Детекция и мониторинг клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, кандидат наук Фидарова Залина Таймуразовна

• Фидарова Залина Таймуразовна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Фидарова Залина Таймуразовна

Введение

Актуальность темы

Цель работы

Задачи исследования:

Научная новизна

Практическая ценность

Публикации

Апробация и реализация работы

Объем и структура диссертации

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Патогенез апластической анемии

1.2. Клональные осложнения у больных апластической анемией

1.3 ПНГ-клон и синдромы костномозговой недостаточности

1.4 Прогностическое значение выявления ПНГ-клона у больных апластической анемией

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Клиническая характеристика больных

2.2 Дизайн исследования

2.3. Протокол иммуносупрессивной терапии

2.4.Оценка гемолиза

2.5. Определение ПНГ-клона методом высокочувствительной проточной цитометрии

2.6 Сравнение двух методов иммунофенотипической диагностики ПНГ-клона: стандартного и с использованием анти-СВ157

2.7 Статистический анализ данных

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Выявление ПНГ-клона у больных апластической анемией впервые выявленной, его динамика на фоне иммуносупрессивной терапии и значение для ответа на лечение

3.1.1. Выявление ПНГ-клона у первичных больных апластической анемией47

3.1.2 Ответ на иммуносупрессивную терапию у больных апластической анемией с наличием или отсутствием ПНГ-клона

3.1.3. Результаты мониторинга ПНГ-клона у больных апластической анемией в процессе иммуносупрессивной терапии

3.1.3.1. Динамическое изменение ПНГ-клона в процессе лечения

3.1.3.2 Проявления внутирисосудистого гемолиза у больных апластической анемией с ПНГ-клоном в процессе лечения

3.1.3.3 Оценка восстановления клеточности костного мозга в зависимости от наличия ПНГ-клона

3.2 Выявление ПНГ-клона у больных в ремиссии апластической анемии

3.3. Новые возможности диагностики ПНГ-клона

Глава 4. Заключение

Выводы

Список литературы

Приложения

Описание клинического случая

Описание клинического случая

Описание клинического случая

Список используемых сокращений

АА апластическая анемия

АТГ антитимоцитарный глобулин

АКН абсолютное количество нейтрофилов

АКР абсолютное количество ретикулоцитов

ВГН верхняя граница нормы

Г-КСФ гранулоцитарный колиниестимулирующий фактор

ГФИ гликозилфосфатидилинозитол

ДИ доверительный интервал

ИЛ интерлейкин

ИСТ иммуносупрессивная терапия

ИФНу интерферон гамма

КМ костный мозг

ЛДГ лактатдегидрогеназа

МДС миелодиспластическй синдром

МонАТ моноклональные антитела

НАА нетяжелая апластическая анемия

ОВ общая выживаемость

ОШ отношение шансов

ПНГ пароксизмальная ночная гемоглобинурия

ПР полная ремиссия

СТАА сверхтяжелая апластическая анемия

СКК стволовая кроветворная клетка

ТАА тяжелая апластическая анемия

ТКМ трансплантация костного мозга

ТРФр трансформирующий ростовой фактор в

ФНОа фактор некроза опухоли а

ЦсА циклослоприн А

ЧР частичная ремиссия

CD кластеры дифференцировки

HLA человеческие лейкоцитарные антигены

PIG-A фосфатидилинозитолфосфат A

Th Т-хелперы

Tгeg Т-регуляторные клетки

NK натуральные киллеры

FSC прямое рассеяние света

SSC боковое рассеяние света

Введение

Апластическая анемия - заболевание системы крови, характеризующееся панцитопенией, обусловленной аплазией костного мозга, связанной с нарушением иммунных механизмов регуляции кроветворения, количественным дефицитом и функциональными дефектами стволовых кроветворных клеток [5][3].

Успех иммуносупрессивной терапии больных апластической анемией связан с воздействием на патогенетические звенья процесса угнетения функции костного мозга, которое происходит вследствие аутоиммунной атаки на клетки-предшественницы кроветворения [41]. Частота ответа на комбинированную иммуносупрессивную терапию составляет по данным разных авторов от 78 до 90%[7]. Однако приблизительно у 30% больных в дальнейшем развивается рецидив заболевания [64][42].

Современные протоколы лечения апластической анемии, включающие программную иммуносупрессивную терапию в сочетании или без проведения трансплантации костного мозга от ИЬЛ-совместимого донора существенно повысили вероятность длительной общей выживаемости больных. Анализ эффективности комбинированной иммуносупрессивной терапии

демонстрирует сопоставимые результаты в достижении ремиссии между комбинированной иммуносупрессивной терапией и трансплантацией костного мозга[17][24][27]. Но при этом наблюдается развитие поздних событий и рецидивов у больных, которым трансплантация костного мозга не была включена в программу лечения[27].

К поздним клональным осложнениям после достижения ответа на иммуносупрессивную терапию принято относить развитие миелодиспластического синдрома, острого миелоидного лейкоза или пароксизмальной ночной гемоглобинурии. По данным различных

исследователей, вероятность развития подобных клональных осложнений колеблется от 1,7 до 32% [30][11]. Однако высокая частота развития миелодиспластического синдрома, острого миелоидного лейкоза или пароксизмальной ночной гемоглобинурии может быть обусловлена недостаточной диагностикой на первых этапах течения заболевания. Так, например, необходимо проведение анализа морфологических особенностей и признаков дисмиелопоэза, выполнение FISH-исследования с зондами, наиболее характерными для миелодиспластического синдрома, несмотря на отсутствие цитогенетических аберраций при стандартном цитогенетическом исследовании [2][9], а так же применение для определения клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии иммунофенотипического исследование у всех больных с рефрактерными цитопениями [28][53].

Современная диагностика пароксизмальной ночной гемоглобинурии позволяет с высокой чувствительностью определить наличие клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией уже в начале заболевания, даже у пациентов со сверхтяжелой формой. С помощью проточной цитометрии с применением протоколов, включающих меченный флюоресцентный аэролизин, стало возможным выявление ПНГ-клона размером от 0,01%[21].

Однако, выявление клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии не равнозначно диагнозу пароксизмальной ночной гемоглобинурии [4]. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия - клональное заболевание стволовых кроветворных клеток, характеризующееся клинической триадой -внутрисосудистым гемолизом, склонностью к тромбообразованию и костномозговой недостаточностью [49]. Пароксизмальная ночная

гемоглобинурия развивается у больных АА по данным различных авторов от 9 до 15% случаев [52][61]. Клон пароксизмальной ночной гемоглобинурии - это развивающийся в результате мутации в РЮ-Л гене клон стволовой

кроветворной клетки, в которой нарушается синтез гликозилфосфатидилинозитола - гликолипида, с помощью которого к мембранам клеток крови крепятся белки, защищающие их от воздействия терминальных компонентов системы комплемента - белки гликозилфосфатидилинозитолового комплекса[74].

У 24,7 - 78,3% больных апластической анемией на момент диагностики может быть выявлен клон пароксизмальной ночной гемоглобинурии[63][61], что по данным разных исследователей может стать прогностически благоприятным признаком для ответа на иммуносупрессивную терапию [62]. В настоящее время остается без ответа вопрос, почему же у больных с синдромами костномозговой недостаточности выявляется клон пароксизмальной ночной гемоглобинурии. В 1989г Rotoli B. и Luzzatto Ь. была предложена гипотеза «двойного удара» [58]. По данной гипотезе мишенью иммунной атаки при апластической анемии и других синдромах, характеризующихся костномозговой недостаточностью, являются белки гликозилфосфатидилинозитолового -комплекса на поверхности стволовых клеток крови. Дефицит данных белков на поверхности клональных стволовых кроветворных клеток с мутациями в РЮ-Л гене, делает их нечувствительными к иммунной атаке. Таким образом, не имея никакого пролиферативного преимущества происходит экспансия клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии в результате резистентности к повреждающему фактору.

В пользу данной теории так же говорит отсутствие ПНГ-клона у больных с конституциональными апластическими анемиями, в основе которых лежит не иммуноопосредованная, а генетическая предрасположенность к развитию костномозговой недостаточности [26].

Рассмотрение некоторых факторов указывающих на иммунную этиологию развития апластической анемии, таких как повышение количества активированных Т-лимфоцитов, повышенная экспрессия Т-лимфоцитами

интерферона - у в костном мозге и периферической крови и т.д., не оказалось значимым для оценки ответа на иммуносупрессивную терапию[78]. Клон пароксизмальной ночной гемоглобинурии, являясь косвенным маркером иммунного патогенеза развития апластической анемии, может рассматриваться как фактор положительного ответа на иммуносупрессивную терапию [70].

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Детекция и мониторинг клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией»

Актуальность темы

Как известно, течение апластической анемии - одного из наиболее тяжелых заболеваний системы крови, может осложниться развитием клональных заболеваний[69]. У 9-15% больных апластической анемией развивается клинически значимая пароксизмальная ночная гемоглобинурия.

С внедрением в практическую медицину метода проточной цитофлюориметрии, позволяющего определить дефицит белков гликозилфосфатидилинозитолового комплекса на мембранах эритроцитов и лейкоцитов, значительно повысилась возможность раннего выявления клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией[73]. Как при апластической анемии, так и при классической гемолитической пароксизмальной ночной гемоглобинурии с помощью проточной цитофлюориметрии можно определить размер аномального клона и его динамику на протяжении заболевания. Наличие минорного клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией может оказаться благоприятным прогностическим критерием ответа на иммуносупрессивную терапию.

