Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат технических наук Дмитриенко, Марина Александровна

• Дмитриенко, Марина Александровна
• кандидат технических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат технических наук Дмитриенко, Марина Александровна

Введение.

Глава 1. Обзор и обсуждение литературы.

1.1. Helicobacter pylori, история открытия, свойства микроорганизма, эпидемиология инфекции и ассоциированность ее с другими заболеваниями.

1.2. Хеликобактериоз и методы его диагностики.

1.3. Уреаза, ее свойства и методы исследования.

1.4. Методы определения уреазной активности.

1.5. Уреазная система Helicobacter pylori.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

Глава 3. Процесс определения Helicobacter pylori по уреазной активности.

3.1. Кинетика ферментативного гидролиза карбамида.

3.2. Кинетика диффузионных процессов.

3.3.Обнаружение продуктов реакции гидролиза. Линейноколористический метод индикации веществ.

3.4. Формулирование требований к разрабатываемым тест-системам.

Глава 4. Разработка способа определения уреазной активности in vitro.

4.1. Определение рН биоптата.

4.2. Оптимизация индикаторной системы.

4.3. ХЕЛПИЛ-тест.

4.4. Проверка ХЕЛПИЛ-теста

Глава 5. Способы определения уреазной активности in vivo.

5.1. ХЕЛИК-тест как метод определения уреазной активности in vivo.

5.2. Пассивные дозиметры для определения аммиака.

5.3. Индикаторные трубки как детектор содержания аммиака.

5.4. Диагностика хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора.

5.5. Повышение чувствительности ХЕЛИК-теста.

Глава 6. Оценка возможности применения ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-теста для диагностики хеликобактериоза в медицинской лечебной и исследовательской практике.

6.1. Применение ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов в медицине.

6.2. Схема диагностики инфекции Helicobacter pylori.

Выводы.

Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности»

Бактерия Helicobacter pylori обитает на слизистой оболочке желудка человека и других млекопитающих и вызывает заболевание, названное хеликобактериозом. Инфекция H.pylori является одной из наиболее распространенных на Земле; ею инфицировано около половины человечества, в разных странах от 20 до 95% населения. В России уровень инфицирования составляет 70-80%.

Присутствие микроорганизмов на слизистой оболочке желудка (СОЖ) вызывает постепенное изменение слизистой и приводит к таким заболеваниям желудочно-кишечного тракта, как хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка и др.

Бактерия H.pylori была открыта почти 20 лет назад; за это время изучены свойства микроорганизма, его метаболизм, ферментная система, взаимодействие с макроорганизмом. Это открытие называют «революцией в гастроэнтерологии», так как оно коренным образом изменило представления о сущности, патогенезе и терапевтическом подходе к целому ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с данной инфекцией.

Мнение большинства врачей-исследователей сейчас однозначно — бактерия H.pylori оказывает патогенное влияние на организм человека, следовательно, эту инфекцию необходимо своевременно обнаруживать и лечить, не допуская развития тяжелой патологии. Таким образом, разработка методов определения инфекции Н. pylori является весьма актуальной задачей. Более того, требуются новые диагностические технологии, позволяющие быстро и достоверно определить хеликобактериоз у пациента.

Существующие методы определения H.pylori (бактериологические, морфологические, биохимические, иммунологические, молекулярные) настолько громоздки, что не могут быть использованы для массовой серийной диагностики. Необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод обнаружения бактерии H.pylori, а также реализовать этот метод в удобных и недорогих тестах для широкого применения в медицинской практике.

Детектирование хеликобактериоза может проводиться по продуктам реакции уреазного гидролиза карбамида - специфической реакции, которая обеспечивает бактерии возможность выживания в агрессивной кислой среде желудка. Данный метод определения инфекции H.pylori по уреазной активности является косвенным, но позволяет достичь весьма высоких показателей чувствительности и специфичности.

