Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Микулинская, Галина Викторовна

• Микулинская, Галина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Микулинская, Галина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация ферментов биосинтеза дНТФ.

1.1.1. Биосинтез дНТФ в клетках E.coli, инфицированных бактериофагом Т4.

1.1.2. дНТФ-синтезирующие комплексы (ДСК).

1.1.3. Связь ДСК с репликационным аппаратом.

1.1.4. Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах.

1.2. Особенности физиологии бактериофага Т5.

1.2.1. Общие черты бактериофага Т5.

1.2.2. Особенности структуры ДНК.

1.2.3. FST-механизм транспорта ДНК в клетку.

1.2.4. Регуляция транскрипции генов.

1.2.5. Разрушение ДНК клетки-хозяина.'.

1.2.6. Ферменты биосинтеза дНТФ.

1.2.7. Степень изученности генома бактериофага.

1.3. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5.

1.3.1. Роль фермента в метаболизме.

1.3.2. Описание фермента и его свойства.

1.3.3. Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ.

1.3.4. Структурные основы субстратной специфичности.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Микробиологические методы.

2.1.1. Штаммы бактерий, бактериофаги, плазмиды и среды.

2.1.2. Получение бактериофага Т5 в высоком титре.

2.1.3. Получение биомассы клеток E.coli, инфицированных бактериофагом Т5.

2.2. Аналитические методы.

2.2.1. Метод определения белка.

2.2.2. Электрофорез белков в ПААГ.

2.2.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот.

2.2.4. Изоэлектрофокусирование.

2.2.5. Определение молекулярной массы дНМФ-киназы бактериофага Т5.

2.3. Определение активности дНМФ-киназ.

2.3.1. Хроматографический метод. ф 2.3.2. Спектрофотометрический метод.

2.3.3. Тестирование активности методом тонкослойной хроматографии.

2.4. Методы очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5.

2.4.1. Приготовление клеточного экстракта.

2.4.2. Удаление нуклеиновых кислот.

2.4.3. Фракционирование сульфатом аммония.

2.4.4. Ионообменная хроматография.

2.4.5. Аффинная хроматография. t 2.5. Методы молекулярной биологии.

2.5.1. Выделение ДНК.

2.5.2. Гидролиз ДНК.

2.5.3. Лигирование фрагментов ДНК.

2.5.4. Полимеразная цепная реакция.

2.5.5. Определение первичной последовательности ДНК.

2.5.6. Праймеры.

2.5.7. Получение компетентных клеток и их трансформация. i 2.5.8. Скрининг рекомбинантных клонов.

2.5.9. Экспрессия рекомбинантных плазмид. ч 2.5.10. Гибридизация ДНК бактериофагов с зондом.

2.6. Компьютерные методы.

2.6.1. Анализ нуклеотидных последовательностей.

2.6.2. Анализ аминокислотных последовательностей.

2.6.3. Определение потенциальной пространственной структуры белка.

2.7. Методы биотехнологии. v 2.7.1. Иммобилизация дНМФ-киназы бактериофага Т5.

2.7.2. Синтез дНТФ при помощи ИФП дНМФ-киназы бактериофага Т5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5.

3.1.1. Очистка дНМФ-киназы.

3.1.2. Физико-химические свойства белка.

3.1.3. Определение N-концевой последовательности аминокислот.

3.2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 (13-19,5% генома).

3.2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности.

3.2.2. Локализация генов и открытых рамок считывания и анализ потенциальных функций их продуктов.

3.2.3. Потенциальные регуляторные элементы.

3.2.4. Клонирование гена lys и его экспрессия.

3.2.5. Идентификация продукта гена lys - лизоцима.

3.3. Функциональная характеристика гена dnk.

3.3.1. Клонирование гена dnk и его экспрессия в E.coli.

3.3.2. Очистка рекомбинантной дНМФ-киназы и ее свойства.

3.3.3. Анализ потенциальной структуры фермента.

3.3.4. Ферментативный синтез дезоксирибоаденозин-а-тиотрифосфата (дАТФа8).

3.4. Исследование широкоспецифичных киназ других бактериофагов.

3.4.1. Ген 52 бактериофага срС31: клонирование и экспрессия в E.coli.

3.4.2. Ген 52 кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности.

3.4.3. Бактериофаг Т4-типа RB49 также кодирует дНМФ-киназу.