В то же время получены данные, что наличие клон пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией не является фактором риска развития клинически значимой пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Исследование наличия клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии и его мониторинг на фоне лечения позволит определить характер очередного этапа иммуносупрессивной терапии и проследить особенности течения заболевания.

Цель работы

Определить наличие и динамику ПНГ-клона у больных апластической анемией на различных этапах течения болезни в процессе иммуносупрессивной терапии и его значение для достижения ответа на лечение.

Задачи исследования:

1. Определить наличие ПНГ-клона у больных впервые выявленной апластической анемией и дать характеристику его размерам и частоте выявления у больных тяжелой и нетяжелой апластической анемией.

2. Провести мониторинг ПНГ-клона у больных апластической анемией в процессе иммуносупрессивной терапии и после ее окончания.

3. Определить прогностическое значение ПНГ-клона для ответа на иммуносупрессивную терапию у больных апластической анемией.

4. Установить наличие ПНГ-клона у больных в длительной ремиссии апластической анемии и охарактеризовать полноту достижения положительного ответа на лечение (частичная и полная ремиссия).

5. Оценить частоту развития клинически значимой пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией с ПНГ-клоном.

6. Провести сравнительный анализ двух методов выявления ПНГ-клона: стандартный метод и с использованием моноклональных антител к CD157

Научная новизна

У больных апластической анемией впервые определена динамика ПНГ-клона на различных стадиях течения болезни в процессе иммуносупрессивной терапии в определенном алгоритме исследования (через каждые 3 месяца от начала лечения). Показана зависимость развития синдрома и гемолитической формы пароксизмальной ночной гемоглобинурии у больных апластической анемией от размера клона пароксизмальной ночной гемоглобинурии на момент первичного исследования.

Показана возможность получения положительного эффекта у больных апластической анемией с ПНГ-клоном даже после минимального объема проведенной терапии. В процессе динамического наблюдения за размером ПНГ-клона на фоне иммуносупрессивной терапии и развития ответа на лечение у больных с размером ПНГ-клона менее 10% не отмечено нарастания его размера, превышающего данное значение и клинически значимого гемолитического процесса.

Проведенный сравнительный анализ двух методов диагностики ПНГ-клона

- стандартного и метода, с применением моноклональных антител анти-CD157

- показал высокую сопоставимость результатов, наряду со снижением затрат при использовании метода с применением моноклональных антител анти-CD157.

Практическая ценность

Показана необходимость мониторирования больных апластической анемией для выявления ПНГ-клона и его динамического наблюдения. Определена оптимальная тактика иммуносупрессивной терапии в зависимости от наличия ПНГ-клона и его влияние на течение заболевания. Внедрен международный метод определения ПНГ-клона в рутинную практику ФГБУ

ГНЦ МЗ РФ. Предложен и апробирован новый метод диагностики ПНГ-клона с использованием для гранулоцитов и моноцитов одного ГФИ-связанного антитела СЭ157, что значительно уменьшает время выполнения исследования и расход антител, в отличие от стандартной методики с использованием 2 пробирок и 4-цветной комбинации.

Анализ полученных данных позволяет рекомендовать метод с антителами анти-CD157 для выявления и мониторинга минорного ПНГ-клона (менее 1%) у больных апластической анемией.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ и 10 тезисных сообщений (из них 7 на английском языке и 3 на русском языке)

Апробация и реализация работы

Основные положения диссертации представлены в материалах и докладах:

• XXXIX симпозиум Европейской группы по трансплантации костного мозга (Лондон,2013г.);

• I Конгресс гематологов России (Москва, 2012г.);

• II Конгресс гематологов России (Москва, 2014г.);

• Международная гематологическая школа «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2014).

• ХХ научно-практической юбилейная конференция Достижения и перспективы развития лабораторной службы России (Москва, 2015)

• XX конгресс Европейской гематологической ассоциации (Вена,2015)

• III Конгресс гематологов России (Москва, 2016г.)

Получен международный лабораторный сертификат на проведение диагностики ПНГ-клона стандартным методом иммунофенотипирования.

Объем и структура диссертации

Диссертация построена по традиционному плану, изложена на 92 страницах и состоит из введения, четырех глав, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, а также 3 приложений. Иллюстративный материал представлен в виде 17 рисунков и 16 таблиц.

Глава 1. Обзор литературы

Апластическая анемия (АА) - заболевание системы крови, характеризующееся панцитопенией, обусловленной аплазией костного мозга, связанной с нарушением иммунных механизмов регуляции, количественным дефицитом и функциональными дефектами стволовых кроветворных клеток (СКК)[3][5]

В отечественной литературе апластическая анемия подробно описана в 1928 году профессором военно-медицинской академии Аринкиным М.И. под названием «апластической перницинозной анемии» или «алейкии Франка». Приведены первые классификации заболевания, основанные на гистологической картине костного мозга. Описана яркая клиническая картина болезни и крайне неблагоприятный прогноз заболевания, за исключением случаев «алейкии после отравления бензолом», закончившихся выздоровлением [1].

Одним из первых клинический случай апластической анемии описал в 1888г. Пауль Эрлих. При аутопсии беременной женщины, погибшей в результате тяжелой анемии и нейтропении, был обнаружен жировой костный мозг при отсутствии кроветворного [1]. Термин апластической анемии впоследствии был введен французским исследователем Shauphard Р. в 1904 г. Несмотря на то, что тяжесть заболевания определяет панцитопения, а именно нейтропения и тромбоцитопения, данное обозначение укоренилось в медицинской среде. Последующие 40 лет состояния, характеризующиеся панцитопенией, расценивали как апластическую анемию при отсутствии возможности гистологического исследования костного мозга. И только во 2й половине ХХ века ситуация изменилась, когда стала возможным прижизненная биопсия костного мозга с гистологическим исследованием.

В настоящее время значительные успехи в лечении больных апластической анемией были достигнуты благодаря изучению патогенеза апластической анемии, выявлению ряда нарушений иммунной системы, приводящих к иммунной деструкции гемопоэза, проявляющейся аплазией костного мозга[39]. Так же стали накапливаться данные о поздних клональных осложнениях как злокачественной (МДС, ОМЛ) природы, так и незлокачественных процессов (ПНГ). Благодаря современным методам диагностики, выявление аномальных клонов СКК стало возможным на этапах установки диагноза апластической анемии[36]. Изучение механизмов развития и персистенции патологического клона у больных апластической анемией в настоящее время является актуальной задачей современной гематологии.

1.1. Патогенез апластической анемии

Несмотря на разнообразие этиологических факторов, влияние которых доказательно приводит к развитию аплазии костного мозга (химические и инфекционные агенты, радиация, беременность, ассоциация с гепатитами А, В, С), в большинстве случаев триггерный фактор развития приобретенной апластической анемии остается неизвестным, в связи с чем диагностируется идиопатическая апластическая анемия[45]. При этом патогенетические механизмы развития приобретенной АА носят иммуноопосредованный характер вне зависимости от этиологического фактора, что подтверждается ответом на иммуносупрессивную терапию [80]. Данная гипотеза находит подтверждение в различных лабораторных исследованиях, как например, угнетение нормального гемопоэза in vitro лимфоцитами костного мозга больного апластической анемией или наличие специфических CD4+ клеток в присутствии олигоклональных CD8+ лимфоцитов [55].

Нарушение регуляции CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, CD4+ Т-лимфоцитов, включая Т-хелперы 1 типа (Th1), Th2, регуляторные Т-лимфоциты и Th17, NK - клетки и NK-T-клетки, наряду с аномальной продукцией цитокинов, таких как интерферон (ИНФ)-у, фактор некроза опухоли(ФНО)-а, трансформирующий фактор роста (ТФР)- в, активируют апоптоз стволовых клеток крови лежащий в основе приобретенной апластической анемии. Изменения полиморфизма генов ИНФ-у, ФНО-а, ТФР-в, так же как и аллелей главного комплекса гистосовместимости (HLA) могут определять иммуно-опосредованную гибель клеток-предшественниц кроветворения и неэффективность гемопоэза. Последние публикации предоставляют молекулярные и генетические доказательства того, что первичный и вторичный дефицит клеток-предшественниц кроветворения и мезенхимальных стволовых клеток также лежит в основе развития недостаточности костного мозга[82].

В результате изучения факторов иммуногенетической предрасположенности к развитию апластической анемии в качестве значимых выделены система главного комплекса гистосовместимости (HLA) и полиморфизм генов цитокинов [48]. В нескольких исследованиях показана связь между полиморфизмом нуклеотидных последовательностей генных фрагментов определенных молекул HLA с развитием приобретенной апластической анемии[72]. Несмотря на то, что исследования в данном направлении ограничиваются небольшим объемом выборки из-за редкости заболевания, различиями полиморфизма генов в этнических популяциях и возрастными различиями, на основании существующих данных удалось выделить потенциальное влияние полиморфизма HLA генов на развитие приобретенной апластической анемии. Zeng Y. c соавт. суммировали данные наиболее часто встречающихся HLA аллелей, ассоциирующихся или не имеющих корреляции с развитием апластической анемии, и являющихся предикторами ответа на иммуносупрессивную терапию [84]. Противоречивы на сегодняшний день и

данные о хорошем прогностическом ответе на иммуносупрессивную терапию при сочетании HLA-DRB 1*1501 и ПНГ-клона[47][72].

