Децеллюляризированные матрицы митрального клапана и направленная регенерация тканей в биологической модели тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.24, кандидат наук Яблонский, Павел Петрович

• Яблонский, Павел Петрович
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Яблонский, Павел Петрович

Оглавление

Введение

Глава 1. Эволюция заменителей клапанов сердца и предпосылки к созданию тканевой матрицы митрального клапана (обзор литературы)

1.1. Ксепогенные сердечные клапаны

1.1.1. Химическая фиксация

1.1.2. Каркасные и бескаркасные БИКС

1.2. Тканевая инженерия для создания клапанного протеза

1.2.1. Синтетические матрицы для сердечных клапанов

1.2.2. Децеллюляризированные матрицы для сердечных клапанов

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы

2.2.1. Заготовка клапанов

2.2.2. Децеллюляризация

2.2.3. Гистологический анализ

2.2.4. Цитотоксический тест

2.2.5. Определение количества ДНК

2.2.6. Механические испытания

2.2.7. Хирургическая имплантация

2.2.8. Статистический анализ

Глава 3. Результаты

3.1. Сравнительная оценка различных способов дег^еллюляризации митрального аллографта

3.2. Динамика репопуляции фрагмента митрального аллографта входе

2 fumo токсического теста

3.3. Результаты исследования механических свойств дег{еллюляризированного митрального аллографта

3.4. Результаты оценки функциональных и морфологических характеристик децеллюляризированных митральных аллографтов в хроническом эксперименте in vivo

3.4.2. Макроскопическая оценка результатов имплантации ДМА in vivo

3.4.3. Характеристика внеклеточного матрикса и направленной регенерации ткани децеллюляризированных митральных аллографтов

Глава 4. Обсуждение

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Список сокращений

Список использованной литературы

Приложение. Протоколы окрашивания препаратов для рутинной световой микроскопии и иммунофлюоресцентного анализа

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Децеллюляризированные матрицы митрального клапана и направленная регенерация тканей в биологической модели»

Введение

Актуальность проблемы Возможности замены пораженных органов и частей тела больного человека выдвинули на первый план проблему нехватки достаточного количества трансплантатов. В значительной мере эта проблема решалась путем создания искусственных материалов и конструкций, которые, будучи имплантированными в организм, некоторое время компенсировали функцию утраченного элемента. Применительно к кардиохирургии наиболее остро эти проблемы ощущаются в хирургии клапанов сердца. Так, при необходимости замены атриовентрикулярного клапана у больных с приобретенными пороками существуют два принципиальных варианта операции: протезирование биологическим искусственным клапаном сердца (ИКС) и протезирование механическим ИКС [1—5]. При врожденных пороках возможности реконструктивной хирургии часто ограничиваются недостаточным количеством собственных тканей пациента, что также обуславливает необходимость протезирования клапана [6-8]. Это, в свою очередь, ведет к неизбежной повторной операции, а в случае с больными детского возраста — к серии повторных вмешательств вследствие роста больного, ведущего к относительному стенозу протезированного клапана [6,9-11].

С другой стороны, результаты выполнения подобных операций все еще неудовлетворительны. Так, общая частота параклапанных фистул для обоих типов протезов ИКС составляет, по разным данным, от 7 до 17%. Механические ИКС в силу необходимости пожизненной антикоагулянтной терапии характеризуются высокой частотой тромбозов и кровотечений - оба этих показателя достигают 10% в год [4,12,13]. Несомненные преимущества имплантации биологических искусственных клапанов (отсутствие антикоагулянтной терапии, устойчивость к инфекции) скрадываются неизбежной биодеградацией, темп которой достигает 35% в год у больных среднего возраста [8,9,14]. Особенно огорчает тот факт, что, по данным К. Наттегте1з1ег et а1. [1], скорость деградации биологического

протеза имеет практически линейную обратную зависимость от возраста больного, поэтому приемлемый срок службы этого типа заменителей был характерен только для больных старше 60 лет.

При этом, абсолютное число клапанных операций имеет устойчивую тенденцию к росту [15]. Особое внимание к митральному клапану объясняется особенностями структуры клапанной патологии сердца. Так, по мнению V.T. Nkomo et al. (2006) [16], основанном на результатах крупного популяционного исследования, в котором учитывались все диагностированные клапанные нарушения, митральные пороки преобладали над аортальными во всех возрастных группах. Несмотря на то, что в последние десятилетия широкое распространение получили реконструктивные операции на митральном клапане [15],только в России, по данным JI.A. Бокерия [17], в замене митрального клапана нуждалось более 180.000 человек. Все это позволяет говорить о недостаточной обеспеченности населения кардиохирургической помощью и прогнозировать рост количества вмешательств на митральном клапане в ближайшие годы.

Отсюда вытекает потребность в создания нового типа протезов — клапанов, отличающихся от доступных в настоящий момент ИКС сочетанием длительного срока службы (сопоставимого с ожидаемой продолжительностью жизни пациента) и отсутствием необходимости в пожизненном приеме антикоагулянтов.

Благодаря многолетним фундаментальным исследованиям, в хирургии аортального и легочного клапана решение было найдено. Посмертно заготовленные человеческие аллографты, обработанные в соответствии с различными авторскими методиками, позволили достичь многообещающих результатов. По данным литературы, при использовании «гомовитальных аортальных гомографтов» их удовлетворительная функция достигала 97% через 10 лет после операции [18], а при использовании децеллюляризированных аортальных гомографтов [19] — 100% в течение 19 месяцев. Использование децеллюляризированных легочных гомографтов в работе S. Cebotari [20] привело к полному сохранению их структуры и функции в течение 5 лет после операции. Важно отметить, что в работах F. da Costa и S. Cebotari клапаны имплантировались

детям начиная со 2-го месяца жизни, и в течение указанных периодов наблюдения у них не только не было выявлено признаков деградации децеллюляризированного гомографта, но и было зафиксировано увеличение диаметра фиброзного кольца клапана без появления недостаточности клапана, что расценивалось авторами как рост гомографта вследствие его полной интеграции в организм реципиента.

В то же время, попытки применения митрального гомографта (свежего или криоконсервированного) для протезирования митрального клапана как в экспериментах на животных [21—27], так и в клинической практике [28-44] не выявили каких-либо преимуществ по сравнению с обычными биологическими протезами в митральной позиции. Причиной неудач, как было показано Б. Ыарр1 а\. [33] по результатам анализа 19-летнего опыта, оказалась биодеградация митральных гомографтов - при гистологическом исследовании всех эксплантированных во время повторных операций митральных гомографтов выявлена картина выраженного рубцового процесса с очагами кальциноза при почти полном отсутствии клеток. Можно предположить, что в митральной позиции клапан испытывает больший градиент давлений и более высокую механическую нагрузку [45,46], а меньшая скорость кровотока позволяет иммунологически активным клеткам крови активнее оседать на створках, вызывая более тяжелые изменения в донорской ткани. Если это предположение верно, то создание протеза с более низкой иммуногенностыо и достаточными прочностными характеристиками может стать основой для создания нового типа клапанного заменителя, устанавливаемого в атриовентрикулярную позицию.

Целью работы явилось улучшение результатов протезирования атриовентрикулярного клапана путем разработки нового типа клапанного заменителя на основе аллогенной тканевой матрицы на модели крупного животного.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи: 1. Разработать методику заготовки митрального клапана у крупного животного (овца) и имплантации матрицы митрального клапана в ортотопическую позицию.

2. Разработать способ децеллюляризации митрального клапана овцы.

3. Изучить биологические, иммунологические и механические свойства свежего и децеллюляризированного митрального аллографта (ДМА).

4. Оценить функциональные, иммунологические и морфологические характеристики матрицы митрального клапана in vivo во время хронического эксперимента.

Научная новизна научной работы

1. Разработана методика заготовки и имплантации митрального клапана на модели крупного животного (овца), позволяющая изучать биологические, механические, иммунологические и гемодинамические свойства полученной тканевой матрицы.

2. Впервые предложена оригинальная технология децеллюляризации цельного митрального аллографта, позволяющая добиться практически полной элиминации клеточных элементов во всех структурах клапана, а также ДНК и эпитопа a-GAL как маркеров вне- и внутриклеточных антигенов.

3. Впервые доказана возможность репопуляции клетками эндотелия матрицы митрального клапана как in vitro, так и in vivo, а также менее выраженная подверженность кальцификации по сравнению с биологическим протезом на основе свиного аортального клапана.

Практическая значимость научной работы заключается в создании прообраза биологического протеза нового типа, который, будучи имплантированным в ортотопическую позицию сохраняет механическую прочность, не вызывает реакции отторжения, не требует антикоагулянтной терапии и в значительно меньшей степени, чем традиционные биологические протезы, подвержен биологической деградации. Все это, при использовании в клинике, может значительно увеличить продолжительность службы клапана и качество жизни больных молодого возраста, нуждающихся в протезировании митрального клапана.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанная методика заготовки митрального аллографта достаточно проста, воспроизводима и позволяет после его децеллюляризации имплантировать полученную матрицу в ортотопическую позицию.

