Диазотрофы содовых солончаков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Сорокин, Иван Дмитриевич

• Сорокин, Иван Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сорокин, Иван Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ.4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.8

1.1. Общие сведения о почвах содового засоления.8

1.2. Значение биологической фиксации атмосферного азота.10

1.3. Общие сведения об азотфиксации. 11

1.4. Влияние солей и щелочности на активность азотфиксации (АА) в природных местообитаниях. 15

1.5. Влияние ионов натрия на АА чистых культур.16

1.6. Галотолерантные и галофильные свободноживущие диазотрофы из засоленных почв.18

1.7. Азотфиксирующие бактерии соленых водоемов.19

1.8. Микробные сообщества содовых озер и сведения о галоалкалофильных диазотрофах. 20

1.9. Механизмы адаптации бактерий к галоалкалофильным условиям.22

1.10. Гены нитрогеназного комплекса.25

1.11. Применение методов молекулярной экологии для изучения диазотрофии.27

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.30

2.1. Объекты исследования.

2.2. Определение химических параметров почвенных образцов. 30

2.3. Измерение потенциальной АА ацетиленовым методом.

2.4. Получение накопительных и чистых культур галоалкалофильных диазотрофов. 33

2.5. Фенотипическая характеристика-чистых культур.т. 35

2.6. Эксперименты с клеточными суспензиями.

2.7. Молекулярно-биологические методы. 37

2.8. Аналитические методы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.42

3.1. Потенциальная АА содовых солончаков различных регионов.42

3.2. Влияние различных факторов на потенциальную АА природной диазотрофной популяции содовых солончаков. . 45

3.3. Получение диазотрофных накопительных культур из образцов содовых солончаков . 50

3.4. Определение состава диазотрофных накопительных культур. . 51

3.5. Выделение чистых культур анаэробных диазотрофных галоалкалофилов из накопительных культур.55

3.6. Идентификация диазотрофов из содовых солончаков. 60

3.7. Характеристика чистых культур диазотрофных алкалофилов.64

3.7.1. Отношение к кислороду и сероводороду.64

3.7.2. Продукты брожения и метаболический профиль.65

3.7.3. Влияние рН и солей на рост. 68

3.7.4. Диазотрофная активность и влияние на нее рН и солей. 69

3.7.5. Описание новых таксонов диазотрофных галоалкалофилов, выделенных из содовых солончаков. 74

3.8. Детекция nifHв чистых и накопительных культурах диазотрофов из содовых солончаков и у референтных культур.76

3.8.1. Чистые культуры. 76

3.8.2. Клонирование фрагмента гена nifH в микроаэрофильных накопительных культурах из содовых солончаков. 78

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диазотрофы содовых солончаков»

Азотфиксация (АФ) является важнейшим звеном в глобальном цикле азота и наряду с фиксацией углекислоты обеспечивает продуктивность биосферы в целом. Многие природные экосистемы лимитированы по доступным соединениям азота, что придает процессу азотфиксации особое значение в круговороте биогенных элементов. Традиционно основное внимание исследователей было направлено на изучение симбиотической азотфиксации в связи с ее значимостью для сельского хозяйства. Однако за последние годы было убедительно показано, что диазотрофия широко распространена среди прокариот, и микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, присутствуют практически во всех экосистемах, не связанных с агрокультурой (Zehr, 2003). Именно способность к азотфиксации дает возможность прокариотам существовать в эконишах с крайне низким содержанием азота, а также обогащать окружающую среду азотными соединениями.

Исследования процесса азотфиксации в засоленных почвах выполнены главным образом, в таких странах как Пакистан, Индия, Египет, где большие территории возделываемых земель подвержены засолению (Rai, 1991; Zahran et al., 1995; Abd-Alla, 1999). Однако они не распространяются на почвы содовых солончаков, характерной особенностью которых является высокая щелочность. В нашей стране почвы содового засоления можно отнести к экзотическим местообитаниям за исключением Юго-Западной Сибири и Забайкалья. В то же время они представляют уникальный природный объект для изучения галоалкалофильных микроорганизмов - экологической группы, которая обладает рядом физиологических особенностей, обусловленных средой обитания. Изучение процесса азотфиксации важно также для агрономии, которая пытается решить проблемы увеличения плодородия в этих почвах.