В своем исследовании Nakao с соавт. показали, что сочетание аллелей главного комплекса гистосовместимости человека могут играть роль в активации аутореактивных Т-клонов у больных апластической анемией. Более того, защитные эффекты HLA молекул недостаточны вследствие снижения генерации Т-регуляторных клеток, подавляющих аутоиммунитет[48].

Полногеномный транскрипционный анализ Т-клеток больных апластической анемией выявил большое количество аномальных генов в CD4+ и CD8+ Т-клетках[83]. В сочетании с аномальной экспансией Th1, Th2 и Th17, снижение или изменение иммунофенотипа и функции Treg является определяющей характеристикой тяжести приобретенной апластической анемии [54].

De Latour R.P. и соавт., изучая патофизиологию апластической анемии, пришли к выводу, что Th17 иммунный ответ имеет важное значение в развитие апластической анемии[37]. Интерлейкин (ИЛ)-17А, продуцируемый Th17, играя значимую роль в развитии воспалительной реакции тканей, индуцирует так же Г-КСФ, ГМ-КСФ и молекулы адгезии, приводящие к усилению гранулоцитопоэза. Однако снижение в плазме ИЛ-17А не наблюдается у больных НАА, в то время как у больных ТАА он даже не определяется. Таким образом, поляризация ответа через Th1/Th17 соотносится с развитием костномозговой недостаточности, что с одновременным снижением Treg приводит к увеличению активности аутореактивных Т-клеток и развитию клиники апластической анемии [31].

Рис. 1. Патогенез развития приобретенной апластической анемии У., 2015)

Аберрантная иммунная регуляция гемопоэза приводит к деструкции клеток-предшественниц кроветворения. Однако аномальную активацию Т-клеточного иммунитета может вызвать аномальная экспрессия антигенов на поверхности стволовых клеток крови. Дефицит клеток-предшественниц и обеднение костномозговой ниши способствует развитию аплазии костного мозга (рисунок 1).

1.2. Клональные осложнения у больных апластической анемией

Клональная эволюция является наиболее тяжелым исходом апластической анемии. К поздним клональным осложнениям апластической анемии относят миелодиспластический синдром, острый миелоидный лейкоз и

пароксизмальную ночную гемоглобинурию. Развитие злокачественных осложнений (ОМЛ, МДС) по данным различных исследований составляет 1,7-21%[11][16]. Среди статистических причин развития данных осложнений рассматривается, как недостаточная первоначальная диагностика апластической анемии, когда дифференциальный диагноз с миелодиспластическими синдромами из группы низкого риска в дебюте заболевания представляется достаточно трудным, так и приобретение мутации в результате пролиферативного стресса в сочетании как с укорочением теломерных участков ДНК, так и без таковых изменений[59]. В случае отсутствия полной ремиссии апластической анемии после иммуносупрессивной терапии происходит повышение пролиферативной активности оставшихся стволовых клеток крови в результате сужения плацдарма кроветворения[60][76][18]. Это в совокупности с укорочением теломерных участков ДНК, повышается риск развития анеуплоидии[20][16].

УовЫ7а1:о Т. с соавт, выполнив полное геномное секвенирование больным апластической анемией в дебюте заболевания, выявили характерные для развития миелодиспластического синдрома мутации. Однако, при динамическом наблюдении за больными, прогрессия в МДС наблюдалась только у больных, у которых наличие мутаций сочеталось с моносомией соответствующих хромосом [79]. Развитие моносомного кариотипа так же наблюдалось чаще у больных апластической анемией, которым в программу лечения была включена длительная терапия Г-КСФ[75].

В отличие от миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза, пароксизмальная ночная гемоглобинурия не проявляет признаков злокачественности и имеет другую биологию развития. В настоящее время все больше работ направлено на изучение сочетания лейкемического клонального кроветворения и клона ПНГ[46]. Однако приобретение пролиферативного преимущества для клональной экспансии ПНГ-клона может происходить ввиду

наличия добавочной соматической мутации или дополнительной мутации в РЮ-Л гене[65][46][34]. При этом мутация РЮ-Л может быть добавочной по отношению к соматической. Имеющиеся данные свидетельствуют об изолированном проявлении мутаций РЮ-Л гена, тогда как дополнительные мутации являются гетерозиготными [38] (рисунок 2).

Основная Приобретение Клональная

скк

Сомагическа мутация

экспансия и

мутация дополнительной

мутации прогрессия ПНГ

г—/ж—

Мутация "ШЩГ щЯ*

+ -

Размер ПНГ-клона

Прогрессия болезни

Злокачественная трансформация в ОМЛ/МДС

ДА

Рис.2. Клональная архитектура и эволюция ПНГ-клона (C-W.Lee and O.Abdel-Wahab 2015).

Противоречивые данные описаны о наличии и характере течения заболевания при выявлении цитогенетических аномалий одновременно с диагностикой ПНГ-клона[12][13]. Так, по данным опубликованного в 2001г исследования Ага1еп с соавт., цитогенетические аберрации выявлены у 11 больных АА с ПНГ-клоном и гемолитической формой ПНГ. Выявлены следующие аномалии кариотипа: трисомия 6 (п=3), трисомия/делеция 8 (п=2),

моносомия 7 (n=1), трисомия X(n=1) и другие [14]. Стоит отметить, что у данных больных выявлена низкая степень диспластических изменений в клетках костного мозга по сравнению с больными МДС, что оказалось статистически незначимо. При динамическом наблюдении произошло значительное уменьшение и исчезновение цитогенетического клона (3/11 и 4/11 соответственно), в то время, как значение ПНГ-клона оставалось без существенных изменений

Sloand E. с соавт. выявили цитогенетические абберации у 9 больных с ПНГ-клоном[68]. После предварительной сортировки клеток костного мозга на ГФИ-позитивные и ГФИ-негативные, аномалии кариотипа, кроме моносомии 7, в большем проценте случаев выявлены в ГФИ-позитивных клетках. Выявление в небольшом проценте цитогенетического клона в ГФИ- негативных клетках объясняется авторами как примесь при сортировке клеток.

Таким образом, течение апластической анемии может сопровождаться скрытыми нарушениями гемопоэза, риск проявления которых увеличивается в условиях пролиферативного стресса.

1.3 ПНГ-клон и синдромы костномозговой недостаточности

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) - клональное заболевание стволовой клетки крови, характеризующееся клинической триадой -внутрисосудистым гемолизом, склонностью к тромбообразованию и костномозговой недостаточностью [49] [10].

Одним из первых клинический случай развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии детально описал в 1882 г молодой немецкий врач Paul Strubing, в котором он так же предложил механизм развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии и возможный метод диагностики [50]. Paul Strubing предположил, что ПНГ-эритроциты разрушаются ночью вследствие

аномальной чувствительности к кислой среде, образующейся при накопления диоксида углерода и лактата, как результат снижения скорости кровотока у больных во время сна.

В1939г Thomas Hale Ham опубликовал оригинальное для того времени наблюдение, как ПНГ-эритроциты подвергают лизису в подкисленной сыворотке с помощью антитело-независимой системы, для которой требуются факторы неотличимые от системы комплемента[32]. Данное открытие легло в основу диагностического теста, провоцирующего лизис эритроцитов больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией посредством активации альтернативного пути комплемента в кислой среде под названием теста Хема. Тест Хема вместе с сахарозной пробой Хартмана до середины 1990х годов оставались основой диагностики ПНГ до внедрения принципов проточной цитометрии. В 1966 г Rosse and Dacie продемонстрировали чувтвительность к комплемент-опосредованному лизису не только эритроцитов, но и нейтрофилов и тромбоцитов [57]. Тогда же впервые была высказана теория о развитии ПНГ-дефекта на уровне предшественников кроветворения[56]. И уже в 1970г Luzzatto и соавт. посредством изотипического контроля глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы показали моноклональность чувствительной к комплементу популяции клеток, тогда как нечувствительные клетки были поликлональны[15]. Данное открытие клонального происхождения пароксизмальной ночной гемоглобинурии легло в основу гипотезы Dacie о наличии соматической мутации. В дальнейшем, наряду с открытием клеточной основы развития гемолиза (дефицит гликозилфосфатидилинозитол-связанных белков на поверхности ПНГ- клеток), была выявлена генетическая мутация в СКК, приводящая к нарушению синтеза ГФИ-якоря[51].

Таким образом, ПНГ-клон - это клон стволовой клетки крови с мутацией в PIG-A гене, в результате которой нарушается синтез гликозилфосфатидилинозитола (ГФИ) - гликолипида, с помощью которого к

мембранам клеток крепятся белки ГФИ -комплекса, защищающего мембраны клеток крови от воздействия терминальных компонентов системы комплемента.

Однако наличие ПНГ-клона не означает диагноз пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия как заболевание характеризуется не только наличием клона ПНГ, но и четкой клинической картиной.