2. Разработанная методика производства тканевой матрицы атриовентрикулярного клапана из свежего митрального аллографта овцы путем его децеллюляризации позволяет сохранить механические свойства клапана, его гистологическую структуру, и является воспроизводимой.

3. Полученная матрица обладает биологическими и иммунологическими свойствами, превосходящими таковые современных биологических протезов клапанов сердца, что проявляется в значительно менее выраженной склонности к кальцификации, а по механическим свойствам не уступает нативному митральному клапану, что позволяет рассчитывать на улучшение результатов хирургического лечения пороков митрального клапана при ее использовании в клинической практике.

4. Созданная матрица, имплантированная в митральную позицию способна эффективно выполнять запирательную функцию, а, с течением времени, подвергается постепенной репопуляция клетками эндотелия реципиента, в отличие от традиционного БШСС.

Степень достоверности и апробация научной работы Достоверность результатов работы основывается на изучении большого количества (105) митральных аллографтов in vitro, а также четырех in vivo - после имплантации на модели овцы. Методами разнообразных гистологических и иммунофлюоресцентных окрасок, а также в ходе цитотоксического теста и механических испытаний были разносторонне изучены эффекты 21-го раствора для децеллюляризации. Результаты хронического эксперимента in vivo так же не вызывают сомнений благодаря адекватному выбору животного и подробному анализу эксплантированных клапанов.

Апробация работы состоялась на совместном заседании проблемной комиссии №2 «Ангиология и кардиохирургия», секция «Сердечно-сосудистая хирургия» и кафедры госпитальной хирургии №2 Федерального государственного бюджетного учреждения высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, протокол № 4-2016 от 29.08.2016.

Материалы диссертации были доложены на следующих конференциях и конгрессах:

1. Morphological and Biomechanical Characterization of Tissue Engineered Mitral Valve - Постерный доклад на конференции Tissue Engineering & Regenerative Medicine Society - Генуя, Италия, 10-13 июня 2014 г.

2. Tissue Engineered Atrioventricular Valve: Morphological and Biomechanical Properties - Устный доклад на конференции Valves in the Heart of the Big Apple VIII - Нью-Йорк, CHI A, 8-10 мая 2014 г.

3. Тканевая инженерия атриовентрикулярного клапана: Морфология и биомеханика - Устный доклад на IV Международном конгрессе «Актуальные направления современной кардиоторакальной хирургии» — Санкт-Петербург, Россия, 26-29 июня 2014 г.

4. Tissue Engineering of Atrioventricular Valve: Morphological and Biomechanical Properties - Устный доклад на 28-м Ежегодном Конгрессе European Association for Cardio-Thoracic Surgery 2014 - Милан, Италия, 11-15 октября 2014 г.

5. Тканевая инженерия митрального клапана: децеллюляризированная матрица - Устный доклад на V Международном конгрессе «Актуальные направления современной кардиоторакальной хирургии» - Санкт-Петербург, Россия, 2527 июня 2015 г.

Личный вклад автора Автором разработаны методики и самостоятельно выполнены все процедуры, связанные с заготовкой и децеллюляризацией овечьего митрального аллографта, самостоятельно выполнены все гистологические и иммунофлюоресцентные исследования образцов, механические испытания МА. Самостоятельно выполнены 2 из 5 хирургических имплантаций ДМА на овцах.

Внедрение работы в практику

Материалы данной работы используются в образовательных программах Медицинского факультета ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» (21-я линия, В.О. 8а, 199106 Санкт-Петербург, Россия) и ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» (ул. Л. Толстого, д. 6/8, 197022 Санкт-Петербург, Россия).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 научных работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК и 1 в европейском журнале с индексом цитирования 1,155

Объем и структура работы Работа состоит из введения, четырех глав, в первой из которых представлен обзор литературы, во второй - материалы исследования, в третьей - результаты, в четвертой - обсуждение результатов; заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 208 источников, 11 из которых -отечественные; и одного приложения. Работа напечатана на 105 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и 8 таблицами.

Глава 1. Эволюция заменителей клапанов сердца и предпосылки к созданию тканевой матрицы митрального клапана (обзор литературы)

Протезирование митрального клапана - операция, имеющая долгую историю. Первое успешное вмешательство такого типа было выполнено Nina Braunwald в 1960 году [47], и с тех пор митральное протезирование развивалось наряду с аортальным. В качестве заменителей митрального клапана были предложены механические и биологические протезы различного происхождения. В данной главе представлены исторические и биологические предпосылки, а таюке обоснование для разработки тканевой матрицы на основе митрального аллографта. В течение долгого времени в России преобладали механические клапанные протезы, однако перечисленные выше осложнения их использования все чаще заставляют хирургов обращаться к биологическим клапанам, особенно у больных старших возрастных групп. Наиболее часто используемые биологические клапаны — ксеногенные, о которых будет рассказано ниже.

1.1. Ксеногенные сердечные клапаны

Биологические искусственные клапаны сердца (БИКС) ведут свою историю с 1960-х годов XX века, когда A. Carpentier в своих исследованиях анатомии клапанов различных видов животных, опубликованных в 1964 году, обнаружил, что свиные клапаны наиболее близки к человеческим [48]. Чуть позже в Англии С. Duran и A. Gunning выполнили протезирование аортального клапана пациенту свиным аортальным ксенографтом [49]. С этого момента свиные аортальные клапаны не просто считаются подходящими биологическими заменителями и в разных модификациях широко используются в кардиохирургии, но и, наряду с перикардиальными протезами, стали стандартом лечения пороков всех четырех клапанов сердца [50].

Перикардиальные клапаны были разработаны несколько позже. М. lonescu [51] предложил клапан из бычьего перикарда, обработанного глутаральдегидом и размещенного на обшитом дакроном титановом каркасе. Этот оригинальный клапан показал отличные гидродинамические свойства и хорошую надежность in vitro. В марте 1971, М. lonescu впервые использовал ксеногенные клапаны при операциях на людях, а спустя пять лет, в 1976, Shiley Laboratory в Калифорнии начала производство и распространение этого типа БИКС под названием «Перикардиальный ксенографт Ionescu-Shiley» [51].

И свиной аортальный, и бычий перикардиальный протезы показали схожие результаты и отсутствие необходимости антикоагулянтной терапии [50]. Однако основными недостатками, по-прежнему, были постепенная дегенерация, ограничивающая срок службы БИКС. Процессы, ответственные за структурные изменения биопротезов напрямую связаны с химическими и морфологическими изменениями, происходящими во время обработки ткани и создания клапана с последующим механическим повреждением из-за возросшего сдвигового напряжения после имплантации клапана. Долговечность клапана зависит от множества факторов, таких, как: происхождение ткани, возраст и состояние пациента, иммунологическое взаимоотношение тканей донора и реципиента, гемодинамическая нагрузка во время сердечного цикла и, конечно, способ химической фиксации и методика консервации [52,53].

1.1.1. Химическая фиксация

Клинически используемые ксенографты обычно консервируются с использованием химических сшивок (кросс-линкинг) с помощью альдегидов. Такой способ снижает антигенность ксенографта, ингибирует аутолиз, улучшает стабильность материала. Так же фиксация позволяет сохранить клапан стерильным и резистентным к образованию тромба [52]. В начале, при производстве ксенографтов для химической консервации использовался раствор формальдегида, однако быстрая дегенерация таких клапанов не позволила добиться удовлетворительных отдаленных результатах. Исследование, проведенное

A. Carpentier et al. [54] показало, что именно глутаральдегид способен наиболее эффективно бороться с воспалительным ответом организма реципиента. Позже, глутаральдегид был предложен для фиксации ткани ксеногенных клапанов и обеспечил улучшение результатов их клинического применения [55]. Было показано, что глутаральдегид эффективно сшивает коллаген, в отличие от формальдегида, что может объяснить преждевременное разрушение ксенографтов, фиксированных в формальдегиде [56].

Однако слабым местом химической фиксации является необратимое нарушение жизнеспособности фибробластов и интерстициальных клеток, делая, таким образом, невозможным с самого начала ремоделирование коллагена в ткани клапана in vivo, таким образом, механические свойства клапана зависят преимущественно от качества коллагена в ксенографте, и со временем могут только ухудшаться, по мере «износа» внеклеточного матрикса. Более того, фрагменты убитых клеток остаются в ткани и служат ядрами кальцификации [52]. G. Thiene et al. [57] описали каскад событий, следующих за фиксацией в глутаральдегиде и приводящий к минерализации графта и разрушению клапана. Глутаральдегид, убивая клетки ксенографта, вызывает увеличение притока кальция в цитоплазму. Затем, возросшее количество внутриклеточного кальция, вместе с фосфором из фрагментов фосфолипидной мембраны и клеточного детрита, запускает образование фосфата кальция. После этого происходит минерализация коллагена, ведущая к прогрессирующему разрушению ксенографта и нарушению функции клапана. Для уменьшения этого эффекта исследователи внедряют различные технологии, дополняющие химическую сшивку - консервация при очень низком или нулевом давлении, обработка сурфактантом или особый температурный режим, а также модификацию конструкции каркаса. Все эти улучшения направлены на дельнейшее снижение частоты структурных изменений [58]. Тем не менее, даже для современных клапанов скорость деградации напрямую зависит от возраста больного, как уже упоминалось выше [1,33].