В отличие от содовых солончаков, микроорганизмы содовых озер активно исследуются микробиологами в течение последних 10-15 лет (Жилина и др., 2001, 2005; Jones et al., 1998; Baumgarte, 2003; Sorokin and Kuenen, 2005). Благодаря исследованиям, выполненным сотрудниками ИНМИ РАН, получена достаточно полная картина основных компонентов галоалкалофильного сообщества и их взаимодействий (Заварзин и др., 1999). В то же время, сведения о процессе АФ и составе диазотрофных сообществ в содовых местообитаниях остаются весьма ограниченными (Herbst, 1998; Steward et al., 2004).

В связи с изучение активности и биоразнообразия азотфиксирующих диазотрофов в почвах содовых солончаков, для которых характерно как высокое содержание солей, так и высокая щелочность, представляет научный и практический интерес. В контексте настоящей работы представлялось важным выяснить, существуют ли отличия в диазотрофной микрофлоре содовых солончаков от того, что известно для содовых озер.

Целью данной работы являлось изучение процесса АФ и характеристика диазотрофных микроорганизмов в почвах содового засоления. В задачи исследования входило:

1. Определение потенциальной АФ в содовых солончаках различной географической принадлежности.

2. Изучение влияния различных факторов на АФ микробных популяций содовых солончаков.

3. Выделение и исследование накопительных культур азотфиксирующих бактерий из образцов содовых солончаков.

4. Выделение, характеристика и таксономическое описание чистых культур диазотрофов из содовых солончаков.

5. Изучение структуры диазотрофных сообществ в накопительных культурах методом молекулярного анализа гена nifii.

Научная новизна. Впервые установлено наличие потенциальной способности к АФ в почвах содового засоления различных географических регионов. С помощью культуральных и молекулярных методов установлено преобладание в диазотрофных накопительных культурах, выделенных при рН 10, грамположительных бактерий с низким ГЦ; относящихся к бациллам и сульфидогенным клостридиям. Из содовых солончаков Центральной Азии и Египта выделены 11 чистых культур галоалкалофильных азотфиксирующих бацилл РНК групп 1 и 6, в которых АФ не была известна. На основании физиологических и филогенетических признаков восемь изолятов описывается как новый род и новый вид "Natronobacillus azotifixans", два изолята классифицированы как новый вид "Amphibacilhis diazotrophicus" и один изолят как новый вид "Bacillus alkalidiazotrophicus". Все выделенные чистые культуры являются облигатными бродилыциками, рост и АФ активность которых возможны только в щелочных условиях с оптимумом рН 9-10. АФ активность клеток подавлялась уже умеренными концентрациями солей натрия (> 2 М Na+).

Практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о том, что, при наличии благоприятных условий (увлажнение и частичное рассоление) содовые солончаки могут осуществлять одну из важнейших функций плодородных почв - фиксацию атмосферного азота.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2005, Москва, Россия; III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» 2007, Москва, Россия; Second International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (MicroBioWorld), 2007, Севилья, Испания.

Публикации. Основные материалы, обсуждаемые в диссертации, содержатся в 2 статьях и 3 тезисах конференций. 2 статьи сданы в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, описания методов и объектов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Текст включает 98 страниц, 13 таблиц, 22 рисунка; список литературы включает 138 наименований, из них 13 на русском и 125 на английском языке.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Сорокин, Иван Дмитриевич

Выводы

1. Для содовых солончаков Южной Сибири, Северо-Восточной Монголии и Египта показано наличие потенциальной азотфиксирующей активности в микроаэробных-анаэробных условиях, зависящей от степени увлажнения и глюкозы в качестве органического донора электронов. В целом величины нитрогеназной активности отрицательно коррелировали с содержанием растворимых солей и карбонатной щелочностью. Тем не менее, ряд солончаков обладал сравнительно высокой активностью при умеренных значениях щелочности и солености.