В настоящее время продолжается поиск причинных связей между развитием и эволюцией ПНГ-клона у больных с костномозговой недостаточностью. Различные исследования свидетельствуют о наличии внутренних факторов эволюции ПНГ-клона[19]. Даже при рассмотрении гипотезы иммунной привилегированности, позволяющей ГФИ-дефицитному клону клеток избежать иммуноопосредованной атаки на костномозговое кроветворение, не получен ответ о причинах эволюционного течения ПНГ-клона с развитием гемолитической формы пароксизмальной ночной гемоглобинурии[34]. Так, увеличение размера ПНГ-клона продолжается у некоторых больных апластической анемией на фоне проведения иммуносупрессивной терапии и после достижения ремиссии, а у больных с гемолитической формой пароксизмальной ночной гемоглобинурии клиническая манифестация не всегда сочетается с клиническими проявлениями костномозговой недостаточности[44]. Более того, у здоровых людей могут определяться небольшие популяции РЮ-Л мутантных клеток, что говорит о наличии дополнительных внутренних факторов, способствующих экспансии ГФИ-дефектного клона[33].

В различных исследованиях было показано сочетание ПНГ-клона с редкими хромосомными аномалиями или наличием соматических мутаций ЫРЛ8 и ^К2[46][29]. Наибольший интерес представляют данные, полученные Shen W. с соавт., рассматривающих идею наличия внутреннего преимущества

роста у клона клеток пароксизмальной ночной гемоглобинурии[66]. После предварительного разделения гемопоэтических клеток-предшественниц на клетки с ПНГ-фенотипом и «нормальным» фенотипом, проведено полногеномное секвенирование ДНК, полученной из клеток костного мозга 12 больных ПНГ и секвенирование по методу Сенгера с подбором праймеров для 61 гена, мутации которых специфичны для злокачественных миелоидных заболеваний. Обнаружено большое количество мутаций совместно с мутациями РЮ-Л, ранее не ассоциировавшихся с пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Более того, данные дополнительные мутации возникают либо как суб-клон в пределах РЮ-Л мутантной клеточной популяции, или в качестве инициального генетического случая до приобретения мутации РЮ-Л. У 83% (10 из 12) больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией выявлены дополнительные соматические мутации, такие как ТЕТ2, МЛОЕС1, БЯРП, КВМ3Б, 8ТЛС3. Стоит отметить, что данные мутации выявлены во фракции ПНГ, а не в фенотипически нормальных клетках. Все дополнительные мутации геторозиготны без потери гетерозиготности в пострадавших локусах. Наличие дополнительной соматической мутации в ПНГ-клетках, по мнению авторов, наиболее вероятно является причиной внутреннего ростового преимущества для экспансии ПНГ-клона. Однако, наличие внутреннего преимущества не исключает значимости механизмов избегания иммунной атаки.

Анализ профиля экспрессии генов в ГФИ-позитивных (нормальных) CD34+ клетках костного мозга больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией показал повышение регуляции генов, участвующих в иммунном ответе, тогда как в ГФИ-негативных CD34+ паттерн экспрессии не отличался от здоровых доноров. Экспрессия генов, отвечающих за пролиферацию, не отличалась в популяциях CD34+ ГФИ-позитивных и ГФИ-негативных[40]. Наличие пролиферативного дефекта в ГФИ-позитивных (нормальных) CD34+, выделенных у больных пароксизмальной ночной

гемоглобинурией, показали в своих исследованиях Chen R. с соавт. и Maciejewski J.P. с соавт., что в дополнении к предыдущему исследованию свидетельствуют о внутриклеточных механизмов экспансии ПНГ-клона[25][40].

Таким образом, пароксизмальная ночная гемоглобинурия со сложной комплексной структурой генотипа является доброкачественным заболеванием с клональной архитектурой и эволюцией, свойственной злокачественным новообразованиям. Дальнейшие исследования, направленные на более детальное изучение случаев трансформации пароксизмальной ночной гемоглобинурии в ОМЛ/МДС, позволят расширить диапазон молекулярных маркеров и возможности прицельного терапевтического воздействия.

В настоящее время неоспорим факт необходимости мониторирования ПНГ-клона у больных с синдромами костномозговой недостаточности [81].

Внедрение принципов проточной цитометрии наряду с открытием патогенетических механизмов развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии (рисунок 3), стали основой ранней диагностики, основанной на выявлении дефицита ГФИ-связанных белков CD55 и CD59 на поверхности эритроцитов [77]. Но, учитывая нестабильность популяции ПНГ-эритроцитов, подвергающихся постоянному гемолизу, ограничена как надежность метода, так и возможность динамического наблюдения за течением заболевания. Включение в анализ лейкоцитарной популяции, не подвергающейся комплемент-опосредованному лизису, необходимо для более точной диагностики[73]. Однако, применение разных протоколов диагностики ПНГ-клона, основанных на выявлении дефицита различных ГФИ-связанных белков на поверхности гранулоцитов, не позволяет достоверно сравнивать полученные результаты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Фидарова Залина Таймуразовна, 2016 год

Список литературы

1. Аринкин М.И.Клиника болезней крови и кроветворных органов / под ред. Аринкин М.И. — Ленинград: Практическая медицина, 1928.- 90-99c.

2. Кохно А.В. Выявление скрытых аномалий кариотипа при миелодиспластическом синдроме. / Кохно А.В., Пименова М.А., Паровичникова Е.Н., Домрачева Е.В., Савченко В.Г. // Гематология и трансфузиология - 2014. - Т. 59 - № 1 - 25-28с.

3. Кулагин А.Д. Апластическая анемия / Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Козлов В.А. — Новосибирск: Наука, 2008.

4. Кулагин А.Д. Национальные рекомендации по диагностике и лечению пароксизмал / Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Птушкин В.В., Шилова Е.Р., Цветаева Н.В., Михайлова Е.А. // Онкогематология - 2014. - Т. 2 - 20-28с.

5. Михайлова Е.А. Апластическая анемия / под ред. Воробьев А.И. Москва: Ньюдиамед, 2002. - 797-805с.

6. Михайлова Е.А. Протокол программного лечения больных апластической анемией: комбинированная иммуносупрессивная терапия / под ред. В.Г.Савченко. Москва: Практика, 2012. - 135-150с.

7. Михайлова Е.А. Комбинированная иммуносупрессивная терапия больных апластической анемией: повторные курсы антитимоцитарного глобулина / Михайлова Е.А., Фидарова З.Т., Устинова Е.Н., Троицкая В.В., Гальцева И.В. и др. // Гематология и трансфузиология - 2014. - Т. 59 - № 4 - 11-18с.

8. Наумова Е.В. Стандартизация диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии с помощью проточной цитометрии / Наумова Е.В., Почтарь М.Е., Кисиличина Д.Г., Плеханова О.С., Сипол А.А. и др.// Клиническая и

лабораторная диагностика - 2013. - № 7 - 54-58с.

9. Ольшанская Ю.В. Клональные хромосомные перестройки у больных апластической анемией в начале заболевания и при трансформации. / Ольшанская Ю.В., Михайлова Е.А., Домрачева Е.В., Удовиченко А.И., Давидян Ю.Р., Водинская Л.А., Захарова А.В., Кохно А.В., Капланская И.Б., Тихонова Л.Ю., Цветаева Н.В., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. // Терапевтический архив - 2006. - Т. 78 - № 7 - 31-37с.

10. Цветаева Н.В. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия / под ред. Воробьев А.И. Москва: Ньюдиамед, 2007 - 797-805с.

11. Afable M.G. Clonal evolution in aplastic anemia. / M. G. Afable, R. V Tiu, J. P. Maciejewski // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program - 2011. - Т. 2011 -90-5 с.

12. Araten D.J. Dynamics of hematopoiesis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH): no evidence for intrinsic growth advantage of PNH clones. / D. J. Araten, M. Bessler, S. McKenzie, H. Castro-Malaspina, B. H. Childs, F. Boulad, a Karadimitris, R. Notaro, L. Luzzatto // Leukemia - 2002. - Т. 16 - № 11 - 2243-8с.

13. Araten D.J. Clonal populations of hematopoietic cells with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria genotype and phenotype are present in normal individuals / D. J. Araten, K. Nafa, K. Pakdeesuwan, L. Luzzatto // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999. - Т. 96 - № 9 - 5209-5214с.

14. Araten D.J. Cytogenetic and morphological abnormalities in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria / D. J. Araten, D. Swirsky, A. Karadimitris, R. Notaro, K. Nafa, M. Bessler, H. T. Thaler, H. Castro-Malaspina, B. H. Childs, F. Boulad, M. Weiss, N. Anagnostopoulos, A. Kutlar, D. G. Savage, R. T. Maziarz, S. Jhanwar, L. Luzzatto // Br. J. Haematol. - 2001. - Т. 115 - № 2 - 360-368с.

15. B. Oni, B. O. Osunkoya L.L. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: Evidence for Monoclonal Origin of Abnormal Red Cells / B. Oni, B. O. Osunkoya // Blood -1970. - T. 36 - № 2 - 509-524c.

16. Babushok D. V Emergence of clonal hematopoiesis in the majority of patients with acquired aplastic anemia. / D. V Babushok, N. Perdigones, J. C. Perin, T. S. Olson, W. Ye, J. J. Roth, C. Lind, C. Cattier, Y. Li, H. Hartung, M. E. Paessler, D. M. Frank, H. M. Xie, S. Cross, J. D. Cockroft, G. M. Podsakoff, D. Monos, J. A. Biegel, P. J. Mason, M. Bessler // Cancer Genet. - 2015. - T. 208 - № 4 - 115-28c.