Но не только биологическая совместимость влияет на долговечность и гемодинамические особенности клапана. Отдельной проблемой биологических

заменителей является сложность их хирургической имплантации. Ниже рассматриваются различные варианты биопротезов в зависимости от наличия или отсутствия каркаса и его влияние на функционирование БИКС.

1.1.2. Каркасные и бескаркасные БИКС

Большинство выпускаемых коммерчески клапанов фиксированы на металлическом или пластмассовом каркасе с тремя стойками (типичная форма для крепления комиссур полулунного клапана) и окружены кольцом для наложения швов, являющимся основанием конструкции. Кольцо, с одной стороны, упрощает надежную фиксацию имплантируемого графта к фиброзному кольцу, с другой -уменьшает полезную площадь раскрытия клапана [52]. Кроме того, форма и профиль кольца влияют на градиент давлений на протезе и на величину сдвиговой деформации полулунных створок, особенно в месте их прикрепления к каркасу [59]. В некоторых случаях особенности конструкции могут ухудшать гемодинамические характеристики БИКС, а так же приводить к его ускоренной деградации [60].

В качестве бескаркасных протезов, в случае с митральным клапаном, клинически использовались только человеческие аллографты - подробнее их особенности описаны ниже. Как известно на примере аортального и легочного клапанов, человеческие аллографты обладают определенными преимуществами по сравнению с традиционными БИКС [61]. Будучи забранными от трупов или больных, перенесших трансплантацию сердца (сердца-«домино»), они доказали значительную устойчивость к инфекции и улучшенные гемодинамические свойства. Более того, в случае тяжелого эндокардита они предпочтительны, поскольку отлично адаптируются к поврежденному фиброзному кольцу пациента [18,62,63].

В начале эры гомографтов, в клинической практике широко использовались клапаны, стерилизованные с помощью антибиотиков и хранившиеся в жидкой среде, однако, из-за их недолговечности, они вскоре были заменены криоконсервированными гомографтами. В наши дни, их замораживают в

диметилсульфоксиде и хранят при температуре -196°С. Эти клапаны содержат жизнеспособные клетки, могут храниться годами и служат дольше [64]. Другой метод консервации был разработан М. УасоиЬ. Свежие аортальные аллографты, хранившиеся при +4°С («гомовитальные аллографты») показали хорошие результаты в отдаленном периоде - 97% больных старше 30 лет не имели признаков клапанной дегенерации по истечении 10 лет [18]. Эти результаты позволяют предположить, что сохранение жизнеспособности клеток в необработанных клапанах является преимуществом, и что темп их дегенерации более низкий.

Было показано, что сохранность и функционирование клеток в гомографте, как и стабильность компонентов внеклеточного матрикса, очень важны для обеспечения длительной работы клапанного аллографта [65]. С другой стороны, эндотелиальные клетки экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) I и II класса, представляя собой потенциальную иммуногенную поверхность и стимулируя донор-специфический иммунный ответ, способный вызвать дегенерацию имплантированного клапана [66]. Вследствие высокой активности иммунитета у детей, именно в этой возрастной группе часто встречается ранняя дисфункция аллографта [67]. Другое препятствие для использования аллографтов — их неспособность расти в соответствии с ростом пациента, что приводит к повторным протезированиям клапанов у детей.

Однако, как говорилось выше, все эти результаты был получены, в основном, для аортального и легочного человеческого аллографта. Ситуация с митральным аллографтом несколько сложнее. Первые научные изыскания, посвященные изучению возможности протезирования митрального клапана аллографтом, были проведены во второй половине 1960-х —начале 1970-х годов. В 1965 году С. Ы^еШ е1 а1. опубликовали результаты хирургического эксперимента на собаках, в ходе которого выполнялась пересадка свежезаготовленного митрального от одного животного другому [24]. В течение 1966-1972 годов были представлены результаты еще нескольких экспериментальных работ на эту тему, а также первые попытки внедрить этот тип операций в клиническую практику с неудовлетворительными

результатами [25,34,35,68]. В 1973 году в фундаментальном исследовании N. А1-Janabi и D. Ross было показано, что свежий митральный аллографт невозможно хранить более 7 дней. Причиной столь жесткого временного ограничения стали хорды - уже по истечении суток до 50% клеток в них погибали. Сопоставимые изменения в створках митрального клапана происходили только после 10 недель хранениях. Вызываемые гибелью клеток структурные изменения внеклеточного матрикса становились заметными при рутинной световой микроскопии по истечении 4-х недель в хордах, и только на 13-й неделе в створках [69]. Неудовлетворительные результаты экспериментальных и клинических исследований митрального аллографта привели к его забвению почти на два десятилетия.

Работа J. Revuelta et al. в 1990-х годах ознаменовала следующий этап в изучении этой проблемы. Авторы использовали для сохранения аллографта криоконсервацию, ранее не применявшуюся для митрального клапана, и позволившую, продлить срок его хранения [26]. После публикации экспериментальной работы на овцах, в 1994 году J. Revuelta [70] описал также две операции на людях, выполнив протезирование задней створки митрального клапана - одному больному по поводу эндокардита, второму — в связи с недостаточностью митрального клапана, вызванной дегенерацией. Больные были обследованы через 22 и 4 месяца после операции, соответственно: у обоих не было симптомов сердечной недостаточности, а митральных клапан не имел признаков регургитации. Почти одновременно, также в 1994 году Acar et al. опубликовал описание случая протезирования митрального клапана 49-летней женщине человеческим аллографтом, фиксированным в 0,6% глутаральдегиде в течение 45 минут, по поводу митрального стеноза. Результаты операции по истечении 6-ти месяцев, по данным авторов, были удовлетворительны [28].

На рубеже XX-XXI веков были опубликованы несколько работ, посвященных протезированию митрального клапана замороженным аллографтом [29,32]. Результаты, представленные авторами, были несколько лучше полученных в 1970-х года. Однако, в большей части представленных работ эффективность

выполненного вмешательства оценивалась только в период времени, не превышающий 12 месяцев с момента операции. В средне- и долгосрочной перспективе створки и хорды митральных аллографтов, тем не менее, подвергались деградации. Так, в исследовании А.Китаг е1 а1., опубликованном в 2000 году, проанализированы данные 37 больных, перенесших полное (п=35) или частичное (п=2) протезирование митрального клапана человеческим аллографтом (23 -свежим, консервированным в антибиотиках, 14 - криоконсервированным), срок наблюдения составил от 1 до 60 месяцев (26,6 ± 12 мес.). Авторы установили, что после преодоления 54-месячного срока (4,5 года) все больные имели значимую митральную регургитацию, причем ни исходная патология, ни тип консервации клапана, ни выполнение аннулопластики не влияли на ее развитие. Морфологически на эксплантированных при повторной операции клапанах отмечалось истончение хорд и кальцификация створок разной степени выраженности [29]. Работы других авторов так же имели сходные результаты [32,33,71]. Таким образом, ни криоконсервация, ни кратковременная фиксация в глутаральдегиде не способны предотвратить дегенерацию митрального аллографта в средне- и долгосрочном периоде. Это и послужило причиной повторного забвения метода в начале первого десятилетия XXI века. В крупнейшей работе, обобщившей 106 больных, перенесших протезирование митрального клапана человеческим замороженным аллографтом, сделан вывод о том, что этот метод не позволяет добиться преимущества в долговечности по сравнению с классическими биологическими протезами, что, вкупе со сложностью подготовки аллографта и особенностями операции, делает его использование в клинической практике неоправданным [33].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яблонский, Павел Петрович, 2016 год

Список использованной литературы

1. Outcomes 15 years after valve replacement with a mechanical versus a bioprosthetic valve: final report of the veterans affairs randomized trial / K. Hammermeister [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. -2000. - Vol. 36, № 4. -P. 1152-1158.

2. Chambers, J. Prosthetic heart valves / J. Chambers // Int. J. Clin. Pract. - 2014. -Vol. 68, № 10.-P. 1227-1230.

3. Mitral valve prosthesis choice for patients aged 65 years and over in the UK. Are the guidelines being followed and does it matter? /1. Dimarakis [et al.] // Heart. -2014. - Vol. 100. - P. 500-507.

4. Результаты протезирования митрального клапана механическими протезами у пожилых пациентов / Е.А. Щебуняева [и др.] // Клин, физиология кровообращения. -2014.-№2.-С. 32-41.

5. Немченко, Е.В. Десятилетний опыт использования отечественного искусственного клапана сердца «Мединж» при митральном протезировании / Е.В. Немченко, С.С. Степанов, В.К. Новиков // Вестн. СПб ун-та. - 2006. - Т. 11, №2.-С. 86-95.

6. Mitral valve replacement in children / E. Erez [et al.] // J. Heart Valve Dis. — 2003. -Vol. 12.-P. 25-30.

7. A standardized repair-oriented strategy for mitral insufficiency in infants and children: midterm functional outcomes and predictors of adverse events / D. Kalfa [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2014. - Vol. 148, № 4. - P. 1459-1466.