2. Культуральными и молекулярно-биологическими методами установлено, что группа грамположительных аэротолерантных бродилыциков из РНК групп 1 и 6 бацилл с низким ГЦ обуславливает диазотрофную активность содовых солончаков. Ранее способность к фиксации азота у этих бактерий не была известна.

3. Из 11 диазотрофных изолятов 10 относятся к РНК группе 1 бацилл. Преложено описать 8 штаммов в качестве нового рода и вида "Natronobacillus azotifixans''' и 2 штамма в качестве нового вида рода Amphibacillus "A.diazotrophicus". Один штамм, относящийся к РНК группе 6 бацилл, предложено выделить в новый вид рода Bacillus - "B.alkalidiazotrophicus".

4. Все диазотрофные бактерии, выделенные из содовых солончаков, отличаются облигатной алкалофилией, натронофилией (предпочтение соды вместо NaCl) и от умеренной ("B.alkalidiazotrophicus") до экстремальной (изоляты группы 1) солетолерантностью. Диазотрофная активность у изученных галоалкалофилов также имела четко выраженный алкалофильный рН профиль, в то время как ее солетолерантность была значительно ниже ростовой.

5. У всех выделенных из содовых солончаков диазотрофов обнаружен ключевой функциональный ген азотфиксации nifH, который по данным филогенетического анализа образует новую ветвь среди кластера грамположительных бактерий с низким ГЦ. Результаты клонирования гена nifH в накопительных культурах подтвердили доминирование представителей РНК групп 1 и 6 в диазотрофном сообществе содовых солончаков, а также выявили присутствие облигатно анаэробных сульфидогенных клостридий в качестве минорного компонента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сорокин, Иван Дмитриевич, 2008 год

1. Базилевич Н.И. Геохимия почв содового засоления. М., Наука. (1965). 351 стр.

2. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий. Микробиология. 2002. Т.71. С. 500-508.

3. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П. Amphibacillus fermentum sp.nov., Amphibacillus tropicus sp.nov. новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади. Микробиология. 2001. Т. 70. С. 825-837.

4. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Турова Т.П., Лысенко A.M., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Clostridium alcalicellum — облигатно алкалофильная целлюлолитическая бактерия из содового озера Забайкалья. Микробиология 2005. Т.74. С.556-567.

5. Заварзина Д.Г., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П., Заварзин Г.А. Geoalkalibacter ferrihydtiticus, первый алкалофильный представитель семейства Geobacteraceae из содового озера. Микробиология. 2006. Т.75. С.673-682.

6. Ковда В.А. Основы учения о почвах. Общая теория почвообразовательного процесса. Книга вторая. М.: Наука. 1973. 467 с.

7. Кондорская Н.И. Географическое распространение почв содового засоления в СССР. Почвоведение 1965. №9.10-16.

8. Кравченко И.К., Калининская Т.А. Азотфиксирующие бактерии сильнозасоленной такыровидной почвы. Микробиология. 1988. V.57. С. 279-283.

9. Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов. 43-е Баховское чтение. М.: Наука. 1989. С. 87.

10. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот. Микробиология 2001. Т.70. С. 86-91.

11. Меняйло О.В. Особенности процесса денитрификации в засоленных почвах. Канд. Дисс. МГУ. 1996. С. 117.

12. Слободова Н.В. Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов niJR. Канд. Диссерт. МГУ. 2006. 150 с.

13. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильные микробные сообщества и их функциональное разнообразие. Микробиоология 1999. Т.68. С.503-521.

14. Abd-Alla М.Н. Nodulation and nitrogen fixation of Lupinus species with Bradyrhizobium (lupin) strains in iron-deficient soil. Biol. Fertil Soils. 1999. V. 28. P. 407- 415.

