Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Рязанцева, Анастасия Александровна

• Рязанцева, Анастасия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рязанцева, Анастасия Александровна

I. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные задачи исследования.

1.4. Научная новизна работы.

1.5. Научно-практическая ценность.

1.6. Основные положения, выносимые на защиту.

1.7. Апробация работы.

II. Обзор литературы.

2.1. Общие сведения о вирусе гепатита С (ВГС).

2.2. Структура и организация генома. Краткая характеристика некоторых продуктов его экспрессии:

• 5'-нетранслируемый участок (5-UTR)

• З'-нетранслируемый участок (З'-UTR)

• вирусные протеины. Структурные белки. Белок Core

• гликопротеины оболочки

• неструктурные белки. NS

2.3. Тканевой тропизм ВГС.

2.4. Роль ВГС в канцерогенезе.

2.5. Метод ОТ-ПЦР in situ.

2.6. Морфогенез ВГС.

III. Материалы и методы.

3.1. Клинический материал для детекции РНК ВГС.

3.2. Метод ПЦР. З.З.ОТ-ПЦР in situ.

3.4. Электронная микроскопия.

IV. Результаты и обсуждение.

4.1. Метод ОТ-ПЦР in situ.

4.2. Обнаружение РНК ВГС in situ.

4.3. Локализация in situ.

4.4. Ультраструктурные исследования.

4.5. Общее заключение по обсуждению.

V. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ»

1.1.Актуальность проблемы.

Вирус гепатита С (ВГС), как предполагается, проник в человеческую популяцию довольно давно и в настоящее время получил широкое распространение, в том числе из-за парентеральных манипуляций. Число инфицированных вирусом - около 500 млн. человек, большинство из которых является скрытыми носителями. У 50-85% заболевших острым гепатитом С развивается хроническая (персистирующая) ВГС-инфекция, при которой вирус сохраняется и размножается в организме в течение десятков лет [125].

Данные о частоте встречаемости гепатита С неоднородны и колеблются от 0,1% от общей численности населения в таких странах, как Исландия, или Норвегия и до 18,1% - в Египте [44].

Кроме того, на фоне хронического вирусного гепатита может развиваться первичный рак печени (гепатоцеллюлярная карцинома). Как известно, гепатоцеллюлярная карцинома является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека. Среди злокачественных новообразований печени на её долю приходится 80-90%, а ВГС, наряду с ВГВ (вирусом гепатита В), являются важнейшими 4 этиологическими агентами. Причем в некоторых регионах мира, например в

Японии, доля ВГС-инфекции в этом отношении является ведущей, достигая 75% [20].

Несмотря на всё вышеперечисленное, до сих пор остаются неизученными молекулярно-биологические аспекты репродукции вируса. Также однозначно не выяснена его внутриклеточная локализация. Хотя факт участия ВГС в развитии гепатоцеллюлярной карциномы доказан, молекулярные механизмы ВГС-ассоциированного канцерогенеза не изучены до настоящего времени. [132]. В. В связи с этим возникает вопрос о методе, который позволил бы :

• выявить генетический материал (РНК) вируса непосредственно в инфицированной ткани (in situ).

• сохранить тканевые срезы достаточно цельными для того, чтобы можно было установить внутриклеточную локализацию вирусной РНК.

Таким методом, по сути, является гибридизация in situ. Однако, этот метод в применении к вирусу гепатита С имеет низкую чувствительность и дает не очень достоверные результаты из-за того, что во-первых, количество вирионов ВГС в ткани невелико, а во-вторых, в процессе выполнения процедур его РНК часто подвергается разрушению.

Метод ОТ-ПЦР in situ был разработан на основе двух методов - метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ. Таким образом, он сочетает в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Однако, несмотря на преимущества, ОТ-ПЦР in situ обладает и некоторым недостатком. Более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады, имеющие место на этапе амплификации, приводят к более сильному, чем при гибридизации in situ, разрушению срезов. Также к сложностям ОТ-ПЦР in situ можно отнести его многоэтапность, трудоёмкость и высокую стоимость реактивов. Всё это вместе и привело к тому, что в нашей стране этот метод практически не применяется, в то время как за рубежом появляются исследования с применением ОТ-ПЦР in situ для идентификации различных вирусов.