8. Outcomes and associated risk factors for mitral valve replacement in children / B. Alsoufi [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. -2011. - Vol. 40, № 3. - P. 543-551.

9. Long-term survival after mitral valve replacement in children aged <5 years: a multiinstitutional study / C. Caldarone [et al.] // Circulation. - 2001. - Vol. 104. -P. 1143-1147.

10. Surgical repair of congenital mitral valve malformations in infancy and childhood: a single-center 36-year experience / G. Stellin [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2010. - Vol. 140, № 6. - P. 1238-1244.

11. Annulus upsizing for mitral valve re-replacement in children / P.O. Myers [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2013. - Vol. 146, № 2. - P. 347-351.

12. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis: Weighing lifetime anticoagulant-related event risk against reoperation risk / M.W.A. Van Geldorp [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2009. -Vol. 137, №4.-P. 881-886.

13. Mechanical versus bioprosthetic mitral valve replacement in patients <65 years old / T. Kaneko [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2014. - Vol. 147, № 1. - P. 117-126.

14. Отдаленные результаты протезирования митрального клапана биопротезами с различной обработкой: анализ частоты и причин дисфункций /

В.В. Соколов [и др.] // Груд, и сердеч.-сосуд, хирургия. — 2004. - № 6. - С. 22.

15. 79 herzchirurgische Fachabteilungen mit hohem Qualitätsniveau [Electronic research] // DGTHG. Pressemitteilung zur Vorstellung des Herzberichtes 2014 am 28.1.2015.

16. Burden of valvular heart diseases: a population-based study / V.T. Nkomo [et al.] // Lancet. - 2006. - Vol. 368, № 9540. - P. 1005-1011.

17. Анализ результатов оказания высокотехнологичной медицинской помощи по профилю «сердечно-сосудистая хирургия» в медицинских учреждениях Российской Федерации в 2012-2013 гг. / JI.A. Бокерия [и др.] // Груд, и сердеч.-сосуд, хирургия. -2014. -№ 2. - С. 4-13.

18. Fourteen-year experinence with homovital homografts for aortic valve replacement / M.N. Yacoub [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1995. - Vol. 110, № 1. -P. 186-193.

19. The early and midterm function of decellularized aortic valve allografts / F.D. Da

Costa [et al.] // Ann. Thorac. Surg. -2010. - Vol. 90, №6.-P. 1854-1860.

20. Use of fresh decellularized allografts for pulmonary valve replacement may reduce the reoperation rate in children and young adults: Early report / S. Cebotari [et al.]//Circulation.-2011.-Vol. 124, № 11, Suppl.-P. 115-123.

21. Total replacement of the mitral apparatus with a stentless, chordally supported mitral valve allograft: an experimental study / H. Vetter [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1996. - Vol. 111. - P. 595-604.

22. Behavior of mitral allografts in the tricuspid position in the growing sheep model / J.M. Bernai [et al.] //Ann. Thorac. Surg. - 1998. - Vol. 65, № 98. - P. 1326-1330.

23. Transplantation of mitral allograft into the tricuspid position - a sheep experimental model / A. Mokrâcek [et al.] // Acta Vet. Brno. - 2008. - Vol. 77. -P. 89-95.

24. Rastelli, G.C. Evaluation of function of mitral valve allograft after homotransplantation in dog / G.C. Rastelli, J. Beghuis, H.J.C. Swan // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1965. - Vol. 49, № 3. - P. 459-474.

25. Experimental homograft replacement of mitral valve / R.J. Baird [et al.] // Can. J. Surg.-1969.-Vol. 12.-P. 144-153.

26. Partial replacement of mitral valve by homograft / J.M. Revuelta [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1992. - Vol. 104, № 5. - P. 1274-1279.

27. Разработка методики имплантации бескаркасного митрального ксенографта в митральную позицию / Л.А. Бокерия [и др.] // Груд, и сердеч.-сосуд, хирургия. - 2003. - № 4. - С. 12-16.

28. Mitral valve replacement using a cryopreserved mitral homograft / C. Acar [et al.] // Ann. Thorac. Surg. - 1994. - Vol. 57, № 3. - P. 746-748.

29. Homograft mitral valve replacement: five years' results / A.S. Kumar [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2000. - Vol. 120. - P. 450-458.

30. Conklin, L.D. Technical aspects of mitral valve replacement with an allograft for acute bacterial endocarditis / L.D. Conklin, M.J. Reardon // Tex. Heart Inst. J. -

1999.-Vol. 26, №3.- P. 192-194.

31. Benetis, R. Pirmoji klinikinè patirtis ir techniniai ypatumai implantuojant mitralinio voztuvo homograft^ / R. Benetis, S. Giedraitis, Bolys R. // Medicina. -2002.-Vol. 38, №2-P. 176-180.

32. Homograft replacement of the mitral valve: eight-year results / M. Ali [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2004. - Vol. 128, № 4. - P. 529-534.

33. Nappi, F. The cryopreserved mitral homograft valve: 19 years experience / F. Nappi // JACC Cardiovasc. Interv. - 2014. - Vol. 7, № 2. - P. S58.

34. Replacement of Mitral and Tricuspid Valves by Homograft / M. Hubka [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1966. - Vol. 51, № 2. - P. 195-204.

35. Hubka, M. Replacement of the mitral valve with a mitral or aortic valve homograft / M. Hubka, E.B. Kay // Bull. Soc. Int. Chir. - 1969. - Vol. 28, № 3. - P. 359-365.

36. Pomar, J.L. Tricuspid valve replacement using a mitral homograft. Surgical technique and initial results / J.L. Pomar, C.A. Mestres // J. Heart Valve Dis. -1993.-Vol. 2, №2.-P. 125-128.

37. Rucker, R.B. Elastin metabolism and chemistry: potential roles in lung development and structure / R.B. Rucker, M.A. Dubick // Environ. Health Perspect. - 1984. - Vol. 55. - P. 179-191.

38. Milsom, F.P. Aortic valve replacement and mitral valve repair with allograft / F.P. Milsom, D.B. Doty // J. Card. Surg. - 1993. - Vol. 8. - P. 350-357.

39. Experience with homograft mitral valve replacement / A.S. Kumar [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 1998. - Vol. 7, № 2. - P. 225-228.

40. Homograft replacement of mitral valve in children / M.D. Plunkett [et al.] // Ann. Thorac. Surg. - 1998. - Vol. 66, № 3. - P. 849-852.

41. Reardon, M.J. Mitral valve homograft for mitral valve replacement in acute bacterial endocarditis / M.J. Reardon, A. Vinnerkvist, S.A. LeMaire // J. Heart Valve Dis.- 1999.-Vol. 8, № 1.-P. 71-73.

42. Реконструкция хорд нитью ePTFE и частичное протезирование передней створки митрального клапана криосохраненным митральным аллографтом при инфекционном эндокардите / В.А. Мироненко [и др.] // Груд, и сердеч. -сосуд, хирургия. — 2005. - № 6. - С. 58-60.

43. Частичное протезирование пораженного опухолью трикуспидального клапана криосохраненным митральным аллографтом / И.И. Скопин [и др.] // Груд, и сердеч.-сосуд, хирургия. - 2006. - № 1. - С. 59-62.

44. Бокерия, JI.A. Криосохраненный митральный аллографт в митральной позиции / JI.А. Бокерия, И.И. Скопин, М.А. Сазоненков // Груд, и сердеч. -сосуд, хирургия. - 2006. - № 6. - С. 69-71.

45. Mechanical properties of mitral allografts are not reasonably influenced by cryopreservation in sheep model / J. Hlubocky [et al.] // Physiol. Res. — 2011.— Vol. 60.-P. 475-482.

46. Tissue engineering of heart valves: biomechanical and morphological properties of decellularized heart valves /1. Tudorache [et al.] // J. Heart Valve Dis. — 2007. -Vol. 16. - P. 567-573; discussion 574.

47. Braunwald, N.S. Prosthetic reconstruction of the mitral valve / N.S. Braunwald, A.G. Morrow//Prog. Cardiovasc. Dis. - 1963. - Vol. 5, № 4. - P. 313-328.

48. Spencer, F.C. Presidential address. Intellectual creativity in thoracic surgeons / F.C. Spencer // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1983. - Vol. 86, № 2. - P. 163-179.

49. Duran, C.G. Experimental aortic valve heterotransplantation 1 / C.G. Duran, A.J. Gunning, R. Whitehead // Thorax. - 1967. - Vol. 22, № 6. - P. 510-518.

50. Bovine pericardium versus porcine aortic valve: comparison of tissue biological properties as prosthetic valves / K. Liao [et al.] // Artif. Organs. - 1992. - Vol. 16, №4.-P. 361-365.

51. Heart valve replacement with the Ionescu-Shiley pericardial xenograft / M.I. Ionescu [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1977. - Vol. 73, № 1. -P. 31-42.

52. Schoen, F.J. Calcification of tissue heart valve substitutes: progress toward understanding and prevention / F.J. Schoen, R.J. Levy // Ann. Thorac. Surg. -2005. - Vol. 79. - P. 1072-1080.

