A.L.T.O., SVerzovski-Almeida S., Van Sluyes M.A., Monteiro

114. Vitorello C.B. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhagen!//112

115. Braz. JiMed: BioK Res. 2004. - Vol. 37.-№4. - P; 459-4791

116. Paster B.J., Dewhirst F.E., Weisburg W.G., Tordoff L.A:, Eraser G.J., Hespell R.B;, Staton T.B., Zablen.L., Mndelco L., Woese C.R. Phylogenetic analysis of the spirochetes//J. bacterol. 1991. - Vol.173. -P. 6101-6109.

117. Perolat P., Merien F., Ellis W.A., Baranton G. Characterization of Leptospira isolates from serovars hardjo by Ribotyping, arbitrarily primed PCR, and mapped restriction site polymorphism// J. Clin. Microbiol. -- 1994. Vol.32. - P. 19491957.

118. Radolf J.D., Bourell K.W., Akins D.R. et al. Analisis of Borrelia burdodrferi membrane architecture by freeze-facture electrone microscopy//J. Bacteriol. -1994. -Vol.176. -P.21-31.

119. Radolf J.D;, Goldberg M.S., Bourell K. et al. Characterization of outer membranes isolated from Borrelia burdorferij the Lyme disease spirochete//Infect. Immun. 1995.-Vol.63. - P:2154-2163.

120. Ramadass P., Jarvis B.D.W., Corner R'J:- et al. Genetic characterization of pathogenic Leptospira species by DNA hybridization // Int. J. system. Bacteriol. -1992.-Vol.42.-P.215-219.

121. Renesto P., Lorvellec-Guillon K., Drancourt 'M., Raoult D: rpoB gene analysis as a novel strategy for identification of spirochetes from the genera Borrelia, Treponema, and Leptospira//.!: Clin. Microbiol. 2000; - Vol.38. -P.2200-2203.

122. Ren S.X., Fu G., Jiang X.G. et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole genome sequencing// Nature. - 2003. - Vol.422. - P.888 - 893.

123. Rhen M., Ericksson S., Pettersson S. Bacterial adaptation to host innate . immunity responses//Curr. Opinion Microbiol. 2000. - Vol.3.- P.60 - 64.

124. Richaud C., Margarita D., Baranton G.,Saint-Girons I. Cloning of genes £ required for amino acid biosynthesis from Leptospira interrogans serovaricterohaemorrhagiaelli. Gen. Microbiol. 1990. - Vol.136. - P.651-656.

125. Saint Girons I., Margarita Dl, Amouriaux P., Baranton G.N. First isolation of ' bacteriophages for a spirochaete: potential genetic tools for Leptospira//Res.

126. Microbiol. 1990.-Vol.141. -№ 9.-P. 1131-1138.

127. Savio M.L., Rossi G., Tagliabue S., Pacciarini" M.L. Detection an& identification of Leptospira interrogans serovars by PCR coupled with restriction' endonucleas analysis of amplified DNA//J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32: - P.i935.941.

128. Schmidt G.P., Steere A.C., Kornblatt A.N. et al. Newly recognized Leptospira species (Leptospira inadai, serovar lyme) isolated from human skin// J.Clin. Microbiol. 1986. - Vol.24. - №3. - P.484 - 486.

129. Schoone G.J., TerpstraW.J., Ter Schegget J. Recognition of Leptospira by DNA hybridization// Zbl. Bakt. 1984. - Vol.257.-№4. - P.491.

130. Shang E. S., Exner M.M., Summers T.A. et al. The rare outer membrane protein OmpLi, of pathogenic Leptospira species is a heat-modifiable porin //Infect. Immun. 1995. - Vol.63. -P.3174—3181.

131. Shang E.S., Summers T.A., Haake D.A. Molecular cloning and sequence analysis of gene encoding LipL41, a surface exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species// Infect, immune. - 1996. - Vol.64. - №6. -P.2322 - 2330.

132. Smith D.J., SelfH.R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water// J Hyg. 1955. - Vol.53. - №4 - P.436-444.

133. Smithe L.D., Smith I.L., Smith G.A. A quantitave PCR (TaqMan) assay for114pathogenic Leptospira spp.//BMC Infectious Diseases 2002. — Vol.2. — P. 13;

134. Sorkin M.Yu., Aparin G.PlRestriction endonuclease analysis for the identification of leptospires serogroup Grippotyphosa isolated in the Far East of the USSR // In: Leptospirosis. VII European and Conference. Moscow. - 1990. -P.68.

135. Taylor G.R. Polymerase chain reaction: basic principles and automation// PCR. A Practical Approach (ed. M.J. McPherson, P. Quirke, G.R. Taylor). Oxford' University Press. Oxford.- N. Y. - Tokyo. - 1991. - P. 1 -14.

136. Terpestra W.J., Korver H., van Leeuwen J. et al. Alternative methods for the classification of leptospiral serovars// The Present State of Leptospirosis Diagnosis and Control (ed. W.A.Ellis and Little): 1985. - P.83-86.