О первых результатах, полученных с использованием этого метода сообщалось в работе А.Т .Haase и др. в 1990 г. [39]. В дальнейшем, количество работ с применением метода обнаружения РНК ВГС в срезах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин заметно возросло, но наибольший вклад в развитие и стандартизацию методики, ее усовершенствование и изучение с ее помощью ВГС внес G. Nuovo [81 - 90].

Применение метода детекции РНК ВГС in situ позволило обнаружить ВГС не только в гепатоцитах, но и в купферовских клетках [6]. Кроме того, было показано, что РНК вируса гепатита С обнаруживается не только в печени, но и, например, в лимфоцитах [54], и в эритротроцитах [73]. Предполагают, что эти клетки могут принимать участие в транспорте ВГС от места проникновения в организм до клеток печени, где, в основном, происходит его размножение.

До сих пор остаётся спорным вопрос о внутриклеточной локализации РНК ВГС. Некоторые исследователи сообщают о нахождении РНК ВГС только в цитоплазме гепатоцитов [15, 93, 103, 104], другие указывают на исключительно ядерную локализацию [7], третьи обнаруживают РНК ВГС как в цитоплазме, так и в ядрах клеток [6, 16, 41, 60, 89, 118].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Рязанцева, Анастасия Александровна

Выводы:

1. Впервые в практике отечественных исследований применён и модифицирован метод ОТ-ПЦР in situ для детекции вирусного генома в парафиновых срезах. Подобраны оптимальные условия для снижения деградации РНК, установлено оптимальное время инкубации срезов с ДНКазой, подобраны реагенты для проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одну стадию, а также режим амплификации.

2. При исследовании биопсийного и операционного материала от больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой показана эффективность модифицированного нами метода для выявления РНК ВГС в ядрах и цитоплазме гепатоцитов и раковых клеток.

3. В образцах печени от больных с хроническим гепатитом С, положительных по ОТ-ПЦР in situ методом электронной микроскопии установлено наличие в цитоплазме гепатоцитов вирусоподобных частиц и тубулярных образований, представляющих собой структурные белки ВГС, характерных для клеток, инфицированных вирусом гепатита С. Сочетание указанных подходов повышает достоверность полученных результатов.

4. Не выявлено прямой корреляции между гистологической картиной поражения печени при хроническом гепатите С с числом инфицированных гепатоцитов, детектируемых с помощью ОТ-ПЦР in situ.

5. В результате проведения ОТ-ПЦР in situ впервые показана перинуклеарная локализация РНК ВГС в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.

6. Показана возможность использования ОТ-ПЦР in situ в качестве одного из методов ранней диагностики вирусных и онкологических заболеваний.

Глава VI.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рязанцева, Анастасия Александровна, 2005 год

1. Agnello V, Abel G., Knight G. The role of hepatitis С virus (HCV) in the pathogenesis of type II cryoglobulinemia (MC). //Arthritis Rheum. 1993;. 36: S241.

2. Ali N., Siddiqui A. Interaction of polypirimidine tract-binding protein with the 5' noncoding region of the hepatitis С virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation. U J. Virol 1995; 69:6367-6375.

3. Barba G., Harper F., Harada Т., et al. Hepatitis С virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. // Proc. Natl. AcadSci. USA, 1997; 94: 1200-1205.

4. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., Jacobs en H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis С virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. // J. Virol, 1993; 67: 3835 3844.

5. Behrens, S. E., Tomei, L., De Francesco, R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus. // EMBO J, 1996; 15: 12-22.

6. Bettinger D., Mougin C., Fouque В., et al Direct in situ reverse transcriptase-linked polymerase chain reaction with biothinylated primers for the detection of hepatitis С RNA in liver biopsies. //J Clin Virol 1999; 12:233 — 241.

7. Biagini P., Bencoel L., Dodero F., et.al. Hepatitis С virus by in situ RT- PCR in formalin-fixed paraffin-embedded liver tissue. Comparison with serum and tissue results. //Cel. Mol Biol 2001;47, № 23: OL 167-ОЫ71.

8. Blanchard E., Brand D., et al Hepatitis С virus-like particles morphogenesis. // J. Virol, 2002;76: 4073 4079.

9. Blight K.J., Trowbridge R., Rowland R., Gowans E.J. Detection of hepatitis С virus RNA by in situ hybridization. // Liver 1992; 12: 286 — 289.