53. Schoen, F.J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering /

F.J. Schoen//Circulation. - 2008. - Vol. 118.-P. 1864-1880.

54. Biological factors affecting long-term results of valvular heterograft /

A. Carpentier [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1969. - Vol. 58, № 4. -P. 567-583.

55. Hendriks, M. Alternative fixation of bioprostheses / M. Hendriks, F. Everaerts, M. Verhoeven // J. Long. Term. Eff. Med. Implants. - 2001. - Vol. 11, № 3-4. -P. 163-183.

56. Formaldehyde - versus glutaraldehyde - processed porcine bioprostheses in the aortic valve / U. Bortolotti [et al.] H Am. J. Cardiol. - 1984. - Vol. 54. - P. 681682.

57. Thiene, G. Anticalcification strategies to increase bioprosthetic valve durability /

G. Thiene, M. Valente // J. Heart Valve Dis. - 2011. - Vol. 20, № 6. - P. 37-44.

58. Chikwe, J. Durability of tissue valves / J. Chikwe, F. Filsoufi // Semin. Thorac. Cardiovasc. Surg.-2011.-Vol. 23, № l.-P. 18-23.

59. Kobayashi, J. Stentless aortic valve replacement: an update / J. Kobayashi // Vase. Health Risk Manag. - 2011. - Vol. 7. - P. 345-351.

60. Kallikourdis, A. Is a stentless aortic valve superior to conventional bioprosthetic valves for aortic valve replacement? / A. Kallikourdis, S. Jacob // Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. - 2007. - Vol. 6. - P. 665-672.

61. Luciani, G.B. Autografts, homografts, and xenografts: overview on stentless aortic valve surgery / G.B. Luciani, F. Santini, A. Mazzucco // J. Cardiovasc. Med. -2007. - Vol. 8, № 2. - P. 91 -96.

62. Surgical management of acute aortic root endocarditis with viable homograft: 13-

year experience / A.C. Yankah [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 2002. -Vol. 21.-P. 260-267.

63. Aortic valve replacement with cryopreserved pulmonary allograft / J. Doty [et al.] //J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1998. - Vol. 115, № 2. - P. 371-379.

64. Gulbins, H. Homografts: a review / H. Gulbins, E. Kreuzer, B. Reichart // Expert Rev. Cardiovasc. Ther. - 2003. - Vol. 1, № 4. - P. 533-539.

65. Transplantation of aortic and pulmonary allografts, enhanced viability of endothelial cells by cryopreservation, importance of histocompatibility /

A.C. Yankah [et al.] // J. Card. Surg. - 1987. - Vol. 2, № 1, Suppl. - P. 209-220.

66. HLA antibodies specific for cryopreserved heart valve «homografts» in children / I. Den Hamer [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1997. - Vol. 113, № 2. -P. 417-419.

67. Degeneration of aortic valve allografts in young recipients / D.R. Clarke [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1993. - Vol. 105, № 5. - P. 934-941; discussion 941-942.

68. Long-term follow-up studies after homograft replacement of the mitral valve / A.F. Graham [et al.] // Can. Med. Assoc. J. - 1972. - Vol. 107.-P. 516-519.

69. Al-Janabi, N. Viability of fresh mitral homograft valves / N. Al-Janabi, D.N. Ross // Thorax. - 1973. - Vol. 28. - P. 293-294.

70. Revueita, J.M. Partial homograft replacement of mitral valve / J.M. Revueita, J.M. Bernai, J.M. Rabasa // Lancet. - 1994. - Vol. 344, № 8921. - P. 514.

71. Homograft replacement of the mitral valve in young recipients: Mid-term results / S. Chauvaud [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 2003. - Vol. 23. - P. 560-566.

72. Fuchs, J.R. Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction / J.R. Fuchs, B.A. Nasseri, J.P. Vacanti // Ann. Thorac. Surg. - 2001. - Vol. 72, №01. -P. 577-591.

73. Biological scaffolds for heart valve tissue engineering / A. Lichtenberg [et al.] // Methods Mol. Med. - 2007. - Vol. 140, № 2. - P. 309-317.

74. Flow-dependent re-endothelialization of tissue-engineered heart valves /

A. Lichtenberg [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 2006. - Vol. 15. - P. 287-293; discussion 293-294.

75. Tissue engineering heart valves: valve leaflet replacement study in a lamb model / T. Shinoka [et ah] //Ann. Thorac. Surg. - 1995. - Vol. 60. - P. S513-S516.

76. Results of a decellularized porcine heart valve implanted into the juvenile sheep model / P.M. Dohmen [et al.] // Heart Surg. Forum. - 2005. - Vol. 8, № 2. -P. 7276.

77. Histological evaluation of tissue-engineered heart valves implanted in the juvenile sheep model: is there a need for in-vitro seeding? / P.M. Dohmen [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 2006. - Vol. 15, № 6. - P. 823-829.

78. The SynerGraft valve: a new acellular (nonglutaraldehyde-fixed) tissue heart valve for autologous recellularization first experimental studies before clinical implantation / M.F. O'Brien [et al.] // Semin. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1999. -Vol. 11, №4, Suppl. l.-P. 194-200.

79. Construction of autologous human heart valves based on an acellular allograft matrix / S. Cebotari [et al.] //Circulation. - 2002. - Vol. 106. - P. 163-168.

80. Schmidt, D. Tissue engineering of heart valves using decellularized xenogeneic or polymeric starter matrices / D. Schmidt, U.A. Stock, S.P. Hoerstrup //Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. - 2007. - Vol. 362. - P. 1505-1512.

81. Mendelson, K. Heart valve tissue engineering: concepts, approaches, progress, and challenges / K. Mendelson, F.J. Schoen // Ann. Biomed. Eng. - 2006. - Vol. 34, № 12.-P. 1799-1819.

82. Agrawal, C.M. Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal tissue engineering / C.M. Agrawal, R.B. Ray // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - Vol. 55, №2.-P. 141-150.

83. Functional living trileaflet heart valves grown in vitro / S.P. Hoerstrup [et al.] // Circulation. -2000. - Vol. 102, № 19, Suppl. 3. - P. III44-I49.

84. From stem cells to viable autologous semilunar heart valve / F.W.H. Sutherland [et al.] // Circulation. - 2005. - Vol. 111, № 21. - P. 2783-2791.

85. In vivo monitoring of function of autologous e ngineered pulmonary valve / D. Gottlieb [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2010. - Vol. 139, № 3. -P. 723-731.

86. The role of organ level conditioning on the promotion of engineered heart valve tissue development in-vitro using mesenchymal stem cells / S. Ramaswamy [et al.] //Biomaterials.-2010.-Vol. 31, №6.-P. 1114-1125.

87. Endothelial progenitor cells as a sole source for ex vivo seeding of tissue-engineered heart valves / V.L. Sales [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2010. - Vol. 16, № l.-P. 257-267.

88. Use of human umbilical cord blood-derived progenitor cells for tissue-engineered heart valves / R. Sodian [et al.] // Ann. Thorac. Surg. - 2010. - Vol. 89, № 3. -P. 819-828.

89. Three-dimentional quantitative micromorphology of pre- and post-implanted engineered heart valve tissues / C.K. Eckert [et al.] // Ann. Biomed. Eng. - 2011. -Vol. 37, № l.-P. 205-222.

90. Minimally-invasive implantation of living tissue engineered heart valves: a comprehensive approach from autologous vascular cells to stem cells / D. Schmidt [et al.] //J. Am. Coll. Cardiol. -2010. - Vol. 56, № 6. - P. 510-520.

91. Variation in tissue outcome of ovine and human engineered heart valve constructs: relevance for tissue engineering / D. Van Geemen [et al.] // Regen. Med. - 2012. — Vol. 7, № l.-P. 59-70.

92. Rapid 3D printing of anatomically accurate and mechanically heterogeneous aortic valve hydrogel scaffolds / L. Hockaday [et al.] // Biofabrication. - 2012. - Vol. 4, № 3. - P. 035005.

93. Neidert, M.R. Tissue-engineered valves with commissural alignment /

M.R. Neidert, R.T. Tranquillo // Tissue Eng. - 2006. - Vol. 12, № 4. - P. 891-903.

94. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen / P.S. Robinson [et al.] // Tissue Eng. Part A. -2008.-Vol. 14, № l.-p. 83-95.

95. In vivo remodeling and structural characterization of fibrin-based tissue-engineered heart valves in the adult sheep model / T.C. Flanagan [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2009. - Vol. 15, № 10. - P. 2965-2976.

96. Mechanical properties and cell cultural response of polycaprolactone scaffolds designed and fabricated via fused deposition modeling / D. W. Hutmacher [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - Vol. 55, № 2. - P. 203-216.

97. Nam, Y.S. Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation / Y.S. Nam, T.G. Park // J. Biomed. Mater. Res. - 1999. -Vol. 47, № l.-P. 8-17.

98. Processing and microstructural characterization of porous biocompatible protein polymer thin films / C J. Buchko [et al.] // Polymer (Guildf). - 1999. - Vol. ,40, №26.-P. 7397-7407.