Цель работы

Разработка специфичного, чувствительного, экспрессного и удобного метода определения уреазной активности (УА) биологического материала in vitro и совершенствование метода определения У A in vivo.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи: определить закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении УА in vivo и in vitro; выявить лимитирующие стадии этих процессов и оптимизировать определение УА;

- разработать способы определения инфекции H.pylori по УА in vivo и in vitro с различными вариантами получения и обработки аналитического сигнала; разработать технологию изготовления экспресс-тестов для определения УА биологического материала in vitro; оценить диагностическую эффективность новых тестов и апробировать их на клиническом материале.

Научная новизна работы

- Впервые определение инфекции H.pylori по ее уреазной активности рассмотрено как комплексный процесс; выявлены лимитирующие стадии при прохождении процесса in vivo и in vitro и определены пути совершенствования биохимического метода определения бактерии;

- исследованы процессы переноса субстрата карбамида к уреазе бактерии, обитающей на поверхности СОЖ, а также продуктов ферментативного гидролиза из зоны реакции;

- впервые разработана физико-химическая индикационная система на плоском волокнистом носителе для определения уреазной активности биологического материала, в т.ч. биоптатов СОЖ;

- на основании выявленных особенностей механизма процесса усовершенствован метод определения уреазной активности in vivo;

- показана применимость разработанного метода для диагностики инфекции H.pylori, проведено сопоставление его специфичности и чувствительности с аналогичными характеристиками применяемых в медицинской практике методов;

- разработана комплексная схема диагностики хеликобактериоза, включающая инвазивные и неинвазивные методики.

Практическая значимость

Разработан новый метод определения уреазной активности биологических объектов; на основе предложенного метода разработан ХЕЛПИЛ-тест - экспресс-тест для оценки уреазной активности биологического материала in vitro.

Разработана рецептура и технология производства ХЕЛПИЛ-теста, определены его специфичность и чувствительность.

Модифицирована методика неинвазивного определения хеликобактериоза (ХЕЛИК-тест) с помощью индикаторных трубок в качестве детекторов, в результате повышена чувствительность определения и уменьшено время обследования.

Разработан новый способ определения хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора и устройство для этого способа определения.

Разработан комплекс методик диагностики H.pylori, включающий инвазивное и неинвазивное определение хеликобактериоза. ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тесты прошли клинические испытания и рекомендованы Министерством Здравоохранения России к серийному производству и практическому применению в медицинских учреждениях России.

Апробация работы

Основные результаты были представлены в постерном докладе на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (25 - 29 мая 1998 года, Санкт-Петербург), постерном сообщении на 22м Международном Симпозиуме по Хроматографии ISC-98 (13 - 18 сентября 1998 года, Рим), в докладе на III Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori (7 апреля 2000 года, Москва), докладе на VIII Восьмой Российской гастроэнтерологической неделе (18-21 ноября 2002 года, Москва), постерном сообщении на 15м Европейском Конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине EUROMEDLAB-2003 (1-5 июня 2003 года, Барселона).

По результатам работы опубликовано 8 статей, 3 тезиса^ докладов, получен Патент РФ на изобретение «Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления» RU №2184781, оформлены заявки на Патенты на патенты «Способ диагностики хеликобактериоза ин виво» (Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., 2002), приоритет от 19.04.2002 и «Способ неинвазивной диагностики инфекции Helicobacter pylori ин виво и устройство для его реализации» (Дмитриенко М.А., Корниенко Е.А., 2003), приоритет от 11.04.2003.

Разработанные тесты проверены в научно-исследовательских медицинских и лечебных учреждениях города Санкт-Петербурга и других городов России, в т.ч. в Санкт-Петербургской Педиатрической Академии,

Санкт-Петербургской Медицинской Академии Последипломного образования, Санкт-Петербургском Медицинском Университете, Военно-Медицинской Академии (г.Санкт-Петербург), " Научно-Исследовательском институте Скорой помощи (г.Санкт-Петербург). Представлены отзывы и акты апробации тестов для диагностики хеликобактериоза.

Проект "Аналитический комплекс для диагностики хеликобактериоза" занял первое место в городском конкурсе научных работ "Внедрение-97", проводимом под эгидой Союза Ученых Санкт-Петербурга.

Разработаны Методические рекомендации по методикам определения уреазной активности и диагностики хеликобактериоза.