10. Blight K. J., Rowland R., de la Hall P.M., et al. Immunohistochemical detection of the NS4 antigen of hepatitis С virus and its relation to histopathology. //Am J Pathol. 1993; 143:1568—1573.

11. Bosman C., Valli M.B., et al. Detection of virus-like particles in liver biopsies from HCV-infected patients. II Res. Virol., 1998; 149: 311 314.

12. Bouffard P., Hayashi P.H., Acovedo R. et al. Hepatitis С virus is detected in monocyte/macrophage subpopulation of peripheral blood mononuclear cells of infected patients. //J. Infect. Dis., 1992; 166:1276-1280.

13. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the 5' non-coding region of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1992;89: 4942 -4946.

14. Buratti E., Tisminetzky Zotte M., Baralle F. E. Functional analysis of interaction between HCV 5'UTR and putative subunits of eukaryotic translation initiation factor eIF3. //Nucleic Acid Res., 1998; 26: 3179 3187.

15. Chang M., Marquardt A.P., Wood B. L., et al. In situ distribution of hepatitis С virus replicative-intermediate RNA in hepatic tissue and its correlation with liver disease. //J Virol 2000; 74: 944 955.

16. Cho S. W., Hwang S. G., Han D. C., et al. In situ detection of hepatitis С virus RNA in the liver tissue using a digoxigenin-labelled probe created during a polymerase chain reaction. // J Med Virol. 1996; 48: 227 — 233.

17. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88:2451 -2455.

18. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. Involvement of endoplasmatic reticulum chaperones in the folding of hepatitis С virus glycoproteins. // J. Virol. 1998; 72:3851- 3858.

19. Clarke B. Molecular virology of hepatitis С virus. // J. Gen. Virol., 1997; 78: 2397-2410.

20. Colombo M. Hepatitis С virus and hepatocellular carcinoma. // Seminars in liver disease 1999; vol.19; №3 : 263 269.

21. De Vita S., Sansonno D., Dolcetti R., et al. Hepatitis С virus within a malignant lymphoma lesion in the course of type II mixed cryoglobulinemia. // Blood 1995; 86:1887—1892.

22. De Vos R., Verslype C., et al. Ultrastructural visualization of hepatitis С virus components in human and primate liver biopsies. // J.Hepatol., 2002; 37: 370-379.

23. Deleersnyder V, Pillez A., Wychowski C., et al. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes. //J. Virol., 1997; 71: 697-704.

24. Dubuisson J. Folding, assembly and subcellular localization of hepatitis С virus glycoproteins. // Cur. Top. Microbiol. Immunol., 2000; 242: 135 — 148.

25. Dubuisson J., Hsu H.H., Cheung R.S., et al. Formation and intracellular localization of hepatitis С virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccina and Sindbis viruses. //J.Virol., 1994; 68: 6147 6160.

26. Enomoto N., Sakuma I., Asahina Y., et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis С virus lb infection. II N.Engl. J.Med, 1996; 334: 77-81.

27. Failla C.M., Tomei L., De Francesco R. Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of the hepatitis С virus nonstructural proteins //J. Virol. 1994; 68:3753-3760.

28. Falcon V., Acosta-Rivero N., et al. Ultrastructural evidences of HCV infection in hepatocytes of chronically HCV-infected patients. // Biochem. Biophys. Res. Com., 2003; 305: 1085 1090.

29. Falcon V., Baranosky N., et al. Ultrastructural and immunocytochemical characteristics of hepatocytes from hepatitis В virus infected shimpanzees. // Tissue Cell, 1993; 25: 865 873.

30. Farci P., Bukh J., Purcell R. The quasispecies of hepatitis С virus and the host immune response. // Springer Semin. ImmunopatoL, 1997; 19: 5-26.

31. Feinstone S., Mihalik K.B., Kamimura Т., et al. Inactivation of hepatitis В virus and non-A, non-B hepatitis by chlorophorm. // Infect. Immun. 1983;41:816-821.

32. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Classification and nomenclature of viruses: Fifhtreport of the International Committee on Tacsonomy of Viruses. I I Arch. Virol. 1991; 2: 223.