17. Bacigalupo A. Treatment strategies for patients with severe aplastic anemia. / A. Bacigalupo // Bone Marrow Transplant. - 2008. - T. 42 Suppl 1 - № SUPPL.1 -S42-S44c.

18. Ball S.E. Progressive telomere shortening in aplastic anemia / S. E. Ball, F. M. Gibson, S. Rizzo, J. A. Tooze, J. C. W. Marsh, E. C. Gordon-Smith // Blood - 1998. - T. 91 - № 10 - 3582-3592c.

19. Bessler M. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene / M. Bessler, P. J. Mason, P. Hillmen, T. Miyata, N. Yamada, J. Takeda, L. Luzzatto, T. Kinoshita // EMBO J. - 1994. - T. 13 - № 1 -110-117c.

20. Borisov V. Measuring telomere length in proliferating cells by flow-fish method / K. V. Borisov V., Korolkova O., Blinova E., Baev D., Kozhevnikov V., Kozlov V.A. // J. Life Sci. - 2012. - T. 6 - № 8 - 945-951 c.

21. Borowitz M.J. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry / M. J. Borowitz, F. E. Craig, J. A. DiGiuseppe, A. J. Illingworth, W. Rosse, D. R. Sutherland, C. T. Wittwer, S. J. Richards // Cytom. Part B - Clin. Cytom. - 2010. - T. 78 - № 4 - 211-

230c.

22. Borowitz M.J. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. / M. J. Borowitz, F. E. Craig, J. A. Digiuseppe, A. J. Illingworth, W. Rosse, D. R. Sutherland, C. T. Wittwer, S. J. Richards // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2010. - T. 78 - № 4 - 211— 30c.

23. Camitta B.M. What is the definition of cure for aplastic anemia? // Acta Haematol. - 2000. - T. 103. - № 1. - 16-18c.

24. Champlin R.E. Bone marrow transplantation for severe aplastic anemia: a randomized controlled study of conditioning regimens. / R. E. Champlin, W. S. Perez, J. R. Passweg, J. P. Klein, B. M. Camitta, E. Gluckman, C. N. Bredeson, M. Eapen, M. M. Horowitz // Blood - 2007. - T. 109 - № 10 - 4582-5c.

25. Chen G. Differential gene expression in hematopoietic progenitors from paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients reveals an apoptosis/immune response in «normal» phenotype cells. / G. Chen, W. Zeng, J. P. Maciejewski, K. Kcyvanfar, E. M. Billings, N. S. Young // Leukemia - 2005. - T. 19 - № 5 - 862-8c.

26. DeZern A.E. Detection of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones to exclude inherited bone marrow failure syndromes. / A. E. DeZern, H. J. Symons, L. S. Resar, M. J. Borowitz, M. Y. Armanios, R. A. Brodsky // Eur. J. Haematol. -2014. - T. 92 - № 6 - 467-70c.

27. Dufour C. Outcome of aplastic anemia in adolescence: a survey of the Severe Aplastic Anemia Working Party of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. / C. Dufour, M. Pillon, J. Passweg, G. Socié, A. Bacigalupo, G. Franceschetto, E. Carraro, R. Oneto, A. M. Risitano, R. Peffault de Latour, A. Tichelli, A. Rovo, C. Peters, B. Hoechsmann, S. Samarasinghe, A. G. Kulasekararaj,

H. Schrezenmeier, M. Aljurf, J. Marsh // Haematologica - 2014. - T. 99 - № 10 -1574-81 c.

28. Dunn D.E. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes / D. E. Dunn, P. Tanawattanacharoen, P. Boccuni, S. Nagakura, S. W. Green, M. R. Kirby, M. S. A. Kumar, S. Rosenfeld, N. S. Young // Ann. Intern. Med. - 1999. - T. 131 - № 6 - 401-408c.

29. Fouassier M. Absence of JAK2-V617F in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria-associated thrombosis. / M. Fouassier, F. Girodon, C. Cleyrat, N. Robillard, R. Garand, S. Hermouet // Thromb. Haemost. - 2009. - T. 102 - № 1 -180-2c.

30. Frickhofen N. Antithymocyte globulin with or without cyclosporin A: 11-year follow-up of a randomized trial comparing treatments of aplastic anemia. / N. Frickhofen, H. Heimpel, J. P. Kaltwasser, H. Schrezenmeier // Blood - 2003. - T. 101 - № 4 - 1236-42c.

31. Gu Y. Interleukin (IL)-17 promotes macrophages to produce IL-8, IL-6 and tumour necrosis factor-alpha in aplastic anaemia. / Y. Gu, X. Hu, C. Liu, X. Qv, C. Xu // Br. J. Haematol. - 2008. - T. 142 - № 1 - 109-14c.

32. Ham T.H. Studies on destruction of red blood cells in chronic hemolytic anemia with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: certain immunological aspects of the hemolytic mechanism with special reference to serum complement. / T. H. Ham, J. H. Dingle // J. Clin. Invest. - 1939. - T. 18 - № 6 - 657-672c.

33. Hu R. PIG-A mutations in normal hematopoiesis. / R. Hu, G. L. Mukhina, S. Piantadosi, J. P. Barber, R. J. Jones, R. A. Brodsky // Blood - 2005. - T. 105 - № 10 - 3848-54c.

34. Inoue N. Molecular basis of clonal expansion of hematopoiesis in 2 patients with

paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). / N. Inoue, T. Izui-Sarumaru, Y. Murakami, Y. Endo, J.-I. Nishimura, K. Kurokawa, M. Kuwayama, H. Shime, T. Machii, Y. Kanakura, G. Meyers, C. Wittwer, Z. Chen, W. Babcock, D. Frei-Lahr, C. J. Parker, T. Kinoshita // Blood - 2006. - T. 108 - № 13 - 4232-6c.

35. Kulagin A. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: Results of two-centre prospective study / A. Kulagin, I. Lisukov, M. Ivanova, I. Golubovskaya, I. Kruchkova, S. Bondarenko, V. Vavilov, N. Stancheva, E. Babenko, A. Sipol, N. Pronkina, V. Kozlov, B. Afanasyev // Br. J. Haematol. - 2014. - T. 164 - № 4 - 546-554c.

36. Kulasekararaj A.G. Somatic mutations identify a subgroup of aplastic anemia patients who progress to myelodysplastic syndrome. / A. G. Kulasekararaj, J. Jiang, A. E. Smith, A. M. Mohamedali, S. Mian, S. Gandhi, J. Gaken, B. Czepulkowski, J. C. W. Marsh, G. J. Mufti // Blood - 2014. - T. 124 - № 17 - 2698-704c.

37. Latour R.P. de Th17 immune responses contribute to the pathophysiology of aplastic anemia. / R. P. de Latour, V. Visconte, T. Takaku, C. Wu, A. J. Erie, A. K. Sarcon, M. J. Desierto, P. Scheinberg, K. Keyvanfar, O. Nunez, J. Chen, N. S. Young // Blood - 2010. - T. 116 - № 20 - 4175-84c.

38. Lee S.C.-W. The mutational landscape of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria revealed: new insights into clonal dominance. / S. C.-W. Lee, O. Abdel-Wahab // J. Clin. Invest. - 2014. - T. 124 - № 10 - 4227-30c.

39. Li J.P. Abnormal immunity and stem/progenitor cells in acquired aplastic anemia. / J. P. Li, C. L. Zheng, Z. C. Han // Crit. Rev. Oncol. Hematol. - 2010. - T. 75 - № 2 - 79-93c.

40. Maciejewski J.P. Application of array-based whole genome scanning

technologies as a cytogenetic tool in haematological malignancies. / J. P. Maciejewski, R. V Tiu, C. O'Keefe // Br. J. Haematol. - 2009. - T. 146 - № 5 - 479-488c.

41. Marsh J. Making therapeutic decisions in adults with aplastic anemia. // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. - 2006. - 78-85c.

42. Marsh J.C.W. Management of the refractory aplastic anemia patient: what are the options? / J. C. W. Marsh, A. G. Kulasekararaj // Blood - 2013. - T. 122 - № 22 -3561-7c.

43. Marsh J.C.W. Management of the refractory aplastic anemia patient: what are the options ? Review Article Management of the refractory aplastic anemia patient: what are the options ? / J. C. W. Marsh, A. G. Kulasekararaj - 2014. - T. 122 - 3561-3567c.

44. Miano M. The diagnosis and treatment of aplastic anemia: a review / M. Miano, C. Dufour // Int. J. Hematol. - 2015. - 527-535c.

45. Miano M. The diagnosis and treatment of aplastic anemia: a review. / M. Miano, C. Dufour // Int. J. Hematol. - 2015. - T. 101 - № 6 - 527-35c.

46. Mortazavi Y. N-RAS gene mutation in patients with aplastic anemia and aplastic anemia/paroxysmal nocturnal hemoglobinuria during evolution to clonal disease / Y. Mortazavi, J. A. Tooze, E. C. Gordon-Smith, T. R. Rutherford // Blood - 2000. - T. 95 - № 2 - 646-650c.

47. Nakao S. Response to immunosuppressive therapy and an HLA-DRB1 allele in patients with aplastic anaemia: HLA-DRB1*1501 does not predict response to antithymocyte globulin / S. Nakao, A. Takami, N. Sugimori, M. Ueda, S. Shiobara, T. Matsuda, H. Mizoguchi // Br. J. Haematol. - 1996. - T. 92 - № 1 - 155-158c.