Разработаны Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза по уреазной активности биоптата (in vitro) ХЕЛПИЛ-тест-«АМА» ТУ 9398001-45564088-2003 и Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза дыхательным методом (in vivo) ХЕЛИК-тест-«АМА» ТУ 9398-002-45564088-2003, проведены их технические приемочные испытания, а также клинические испытания на базе кафедры педиатрии ФПК и 1111 Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической академии, кафедры детских болезней №2 Российского государственного медицинского университета (г. Москва) и Научного центра Здоровья детей РАМН (г. Москва). По результатам этих испытаний Министерство Здравоохранения РФ рекомендовало тесты к серийному производству и практическому применению в медицинской практике, к внесению в Реестр изделий медицинского назначения.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 25 рисунков и 15 таблиц. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, благодарностей, приложений (протокол проверки, отзывы, акт технических испытаний, протоколы клинических испытаний, выписка из протокола комиссии МЗ РФ) и библиографии (178 наименований).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Дмитриенко, Марина Александровна

139 ВЫВОДЫ

1. Разработан специфичный, чувствительный, экспрессный и удобный метод определения уреазной активности биологического материала in vitro. На основе разработанного метода создана аналитическая тест-система для экспресс-тестирования биологического материала и диагностики хеликобактериоза по его уреазной активности ХЕЛПИЛ-тест. Тест-система имеет чувствительность 92-97%, специфичность 94-98%, время анализа - не более 3 минут.

2. Усовершенствован способ определения уреазной активности in vivo ХЕЛИК-тест. Модифицированный способ характеризуется более высокой чувствительностью определения и меньшим временем обследования.

3. Проанализированы закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении уреазной активности in vitro и in vivo, определение УА рассмотрено как комплексный процесс. Определены лимитирующие стадии и пути оптимизации определения уреазной активности.

4. Разработана технология изготовления экспресс-тестов для определения уреазной активности биологического материала in vitro.

5. Рассмотрены различные типы детектирующих устройств для определения инфекции H.pylori по УА in vivo: пассивные дозиметры, линейно-колористические трубки, электрохимические сенсоры. Установлены технические требования к детекторам. Определены характеристики различных типов детекторов и области их применения. Разработаны методики контроля работоспособности различных детектирующих тест-систем.

6. Оценена диагностическая эффективность тест-систем для инвазивного и неинвазивного определения инфекции H.pylori по УА, проведена их апробация на клиническом материале. Успешно проведены технические и клинические испытания. Создан комплекс аналитических методик и средств обнаружения инфекции по ее уреазной активности. Предложена схема диагностики инфекции H.pylori с применением разработанных ХЕЛПИЛ- и модифицированных ХЕЛИК-тестов. Схема обеспечивает достоверное, комплексное и доступное определение хеликобактериоза и контроль за результатом его терапии.

141

Благодарности

В первую очередь я бы хотела выразить признательность научному руководителю профессору Анатолию Иосифовичу Гинаку за высокую требовательность и вдохновляющую поддержку работы. Со студенческой поры Ваш научный опыт, умение видеть практическую применимость сугубо исследовательских работ вдохновляла нас и пробуждала интерес к научной деятельности.

Огромное спасибо научному консультанту Михаилу Аркадьевичу Мамаеву за бесконечное терпение и поддержку в самые трудные моменты, за многие часы обсуждений результатов, за то, что он научил обращать внимание на мельчайшие детали - в постановке исследований, в их осуществлении и в представлении.

Я благодарна профессору Елене Александровне Корниенко за всю ту неоценимую помощь, которую она оказывала во время совместной работы. Врач и исследователь мирового уровня, умеющий совмещать широту научных интересов с глубиной понимания и тщательностью проведения исследований, она организовала эффективную проверку качества разрабатываемых методик и тест-систем, что привело к созданию первых в России тестов для определения HP, принятых МЗ РФ.

Хочу поблагодарить Виктора Евгеньевича Милейко, который познакомил меня с проблемой, легшей в основу данной работы. Плодотворная совместная работа открыла для нас новые перспективы профессиональной деятельности и побудила основать предприятие ООО «АМА».

Сердечное спасибо моим коллегам, сотрудникам ООО «АМА» Ирине Георгиевне Шургалиной и Надежде Александровне Сухаревой за их самоотверженную работу по обеспечению качества и стабильности разработанных нами тестов и методик.