15. Achouak W., Normand P., Heulin T. Comparative phylogeny of rrs and nifH genes in the Bacillaceae. Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V.49. P.961-967.

16. An, S.-Y., Ishikawa, S., Kasai, H., Goto, K. & Yokota, A. (2007). Amphibacillus sediminis sp. nov., an endosporeforming bacterium isolated from lake sediment in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V.57 P.2489-2492.

17. Apte S. K., Joseph T. Sodium is required for nitrogenase activity in cyanobacteria. Curr. Microbiol. 1980. V. 6. P. 291-293.

18. Argandona M., Fernandez-Carazo R., Llamas I., Martinez-Checa F., Caba J.M., Quesada E. and del Moral A. The moderately halophilic bacterium Halomonas maura is a free-living diazotroph. FEMS Microbiol. Lett. 2005. V. 244. P.69-74.

19. Bagwell C.E., La Rocque J.R., Smith G.W., Poison S.W., Friez M.J., Longshore J.W. and Lovell C.R. Molecular diversity of diazotrophs in oligotrophic tropical seagrass bed communities. FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V.39. P.l 13-119.

20. Baumgarte S. Microbial diversity of soda lake habitats. PhD thesis. 2003. Carolo-Wilhelmina University, Braunschweig.

21. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res. 1979. V.7. P.1513-1523.

22. Boussiba S., Schleizenger P., Belkin S. Sodium sustains the growth of Spirulina platensis in extreme alkaline enviorements. 8th Int. Symp. Phototrophic Prokaryotes. 1994. Urbino. 10-15 Sept. V.l. P.183.

23. Brown I.I., Fadeyev S.I., Kirik I.I., Severina 1.1., Skulachev V.P. Light-dependent delta mu Na-generation and utilization in the marine cyanobacterium Oscillatoria brevis. FEBS Lett. 1990. V. 270. P.203-206.

24. Brown M.M., Friez M.J., Lovell C.R. Expression of nijYL genes by diazotrophic bacteria in the rhizosphere of short form Spartina alterniflora. FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V.43. P.411-417.

25. Burgess B.K. and Lowe D.J. Mechanism of molybdenum nitrogenase. Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2983-3012.

26. Cannon F.C., Riedel G.E., Ausubel F.M. Overlapping sequences of Klebsiella pneumoniae nifDNA cloned and characterized. Mol. General Genetics 1979. V. 174. P. 59-66.

27. Chen Y.B., Dominic В., Mellon M.T. and Zehr J.P. Circadian rhythm of nitrogenase gene expression in the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. strain IMS 101. J. Bacteriol. 1998. V.180. P. 3598-3605.

28. De Ley J., Caffon H. & Reinaerts A. The quantitative measurements of hybridisation DNA from renaturation rates. Eur. J.Biochem. 1970. V.12 P.133-140.

29. Dibrov V. A. The role of Na ion transport in E. coli energetics. Biochem. Biophys. Acta 1991. V. 1056. P.209-224.

30. Dicker H., Smith D.W. Effects of salinity on acetylene reduction (nitrogen fixation) and respiration in a marine Azotobacter. Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.42. P.740-744.

31. Doolittle W.F. Lateral genomics. Trends Cell Biol. 1999. V.12. P.5-8.

32. Dromgoole F.I., Silvester W.B. and Hicks B.J. Nitrogenase activity associated with Codium species from New Zealand marine habitats. New Zealand J. Marine Freshwater Res. 1978. V.12. P. 17-22.

33. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E. and van Steenbergen R Phylogenetic diversity of soda lakes alkaliphiles. FEMSMicrob. Ecol. 1996. V.l9. P. 181-191.

34. Durrant M.C. An atomic-level mechanism for molybdenum nitrogenase. Part 1. Reduction of dinitrogen. Biochemistry 2002. V.41. P.13934-13945.

35. Elsheikh E.A. and Wood M. Nodulation and N2- fixation by soybean inoculated with salt-tolerant rhizobia or salt-sensitive bradyrhizobia in saline soil. Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P.657-661.