48. Nakao S. Isolation of a T-cell clone showing HLA-DRB1*0405-restricted cytotoxicity for hematopoietic cells in a patient with aplastic anemia / S. Nakao, A. Takami, H. Takamatsu, W. Zeng, N. Sugimori, H. Yamazaki, Y. Miura, M. Ueda, S. Shiobara, T. Yoshioka, T. Kaneshige, M. Yasukawa, T. Matsuda // Blood - 1997. -T. 89 - № 10 - 3691-3699c.

49. Parker C. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. / C. Parker, M. Omine, S. Richards, J.-I. Nishimura, M. Bessler, R. Ware, P. Hillmen, L. Luzzatto, N. Young, T. Kinoshita, W. Rosse, G. Socie // Blood - 2005. - T. 106 -№ 12 - 3699-709c.

50. Parker C.J. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an historical overview. / C. J. Parker // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program - 2008. - 93-103c.

51. Parker C.J. Characterization of the complement sensitivity of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria erythrocytes. / C. J. Parker, T. Wiedmer, P. J. Sims, W. F. Rosse // J. Clin. Invest. - 1985. - T. 75 - № 6 - 2074-2084c.

52. Pu J. Natural history of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones in patients presenting as aplastic anemia / J. Pu, G. Mukhina, H. Wang, W. Savage, R. Brodsky // Eur. J. Haematol. - 2011. - T. 87 - № 1 - 37-45c.

53. Raza A. A prospective multicenter study of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure. / A. Raza, F. Ravandi, A. Rastogi, J. Bubis, S. H. Lim, I. Weitz, H. Castro-Malaspina, N. Galili, R. A. Jawde, A. Illingworth // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2014. - T. 86 - № 3 - 175-182c.

54. Ren J. Elevated expression of CX3C chemokine receptor 1 mediates recruitment of T cells into bone marrow of patients with acquired aplastic anaemia. / J. Ren, X. Y. Hou, S. H. Ma, F. K. Zhang, J. H. Zhen, L. Sun, Y. X. Sun, Y. L. Hao, Y. F. Cheng, M. Hou, C. G. Xu, M. H. Zhang, J. Peng // J. Intern. Med. - 2014. - T. 276 - № 5 -

512-24c.

55. Risitano A.M. In-vivo dominant immune responses in aplastic anaemia: molecular tracking of putatively pathogenetic T-cell clones by TCR beta-CDR3 sequencing. / A. M. Risitano, J. P. Maciejewski, S. Green, M. Plasilova, W. Zeng, N. S. Young // Lancet (London, England) - 2004. - T. 364 - № 9431 - 355-64c.

56. Rosse F. Erythrocyte Acetylcholinesterase Deficiency in Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH)—A Comparison of the Complement-Sensitive and Insensitive Populations / F. Rosse // Blood - 1969. - T. 33 - № 4 - 607-617c.

57. Rosse W.F. Immune lysis of normal human and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) red blood cells. I. The sensitivity of PNH red cells to lysis by complement and specific antibody. / W. F. Rosse, J. V. Dacie // J. Clin. Invest. -1966. - T. 45 - № 5 - 736-748c.

58. Rotoli B. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. / B. Rotoli, L. Luzzatto // Baillieres. Clin. Haematol. - 1989. - T. 2 - № 1 - 113-138c.

59. Savage S.A. The role of telomere biology in bone marrow failure and other disorders. / S. A. Savage, B. P. Alter // Mech. Ageing Dev. - 2008. - T. 129 - № 1-2 - 35-47c.

60. Scheinberg P. Association of telomere length of peripheral blood leukocytes with hematopoietic relapse, malignant transformation, and survival in severe aplastic anemia. / P. Scheinberg, J. N. Cooper, E. M. Sloand, C. O. Wu, R. T. Calado, N. S. Young // JAMA - 2010. - T. 304 - № 12 - 1358-64c.

61. Scheinberg P. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones in severe aplastic anemia patients treated with horse anti-thymocyte globulin plus cyclosporine. / P. Scheinberg, M. Marte, O. Nunez, N. S. Young // Haematologica - 2010. - T. 95 - № 7 - 1075-80c.

62. Scheinberg P. Predicting response to immunosuppressive therapy and survival in severe aplastic anaemia. / P. Scheinberg, C. O. Wu, O. Nunez, N. S. Young // Br. J. Haematol. - 2009. - T. 144 - № 2 - 206-16c.

63. Schrezenmeier H. A pathogenetic link between aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is suggested by a high frequency of aplastic anemia patients with a deficiency of phosphatidylinositol glycan anchored proteins / H. Schrezenmeier, B. Hertenstein, B. Wagner, A. Raghavachar, H. Heimpel // Exp. Hematol. - 1995. - T. 23 - № 1 - 81-87c.

64. Schrezenmeier H. Relapse of aplastic anaemia after immunosuppressive treatment: A report from the European Bone Marrow Transplantation Group SAA Working Party / H. Schrezenmeier, P. Marin, A. Raghavachar, S. McCann, J. Hows, E. Gluckman, C. Nissen, E. T. Van'T Veer-Korthof, P. Ljungman, W. Hinterberger, M. T. Van Lint, N. Frickhofen, A. Bacigalupo // Br. J. Haematol. - 1993. - T. 85 - № 2 - 371-377c.

65. Shen W. Deep sequencing reveals stepwise mutation acquisition in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / W. Shen, M. J. Clemente, N. Hosono, K. Yoshida, B. Przychodzen, T. Yoshizato, Y. Shiraishi, S. Miyano, S. Ogawa, J. P. Maciejewski, H. Makishima // J. Clin. Invest. - 2014. - T. 124 - № 10 - 4529-4538c.

66. Shen W. Deep sequencing reveals stepwise mutation acquisition in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. / W. Shen, M. J. Clemente, N. Hosono, K. Yoshida, B. Przychodzen, T. Yoshizato, Y. Shiraishi, S. Miyano, S. Ogawa, J. P. Maciejewski, H. Makishima // J. Clin. Invest. - 2014. - T. 124 - № 10 - 4529-4538c.

67. Sipol A.A. An inter-laboratory comparison of PNH clone detection by high-sensitivity flow cytometry in a Russian cohort. / A. A. Sipol, E. V Babenko, V. I. Borisov, E. V Naumova, E. V Boyakova, D. I. Yakunin, T. V Glazanova, Z. V Chubukina, N. V Pronkina, A. M. Popov, L. I. Saveliev, S. A. Lugovskaya, I. A.

Lisukov, A. D. Kulagin, A. J. Illingworth // Hematology - 2015. - T. 20 - № 1 - 31-38c.

68. Sloand E.M. Cytogenetic abnormalities in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria usually occur in haematopoietic cells that are glycosylphosphatidylinositol-anchored protein (GPI-AP) positive / E. M. Sloand, M. Fuhrer, K. Keyvanfar, L. Mainwaring, J. Maciejewski, Y. Wang, S. Johnson, A. J. Barrett, N. S. Young // Br. J. Haematol. - 2003. - T. 123 - № 1 - 173-176c.

69. Socie G. Late clonal diseases of treated aplastic anemia / G. Socie, S. Rosenfeld, N. Frickhofen, E. Gluckman, A. Tichelli // Semin. Hematol. - 2000. - T. 37 - № 1 -91-101c.

70. Sugimori C. Minor population of CD55-CD59- blood cells predicts response to immunosuppressive therapy and prognosis in patients with aplastic anemia. / C. Sugimori, T. Chuhjo, X. Feng, H. Yamazaki, A. Takami, M. Teramura, H. Mizoguchi, M. Omine, S. Nakao // Blood - 2006. - T. 107 - № 4 - 1308-14c.

71. Sugimori C. Origin and fate of blood cells deficient in glycosylphosphatidylinositol-anchored protein among patients with bone marrow failure. / C. Sugimori, K. Mochizuki, Z. Qi, N. Sugimori, K. Ishiyama, Y. Kondo, H. Yamazaki, A. Takami, H. Okumura, S. Nakao // Br. J. Haematol. - 2009. - T. 147 -№ 1 - 102-112c.

72. Sugimori C. Roles of DRB1 *1501 and DRB1 *1502 in the pathogenesis of aplastic anemia. / C. Sugimori, H. Yamazaki, X. Feng, K. Mochizuki, Y. Kondo, A. Takami, T. Chuhjo, A. Kimura, M. Teramura, H. Mizoguchi, M. Omine, S. Nakao // Exp. Hematol. - 2007. - T. 35 - № 1 - 13-20c.

73. Sutherland D.R. High-Sensitivity Detection of PNH Red Blood Cells, Red Cell Precursors, and White Blood Cells. / D. R. Sutherland, A. Illingworth, M. Keeney, S.

J. Richards // Curr. Protoc. Cytom. - 2015. - T. 72 - 6.37.1-6.37.29c.

74. Takeda J. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / J. Takeda, T. Miyata, K. Kawagoe, Y. Iida, Y. Endo, T. Fujita, M. Takahashi, T. Kitani, T. Kinoshita // Cell -1993. - T. 73 - № 4 - 703-711 c.