Особенная признательность в моей душе - моему сыну, коллеге и помощнику Вадиму Сергеевичу Дмитриенко. Его поддержка, постоянный интерес и неусыпное внимание обеспечило высокий уровень работы.

Огромное спасибо врачам, с чьим участием выполнялась эта работа: Олегу Николаевичу Нажиганову, Людмиле Ивановне Назаренко, Алле Руслановне Успенской, Анатолию Николаевичу Войцицкому, Лине Анатольевне Хоровской, Сергею Викторовичу Бельмеру, Павлу Владимировичу Антонову, Борису Давидовичу Старостину, Владимиру Леонидовичу Эмануэлю, Елене Николаевне Лаптевой, Светлане Васильевне Гольбиц, Розе Ходжаевне Сиражиддиновой, Александру Владимировичу Иванову и многим другим.

Благодарю Льва Исааковича Головенчица, который оказал неоценимую помощь в правильном оформлении технической документации, что помогло пройти требуемые процессы в Министерстве Здравоохранения, за организацию технических испытаний тестов и за ценные технические и конструкторские советы.

Хочу также выразить признательность Владимиру Петровичу Челибанову и сотрудникам «Лаборатории ЛЭК» и «ОПТЭК» за оказанную помощь, научные консультации и предоставление возможности работы на хорошем оборудовании.

Спасибо Николаю Александровичу Погинайко за вдохновляющую веру в возможность выполнения данной работы - с самого первого дня до последнего, и за мягкую поддержку работы.

Благодарю сотрудников кафедры молекулярной биотехнологии Дмитрия Олеговича Виноходова и Екатерину Борисовну Аронову за их поддержку, за ценные советы по форме представления диссертационной работы и реферата, а также Ученого секретаря Диссертационного совета Татьяну Борисовну Лисицкую за внимательное отношение и рекомендации по поводу оформления сопутствующих документов.

Хочу выразить признательность Владимиру Андреевичу Самокишу — Вы всегда были для меня примером подлинно научной деятельности, способной творить чудеса. Спасибо за школу теоретической и практической исследовательской деятельности, а также за консультирование по поводу данной работы.

Спасибо Игорю Александровичу Морозову за его интерес к простейшим тест-системам диагностики инфекции Helicobacter pylori и за организацию широкомасштабных сопоставительных испытаний тестов.

От всего сердца благодарю моих родителей Валентину Ивановну Лыкову и Авенира Ивановича Митина за веру в реальность завершения диссертации, за поддержку при выполнении работы, а также за реализацию промышленного производства тестов.

Техническая помощь и компьютерное обеспечение Андрея Чухонина позволили выполнить работу на надлежащем уровне, а участие в работе Николая Мамаева и Сергея Григорьева - разработать новый перспективный прибор для определения хеликобактериоза.

Благодарю Уильяма Стюарта Аллисона за поддержку работы и веру в ее перспективность. Спасибо также Марине Тадеушевне Грохочинской, Маргарите Александровне Козловой, Татьяне Михайловне Сипенковой, Нине Борисовне Савковой, Людмиле Викторовне Кравцовой, Михаилу Ивановичу Тюрикову, Юрию Валерьевичу и Ирине Борисовне Степановым, Светлане Александровне Дементьевой, Сергею Алексеевичу Дмитриенко и многим другим за профессиональную помощь и дружескую поддержку в работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Дмитриенко, Марина Александровна, 2003 год

1. ГОСТ 12.1.014-84. Система стандартов безопасности труда. Воздух рабочей зоны. Метод измерения концентраций вредных веществ индикаторными трубками. - М.: Издательство стандартов, 1986.- 14 с.

2. ОСТ 6-16-2446-80 Статистическая обработка результатов наблюдений при измерениях концентраций паров химических веществ в воздухе.

3. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения органов пищеварения. — МЗ РФ, М., 1998.-48 с.

4. МИ 1552-86. Методические указания. Государственная система обеспечения единства измерений. Измерения прямые однократные. Оценивание погрешностей результатов измерений. М.: Издательство стандартов. 1987, —8 с.