3.4.4. Анализ строения фаговых киназ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена»

Нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК - являются незаменимыми компонентами живой клетки, выполняя функцию хранения, передачи и реализации генетической информации. Нарушение структуры и биосинтеза нуклеиновых кислот лежит в основе многих заболеваний наследственной и вирусной этиологии. Предшественники нуклеиновых кислот, нуклеозидтрифосфаты, как соединения, обладающие макроэргическими связями, помимо функции предшественников нуклеиновых кислот, играют большую роль в процессах синтеза и распада белков, липидов и углеводов, являются кофакторами целого ряда ферментов. Поддержание нормальных концентраций и соотношения дНТФ в клетках является одним из важных показателей гомеостаза. В связи с этим большое значение в биологии и медицине имеет исследование метаболизма предшественников нуклеиновых кислот.

Фосфорилирование дезоксирибонуклеозидмонофосфатов до соответствующих дифосфатов является одним из ключевых этапов синтеза предшественников ДНК -дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - в клетках про- и эукариот. Эти реакции в живых клетках катализируют ферменты класса трансфераз - нуклеозидмонофосфаткиназы (НМФ-киназы), в качестве донора фосфорила использующие АТФ или дАТФ. дНМФ+(д)АТФ о дНДФ+(д)АДФ Бактерии, дрожжи и высшие эукариоты, как правило, индуцируют по крайней мере четыре нуклеозидмонофосфаткиназы, специфичные к азотистому основанию субстрата.

Инфекция Escherichia coli колифагом сопровождается активной репликацией фаговой ДНК. При этом количество вновь синтезированной ДНК превышает количество ДНК клетки-хозяина примерно в 4,5 раза (Crawford, 1959). Т-четные бактериофаги (Т2,Т4, Т6) используют для синтеза своей ДНК пул нуклеотидов клетки хозяина, и только часть их синтезируется de novo. Тем не менее, для обеспечения потребности в трифосфатах эти фаги индуцируют дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы (КФ 2.7.4.12), катализирующие фосфорилирование трех из четырех дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, входящих в ДНК этих фагов (дТМФ, дГМФ, гм-дЦМФ).

Бактериофаг Т5 также кодирует дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназу (КФ 2.7.4.13), продукт гена dnk. Однако, в отличие от Т-четных фагов, бактериофаг Т5 использует для быстрой репликации своей ДНК только дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, синтезированные de novo. Цитозин в ДНК фага не гидроксиметилирован; вероятно, поэтому киназа бактериофага Т5 фосфорилирует все четьфе монофосфата, соответствующие каноническим основаниям ДНК. дНМФ-киназа бактериофага Т5 пока является единственным ферментом группы нуклеозидмонофосфаткиназ, обладающим такой широкой субстратной специфичностью.

Этот фермент представляет интерес для исследования механизмов биосинтеза предшественников ДНК в инфицированных бактериофагом клетках, регуляции этого процесса в зависимости от клеточных нужд и роли в нем фаговых и клеточных белков. Изучение структуры и функций ферментов, участвующих в биосинтезе предшественников ДНК, в том числе дНМФ-киназы бактериофага Т5, способно дать информацию, необходимую для понимания их биологической роли. Кроме того, широкая специфичность фермента бактериофага Т5 - потенциальный источник знаний о молекулярных основах взаимодействия белок-субстрат, ключ к пониманию структурных основ специфичности киназ. Особое значение приобретает исследование широкоспецифичной киназы бактериофага Т5 в связи с потенциальным использованием такого фермента в технологии энзиматического синтеза дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, которые в настоящее время широко используются в научных исследованиях и в медицине.

Целью настоящей работы явилось структурно-функциональное и генетическое исследование дНМФ-киназы бактериофага Т5, а также выявление новых дНМФ-киназ широкой специфичности.

К моменту начала работы данный фермент был частично очищен (Bessman et all, 1964), что позволило авторам определить ряд его биохимических свойств — относительную скорость реакции, субстратную специфичность, константы Михаэлиса для различных субстратов и константы ингибирования. При этом невысокая степень очистки не позволила авторам определить молекулярную массу фермента и его удельную активность. Кроме того, отсутствовали данные о первичной структуре гена. Ранее неоднократно предпринимались попытки "шотган"-клонирования фрагментов генома бактериофага Т5, но они не дали результата применительно к ранней области генома, в которой находится ген dnk.