99. Moroni, F. Decellularized matrices for cardiovascular tissue engineering /

F. Moroni, T. Mirabella // Am. J. Stem Cells.-2014.-Vol. 3, № l.-P. 1-20.

100. Generation of bioartificial heart tissue by combining a three-dimensional gel-based cardiac construct with decellularized small intestinal submucosa / Z. Vukadinovic Nikolic [et al.] // Tissue Eng. Part A. -2014. - Vol. 20, № 511. - P. 799-809.

101. Assembly and testing of stem cell-seeded layered collagen constructs for heart valve tissue engineering / M.E. Tedder [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2011. - Vol. 17.-P. 25-36.

102. Decellularized homologous tissue-engineered heart valves as off-the-shelf alternatives to xeno- and homografts / P.E. Dijkman [et al.] // Biomaterials. — 2012. - Vol. 33, № 18. - P. 4545-4554.

103. The independent role of cyclic flexure in the early in vitro development of an engineered heart valve tissue / G.C. Engelmayr [et al.] // Biomaterials. - 2005. -

Vol. 26, №2.-P. 175-187.

104. Design of a new pulsatile bioreactor for tissue engineered aortic heart valve formation / K. Dumont [et al.] // Artif. Organs. - 2002. - Vol. 26, № 8. - P. 710714.

105. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review / V. Barron [et al.] //Ann. Biomed. Eng. -2003.-Vol. 31, № 9. - P. 1017-1030.

106. Design and hydrodynamic evaluation of a novel pulsatile bioreactor for biologically active heart valves / D.K. Hildebrand [et al.] // Ann. Biomed. Eng. -2004. - Vol. 32, № 8. - P. 1039-1049.

107. Tissue engineering of human heart valve leaflets: a novel bioreactor for a strainbased conditioning approach / A. Mol [et al.] // Ann. Biomed. Eng. - 2005. -Vol. 33, № 12.-P. 1778-1788.

108. Development of a novel pulsatile bioreactor for tissue culture / Y.S. Morsi [et al.] //J. Artif. Organs.-2007.-Vol. 10.-P. 109-114.

109. A pulsatile bioreactor for conditioning of tissue-engineered cardiovascular constructs under endoscopic visualization / F. Konig [et al.] // J. Funct. Biomater. 2012.-Vol. 3.-P. 480-496.

110. Rabbah, J.P. A novel left heart simulator for the multi-modality characterization of native mitral valve geometry and fluid mechanics / J.P. Rabbah, N. Saikrishnan, A.P. Yoganathan // Ann. Biomed. Eng. - 2013. - Vol. 41, № 2. - P. 305-315.

111. In vitro mitral valve, simulator mimics systolic valvular function of chronic ischemic mitral regurgitation ovine model / A.W. Siefert [et al.] // Ann. Thorac. Surg. - 2013. - Vol. 95, № 3. - P. 825-830.

112. TexMi: development of tissue-engineered textile-reinforced mitral valve prosthesis / R. Moreira [et al.] // Tissue Eng. Part C. Methods. - 2014. - Vol. 20, № 9. -

P. 741-748.

113. Loh, Q.L. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: role of porosity and pore size / Q.L. Loh, C. Choong // Tissue Eng. Part B. Rev. - 2013. -

Vol. 19, №6.-P. 485-502.

114. Transcatheter implantation of homologous «off-the-shelf» tissue-engineered heart valves with self-repair capacity: Long-term functionality and rapid in vivo remodeling in sheep / A. Driessen-Mol [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. - 2014. -Vol. 63, № 13. - P. 1320-1329.

115. Shi, Y. Characterization of statically loaded tissue-engineered mitral valve chordae tendineae / Y. Shi, I. Vesely // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2004. - Vol. 69. -

P. 26-39.

116. Identification and characterization of calcifying valve cells from human and canine aortic valves / E.R. Mohler [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 1999. - Vol. 8, № 3. -P. 254-260.

117. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix / T.W. Gilbert [et al.] // Biomaterials. - 2008. - Vol. 29, № 36. - P. 4775-4782.

118. Hodde, J. Virus safety of a porcine-derived medical device: evaluation of a viral inactivation method / J. Hodde, M. Hiles // Biotechnol. Bioeng. - 2002. - Vol. 79, №2.-P. 211-216.

119. Effects of sterilization on an extracellular matrix scaffold: Part I. Composition and matrix architecture / J. Hodde [et al.] // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2007. -

Vol. 18, №4.-P. 537-543.

120. RGD-modified acellular bovine pericardium as a bioprosthetic scaffold for tissue engineering / X. Dong [et al.] // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2009. - Vol. 20,

№ ll.-P. 2327-2336.

121. Development of acellular dermis from porcine skin using periodic pressurized technique /1. Prasertsung [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. Part B. Appl. Biomater.-2008. - Vol. 85, № 1. -P. 210-219.

122. The effects of processing methods upon mechanical and biologic properties of porcine dermal extracellular matrix scaffolds / J.E. Reing [et al.] // Biomaterials. -

2010. - Vol. 31, № 33. - P. 8626-8633.

123. Quantitative analysis of biochemical characteristics of bone-patellar tendon-bone allografts / O. Gorschewsky [et al.] // Biomed. Mater. Eng. - 2005. - Vol. 15, № 6. -P. 403-411.

124. Cox, B. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass spectrometry-based proteomics / B. Cox, A. Emili // Nat. Protoc. - 2006. - Vol. 1, №4.-P. 1872-1878.

125. Xu, C.C. A biodegradable, acellular xenogeneic scaffold for / C.C. Xu, R.W. Chan, N. Tirunagari // Tissue Eng. - 2007. - Vol. 13, №3.-P. 551-566.

126. An improved method to obtain a soluble nuclear fraction from embryonic brain tissue / S. Giusti [et al.] //Neurochem. Res. - 2009. - Vol. 34, № 11. - P. 20222029.

127. Strategies to recover proteins from ocular tissues for proteomics / N. Patel [et al.] // Proteomics. -2008. - Vol. 8, №5.-P. 1055-1070.

128. Histological evaluation and biomechanical characterisation of an acellular porcine cornea scaffold / L. Du [et al.] // Br. J. Ophthalmol. - 2011. - Vol. 95, № 3. -

P. 410-414.

129. Process development of an acellular dermal matrix (ADM) for biomedical applications / R.-N. Chen [et al.] // Biomaterials. - 2004. - Vol. 25, № 13. -P. 2679-2686

130. Biomechanical, biochemical, and histological characterization of canine lumbar facet joint cartilage / B.D. Elder [et al.] //Neurosurgery. -2010.-Vol. 66, №4.-P. 722-727.

131. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering / K.H. Nakayama [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2010. - Vol. 16, №7.-P. 2207-2216.

132. The role of protein solubilization in antigen removal from xenogeneic tissue for heart valve tissue engineering / M.L. Wong [et al.] // Biomaterials. - 2011. - Vol.

32.-P. 8129-8138.

133. Stepwise solubilization-based antigen removal for xenogeneic scaffold generation in tissue engineering / M.L. Wong [et al.] // Acta. Biomater. - 2013. - Vol. 9, № 5. -P. 6492-6501.

134. Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells / E. Rieder [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2004. - Vol. 127, № 2. - P. 399-405.

135. Detergent decellularization of heart valves for tissue engineering: toxicological effects of residual detergents on human endothelial cells / S. Cebotari [et al.] // Artif. Organs. -2010. - Vol. 34, № 3. - P. 206-210.

136. An alternative approach to decellularize whole porcine heart / K. Methe [et al.] // Biores. Open Access. - 2014. - Vol. 3, № 6. - P. 327-338.

137. Comparison of aortic valve allograft decellularization techniques in the rat / S.R. Meyer [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. Part A. - 2006. - Vol. 79, № 2. - P. 254262.

138. Lumpkins, S.B. A mechanical evaluation of three decellularization methods in the design of a xenogeneic scaffold for tissue engineering the te mporomandibular joint disc / S.B. Lumpkins, N. Pierre, P.S. McFetridge // Acta Biomater. - 2008. -Vol. 4, №4.-P. 808-816.

139. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung / H.C. Ott [et al.] // Nat. Med. - 2010. - Vol. 16, № 8. - P. 927-933.

140. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction / D. W. Courtman [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. - 1994. - Vol. 28, № 6. - P. 655-666.

141. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves / M.T. Kasimir [et al.] //Int. J. Artif. Organs. -2003. - Vol. 26, № 5. - P. 421-427.

142. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation / T.H. Petersen [et al.] // Science.

-2010.-Vol. 329, №5991.-P. 538-541.

143. Novel utilization of serum in tissue decellularization / L. Gui [et al.] // Tissue Eng. PartC. Methods.-2010.-Vol. 16, №2.-P. 173-184.

144. Tissue engineering of cardiac valve prostheses I: development and histological characterization of an acellular porcine scaffold / C. Booth [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 2002. - Vol. 11, № 4. - P. 457-462.