5. РД 52.04.186-89. Руководство по контролю загрязнения атмосферы. М.: ГК СССР по гидрометеорологии, МЗ СССР, 1991.-693 с.

6. Методика МЗ № 1637-77 от 18.04.1977. Фотометрическое определение аммиака. В кн.: Руководство по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Справ. Изд. М.: Химия, 1993. — С.36.

7. Методика МЗ № 4471-87 от 21.12.1987. Ионометрическое определение аммиака. В кн.: Руководство по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Справ. Изд. — М.: Химия, 1993. — С.35.

8. Ю.Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам. 1993. - 362 с.

9. П.Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М.: Триада-Х, 1998. — 496 с.

10. Аруин Л.И. Роль Helicobacter pylori в формировании морфологического субстрата язвенной болезни // Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. — 18 мая 1999. — Уфа, 1999. -СЛ.

11. Байбаков Ф.Б., Шарапов В.М. Контроль примесей в сжатых газах. М.: Химия, 1989.-160 с.

12. Баранская Е.К. История открытия Helicobacter pylori. II Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии / Под ред. В.Т.Ивашкина, Ф. Мегро, Т.Л. Лапиной. М.: Триада-Х, 1999. - С.54-62.

13. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика. М.: Наука, 1979. - 312 с.

14. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977. - 280 с.

15. Березин И.В., Савин Ю.В. Основы биохимии. М.: Издательство МГУ, 1990.-254 с.

16. Богданов Ю.М., Зубов Л.А., Смирнова Г.П. и др. Значение Helicobacter pylori в детской гастроэнтерологической практике // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол.колопроктол. 1997. — Т.7. - N2. - С.11 - 16.

17. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. JL: Химия, 1986. - 432 с.

18. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. — М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

19. Варфоломеев С.Д., Судьина Г.Ф. Кинетика реакций с иммобилизованными ферментами. -М.: Издательство МГУ, 1980. — 158 с.

20. Грызунов В.В., Лобжанидзе А.А., Боржак М.П. Язва желудка, ассоциированная с раком легкого // Гастробюллетень. Материалы 3-го Российского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2001». — 2001. — N.2-3. — С. 29.

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М.: Мир, 1982. 1120 с.

22. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. — М.: Мир, 1994. — 268 с.

23. Джагацпанян И.Э. Автоматизированный измерительный модуль для диагностики хеликобактериоза: Автореф. дис.канд. техн. наук / СПбГТИ. СПб., 1995. - 20 с.

24. Жебрун А.Б., Сафонова Н.В., Довгаль С.Г., Милейко В.Е., Фаловский М.В. (Российская Федерация). Способ диагностики хеликобактериоза / Патент 2091796 RU, МПК 6 G01 N 33/497.- 93029859/14; Заявл. 28.05.1993; Опубл. 27.09.97, Бюл. № 27. С.396.

25. Зайцева К.К., Калинин А.В., Спесивцев В.Н. Helicobacter (Campilobacter) pylori и их роль в развитии хронического гастрита и язвенной болезни. — М.: НПО «Союзмединформ», 1991. — 56 с.

26. Иванов А.В., Милейко В.Е. (Российская Федерация). Способ исследования уреазной активности / Пат. 2189592 RU, МПК 7 G 01 N 33/497. 98110329/14; Заявл. 15.05.1998; Опубл. 10.12.2001, Бюл. № 34. С.310.

27. Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. — М.: Триада-Х, 1999. — 255 с.

28. Корниенко Е.А. Современная диагностика инфекции Helicobacter pylori. СПб., 2002. 20 с.

29. Корниенко Е.А. Клиника, диагностика и лечение гастродуоденальной патологии, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, у детей.:

30. Дисс. докт. мед. наук. СПб., 1999. — 463 с.

31. Корниенко Е.А., Антонов П.В. Особенности функциональной диспепсии у детей // Гастробюллетень. — Материалы 3-го Российского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2001». 2001. - N.2-3. - С. 44.

32. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Дмитриенко М.А. и др. Методы оценки уреазной активности in vivo и in vitro и их место в диагностике инфекции Helicobacter pylori // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол.,