75. Teramura M. Treatment of severe aplastic anemia with antithymocyte globulin and cyclosporin A with or without G-CSF in adults: a multicenter randomized study in Japan. / M. Teramura, A. Kimura, S. Iwase, Y. Yonemura, S. Nakao, A. Urabe, M. Omine, H. Mizoguchi // Blood - 2007. - T. 110 - № 6 - 1756-61c.

76. Townsley D.M. Bone marrow failure and the telomeropathies / D. M. Townsley, B. Dumitriu, N. S. Young // Blood. - 2015. - T. 124 - № 18 - 2775-2784c.

77. Venneker G.T. CD59: A molecule involved in antigen presentation as well as downregulation of membrane attack complex // Exp. Clin. Immunogenet. - 1992. -T. 9. - № 1. - 33-47c.

78. Yoshida N. Predicting response to immunosuppressive therapy in childhood aplastic anemia. / N. Yoshida, H. Yagasaki, A. Hama, Y. Takahashi, Y. Kosaka, R. Kobayashi, H. Yabe, T. Kaneko, M. Tsuchida, A. Ohara, T. Nakahata, S. Kojima // Haematologica - 2011. - T. 96 - № 5 - 771-4c.

79. Yoshizato T. Spectrum of genetic alterations in acquired aplastic anemia // 2013 ASH Annu. Meet. Expo.

80. Young N.S. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia. / N. S. Young, R. T. Calado, P. Scheinberg // Blood - 2006. - T. 108 - № 8 -2509-19c.

81. Young N.S. The relationship of aplastic anemia and PNH. // Int. J. Hematol. -

2002. - T. 76 Suppl 2. - 168-172c.

82. Zeng W. Gene expression profiling in CD34 cells to identify differences between aplastic anemia patients and healthy volunteers. / W. Zeng, G. Chen, S. Kajigaya, O. Nunez, A. Charrow, E. M. Billings, N. S. Young // Blood - 2004. - T. 103 - № 1 -325-32c.

83. Zeng W. Transcript profile of CD4+ and CD8+ T cells from the bone marrow of acquired aplastic anemia patients. / W. Zeng, S. Kajigaya, G. Chen, A. M. Risitano, O. Nunez, N. S. Young // Exp. Hematol. - 2004. - T. 32 - № 9 - 806-14c.

84. Zeng Y. The complex pathophysiology of acquired aplastic anaemia. / Y. Zeng, E. Katsanis // Clin. Exp. Immunol. - 2015. - T. 180 - № 3 - 361-70c.

85. Zhao X. The role of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones in response to immunosuppressive therapy of patients with severe aplastic anemia. / X. Zhao, L. Zhang, L. Jing, K. Zhou, Y. Li, G. Peng, L. Ye, Y. Li, J. Li, H. Fan, L. Song, W. Yang, F. Zhang // Ann. Hematol. - 2015. - T. 94 - № 7 - 1105-1110c.

Приложения

Описание клинического случая 1

Больная А.Т.И.,1981 г.р.

Наблюдается в отделении химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с июля 2013г с диагнозом: апластическая анемии, нетяжелая форма.

С апреля 2013г отмечается развитие геморрагического синдрома (маточное кровотечение). В гемограмме при обследовании выявлена анемия (ИЬ-48 г/л), лейкоциты-2,1х109/л, тромбоциты - 16 х109/л. Проводились заместительные трансфузии эритроцитной массы. В пунктате костного мозга - клеточный костный мозг, единичные мегакариоциты. По месту жительства проводилась терапия преднизолоном в дозе 1 мг/кг/сут в течение 2 недель, без эффекта.

Госпитализирована в ГНЦ подтвержден диагноз нетяжелой формы

12

апластической анемии (Гемоглобин-57г/л; Эритроциты-1.80x10 /л; Ретикулоциты-10.00%0; Тромбоциты-19.00х109/л; Лейкоциты-

2.30х109/л;Сегментоядерные-12.60%; Лимфоциты- 84.30%; Моноциты-3.10%. Трепанобиопсия - гипоплазия костного мозга с участками аплазии) Методом иммунофенотипирования клеток периферической крови выявлен ПНГ-клон среди эритроцитов (14,21%), гранулоцитов (99,76%), моноцитов (99,71%). При стандартном цитогенетическом исследовании делящиеся клетки не обнаружены. Несмотря на наличие значительного ПНГ-клона, проявлений внутрисосудистого гемолиза на момент манифестации заболевания у больной не было: ЛДГ - 333 г/л, общий билирубин- 7,7 ммоль/л, ретикулоциты -26х109/л,

Выполнено НЬА-типирование больной и сиблинга: сиблинг неидентичен.

В качестве 1го этапа комбинированной ИСТ с 19.08.13 по 22.08.13г проведен курс АТГ (АТГАМ 20 мг/кг/сут) Учитывая развитие тяжелых

токсических осложнений (повышение печеночных трансаминаз до 20 норм, брадикардия) введение препарата прервано на 5й день. Суммарно введено 4000мг АТГАМ. После отмены препарата осложнения регрессировали. 29.08.13г ухудшение состояния в виде развития сывороточной болезни (кожная сыпь, диффузное нарушение процессов реполяризации миокарда с болевым синдромом). На фоне проведения терапии солумедролом (125 мг/сут с дальнейшим снижением дозы препарата до полной отмены) отмечалась положительная динамика. Однако, после отмены солумедрола, 1.09.13г рецидив клинической картины сывороточной болезни (кожные проявления, суставной синдром), потребовавший возобновления терапии глюкокортикостероидами. 13.09.13г (22й день после АТГ), после полной отмены ГКС, ухудшение состояния в виде повышения температуры до 39, появления сыпи на теле по типу «крапивницы». Ситуация расценена как 3-й рецидив сывороточной болезни. Проводилась десенсибилизирующая терапия с положительным эффектом.

С 10.09.13г начато проведение ИСТ циклоспорином А в дозе 300 мг/сут. Доза препарата подобрана в соответствии с достижением терапевтической концентрации в крови.

Больная независима от трансфузий донорских компонентов крови с октября 2013г.

При контрольном обследовании через 3 месяца после АТГ в гемограмме отмечалась тенденция к восстановлению показателей (Гемоглобин: 81г/л; Эритроциты: 2,1х1012/л; Тромбоциты-59х109/л; Лейкоциты-3.3х109/л; Сегментоядерные- 37%; Лимфоциты- 52%; Моноциты-11%), по данным гистологического исследования трепанобиоптата по сравнению с предыдущим исследованием клеточность кроветворной ткани увеличилась, появились элементы мегакариоцитопоэза. Одновременно с констатацией ответа на ИСТ наблюдалось развитие лабораторных признаков внутрисосудистого гемолиза:

повышение ЛДГ до 1517 Е/л, Общего билирубина до 21.8 мкмоль/л (за счет непрямого билирубина - 18.1 мкмоль/л), ретикулоцитоза до 113х109/л. При этом существенно изменился размер ПНГ-клона по эритроцитам: типП+ типШ=73,86+13,10%. Стоит отметить увеличение эритроцитарного клона за счет II типа эритроцитов.

В настоящее время отмечается становление частичной ремиссии апластической анемии. Проводится отмена циклослоприна А. Наряду с восстановлением показателей периферической крови, отмечается усилиние признаков внутрисосудистого гемолиза: ЛДГ от 21.01.16 - 2299Е/л, общий билирубин не превышает верхнюю границу нормы. Тромботических осложнений, гемолитических кризов за время наблюдения у больной не было. Учитывая наличие значительного ПНГ-клона и признаков гемолиза, может быть отнесена в группу риска развития классической ПНГ.

Данный клинический случай демонстрирует больную со значительным ПНГ-клоном, у которой при манифестации апластической анемии не было проявлений внутрисосудистого гемолиза. Однако, при достижении ответа на ИСТ отмечалось одновременной появление признаков внутрисосудистого гемолиза со значительным увеличением размера ПНГ-клона по эритроцитам.

Описание клинического случая 2

Больная Б.М.Н. 1963 г.р. Впервые госпитализирована 26.03.14г в ГНЦ.

С июня 2013г беспокоили обильные менструации. В августе 2013г вследствие некупируемого маточного кровотечения выполнена экстирпация матки без придатков. При дальнейшем обследовании больной на основании гистологического, цитологического исследований костного мозга и гемограммы (Нв-96г/л, Тр-8х109/л, Лей-2,7 х109/л, с/я - 12%) установлен диагноз тяжелой формы апластической анемии. С 11.10.13 развилась зависимость от трансфузий донорских тромбоцитов, эритроцитов.

Для дообследования и определения тактики дальнейшей терапии 29.01.14г госпитализирована в ГНЦ, где на основании данных обследования ( Гемоглобин: 67 г/л; Тромбоциты: 21.00х109/л; Лейкоциты: 2.60х109/л, с/я-21,0%, лимф- 58%; морфологическая картина костного мозга не противоречит апластической анемии; иммунофенотипическая диагностика ПНГ: выявлен ПНГ-клон на эритроцитах (тип2+тип3) - 0,53%+1,86%, Гр- 24,77%, Мон -46,36%) установлен диагноз нетяжелой формы апластической анемии, протекающей с ПНГ-клоном. Ввиду отсутствия митозов, кариотип определить не удалось.

В связи с инфекционными осложнениями при поступлении (тонзиллит, бронхиолит, Herpes nasalis), проводилась антибиотическая терапия трифамоксом, валтрексом с положительным эффектом.