Исходя из имеющихся данных, для достижения выбранной цели были поставлены следующие задачи:

1) Выделить и очистить до гомогенного состояния дНМФ-киназу бактериофага Т5 из инфицированной фагом биомассы E.coli, определить молекулярную массу белка, изучить физико-химические свойства фермента.

2) Секвенировать область генома бактериофага Т5, содержащую ген dnk, кодирующий фермент, и идентифицировать ген, пользуясь данными о ферменте.

3) Клонировать ген dnk и экспрессировать его в E.coli, разработать простой способ очистки целевого белка из клеток штамма-продуцента с высоким выходом.

4) Провести анализ компьютерных баз данных на основании полученной информации о структуре киназ с целью поиска гомологичных ферментов из других источников.

В настоящей работе впервые описан процесс очистки дНМФ-киназы бактериофага Т5 до гомогенного состояния из инфицированной фагом биомассы E.coli и определены ее ранее неизвестные физико-химические свойства - молекулярная масса, изоэлектрическая точка, температурная стабильность, - а также аминокислотная последовательность N-конца белка. Выполнены секвенирование фрагмента области С генома бактериофага, содержащего ген dnk, и его описание (включающее открытые рамки считывания, потенциальные промоторы и терминаторы транскрипции). Ген dnk идентифицирован и клонирован в плазмиду с эффективным промотором. Рекомбинантная дНМФ-киназа бактериофага Т5 очищена из клеток штамма-продуцента с высоким выходом двумя альтернативными способами. На основании полученной информации о первичной структуре дНМФ-киназы Т5 сделано предположение о возможной пространственной структуре белка. В рамках исследования фаговых дНМФ-киназ выделен и клонирован ген новой дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы широкой специфичности, кодируемой бактериофагом фС31.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Микулинская, Галина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа (дНМФ-киназа) бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) впервые очищена до гомогенного состояния из клеток E.coli, инфицированных бактериофагом Т5, с выходом 55,6% и степенью очистки 1190.

2. Изучены физико-химические и каталитические свойства дНМФ-киназы бактериофага Т5. Молекулярная масса белка составляет 29,14 ± 3,03 кДа, оптимум рН работы фермента лежит в области 7,0—7,5. Определены удельная активность фермента и 20 аминокислот N-конца белка.

3. Установлена первичная структура фрагмента ранней области С генома бактериофага ■ Т5 длиной 7736 п.н., содержащая кодирующий дНМФ-киназу ген dnk.

В секвенированном непрерывном фрагменте обнаружены 16 открытых рамок считывания, в том числе гены холина, лизоцима, тиоредоксина, протеинфосфатазы.

4. Ген dnk, кодирующий дНМФ-киназу, клонирован в E.coli и экспрессирован. Рекомбинантный белок очищен до гомогенного состояния двумя альтернативными способами. На основе имеющихся данных об аминокислотной последовательности сделаны предположения о пространственной структуре белка.

5. Показана практическая возможность использования иммобилизованного препарата j дНМФ-киназы бактериофага Т5 в технологии фосфорилирования четырех канонических дезоксирибонуклеозидмонофосфатов, а также дАМФаБ.

6. Установлено, что ген 52 бактериофага срСЗ 1 стрептомицетов кодирует дНМФ-киназу широкой специфичности, катализирующую фосфорилирование дАМФ, дТМФ, дЦМФ идГМФ.

С чувством глубокой признательности выражаю благодарность руководителям моей работы за помощь в работе и преподанные уроки. Искренне благодарна сотруднику ФИБХ РАН Зинченко Дмитрию Валерьевичу, бывшему сотруднику ИБ РАН Колесникову Игорю Валентиновичу, сотруднику ИБК РАН Фунтикову Вячеславу Алексеевичу за помощь в организации и проведении некоторых экспериментов. Большое спасибо Ксензенко Владимиру Николаевичу за помощь, полезные советы и обсуждение моей работы. Благодарю сотрудника ИБФМ РАН Шляпникова Михаила Григорьевича и сотрудника ИБХ РАН Каюшина Алексея Львовича за синтез олигонуклеотидов. Сердечно благодарна всем настоящим и бывшим сотрудникам Группы технологии синтеза нуклеиновых кислот и их компонентов ФИБХ РАН за помощь в работе и чуткое отношение.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Микулинская, Галина Викторовна, 2004 год

1. Забаровский, Е.Р.(2001). Альтернативные подходы к картированию и секвенированию генома. Мол биол 35:224-234.