36. El-Shnnawi M.M. and Frankenberger W.T. Salt inhibition of free-living diazotroph population density and nitroginase activity in soil. Soil Science. 1988. V. 146. P. 176-184.

37. Foti M. Microbial ecology of haloalkaliphilic sulfur bacteria. PhD thesis, 2007. TU Delft, Delft, The Netherlands.

38. Galinski E.A. and Trueper H.G. Microbial behavior in salt-stressed ecosystems. FEMS Microbiol. Rev. 1994. V.15. P. 95-108.

39. Grant W.D., Jones B.E. and Mwatha W.E. Alkaliphiles: ecology, diversity and applications. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.75. P.255-270.

40. Halbleib С. M. and Ludden P.W. Regulation of biological nitrogen fixation. J. Nutr. 2000. V.130. P. 1081-1084.

41. Humayoun S.B., Bano V. and Hollibaugh J.T. Depth distribution of microbial diversity in Mono Lake, a meromictic Soda Lake in California. Appl. Environ. Microbiol. 2003. V.69. P.1030-1042.

42. Hardy R.W., Knight E.Jr., D'Eustachio A.J. An energy-dependent hydrogen-evolution from dithionite in nitrogen-fixing extracts of Clostridium pasteurianum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. V.20. P. 539-544.

43. Hartmann A., Prabhu S.R. and Galinski E.A. Osmotolerance of diazotrophic rhizosphere bacteria. Dev. Plant. Soil Sci. 1991. V. 48. P. 243-247.

44. Herbst D.B. Potential salinity limitations of nitrogen fixation in sediments from Mono-Lake. Int. J. of Salt Lake Res. 1998. V. 7. P. 261-274.

45. Home A.J. and Galat P.L. Nitrogen fixation in an oligotrophic, saline desert lake, Pyramid Lake, Nevada. Limnol. Oceanogr. 1985. V. 30. V. 1229-1239.

46. Igarashi R.Y. and Seefeldt L.C. Nitrogen fixation: the mechanism of the Mo-dependent nitrogenase. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2003. V.38. P. 351-384.

47. Imhoff J.F. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1986. V. 39. P. 57-66.

48. Izquierdo J. A. andNusslein K. Distribution of extensive nifH gene diversity across physical soil microenvironments. Microb. Ecol. 2006. V.51. P.441-452.

49. Jacobitz S. and Bishop J. Regulation of nitrogenase-2 in Azotobacter vinelandii by ammonium, molybdenum, and vanadium. J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 3884-3888.

50. Jenkins B.D., Steward G.F., Short S.M., Ward B.B. and Zehr J.P. Fingerprinting diazotroph communities in the Chesapeake Bay by using a DNA macroarray. Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 3. P. 1767-1776.

51. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles 1998. V.2. P. 191-200.

52. Kaieda N., Wakagi Т., Koyama N. Presence of Na(+)-stimulated V-type ATPase in the membrane of a facultatively anaerobic and halophilic alkaliphile. FEMS Microbiol. Lett. 1998. V.167. P.57-61.

53. Kessler P.S., Blank C. and Leigh J.A. The nif gene operon of the methanogenic archaeon ethanococcus maripaludis. J. Bacteriol. 1998. V.180. P. 1504-1511.

54. Kim K., Zhang Y.P. and Roberts G.P. Correlation of activity regulation and substrate recognition of the ADP-ribosyltransferase that regulates nitrogenase activity in Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. 1999. V.181. P. 1698-1702.

55. Krulwich T.A., Hicks D.B., Seto-Young D. and Guffanti A.A. The bioenergetics of alkaliphilic bacilli. CRC Crit.Rev.Microbiol. 1988. V.16. P.15-36.

56. Krulwich T. A., Ito M., Guffanti A.A The Na-dependence of alkaliphily in Bacillus. Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1505. P.158-168.

57. Lai M.C., Sowers K.S., Robertson D.E., Roberts M.F. and Gunslus R.P. Distribution of compatible solutes in the halophilic methanogenic archaebacteria. J. Bacteriol. 1991. V.173. P. 5352-5358.

58. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970. V. 227, 680-685.

59. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics (Eds. Stackebrandt, E. & Goodfellow, M.). Chichester, UK: John Wiley & Sons) 1991. P. 115-177.

60. Lippert K. and Galinski E. Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V.37. P. 61-65.

61. Lovell C.R., Piceno Y.M., Quattro J.M., Bagwell C.E. Molecular analysis of diazotroph diversity in the rhizosphere of the smooth cordgrass, Spartina alterniflora. Appl. Environ. Microbiol., 2000. V.66. P.3814-3822.

62. Lyons E.M. and Thiel T. Characterization of niJB, ni/S, and nif\J genes in the cyanobacterium Anabaena variabilis. NifB is required for the vanadium-dependent nitrogenase. J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 1570-1575.

63. Malik K. A., Bilal R., Rasul G., Mahmood K. and Sajjad M.I. Associative N2-fixation in plants growing in saline sodic soils and its relative quantification based on 15N natural abundance. Dev. Plant. SoilSci. 1991. V. 48. V. 211-218.

64. Marmur J. A procedure for isolation of DNA from microorganisms. J. Mol. Biol. 1961. V.3. P. 208-214.

65. Martin D.D., Ciulla R.A., Roberts M.F. Osmoadaptation in Archaea. Appl. Envir. Microbiol. 1999. V. 65. P. 1815-1825.

66. McClung C.R. and Patriquin D.G. Isolation of a nitrogen-fixing Campylobacter species from the roots of Spartina alterniflora Loisel. Can. J. Microbiol. 1980. V.26. P. 881-886.

67. Mehta M.P., Butterfield D.A. and Baross J.A. Phylogenetic diversity of nitrogenase (nifH) genes in deep-sea and hydrothermal vent environments of the Juan de Fuca Ridge. Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 960-970.

68. Miller A. G. and Canvin D. G. Prediction cation ratios in corn from saline solution composition. J. Exp. Bot. 1987. V.202. P. 605-612.

69. Murata Т., Kawano M., Igarashi K., Yamoto I. and Kakinuma Y. Catalytic properties of Na+-translocating V-ATPase in Enterococcus herai. Biochem. Biophis. Acta. 2001. V. 1505. P.75-81.

70. Nedwell D.B. and Azni S. Heterotrophic nitrogen in an intertidal saltmarsh sediment. Estuarian Coastal Marine Science. 1980. V. 10. P. 699-702.

71. Ni S., Boone J. E. and Boone D.R. Potassium extrusion by the moderately halophilic and alkaliphilic methanogen Methanolobus teylorii GS-16 and homeostasis of cytosolic pH. J. Bacteriol. 1994. V.176. P.7274-7279.

72. Niimura, Y. et al. A hydrogen peroxide-forming NADH oxidase that functions as an alkyl hydroperoxide reductase in Amphibacillus xylanus. J.Bacteriol. 2000. V. 182. P. 5046-5051.

73. Oliver В., Caumette P., Garcia J-L. and Mah R.A. Anaerobic bacteria from hypersaline enviroments. Microbiol. Rev. 1994. V. 58. P.27-38.

74. Oremland R.S. Nitrogen fixation of two diazotrofic communities in Mono-Lake Appl. Environ. Microbiol. 1990. Y.56. P.614-622.

75. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V.63. P.334-348.

76. Oren A., Heldal M., Svein N., Galinski E.A. Intracellular ion and organic solute concentrations of the extremely halophilic bacterium Salinibacter rubber. Extremophiles 2002. V.7. P.491-498.

77. Pace N.R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 1997. V. 276.- P. 734-740.

78. Padan E., Bibi E., Ito M. and Krulwich T.A. Alkaline pH homeostasis in bacteria: New insights. Biochim. Biophys. Acta 2006. V.1717. P.67-88.

79. Pathak H. and Rao D.L.N. Carbon and nitrogen mineralization from added organic matter in saline and alkaline soil. Soil Biol. Biochem. 1998. V.30. P.695-702.