145. Does sodium dodecyl sulfate wash out of detergent-treated bovine pericardium at cytotoxic concentrations? / S. Caamano [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 2009. -Vol. 18, № 12.-P. 101-105.

146. Inhibition of cusp and aortic wall calcification in ethanol- and aluminum-treated bioprosthetic heart valves in sheep: background, mechanisms, and synergism / R.J. Levy [et al.] // J. Heart Valve Dis. - 2003. - Vol. 12, № 2. - P. 209-216; discussion 216.

147. A comparison of macroscopic lipid content within porcine pulmonary and aortic valves / J. Dunmore-Buyze [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1995. - Vol. 110, №6.-P. 1756-1761.

148. Flynn, L.E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells / L.E. Flynn // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31, № 17. - P. 4715-4724.

149. Comparison of three methods for the derivation of a biologic scaffold composed of adipose tissue extracellular matrix / B.N. Brown [et al.] // Tissue Eng. Part C. Methods. - 2011. - Vol. 17, № 4. - P. 411-421.

150. Cole, M.B. Alteration of cartilage matrix morphology with histological processing / M.B. Cole//J. Microsc.- 1984.-Vol. 133, №2.-P. 129-140.

151. Jamur, M.C. Cell fixatives for immunostaining / M.C. Jamur, C. Oliver//Methods Mol. Biol.-2010.-Vol. 588.-P. 55-61.

152. Montoya, C.V. Preparation of ex vivo-based biomaterials using convective flow decellularization / C.V. Montoya, P.S. McFetridge // Tissue Eng. Part C. Methods.

-2009.-Vol. 15, №2. -P. 191-200.

153. Method of preparing a decellularized porcine tendon using tributyl phosphate / C.R. Deeken [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. Part B. Appl. Biomater. - 2011. -Vol. 96 B, № 2. — P. 199-206.

154. Crapo, P.M. An overview of tissue and whole organ decellularization processes / P.M. Crapo, T.W. Gilbert, S.F. Badylak // Biomaterials. - 2011. - Vol. 32, № 12. -P. 3233-3243.

155. Favorable effects of the detergent and enzyme extraction method for preparing decellularized bovine pericardium scaffold for tissue engineered heart valves / M. Yang [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. Part B. Appl. Biomater. - 2009. - Vol. 91, № l.-P. 354-361.

156. Waldrop F.S. et al. Histochemical investigations of different types of collagen. // Acta Histochem. Suppl. 1980. Vol. 21. P. 23-31.

157. Yang B. et al. Development of a porcine bladder acellular matrix with well-preserved extracellular bioactive factors for tissue engineering. // Tissue Eng. Part C. Methods. 2010. Vol. 16, № 5. P. 1201-1211.

158. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering / A. Hopkinson [et al.] // Tissue Eng. Part C. Methods. - 2008. - Vol. 14, № 4. -P. 371-381.

159. Reduction of xeno-antigens in porcine pulmonary heart valves by decellularization and glycolytic enzymatic treatment / A. Hilfiker [et al.] // Xenotransplantation. -2014. - Vol. 21, № 2. - P. 190-190.

160. Klebe, R.J. Isolation of a collagen-dependent cell attachment factor / R.J. Klebe // Nature. - 1974. - Vol. 250, № 463. - P. 248-251.

161. Gailit, J. Regulation of the fibronectin receptor affinity by divalent cations / J. Gailit, E. Ruoslahti // J. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 263, № 26. - P. 1292712932.

162. Maurer, P. Structural and functional aspects of calcium binding in extracellular

matrix proteins / P. Maurer, E. Hohenester//Matrix Biol. - 1997. - Vol. 15, № 8-9. - P. 569-580; discussion 581.

163. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart /

J.M. Wainwright [et al.] // Tissue Eng. Part C. Methods. - 2010. - Vol. 16, № 3-P. 525-532.

164. Decellularization reduces immunogenicity of sheep pulmonary artery vascular patches / E.J. Lehr [et al.] // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2011. - Vol. 141, № 4. -P. 1056-1062.

165. Изучение биосовместимости трансплантатов клапанов сердца, девитализированных антикальцинозным способом / B.C. Акатов [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2010. - Т. 5, № 2. -С. 36-41.

166. Подавление кальцификации трансплантатов клапанов сердца путем их девитализации / B.C. Акатов [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т. 5, № 1. - С. 1-6.

167. Method for decellularizing skeletal muscle without detergents or proteolytic enzymes / A.R. Gillies [et al.] // Tissue Eng. Part C. Methods. - 2011. - Vol. 17, №4.-P. 383-389.

168. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation / J. Cortiella [et al.] // Tissue Eng. Part A. — 2010. - Vol. 16, № 8. - P. 2565-2580.

169. Lee R.C., Kolodney M.S. Electrical injury mechanisms: electrical breakdown of cell membranes. //Plast. Reconstr. Surg. 1987. Vol. 80, № 5. P. 672-679.

170. Lee, R.C. Cell injury by electric forces / R.C. Lee // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2005. -Vol. 1066.-P. 85-91.

171. Phillips, M. Nonthermal irreversible electroporation for tissue decellularization / M. Phillips, E. Maor, B. Rubinsky // J. Biomech. Eng. - 2010. - Vol. 132, № 9. -P. 091003.

172. Phillips, M. Principles of tissue engineering with nonthermal irreversible electroporation / M. Phillips, E. Maor, B. Rubinsky // J. Heat Transfer. — 2011. — Vol. 133, № l.-P. 011004.

173. Towards the creation of decellularized organ constructs using irreversible electroporation and active mechanical perfusion [Electronic research] / M.B. Sano [et al.] //Biomed. Eng. - 2010. - Vol. 9, № 1. - P. 83. Режим доступа:

10.1186/1475-925X-9-83.

174. Tissue engineering of heart valves: decellularized porcine and human valve scaffolds differ importantly in residual potential to attract monocytic cells / E. Rieder [et al.] // Circulation. - 2005. - Vol. 111, № 21. - P. 2792-2797.

175. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT in pediatric patients / P. Simon [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 2003. - Vol. 23.-P. 1002-1006.

176. Performance of SynerGraft decellularized pulmonary homograft in patients undergoing a Ross procedure / J.W. Brown [et al.] // Ann. Thorac. Surg. - 2011. -Vol. 91, №2.-P. 416-423.

177. Early obstruction of decellularized xenogenic valves in pediatric patients: involvement of inflammatory and fibroproliferative processes /1. Cicha [et al.] // Cardiovasc. Pathol. - 2011. - Vol. 20, № 4. - P. 222-231.

178. Early failure of xenogenous de-cellularised pulmonary valve conduits - a word of caution! / A. Riiffer [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 2010. - Vol. 38, № 1. -P. 78-85.

179. Early and late failure of tissue-engineered pulmonary valve conduits used for right ventricular outflow tract reconstruction in patients with congenital heart disease / G. Perri [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 2012. - Vol. 41, № 6. - P. 13201325.

180. Sheep hematology from birth to maturity III. Serum calcium, phosphorus, magnesium, sodium and potassium zutaut / C.H. Long [et al.] // J. Anim. Sci. -

1965.-Vol. 24.-P. 145-150.

181. Barnhart, G.R. Degeneration and cardiac valves cacfi cation of bioprosthetic bioprosthetic tricuspid valve implantation in sheep / G.R. Barnhart, M. Jones // Am. J. Pathol. - 1982. - Vol. 106, № 1. - P. 136-13.

182. Ali, M. The sheep as an animal model for heart valve research / M. Ali // Cardiovasc. Surg. - 1996. - Vol. 4, № 4. - P. 543-549.

183. Orthotopic replacement of the aortic valve with decellularized allograft in a sheep model / H. Baraki [et al.] // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30, № 31. - P. 6240-6246.

184. Heart valve engineering: decellularized allograft matrices in clinical practice / A. Neumann [et al.] // Biomed. Tech. - 2013. - Vol. 58, № 5. - P. 453-456.

185. Gacko, M. Elastin: structure, properties and metabolism / M. Gacko // Cell. Mol. Biol. Lett. - 2000. - Vol. 5, № 3. - P. 327-348.

186. Shoulders, M.D. Collagen Structure and Stability / M.D. Shoulders, R.T. Raines // Annu. Rev. Biochem. - 2009. - Vol. 78. - P. 929-958.

187. Nagata, S. Autoimmunity and the clearance of dead cells: review / S. Nagata, R. Hanayama, K. Kawane // Cell. - 2010. - Vol. 140, № 5. _ p. 619-630.

188. Development and characterization of acellular porcine pulmonary valve scaffolds for tissue engineering / J. Luo [et al.] // Tissue Eng. Part A. - 2014. - Vol. 20, №21-22.-P. 2963-2974.

189. Inbred or outbred? An evaluation of the functional allogenicity of farm sheep used in cardiac valve studies / E.J. Lehr [et al.] // J. Thorac . Cardiovasc. Surg. - 2006. -

Vol. 132. — P. 1156-1161.