2. Калиман, А.В., Крутилина, А.И., Крюков, В.М. (1987). Структура двух промоторов и терминатора транскрипции из области ранних генов Д10-Д15 бактериофага Т5. Мол Генет Микробиол Вирусол 10:14-19.

3. Краев А.С. (1988). Простая система клонирования в фаге М13 и секвенирования ДНК с терминаторами. Мол Биол 22:1164-1197.

4. Aduma, P.J., Gupta, S.V., Stuart, A.L., Tourigny, G. (1991). Deoxyribonucleoside triphosphate pools of herpes simplex virus infected cells: the influence of selective antiherpes agents and the role of the deaminase pathway. Biochem Cell Biol 69:409-414.

5. Angus, S.P., Wheeler, L.J., Ranmal, S.A., Zhang, X., Markey, M.P., Mathews, C.K., Knudsen, E.S. (2002). Retinoblastoma tumor suppressor targets dNTP metabolism to regulate DNA replication. J Biol Chem 277:44376-44384.

6. Bebenek, K., Roberts, J.D., Kunkel, T.A. (1992). The effects of dNTP pool imbalances on frameshift fidelity during DNA replication. J Biol Chem 267:3589-3596.

7. Bello L.J., Bessman M.J. (1963). The enzymology of virus-infected bacteria IV. Purification and properties of the deoxynucleotide kinase induced by bacteriophage T2. J Biol Chem 238:17771787.

8. Bello, L.J., Bessman, M.J. (1963). The enzymology of virus-infected bacteria.V.

9. Phosphorylation of hydroxymethyldeoxycytidine diphosphate and deoxythymidine diphosphatein normal and bacteriophage-infected E.coli. Biochim Biophys Acta 72:647-650.

10. Berget, S.M., Mozer, T.J., Warner, H.R. (1976). Early events after infection of Escherichia coliby bacteriophage T5. II. Control of the bacteriophage-induced 5'-nucleotidase activity. J Virol18:71-79.

11. Berget, S.M., Warner, H.R., McCorquodale, D.J. (1974). Isolation and partial characterization of bacteriophage T5 mutants deficient in the ability to induce deoxynucleoside monophosphate kinase. J Virol 14:78-85.

12. Bessman, M.J. (1963). Deoxynucleoside monophosphate kinases, in "Methods in Enzymology," vol.VI, pp. 166-177, Academic Press, New York and London.

13. Brunei F., Thi V.H., Pilaete M.F., Davison J. (1983). Transcription regulatory elements in the late region of bacteriophage T5 DNA. Nucleic Acid Res 11:7649-7658.

14. Brush, G.S., Bessman, M.J. (1993). Chemical modification of bacteriophage T4 deoxynucleotide kinase. Evidence of a single catalytic region. J Biol Chem 268:1603-1609.

15. Chen, M.X., McPartlin, A.E., Brown, L., Chen, Y.H., Barker, H.M., Cohen, P.T.(1994). A novel human protein serine/threonine phosphatase, which possesses four tetratricopeptide repeat motifs and localizes to the nucleus. EMBO J 13:4278-4290.

16. Cook, K.S., Seasholtz, A.F. (1982). Identification of some bacteriophage T4 prereplicative proteins on two-dimensional gel patterns. J Virol 42:767-772.

17. Corpet F. (1988). Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 16:10881-10890.

18. Cory, J.G., Carter, G.L. (1985). Drug action on ribonucleotide reductase. Adv Enzyme Regul 24:385-401.

19. Crawford L.V. (1959). Nucleic acid methabolism in Escherichia coli infected with phage T5. Virology 7:359-374.

20. Decker, K., Krauel, V., Meesmann, A., Heller, K.J. (1994). Lytic conversion of Escherichia coli by bacteriophage T5: blocking of the FhuA receptor protein by a lipoprotein expressed early during infection. Mol Microbiol 12:321-332.

21. Desai S.M., Vaughan J., Weiss S.B. (1986). Identification and location of nine T5 bacteriophagetRNA genes by DNA sequence analysis. Nucleic Acid Res 14:4197-4120.

22. Desplats, C., Dez, C., Tetart, F., Eleaume, H., Krisch, H.M. (2002) Snapshot of the genome ofthe pseudo-T-even bacteriophage RB49. J Bacteriol 184 (10), 2789-2804.