80. Pfennig, N., & Lippert, K. D. Uber das Vitamin B12 -bediirfnis phototropher Schwefel bacterien. Arch. Microbiol. 1966. V.55. P.245-256.

81. Piceno Y.M., Noble P.A. and C.R. Lovell. Spatial and temporal assessment of diazotroph assemblage composition in vegetated salt marsh sediments using denaturing dgadient gel electrophoresis analysis. Microb. Ecol. 1999. V.38. P. 157-167.

82. Poly F., Monrozier L.J. and Bally R. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifii genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res. Microbiol. 2001a. V. 152. P. 95-103.

83. Poly F., Ranjard L., Nazaret S., Gourbiere F. and Monrozier L.J. Comparison of nifii gene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties. Appl. Environ. Microbiol. 2001b. V. 67. P. 2255-2262.

84. Prakash R.K., Schilperoort R.A. and Nuti M.P. Large plasmids of fast-growing rhizobia: homology studies and location of structural nitrogen fixation (nif) genes. J. Bacteriol. 1981. V. 145. P. 1129-1136.

85. Rai R. Strain-specific salt tolerance and chemotaxis of Azospirillum brasilense and their associative ^-fixation with finger millet in saline calcareous soil. Dev. Plant. Soil Sci. 1991. V. 48. P. 155-159.

86. Rai A.K., Tiwari S.P. Response to NaCl of nitrate assimilation and nitrogenase activity of the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 and its mutants. Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 87. V. 877-883.

87. Raza S., Jorusgard В., Abou-Taleb H., Christiansen J.L. Tolerance of Bradyrhizobium sp. (Lupini) strains to salinity, рН, СаСОз and antibiotics. Lett. Appl. Microbiol. 2001. V.32. P.379-383.

88. Raymond J., Siefert J.L., Staples C.R. and Blankenship R.E. The natural history of nitrogen fixation. Mol. Biol. Evol. 2004. V. 21. P. 541-554.

89. Rees, D.G. In: Essential Statistics. 3d Edition. London: Chapman & Hall, 1995. P.189-200.

90. Robertson D., Noll D., Roberts M. F., Menaia J., Boone R. D. Detection of the osmoregulator betaine in methanogens. Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 563-565.

91. Rudulier D., Yang S., Csonka L.N. Nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae during osmotic stress effect of exogeonus proline or a proline overproducing plasmid. Biochim. Biophis. Acta. 1982. V. 719. P. 273-283.

92. Sambrook J., Fritsch E.F., Manniatis A. Molecular cloning: a laboratory manual. Ed.: C. Nolan, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

93. Schafer H., Muyzer G. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis in Marine Microbial Ecology. In: Methods in Microbiology. 2001. V.30. P.425-468, Academic Press, London.

94. Short S.M. and Zehr J.P. Quantitative analysis of nifH genes and transcripts from aquatic environments. Methods Enzymol. 2005. V.397. P. 380-394.

95. Singh D.V., Tripathi A.K., Kumar H.D. Isolation and characterization of salt resistant mutant of a nitrogen-fixing cyanobacterium, Anabaena doliolum. Appl. Bacteriol. 1991. V. 71. P. 207-210.

96. Skulachev V.P. Chemoosmotic concept of the membrane bioenergetics: What is already clear and what is still waiting for elucidation? // J.Bioener. Biomembr. 1995. V. 26. P.67-80.

97. Smith. C.J., Chalk P.M., Noble C.H., Prendergast J.B., Robertson F. Nitrogen fixation a white clover-grass pasture irrigated with saline groundwater. Irrig. Sci. 1993. V. 13. P. 189-194.

98. Smith LT, Smith GM, D'Souza MR, Pocard J-M, LeRudulier D, Madkour MA Osmoregulation in Rhizobium meliloti: mechanism and control by other environmental signals J. Exp. Zool. 1994. V. 268. P. 162-165.