137. TerpstraW.J., Schoone G.J., Ter Schegget-J: Detection of leptospira DNA by DNA-hybridization// Antonie van Leeuwenhoek. 1985. - Vol.51. - №5/6 -P.516-517.

138. TerpstraW.J., Schoone G.J., Ter Schegget J. Detection of leptospira DNA by nucleic acid hybridization with 32 P-and biotin-labelled probes// J. Med. Microbiol. 1986.-Vol.22. -№1 -P.23-28.

139. TerpstraW.J., Schoone G.J., Ter Schegget J. Detection of Leptospira interrogans in clinical specimens by in situ hybridization using biotin-labelled DNA probes// J.Gen. Microbiol. 1987. - Vol.133. -№4. -P.911-914.

140. Topciu V., Spinu I., Trinh thi Hang Quy. Consideration sur cartain cas de leptospirose ar reaction serologiques paradoxales// Arch, rouman path, experiam. microboil. 1972. - VoK31. - №1 - P.21-29.

141. Trueba-G.A., Bolin,C. A. and Zuerner R.L. Characterization of the periplasmic flagellum .proteins of Leptospira interrogans//J.Bacteriol. 1992. - Vol.174. - P. 4761-4768.

142. Turner L. Leptospirosis III. Maintenance, isolation and demonstration of leptospires //Trans.R.Soc.Trop.MediHyg. 1970. - Vol.64. - P.623-646.

143. Vijayachari P., Ahmed N., Sugunan A.P. Use of Fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism for Molecular Epidemiology of Leptospirosis in India//J. Glin. Microbiol. 2004. - Vol.42. - P. 3575-3580.

144. Von Heijne G. The structure of signal peptides from bacterial lipoproteins// Protein Eng. 1989. - Vol.2. - №7. - P.531-534

145. Walker E.M., Borenstein L.A., Blanco D.R. et al. Analysis of outer membrane ultrastructure of pathogenic Treponema and Borrelia species by freeze-fracture electrjne microscopy//J. Bacteriol. 1991. - Vol.173. -P.5585-5588.

146. Walker E.M.,Zampighi G.A., Blanco D.R. et al. Demonstration of rare protein in the outer membrane of Treponema pallidum, subsp. Pallidum by freeze-fracture analysis//! Bacteriol. 1989. - Vol. 171.- P.5005-5011.

147. Wayne L. G., Brenner D: J., Colwell R. R. et al. International Committee on Systematic Bacteriology. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics//J. Syst .Bacteriol. 1987. - Vol. 37. - P.463-464.

148. Wen-ping Chen and Tsong-teh Kuo. A simpl and rapid method for preparation of gram-negativ bacterial genomic DNA// Nucleuc Asids Recerch. -1993.- Vol.21. №9.-P.2260.

149. Wilson.J., Ochman H., Prager E.M. Molecular time scale for evolution// Trends in genet. 1987. - Vol.3. - P.241.

150. Woodward M.J., Sullivan G.J. Nucleotide sequence of a repetitive element isolated from Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-bovis//J. Gen. Microbiol. 1991. -Vol.137. -P.l 101-1109.

151. Yanagava R., Hiramune T., Akaike Y. Growth of Saprofitic and Patogenic Leptospirae on Solid medium in Carbon-Dioxid Free Air//J. Bact. 1963. -Vol.85. - №4.-P.953-954.

152. Yang C.W., Wu M.S., Pan M.J. The Leptospira outer membrane protein1.pL32 induces tubulointerstitial nephritis-mediated gene expression, in mouse116proximal tubule cells//J. Am. Soc. Nephrol. 2002. - Vol.13. - P.2037-2045.

153. Yasuda F.H., Steigerwal A.G., Sulzer K.B. et al. Dexosyribonucleic acid relatedness between serogroups and serovars in the family Leptospiraceae with proposal for seven new Leptospira species//J. System. Bacteriol. 1987. — Vol.3 7-№4 — P.407-415.

154. Zuerner R.L., Charon N.W. Nucleotide sequence analysis of a gene cloned from Leptospira biflexa serovar patoc which complements an argE defect in Escherichia coli//J. Bacteriol. 1988. - Vol.170. -P.4548-4554.

155. Zeurner R.L., Hartskeerl A., van de Kemp H., Bal A.E. Characterization of the Leptospira interrogans S10-spc-a operon//FEMS Microbiol. Lett. 2000. -Vol.175.-P.303-308.

156. Zuerner R.L., Herrmann J.L., Saint Girons I. Comparison of genetic maps for two Leptospira interrogans serovars provides evidence for two chromosomes and intraspecies heterogeneity//J. Bacteriol. 1993. - Vol.17. - P.5445-5451.

157. Zuerner RL, Huang WM. Analysis of a Leptospira interrogans locus containing DNA replication genes and a new IS, IS 1502// FEMS Microbiol Lett. -2002.-Vol.8.-P. 175-182.

158. Zerner R.L. Nucleotide sequence analysis of IS 1533 from Leptospira borgpetersenii: identification and expression of two IS-encoded proteins//Plasmid. 1994. - Vol.31.-№1.-P. 1-11.