23. Dreusicke, D., Karplus, P. A., Schulz, G. E. (1988). Refined structure porcine cytosolicadenylate kinase at 2.1 A resolution. J Mol Biol 199:359-371.

24. Duckworth, D.H., Bessman, M.J. (1967). The enzymology virus-infected bacteria. X. A biochemical-genetic study of the deoxynucleotide kinase induced by wild-type and amber mutants of phage T4. J Biol Chem 242:2877-2885.

25. Fricke, J., J. Neuhard, R. A. Kelln, S. Pedersen. (1995). The cmk gene encoding cytidine monophosphate kinase is located in the rpsA operon and is required for normal replication rate in Escherichia coll J Bacteriol 177:517-523.

26. Fukami-Kobayashi, K., Nosaka, M., Nakazawa, A., Go, M. (1996). Ancient divergence of long and short isoforms of adenylate kinase: molecular evolution of the nucleoside monophosphate kinase family. FEBS Lett 385:214-220.

27. Furukawa, H., Kuroiwa, Т., Mizushima, S. (1983). DNA injection during bacteriophage T4infection of Escherichia coli. J Bacteriol 154:938-945.

28. Gan, Z.R. (1991). Yeast thioredoxin genes. J Biol Chem 266:1692-1696.

29. Gentz, R., Bujard, H. (1985). Promoters recognized by Escherichia coli RNA polymeraseselected by function: highly efficient promoters from bacteriophage T5. J Bacteriol 164:70-77.

30. Goelz, S. E., Cronan, J. E. (1982). Adenylate kinase of Escherichia coli: evidence for afunctional interaction in phospholipid synthesis. Biochemistry 21:189-195.

31. Greenberg, G.R., He, P., Hilfinger, J., Tseng, M.-J. (1994). Deoxyribonucleoside triphosphatesynthesis and phage T4 DNA replication. In: Molecular Biology of Bacteriophage Т4/ ed. in chif

32. J.D.Karam; ed., J.W.Drake, K.N.Kreuzer, G.Mosig, D.H.Hall, F.E.Eiserling, L.W.Black,

33. E.K.Spicer, E.Kutter, K.Carlson, E.S.Miller. ASM press, Washington, DC, p. 14-27.

34. Griffig, J., Koob, R., Blakley, R.L. (1989). Mechanisms of inhibition of DNA synthesis by 2chlorodeoxyadenosine in human lymphoblastic cells. Cancer Res 49:6923-6928.

35. Griffith, J.P., Kim, J.L., Kim, E.E., Sintchak, M.D., Thomson, J.A., Fitzgibbon, M.J., Fleming,

36. M.A., Caron, P.R., Hsiao, K., Navia, M.A.(1995). X-ray structure of calcineurin inhibited by theimmunophilin-immunosuppressant FKBP12-FK506 complex. Cell 82:507-522.

37. Hendricks, S.P., and Mathews, C.K. (1997). Regulation of T4 phage aerobic ribonucleotidereductase. J Biol Chem 272:2861-2865.

38. Hendrix, R.W., Smith, M. С. M., Bums, R.N., Ford, M. E., Hatfull, G. F. (1999). Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: All the world's a phage. Proc Natl Acad Sci USA 96:2192-2197.

39. Heusterspreute, M., Ha-Thi, V., Tournis-Gamble, S., Davison, J. (1987). The first-step transfer-DNA injection-stop signal of bacteriophage T5. Gene 52:155-164.

40. Johnston, J.V., Nichols, B.P., Donelson, J.E. (1977). Distribution of "minor" nicks in bacteriophage T5 DNA. J Virol 22:510-519.

41. Kalasauskaite, E.V., Kadisaite, D.L., Daugelavicius, R.J., Grinius, L.L., Jasaitis, A.A. (1983). Studies on energy supply for genetic processes. Requirement for membrane potential in Escherichia coli infection by phage T4. Eur J Biochem 130:123-130.

42. Kaliman, A.V. (1996). Identification of the bacteriophage T5 dUTPase by protein sequence comparisons. DNA Seq 6:347-355.

43. Kaliman, A.V., Kryukov, V.M., Bayev, A.A. (1988). The nucleotide sequence of the region ofbacteriophage T5 early genes D10-D15. Nucleic Acids Res 16:10353-10354.

44. Kaneko, S., Miyazaki, Y., Yasuda, Т., Shishido, K. (1998). Cloning, sequence analysis andexpression of the basidiomycete Lentinus edodes gene uckl, encoding UMP-CMP kinase, thehomologue of Saccharomyces cerevisae URA6 gene. Gene 211:259-266.