33. Fukushi S., Katayama K., Kurlhara C., et al. Complete 5' noncoding region is necessary for efficient internal initiation of hepatitis С virus RNA. //Biochem.Biophys.Res Commun., 1994; 199: 425 432.

34. Gale M. J., Jr., Korth M. J., Tang N. M., et al. Evidence that hepatitis С virus resistance to interferon is mediated through repression of the PKR protein kinase by the nonstructural 5A protein. // Virology, 1997; 230: 217-227.

35. Gonzalez-Peralta R.P., Fang J.W.S., Davis G.L., et al. Optimization for the detection of hepatitis С virus antigens in the liver. // J Hepatol. 1994; 20: 143 —147.

36. Gracoui A., McCourt D. W., Wychowski C., et al. A second hepatitis С virus-encoded proteinase. HProc. Natl. Acad.Sci. USA, 1993; 90:10583-10587.

37. Gracoui A., Wychowski C., Lin.C., et al. Expression and identification of hepatitis С virus polyprotein cleavage products. II J. Virol. 1993; 67:1385-1395.

38. Gwak V., Kim D. W., Han J. H., Choe J. DNA helicase activity of the hepatitis С virus nonstructural protein 3. IIEur. J. Biochem. 1997; 251: 47 54.

39. Haase A.T., Retzel E.F., Staskus K.A. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990,87; 4971-4975.

40. Haruna Y, Hayashi N. Hiramatsu N., et al. Detection of hepatitis С virus RNA in liver tissues by an in situ hybridization technique. // J Hepatoll993;. 18: 96— 100.

41. He L.F., Ailing D., Popkin Т., et al. Determining the size of non-A, non-B hepatitis virus by filtration. И J.Infect.Dis. 1987; 156: 636 640.

42. He X.S., Rehermann В., Lopez-Labrador F. X., et al. Quantitative analysis of hepatitis С virus-specific CD8(+) T-cells in peripheral blood and liver using peptide-МНС tetramers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:5692 5697.

43. Hepatitis C: Global prevalence, 1997.

44. Hijikata M., Mizushima H., Akagi Т., et al. Two distinctproteinase aktivities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis С virus. II J. Virol., 1993; 67:4665 4675.

45. Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y, et al. Gene mapping of the putative structural region of hepatitis С virus by in vitro processing analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1991; 88: 5547-5551.

46. Honda M., Beard M.R., Ping L.H., Lemon S.M. A phylogenetically conserved stem-loop structure at the 5'border fo the internal ribosome entry site of hepatitis С virus is required for cap-independent viral translation. // J.Virol. 1999;73: 1165-1174.

47. Honda M., Brown E. A., Lemon S.M. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis С virus RNA. // RNA, 1996; 2: 955-968.

48. Houghton M. Hepatitis С viruses. // Virology, Ed. B.N. Fields, third ed.,ch.32, p. 1037, "Lippincott-Raven Publishers ", 1995.

49. Ito Т., Lai M. M. An internal polypirimidine tract-binding protein-binding site in the hepatitis С virus RNA attenuates translation, which is relieved by the 3'-untranslated sequence. // Virology, 1999; 254: 288 296.

50. Jackson D., Tabor E., Gerety R. Acute non-A, non-B hepatitis: specific ultrastructural alterations in endoplasmatic reticulum of infected hepatocytes. // Lancet 1979; 1:1249 1250.

51. Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K. et al. Hepatitis С virus particle detected by immunoelectron microscopic study. // J Gen. Virol., 1994; 75:. 1755-1760.

52. Kato N., Ikeda M., et al. Hepatitis С virus population dynamics in human hepatocytes infcted in vitro. //J Gen Virol. 1998; 79 (Pt 8): 1859 — 1869.

53. Kato N., Lan К. H., Ono-Nita S. К Shiratori Y, Omata, M. Hepatitis С virus nonstructural region 5A protein is a potent transcriptional activator. // J. Virol, 1997; 71: 8856-8859.

54. Kato N., Lan K.H., Ono-Nita S. K, et al Hepatitis С virus nonstructural region 5A protein is a potent transcriptional activator. // J. Virol, 1997; 71: 8856-8859.

55. Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S. K, et al Activation of intracellular signaling by hepatitis В and С viruses: C-viral Core is the most potent signal inducer. // Hepatology 2000;32: 405 412.

56. Kim D. W., Gwak Y, Han J. H., Choe J. С terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protein contains an RNA helicase activity. // Biochem.Biophys.Res Commun., 1995; 215: 160-166.

57. Kolykhalov A. A., Feinstone S. M., Rice C.M. Identification of a highly conseved sequence element at the 3' terminus of hepatitis С virus genome RNA. // J. Virol 1996; 70:3363- 3371.

58. Komminoth P., Adams V, Long A., et al Evaluation of methods for hepatitis С virus detection in archival liver biopsies. //Path Res Pract. 1994; 190: 1017—1025.

59. Komoda Y., Hijikata M., Sato S., et al. Substrate requirements of hepatitis С virus serine proteinase for intermolecular polypeptide cleavage in Escherichia coli. // J. Virol. 1994; 68: 7351-7357.

60. Krawczinski K., Beach M.J., Bradley D.W., et al. Hepatitis С virus antigen in hepatocytes: immunomorphologic detection and identification. //Gastroenterology 1992; 103: 622 — 629.

61. Lapis K, Shaff Z Acute viral hepatitis. // Electron Microsc.Hum. Med.: The Liver, 1979; 8:124 136.

62. Leary K., Brair C. Segmental events in morphogenesis of Japanese encephalitis virus. // J.Ultrastruct.Res. 1980; 72: 123 129.

63. Lin C., Lindenbach B. D., Pragai В. M., et al. Processing in the hepatitis С virus E2/NS2 region: identification of p7 and two distinct E2-specific products with different C-termini. // J. Virol. 1994; 68:5063 5073.

64. Lin C., Pragai В. M., et al. Hepatitis С virus NS3 serine proteinase: trans cleavage requirements and processing kinetics. // J. Virol. 1994; 68:8147 — 8157.

65. Lin C., Wu J.W., Hsiao K., Su M.S. The hepatitis С virus NS4A protein: interactions with the NS4B and NS5A proteins. // J. Virol. 1997; 71:6465 -6471.

66. Lo S. Y., Masiarz F., Hwang S. В., Lai M. M., and Ou J. H. Differential subcellular localization of hepatitis С virus core gene products. // Virology, 1995; 213: 455-461.

67. Lo S. Y., Selby M., Tong M., and Ou J. H. Comparative studies of the core gene products of two different hepatitis С virus isolates: two alternative forms determined by a single amino acid substitution. // Virology, 1994;199: 124-13.1

68. Lo S. Y., SelbyM. J., and Ou J. H. Interaction between hepatitis С virus core protein and El envelope protein. II J.Virol., 1996; 70: 5177-5182.

69. Lohmann V, Korner F., Herian U., Bartenschlager, R. Biochemical properties of hepatitis С virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase andidentification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity. // J.Virol, 1997; 71: 8416-8428.

70. Long A., Komminoth P. In situ PCR. //Gosden J. (Ed) PRINS and PCR protocols. Methods in molecular biology. Humana Press, Totowa 1997: 141 — 161.

71. Lotz G., Szalay F., Firneisz G., et al. Localization of hepatitis С virus RNA of human erythrocytes by RT in situ PCR technique. // Scand.J. Gastroenterol. 2002; 37 (5): 578-584.

72. Major M.E., Rehermann В., Feinstone S. Hepatitis С viruses. // Virology, Ed. B.N. Fields, fourth ed.,ch.34, p. 1128, "Lippincott-Raven Publishers ",2000.

73. Matsumoto M., Hwang S. В., Jeng K. S., Zhu N., and Lai M. M. Homotipic interaction and multimerization of hepatitis С virus core protein. // Virololgy, 1996; 218: 43-51.

74. Michalak J. P., Dubuisson, J., Rice, С. M. Characterization of truncated forms of hepatitis С virus glycoproteins. // J.Gen.Virol., 1997; 78: 22992306

75. Mizushima, H., Hijikata, M., Asabe, S., et al. Two hepatitis С virus glycoprotein E2 products with different С termini. // J Virol., 1994; 68: 62156222.