99. Sorokin D.Yu. Is there a limit for high-pH growth? Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1405-1406.

100. Sorokin D.Y. and Kuenen J.G. Alkaliphilic chemolithotrophs from soda lakes. FEMS Microbiol. Ecol. 2005. V.52. P.287-295.

101. Sorokin D. Y., Foti M., Pinkart H.C. and Muyzer G. Sulsur-oxidizing bacteria in Soap Lake (Wash-ington, USA), a meromictic, haloalkaline lake with an upprecedent high sulfide content. Appl. Environ. Microbiol 2007. V. 73: 451-455

102. Steward G.F., Jenkins B.D., Ward B.B. and Zehr J.P. Development and testing of a DNA macroarray to assess nitrogenase {nifH) gene diversity. Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 1455-1465.

103. Tan Z.Y., Wang E.T., Peng G.X., Zhu M.E., Martinez-Romero E. and Chen W.X. Characterization of bacteria isolated from wild legumes in the north-western regions of China. Int. J. Syst. Bacteriol 1999. V.49. P.1457-1469.

104. Taroncher-Oldenburg G., Griner E.M., Francis C.A. and Ward B.B. Oligonucleotide microarray for the study of functional gene diversity in the nitrogen cycle in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1159-1171.

105. Thiel T.J. Characterization of genes for an alternative nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis. J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 6276-6286.

106. Tokuda H., Unemoto T. The Na+-motive respiratory chain of marine bacteria. Microbiol. Sci. V.2. P. 65-71.

107. Van de Peer Y., & De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci. 1994. V.10. V.569-570.

108. Widmer F., Shaffer B.T., Porteous L.A., Seidler R.J. Analysis of nifH gene pool complexity in soil and litter at a Douglas fir forest site in the Oregon cascade mountain range. Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 374-380.

109. Wiemken A. Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve carbohydrate. Antonie van Leeuvenhoek. 1990. V. 58. P. 209-217.

110. Wohlfarth A., Severin J, Galinski E. Identification of N-cetylornithine as a novel osmolyte in some Gram-positive halophilic eubacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 568-573.

111. Yannarell А.С., Steppe T.F. and Paerl H.W. Genetic variance in the composition of two functional groups (diazotrophs and cyanobacteria) from a hypersaline microbial mat. Appl. Environ. Microbiol. 2006. V.72. P. 1207-1217.

112. Zahran H.H. Conditions for successful Rhizobium-legume symbiosis in saline environments. Biol. Fertile Soils. 1991. V. 12. P. 73-80.

113. Zahran H.H. Diversity, adaptation and activity of the bacterial flora in saline environments. Biol. Fertil. Soils. 1997. V. 25. P. 211-223

114. Zahran H.H., Ahmad M.S., Afkar E.A. Isolation and characterization of nitrogen-fixing moderate halophilic bacteria from saline soils of Egypt. Basic Microbiol. 1995. V. 4. P. 269-275.

115. Zahran, H. H., Sprent J. I. Effects of sodium chloride and polyethylene glycol on root hair infection and nodulation of Vicia faba L. plants by Rhizobium leguminosarum. Planta 1986. V.167. P. 303-309.

116. Zehr J.P., Jenkins B.D., Short S.M., Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison. Environ. Microbiol. 2003. V.5. P. 539-554.

117. Zehr J.P., Mellon M., Braun S., Litaker W., Steppe Т., Paerl H.W. Diversity of heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat. Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61. P. 2527-2532.

118. Zehr J.P., Mellon M.T. and Zani S. New nitrogen-fixing microorganisms detected in oligotrophic oceans by amplification nitrogenase (nifll) genes. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P. 3444-3450.

119. Zhilina T. N., Zavarzin G. A Extremely halophilic, methylotrophic, anaerobic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 87. P. 315-322.

120. Zon N., Dart P.J., Marcar N.E. Interaction of salinity and rhizobial strain and growth and N2-fixing by Acacia ampliceps. Soil Biol. Biochem. 1995. V. 27. P. 409-413.