45. Keweloh, H.W., Bakker, E.P. (1984). Increased permeability and subsequent resealing of thehost cell membrane early after infection of Escherichia coli with bacteriophage Tl. J Bacteriol160:354-359.

46. Knopf, K., Bujard, H. (1975). Structure and function of the genome of coliphage T5. Transcription in vitro of the "nicked" and "nick-free" T5+ DNA. Eur J Biochem 53:371-385.

47. Maltouf, F.A., Labedan, B. (1983). Host cell metabolic energy is not required for injection of bacteriophage T5 DNA. J Bacteriol 153:124-133.

48. Mathews, C.K. (1991). Metabolite channeling in deoxyribonucleotide and DNA biosynthesis. J Theor Biol 152:25-28.

49. Mathews, C.K., Moen, L.K., Wang, Y., Sargent, R.G. (1988). Intracellular organization of DNA precursor biosynthesis enzymes. TIBS 13:394-397.

50. Mathews, C.K., Sinha, N.K. (1982). Are DNA precursors concentrated at replication sites? Proc Natl Acad Sci USA 79:302-306.

51. Mathews, C.K., Slabaugh, M.B. (1986). Eucariotic DNA metabolism. Are deoxyribonucleotides channeled to replication sites? Exp Cell Res 162:285-295.

52. Maurizi, M.R., Clark, W.P., Kim, S.H., Gottesman, S. (1990). Clp P represents a unique family of serine proteases. J Biol Chem 265:12546-12552.

53. McCorquodale, D.J., Shaw, A.R., Shaw, P.K., Chinnadurai, G. (1976). Pre-early polypeptides of bacteriophages T5 and BF23. J Virol 22:480-488.

54. McCorquodale D.J., Warner H.R. (1988). Bacteriophage T5 and related phages. In:Bacteriophages, p.439-475.

55. McGaughey, K.M., Wheeler, L.J., Moore, J.T., Maley, G.F., Maley, F., Mathews, C.K. (1996). Protein-protein interaction involving T4 phage-coded deoxycytidylate deaminase and thymidylate synthase. J Biol Chem 271:23037-23042.

56. Mozer, T.J., Thompson, R.B., Berget, S.M., Warner, H.R. (1977). Isolation and characterization of a bacteriophage T5 mutant deficient in deoxynucleoside 5'-monophosphatase activity. J Virol 24:642-650.

57. Moyer, R.W., Rothe, C.T. (1977). Role of the T5 gene D15 nuclease in the generation of nicked bacteriophage T5 DNA. J Virol 24:177-193.

58. Muller, C. W., Schulz, G. E. (1992). Structure of the complex between adenylate kinase from Escherichia coli and the inhibitor Ap5 A refined at 1.9 A resolution. A model for a catalytic transition state. J Mol Biol 224:159-177.

59. Nichols, B.P., Donelson, J.E. (1977). Mapping and cloning of Eco Rl-fragments of bacteriophage T5+ DNA. Nucleic Acids Res 4:3715-3726.

60. Okajima, Т., Goto, S., Tanizawa, K., Tagaya, M., Fukui, Т., Shimofuruya, H., Suzuki, J. (1995). Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of cDNA encoding porcine brain UMP-CMP kinase. Biochem. J. 117:980-986.

61. Okajima, Т., Fukamizo, Т., Goto, S., Fukui, Т., Tanizawa, K. (1998). Exchange of nucleoside monophosphate-binding domains in adenylate kinase and UMP/CMP kinase. J Biochem (Tokyo) 124:359-367.

62. Oldmixon, E., Braun, V. (1978). Changes in fluorescence of 8-anilino-l-naphthalene sulfonate after bacteriophage T5 infection of Escherichia coli. Initial fluorescence rise coincides with onset of rubidium efflux. Biochim Biophys Acta 506:111-118.

63. Oliver, F.J., Collins, M.K., Lopez R., A. (1996). dNTP pools imbalance as a signal to initiate apoptosis. Experientia 52:995-1000.

64. Ostermann, N., Segura-Pena, D., Meiei;, C., Veit, Т., Monneijahn, C., Konrad, M., Lavie, A.2003). Structures of human thymidylate kinase in complex with prodrugs: implications for thestructure-based design of novel compounds. Biochemistry 42:2568-2577.