76. Muller H.M., PfajfE., Goeser T. et al. Peripheral blood leukocytes as a possible extrahepatic site for hepatitis С replication. // J. Gen. Virol., 1993; 74: 669-676.

77. Neddermann P., Clementi A., De F.R. Hyperphosphorylation of the hepatitis С virus NS5A protein requires an active NS3 protease NS4A, NS4B, and NS5A encoded of the same polyprotein. // J. Virol. 1999;73:9984-9991.

78. Nouri-Aria К. Т., Sallie R., Sangar D., et al. Detection of genomic and intermediate replicative strands of hepatitis С virus RNA in liver tissue by in situ hybridization. IIJ Clin Invest. 1993; 91: 2226 — 2234.

79. Nuovo G. PCR in situ hybridization. // NY, Raven Press, 1992.

80. Nuovo G. Preparation of samples for polymerase chain reaction in situ. H Scan Microsc Suppl. 1996; 10: 49 — 55.

81. Nuovo G., Forde A. An improved system for reverse transcriptase in situ PCR. // J. Histotech. 1995; 18 : 295 299.

82. Nuovo G., Gallery F., McConnell P. Analysis of non-specific DNA synthesis during in situ PCR. // PCR Method Applic. 1994; 4: 342 349.

83. Nuovo G., Gallery F., McConnell P., Becker J., Bloch W. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification. // Am J Pathol. 1991; 139: 1239—1244.

84. Nuovo G., Gallery F., McConnell P.,Horn R.„ J., Bloch W. Importance of different variables for enchansing in situ detection of PCR-amplified DNA. // PCR Methods Appl. 1993; 2: 305 — 312.

85. Nuovo G., Gorgone G., McConnell P., Margiotta M.,Gorevic P. In situ localization of PCR-amplified human and viral cDNAs. //PCR Methods Appl. 1992; 2: 117 — 123.

86. Nuovo G., Hohman R., Nardone G., Nazarenko I. In situ amplification using universal energy transfer-labelled primers. // J Histochem Cytochem. 1999; 47: 273 — 280.

87. Nuovo G., Lidonnici K., McConnell P., Lane B. Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis С cDNA. // Am J Surg Pathol. 1993; 17: 683 — 690.

88. Nuovo G., McConnell P., et al. Correlation of the in situ detection of polymerase chain reaction-amplified metalloproteinase complimentary DNAs and their inhibitors with prognosis in cervical carcinoma. // Cancer Res. 1995; Jan. 15; 55 (2): 267-275.

89. Nuovo G., McConnell P., Forde A., Delvenne P. Detection of human papilloma virus DNA in formalin-fixed tissues by in situ hybridization after amplification by polymerase chain reaction. //Am J Pathol. 1991; 139: 847 — 854.

90. Oh J. W., Ito Т., Lai M.M. A recombinant hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase capable of copying the full-length viral RNA. // J.Virol. 1999; 73:7694-7702.

91. Ohishi M., Sakisaka S., Harada M., et a/.Detection of hepatitis С virus and hepatitis С virus replication in hepatocellular carcinoma by in situ hybridization. // Scand.J. Gastroenterol. 1999;4: 432-438.

92. Pfeifer U., Thomssen R., et al. Experimental non-A, non-B hepatitis: four types of cytoplasmic alteration in hepatocytes of infected shimpanzees. // Virchows Arch. В Cell Pathol. 1980; 33: 233 243.

93. Prince, A. M., Huima-Byron, Т., Parker, T. S., and Levine, D. M. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins. //J.ViralHepat., 1996; 3: 11-17.

94. Ralston R., Thudium K., Berger K., et al. Characterization of hepatitis С virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccina viruses. И J. Virol., 1993; 67: 6753 6761.

95. Ray R., Lagging L. M., Meyer K., Steele R., Ray R. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis С virus core protein. // Virus Res., 1995; 37: 209-220.

96. Ray R., Meyer K., Steele R., Ray R. Transcriptional repression of p53 promotor by hepatitis С virus core protein. //J. Biol. Chem., 1997; 272: 1098310986.

97. Ray R.B., Lagging L. M., Meyer K., Ray R. Hepatitis С virus core protein cooperates with ras and transforms primary rat embryo fibroblasts to tumorigenic phenotype. //J. Virol, 1996; 70: 4438-4443.