В качестве 1го этапа программной ИСТ больной с 24.02.14 по 28.02.14г проведен курс терапии АТГ (АТГАМ 20 мг/кг/сут) по протоколу №2, перенесла удовлетворительно. Отмечалась кожная реакция, которая самостоятельно купировалась. В гемограмме на 2-3 дни курса зафиксирована лимфодеплеция (снижение лимф до 18%). В посткурсовом периоде отмечалось развитие сывороточной болезни, проявления которой купировались

десенсибилизирующей терапией. С 18.03.14г возобновлен прием циклосплорина А в дозе 400 мг/сут.

Больная независима от трансфузий донорских компонентов крови с апреля 2014г.

При контрольном обследовании через 3 месяца после АТГ в гемограмме отмечалась тенденция к восстановлению показателей (Гемоглобин: 125г/л; Эритроциты: 2,1х1012/л; Тромбоциты-204х109/л; Лейкоциты-6,6х109/л; Сегментоядерные- 57%), по данным гистологического исследования трепанобиоптата по сравнению с предыдущим исследованием клеточность кроветворной ткани увеличилась, появились элементы мегакариоцитопоэза. Одновременно с констатацией ответа на ИСТ наблюдалась постепенная регрессия лабораторных признаков внутрисосудистого гемолиза: снижение ЛДГ до 438 Е/л, нормализация концентрации общего билирубина, ретикулоцитоза до 80х109/л на фоне восстановления показателей. При этом существенно изменился размер ПНГ-клона: среди эритроцитов (тип2+тип3) -1,8%, гранулоцитов - 1,5%, моноцитов - 3,76%.

В настоящее время отмечается становление полной ремиссии апластической анемии. Проводится отмена циклослоприна А. Наряду с восстановлением показателей периферической крови, отмечается регрессия признаков внутрисосудистого гемолиза: ЛДГ от 14.01.16 - 301Е/л, общий билирубин не превышает верхнюю границу нормы.

Данный клинический случай демонстрирует больную со значительным уменьшением размера ПНГ-клона при достижении максимального ответа на проведенную иммуносупрессивную терапию в минимальные сроки после лечения.

Описание клинического случая 3

Больная В.И.Л. Впервые госпитализирована в ФГБУ ГНЦ МЗ РФ в мае 2011г.

Дебют заболевания с января 2011 года с геморрагического синдрома. В гематологическом отделении по месту жительства на основании данных ОАК (выявлена тромбоцитопения), цитологического исследования ПКМ был установлен диагноз идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.

С 04.02.2011 по 16.02.2011 проведена пульс-терапия дексаметазоном в дозе 24 мг/сут. По 10.03.2011 продолжался прием преднизолона в дозе 30 мг/сут. С 01.03.2011 по 05.03.2011- терапия иммуноглобулином (гамунекс). На фоне проводимой терапии сохранялась тромбоцитопения. В динамике отмечалось снижение уровня гемоглобина, лейкоцитов. На основании данных гистологического исследования трепанобиоптата от 28.02.2011 (аплазия костного мозга), цитогенетического исследования костного мозга (хромосомных перестроек не выявлено) был установлен диагноз апластической анемии.

После установления диагноза преднизолон постепенно отменен. С 13.04.2011 по 15.05.2011 проводилась терапия циклоспорином А в дозе 5 мг/кг/сут (300 мг/сут). Проводилась трансфузионная терапия концентратом тромбоцитов, отмытыми эритроцитами.

Выполнено типирование родной сестры - гаплоидентична.

В мае 2011 г. ФГБУ ГНЦ проведено дообследование больной.

1 9

- ОАК (04.05.2011): гемоглобин 61 г/л, эритроциты — 1,95x10 /л, тромбоциты — 45х109/л, лейкоциты — 3,2х109/л, с/я — 1%, лимфоциты — 98%, моноциты — 1%.

- цитологического исследования костного мозга №1429/11 (05.05.2011): бласты 0,8%, миелоциты — 12%, метамиелоциты — 7,6% ,п/я — 8,8%, с/я — 2,8%, лимфоциты — 17,6%, моноциты — 4%, эритроидный росток — 46%,

мегакариоциты - единичные в препарате, плазматические клетки -0,4%. Умеренно выраженный дизэритропоэз.

- гистологического исследования костного мозга №4623-24/11 (04.05.2011): В трепанобиоптате в прилежащих к корковому слою кости полостях выявляется преимущественно жировой костный мозг. Немногочисленные ядросодержащие элементы представлены эритрокариоцитами, составляющими большую часть клеток, сидерофагами, единичными клетками гранулоцитопоэза и мелкими лимфоидными клетками. Наиболее вероятен диагноз апластической анемии.

- цитогенетического исследования костного мозга (04.05.2011): кариотип 46 ХХ [20]. Хромосомных перестроек не выявлено.

- ПНГ-клон не выявлен.

На основании данных ОАК (панцитопения), цитологического, гистологического, цитогенетического исследований костного мозга подтвержден диагноз тяжелой формы апластической анемии,

При поступлении выявлены инфекционные осложнения - грибковый эзофагит, эрозия шейки матки (в посеве из влагалища - Ureaplasma). На фоне противомикробной терапии авелоксом, микосистом инфекционные осложнения регрессировали.

Продолжена трансфузионная терапия. В связи с выявлением антилейкоцитарных антител в высоком титре (частота реагирования - 80%) трансфузии концентрата тромбоцитов проводились по индивидуальному подбору. На этом фоне реакций на трансфузии не отмечалось. Также с целью уменьшения аллосенсибилизации проведено 2 сеанса плазмообмена.

В качестве первого этапа иммуносупрессивной терапии с 16.05.2011 по 20.05.2011 проведен курс терапии АТГ (Атгам 20 мг/кг/сут в течение 5 дней).

Во время курса отмечалось развитие синусовой брадикардии, синдрома слабости синусового узла, что было, вероятно, обусловлено введением высоких

доз глюкокортикостероидов. На фоне терапии беллатаминалом и после отмены солу-медрола указанные проявления регрессировали.

В посткурсовом периоде отмечалось появление минимальных симптомов сывороточной болезни (артралгии, «крапивница»), которые регрессировали на фоне десенсибилизирующей терапии антигистаминными препаратами. Инфекционных осложнений не было.

С 01.06.2011 начата терапия циклоспорином А в дозе 300-350 мг/сут. 10.06.2011 была выписана для продолжения лечения по месту жительства.

На фоне приема циклоспорина А отмечается постепенное повышение числа лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина. Трансфузии компонентов крови не проводились с июня 2011г.

В ноябре 2011 г. выполнено контрольное обследование в ФГБУ ГНЦ.

Результаты:

19

- ОАК (28.11.2011): ): гемоглобин 118 г/л, эритроциты - 3,5х10 /л, тромбоциты - 166х109/л, лейкоциты - 4,6х109/л, п/я -9%, с/я - 63%, лимфоциты - 26%, моноциты - 2%, ретикулоциты - 7%о, СОЭ - 19 мм/час.

- ПКМ (28.11.2011):костный мозг клеточный, бласты - 2,8%, лимфоциты -4%, гранулоцитарный росток - 66,3%, моноциты - 3,2%, эритроидный росток -23,6%, мегакариоциты в достаточном количестве.

- Иммунофенотипирование клеток периферической крови (29.11.2011): Выявлен ПНГ-клон среди эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов: эритроциты: тип I (нормальная экспрессия CD59) - 98.9%, тип II (частичный дефицит CD59) - 0,2%, тип III (полный дефицит CD59) - 0,9%. Моноциты с дефицитом FLAER/CD14 - 2,3%, гранулоциты с дефицитом FLAER/CD24 -4,9%.

- гистологическое исследование костного мозга №12999/11 (28.11.2011): трепанобиоптат большого объема. В костной ткани - очаговая резорбция (обнаружен один остеокласт), наряду с которой выявляются единичные

остеобласты. В широких костномозговых полостях содержится умеренно гипопластичная, с участками аплазии, кроветворная ткань. В клеточном ее составе определяются элементы трех линий гемопоэза. Соотношение клеток эритро- и гранулоцитопоэза примерно соответствует норме. Последний -представлен клетками преимущественно зрелых и вызревающих генераций. Выявлены единичные моноцитодного вида клетки. Эритропоэз слегка сужен. Количество мегакариоцитов снижено, обнаружен один митотически делящийся мегакариоцит, едининчные - с гипосегментированным ядром. Выявлены также в небольшом числе мелкие лимфоидные клетки. Строма очагово полнокровна, сосуды с умеренно склерозированными стенками. По сравнению с предыдущими биоптатами отмечалось увеличение клеточности кроветворной ткани, полиморфизм ее состава, что соответствует наблюдаемому при лечебном патоморфозе и ремиссии апластической анемии.

Таким образом, на фоне терапии у больной достигнута полная ремиссия апластической анемии. Также отмечается появление ПНГ-клона.

В июле 2013г выполнена постепенная отмена циклослпорина А. По результатам контрольных обследований - сохраняется полная ремиссия апластической анемии, протекающей с ПНГ-клоном. Размер ПНГ-клона после его появления на протяжении периода наблюдения остается без динамики.

Данный клинический пример демонстрирует больную тяжелой формой апластической анемии, у которой после достижения ответа на лечение (полная ремиссия) отмечается появление ПНГ-клона с дальнейшей его персистенцией без значительных изменений размера и проявлений внутрисосудистого гемолиза.