65. Pieroni, L., Bouille, P., Auclair, C., Guillosson, J.J., Nafziger, J. (1999). Early steps ofreplication of moloney murine leukemia virus in resting lymphocytes. Virology 262:408-415.

66. Pinedo, H.M., Peters, G.F. (1988). Fluorouracil: biochemistry and pharmacology. J Clin Oncol6:1653-1664.

67. Ponta, H., Altendorf, K.H., Schweiger, M.,Kaufmann, H.M., Yeh, P.M.L., Herrlich, P. (1976). E.coli membranes become permeable to ions following T7-virus-infection. Mol Gen Genet 149:145-150.

68. Reddy, G.P., Mathews, C.K. (1978). Functional compartmentation of DNA precursors in T4 phage-infected bacteria. J Biol Chem 253:3461-3467.

69. Rhoades, M. (1982). New physical map of bacteriophage T5 DNA. J Virol 43:566-570. Rhoades, M. (1986). Interruption-deficient mutants of bacteriophage T5: analysis of single-site mutants. J Virol 59:203-209.

70. Rikhter, V.A., Rabinov, I.V., Kuznetsov, S.A., Pavlii, T.B., Skoblov, I.u.S. (1988). Isolation and various properties of nucleoside monophosphate kinases from Escherichia coli. Prikl Biokhim Mikrobiol 24:310-318.

71. Sanger, F., Niclein, S., Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467.

72. Schweitzer, B.I., Dicker, A.P., Bertino, J.R. (1990). Dihydrofolate reductase as a therapeutic target. FASEB J 4:2441-2452.

73. Sekulic, N., Shuvalova, L., Spangenberg, O., Konrad, M., Lavie, A. (2002). Structural characterization of the closed conformation of mouse guanylate kinase. J Biol Chem 277:3023630243.

74. Shewach, D.S., and Lawrence, T.S. (1996). Gemcitabine and radiosensitization in human tumor cells. Invest New Drugs 14:257-263.

75. Silins, G.U., Blakeley, R.L., Riddles, P.W. (1996). Characterization of genes encoding a nucleoside monophosphate kinase and a L35 ribosomal protein from Babesia bovis. Mol Biochem Parasitol 76:231-244.

76. Smith, M.C.M., Ingham, C.J., Owen, C.E., Wood, N.T. (1992). Gene expression in the Streptomyces temperate phage (pC31. Gene 115:43-48.

77. Solow, В., Young, J.C., Kennelly, P.J. (1997). Gene cloning and expression and characterization of a toxin-sensitive protein phosphatase from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila TM-1. J Bacteriol 179:5072-5075.

78. Szabo, C., Dharmgrongartama, В., Moyer, R.W. (1975). The regulation of transcription in bacteriophage T5-infected Escherichia coli. Biochemistry 14:989-997.

79. Tomich, P.K., Chiu, C.S., Wovcha, M.G., Greenberg, G.R. (1974). Evidence for a complex regulating the in vivo activities of early enzymes induced by bacteriophage T4. J Biol Chem 249:7613-7622.

80. Van Rompay, A.R., Johansson, M., Karlsson, A. (2000). Phosphorylation of nucleosides and nucleoside analogs by mammalian nucleoside monophosphate kinases. J Pharmacol Ther 87:189-98.

81. Von Gabain, A., Hayward, G.S., Bujard, H. (1976). Physical mapping of the Hindlll, EcoRI, Sal and Sma restriction endonuclease cleavage fragments from bacteriophage T5 DNA. Mol Gen Genet 143:279-290.

82. Wagner, E.F., Ponta, H., Schweiger, M. (1980). Development of Escherichia coli virus Tl. The role of the proton-motive force. J Biol Chem 255:534-539.

83. Warner, H.R., Drong, R.F., Berget, S.M. (1975). Early events after infection of Escherichia coli by bacteriophage T5. Induction of a 5-nucleotidase activity and excretion of free bases. J Virol 15:273-280.

84. Zhang, X., Lu, Q., Inouye, M., Mathews, C.K. (1996). Effect of T4 phage infection and anaerobiosis upon nucleotide pools and mutagenesis in nucleoside diphosphokinase-defective Escherichia coli strains. J Bact 178:4115-4121.

85. Zhang, X„ Mathews, C.K. (1995). Natural DNA precursor pool asymmetry and base sequence context as determinants of replication fidelity. J Biol Chem 270:8401-8404.