98. Reed К. E., Gracoui A., Rice C.M. Hepatitis С virus-encoded NS2-3 proteinase: cleavage-site mutagenesis and requirements for bimolecular cleavage. II J. Virol 1995; 69:4127-4136.

99. Reynolds J.E., Kaminski A., Carrol A.R., et al. Internal initiation of translation of hepatitis С virus RNA: the ribosome entry site is at the authentic initiation codon. // RNA, 1996; 2: 867 878.

100. Sansonno D., Cornacchiulo V., Iacobelli A.R., et al. Localization of hepatitis С virus antigens in liver and skin tissues of chronic hepatitis С virus-infected patients with mixed cryoglobulinemia. // Hepatology 1995; .21:305 — 312.

101. Sansonno D., Cornacchiulo V, Racanelli V, Dammacco F. In situ simultaneous detection of hepatitis С virus RNA and hepatitis С virus-related antigens in hepatocellular carcinoma. // Cancer, 1997; 80 (1): 22- 33.

102. Santolini E., Migliaccio G., and La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein. // J. Virol., 1994; 68: 3631-3641.

103. Santolini E., Pacini L., Fipaldini C., Migliaccio G., and Monica N. The NS2 protein of hepatitis С virus is a transmembrane polypeptide. IIJ. Virol., 1995; 69: 7461-7471.

104. ShaffZ., Lapis K. Fine structure of hepatocytes during the etiology of several common pathologies IIJ. Electron Microsc. Technol: 1990; 14: 179 207.

105. Shih C.M., Chen C.M., Chen S.Y., Wu Lee Y.H. Modulation of the transsupression activity of hepatitis С virus core protein by phosphorilation. // J. Virol. 1995; 69:1160-1171.

106. Shimizu Y.K., Feinstone S. M., Kohara M., et al. Hepatitis С virus: Detection of intracellular virus particles by electron microscopy. // Hepatology 1996;23: 205-209.

107. Shimizu Y.K., Feinstone S. M., Purcell R. L., et al. Non-A, non-B hepatitis: ultrastructural evidence of two agents in experimentally infected shimpanzees. // Science 1979; 205: 197- 200.

108. Smith D.B., Mellor J., Jarvis L.M., et al. Variation of the hepatitis С virus 5' non-coding region: implications for secondary structure, virus detection and typing. II J. Gen. Virol, 1995;76: 1749-1761.

109. Speel E. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. //Histochemistry and Cell Biology 1999; 112: 89 — 113.

110. Su Y.H., Lu S.L., Gu Y.H., Zhu T.F., Zhu S.N. In situ RT-PCR detection of hepatitis С virus genotypes in Chinese patients with hepatocellular carcinoma. II J. Exp. Clin. Cancer Res. 2002; Dec. 21 (4): 591 598.

111. Suzich J.A., Tamura J.K., Palmer-Hill F., et al. Hepatitis С virus NS3 protein polynucleotide-stimulated nucleoside triphosphatase and comparison with the related pestivirus and flavivirus enzymes. // J.Virol, 1993; 67: 6152—6158.

112. Tai C.L., Chi W.K., Chen D.S., and Hwan, L.H. The helicase activity associated with hepatitis С virus nonstructural protein 3 (NS3). // J.Virol., 1996; 70:8477-8484.

113. Tanaka Т., Kato N., Cho M.J., et al Structure of the З'-terminus of hepatitis С virus genome. II J.Virol. 1996; 70:3307- 3312.

114. Tanaka Y., Enomoto N., Kojima S., et al Detection of hepatitis С virus RNA in the liver by in situ hybridization. // Liver 1993; 13: 203 — 208.

115. Tanji Y., Kaneco Т., Satoh S., Shimotohno К Phosphorilation of hepatitis С virus-encoded nonstructural protein NS5A. // J. Virol 1995; 69:39803986.

116. Tomei L., Failla C., Santolini E., De Francesco R., and La Monica N. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С virus polyprotein. IIJ. Virol, 1993; 67: 4017-4026.

117. Tsiquae K.N., Bird R. J., et al. Further evidence of cellular changes associated with non-A, non-B hepatitis. IIJ. Med. Virol. 1980; 5: 63 71.