190. Calcification characteristics of porcine stentless valves in juvenile sheep /

P. Herijgers [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 1999. - Vol. 15. - P. 134-142.

191. The registry of the international society for heart and lung transplantation: eighteenth official pediatric heart transplantation report - 2015 / A.I. Dipchand [et al.] // J. Hear. Lung Transplant. - 2015. - Vol. 34. - P. 1233-1243.

192. The registry of the international society for heart and lung transplantation: thirtysecond official adult heart transplantation report - 2015 / L.H. Lund [et al.] //J. Hear. Lung Transplant. -2015. - Vol. 34. - P. 1244-1254.

193. The registry of the international society for heart and lung transplantation: eighteenth official pediatric lung and heart-lung transplantation report - 2015 / S.B. Goldfarb [et al.] // J. Hear. Lung Transplant. - 2015. - Vol. 34. - P. 12551263.

194. The registry of the international society for heart and lung transplantation: thirty second official adult lung and heart-lung transplantation report - 2015 //

R.D. Yusen [et al.] // J. Hear. Lung Transplant. - 2015. - Vol. 34. - P. 1264-1277.

195. Massey, D. Small bowel transplantation?: the latest developments / D. Massey, S. Gabe // Medicine (Baltimore). - 2015. - Vol. 43, № 4. - P. 244-250.

196. Neuberger, J. An update on liver transplantation: a critical review / J. Neuberger // J. Autoimmun. - 2016. - Vol. 66. - P. 51-59.

197. Knight, S. Pancreas transplantation / S. Knight // Surgery. - 2014. - Vol. 32, № 7. -P. 383-388.

198. Long-term successful outcomes from kidney / T.A. Lung [et al.] // Ann. Thorac. Surg.-2015.-Vol. 99.-P. 1032-1039.

199. Functional status and survival after kidney transplantation / P.P. Reese [et al.] // Transplantation. -2014. - Vol. 97, № 2. - P. 189-195.

200. Quiroga, I. Principles in transplantation?: immunology / I. Quiroga // Surgery. -2011. - Vol. 29, № 7. - P. 295-300.

201. Cota, A.M. Immunology of transplantation / A.M. Cota // Anaesth. Intensive Care Med. -2009. - Vol. 10, № 5. - P. 221-222.

202. The use of xenogeneic small intestinal submucosa as a biomaterial for Achille's tendon repair in a dog model / S.F. Badylak [et al.] // J. Biomed. Mater. Res. -1995. - Vol. 29, № 8. - P. 977-985.

203. Small intestinal submucosa: a substrate for in vitro cell growth / S.F. Badylak [et

al.] // J. Biomater Sci. Polym. - 1998. - Vol. 9, № 8. - P. 863-878.

204. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenrative medicine approach / H. Yagi [et al.] // Cell Transplant. - 2013. - Vol. 22, № 2. -P. 231-242.

205. Bhuyan, A.K. On the mechanism of SDS-induced protein denaturation /

A.K. Bhuyan // Biopolymers. - 2010. - Vol. 93, № 2. - P. 186-199.

206. Khoshnoodi, J. Mammalian collagen IV / J. Khoshnoodi, V. Pedchenko,

B.G. Hudson // Microsc. Res. Tech. - 2008. - Vol. 71. - P. 357-370.

207. Reductive cleavage of the disulfide bonds of the collagen IV noncollagenous domain in aqueous sodium dodecyl sulfate: absence of intermolecular nondisulflde cross links / G.K. Reddy [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1993. -Vol. 190, № 1,-P. 277-282.

208. Grande-Allen, K.J. The heterogeneous biomechanics and mechanobiology of the mitral valve: implications for tissue engineering / K.J. Grande-Allen, J. Liao // Curr. Cardiol. Rep. - 2011. - Vol. 13.-P. 113-120.

Приложение. Протоколы окрашивания препаратов для рутинной световой микроскопии и иммунофлюоресцентного анализа

Протокол окраски гематоксилином-эозином

1. Препараты в парафине на 30 минут в сухожаровой шкаф при 60°С.

2. Удаление парафина: 2х 10 мин.в ксилоле.

3. Регидратация: 2х 5 мин. в 100% этаноле, 2 мин. в 95% этаноле, 2 мин. в 80% этаноле,2 мин. в 70% этаноле.

4. Сполоснуть в дистиллированнойводе.

5. 8 мин. Вгематоксилине.

6. 10 мин. под проточной водой.

7. Сполоснуть в дистиллированной воде.

8. 10 раз сполоснуть в 95% этаноле.

9. Окрасить в эозине в течение 20 секунд.

10. Дегидратация: 5 мин. в 95% этаноле, 2х 5 мин.в 100% этаноле.

11. 2х 5 мин. в ксилоле.

12. Укрыть покровным стеклом.

Пентахром по Мовату

1. Препараты в парафине на 30 минут в сухожаровой шкаф при 60°С.

2. Удаление парафина: 2х 10 мин.в ксилоле.

3. Регидратация: 2х 5 мин. в 100% этаноле, 2 мин. в 95% этаноле, 2 мин. в 70% этаноле.

4. Сполоснуть в дистиллированнойводе.

5. Окрасить в альциановом синем - 10 мин.

6. 5 мин. подпроточной водой.

7. Стабилизировать в гидроксиде аммония — 60 мин.

8. 10 мин. под проточной водой.

9. Сполоснуть в дистиллированной воде.

10. Окрасить в гематоксилине Вейгерта - 10 мин.

11. Сполоснуть в дистиллированной воде.

12. 15 мин. Подпроточнойводой.

13. Окрасить в Crocein Scarlet - 15 мин.

14. Сполоснуть в 0,5% уксусной кислоте.

15. Дифференцировать в 5% фосфорно-вольфрамовой кислоте - 18 мин.

16. Оставить в 0,5% уксусной кислоте на 2 мин.

17. 3x5 мин. в 100% этаноле.

18. Окрасить спиртовом растворе сафранина - 60 мин.

19. Трижды сполоснуть в 100% этаноле.

20. Дегидратация: 5 мин. в 95% этаноле, 2х 5 мин.в 100% этаноле

21. 2х 5 мин. в ксилоле

22. Укрыть покровным стеклом.

Окраска на эластин по ван Гизону

1. Препараты в парафине на 30 минут в сухожаровой шкаф при 60°С.

2. Удаление парафина: 2х 10 мин.в ксилоле.

3. Регидратация: 2х 5 мин. в 100% этаноле, 2 мин. в 95% этаноле, 2 мин. в 80% этаноле,2 мин. в 70% этаноле.

4. Окрасить в резорцин-фуксине — 30 мин.

5. Сполоснуть в дистиллированной воде.

6. Дифференцировать в 100% этаноле - 10 сек.

7. 70% этанол - 1 мин.

8. Окрасить гематоксилином Вейгерта — 10 мин.

9. 10 мин. под проточной водой.

10. Сполоснуть в дистиллированной воде.

11. Окрасить пикрофуксином — 3 мин.

12. Сполоснуть в дистиллированной воде.

13. Дегидратация: 5 мин. в 70% этаноле, 5 мин. в 80% этаноле, 5 мин. в 90% этаноле, 5 мин. в 95% этаноле, 5 мин.в 100% этаноле.

14. 2х 5 мин. в ксилоле.

15.

Укрыть покровным стеклом.

Окраска на кальций по фон Косса

1. Препараты в парафине на 30 минут в сухожаровой шкаф при 60°С.

2. Удаление парафина: 2х 10 мин.в ксилоле.

3. Регидратация: 2х 5 мин. в 100% этаноле, 2 мин. в 95% этаноле, 2 мин. в 80% этаноле,2 мин. в 70% этаноле.

4. Сполоснуть в воде ELGA.

5. Выдержать в 5% растворе нитрата серебра - 15 мин.

6. Выдержать в восстанавливающем растворе — 2 мин.

7. 10 мин. под проточной водой.

8. Фиксировать в 5% растворе натрий сульфата.

9. 15 мин. под проточной водой.

10. Сполоснуть в воде ELGA - 3 мин.

11. Окрасить в растворе сульфата алюминия.

12. Сполоснуть в воде ELGA - 3 мин.

13. Дегидратация: 5 мин. в 50% этаноле, 5 мин. в 70% этаноле, 5 мин. в 80% этаноле, 5 мин. в 90% этаноле, 5 мин. в 95% этаноле, 5 мин.в 100% этаноле.

14. 2х 5 мин. в ксилоле.

15. Укрыть покровным стеклом.

Протокол иммунофлюоресцентной окраски

1. Замороженный препарат выдержать в ацетоне - 4 мин.

2. Сполоснуть в PBS при 4°С - 3x5 мин.

3. Блокировать препарат ослиной сывороткой 1:10 — 30 мин.

4. Реакция с первичными антителами - 24 часа при 4°С (окраска на внеклеточные антигены - в PBS, на внутриклеточные - в PBS/Tween 0,05%)

5. Сполоснуть в PBS при 4°С - 3x5 мин.

6. Реакция с вторичными антителами - 30 мин.

7. Сполоснуть в PBS при 4°С - 3x5 мин.

8. Окраска DAPI (1:10.000) - 15 минГ^

9. Сполоснуть в PBS при 4°С - 3x5 мин.

10. Укрыть покровным стеклом.