118. Vizmanos J.L., Gonzalez-Navarro C.J., Novo F.J. et al. Degree and distribution of variability in the 5'untranslated, El, E2/NS1 and NS5 regions of the hepatitis С virus (HCV). IIJ. Viral. Hepat., 1998; 5: 227-240.

119. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. Translation of human hepatitis С virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism. II J. Virol. 1993; 67: 3338-3344.

120. Westaway E.G. Flaviviruses replication strategy. // Adv. Vir. Res. 1987; 33: 45 90.125. http://www. ibmc. msk. ru/hepatitis/default. htm

121. Yamada K., Mori A., Seki M., et al. Critical point mutations for the hepatitis С virus NS3 proteinase. // Virology, 1998; 246: 104-112.

122. Zignego A.L., Macchia D., Monti M. et al. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C. J. //Hepatol., 1992; 15: 382-386.

123. Алътштейн А. Д. Вирусный канцерогенез и роль вирусов в возникновении опухолей человека. //Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, гл. 5, с.251.

124. Блюгер А. Ф., Зальцмане В. К, Картагиова О. Я. Ультраструктурная патология печени. Электронно-микроскопический атлас. II Рига: Зинатне, 1989; с. 157.

125. Заридзе Д.Г. Введение. //Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, с.27.

126. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований. II Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, гл. 1, с.29.

127. Киселев Ф. Л. Роль вируса гепатита в развитии рака печени. // Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, гл. 5, с.297.

128. Клименко С.М. Структура вириона вирусов животных. //Общая и частная вирусология, под. ред. В. М. Жданова, С. Я. Гайдамович, М: Медицина, 1982, т.1, гл. 3, с.71.

129. Оленина Л.В., Соболев Б.Н. Тканевой тропизм вируса гепатита С. // с сайта http://www.ibmc.msk.ru.

130. Злокачественные образования в России и СНГ. //М., 2004.

131. Dominguez-Malagon Н. Hepatocellular carcinoma: an update. // Ultrastructural pathology, 2001; 25: 497-516.

132. Список работ, опубликованных по теме диссертации:

133. Северова А.А (Рязанцева А.А.), Маныкин А.А. Применение методов гибридизации in situ и обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции in situ для изучения инфекции, вызванной вирусом гепатита С. IIВопросы Вирусологии 2000, 6: 7 — 12.

134. А.А.Северова, А.А.Маныкин, Н.Б.Мацко, П.Г.Богуги Выявление геномной РНК вируса гепатита С в сыворотке больных гепатитом с методом ПЦР с использованием риболайзера. //Тезисы доклада 3-ей Всероссийской

135. Научно-Практической Конференции "Генодиагностика в современной медицине ", Москва, 2000г.

136. Северова А.А., Завалишина Л.Э., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Кучерова Т.Е. Обнаружение ВГС в образцах биоптатов печени больных гепатитом С с помощью метода RT-PCR in situ. //Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2003: т.7, №1, с. 83.

137. Рязанцева А.А., Завалишина Л.Э., Маныкин А.А., Франк Г.А., Петров А.Н., Кучерова Т.Е Детекция РНК ВГС при гепатоцеллюлярном раке с помощью метода RT-PCR in situ. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2004: т. 8, №1, с.87-88.

138. Хронический гепатит печени. Хорошо различимы Ф фиброз, МК - многоядерные клетки. ОН - очаговый некроз клеток и ЗД - зернистая дистрофия. У в. 200. Окраска гематоксилином-эозином.1. Рис. 10.

139. Хронический гепатит печени. Хорошо различимы Ф-фиброз, МК многоядерныеклетки и 5Д зернистая дистрофия.

140. Ув. 200. Окраска гематоксилином-эозином.1. Рис. 11.

141. Гепатоцеллюлярная карцинома. Хорошо различимы многоядерные клетки и клетки сочень крупными ядрами.

142. Ув. 400. Окраска гематоксилином-эозином.•I •ggapfflp a• •••л & •1.| 1Я1• g -V ■ 1: < ■" 9 m1. Щ/ Щ tto . dfe ' Г SS>. *1. C* • £4 ® A1. Щ Щ®9 ® » £1. Mill• №■ Ii: ЩрЩш «у' -W if Ч * wN1. Щ) ;< ГА»1. К сзК111. Рис. 12.