Действие синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 14, на активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Ахматов, Элвин Альтафович

• Ахматов, Элвин Альтафович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Ахматов, Элвин Альтафович

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ................................................................ 7

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ВАКЦИНЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ 16

ПРОФИЛАКТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

1.1. Общая характеристика Streptococcus pneumoniae и данные эпидемиологических исследований............................................................16

1.2. Вакцины коммерческие и экспериментальные................... 18

ГЛАВА 2. КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД S. pneumoniae ?с)

серотипа 14 И ЕГО ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА...............

ГЛАВА 3. ИММУНОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОСАХАРИДОВ S. pneumoniae СЕРОТИПА 14, КОНЪЮГИРОВАННЫХ С БЕЛКОМ-

НОСИТЕЛЕМ......................................................................................................................................34

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................46

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................46

1.1. Препараты................................................................................................................46

1.2. Лабораторные животные..............................................................................48

1.3. Штаммы S. pneumoniae............................................................................................48

1.4. Получение иммунных мышиных сывороток к S. 48 pneumoniae серотипа 14...................................................

1.5. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)..................48

1.6. Иммунизация мышей............................................................................................50

1.7. Определение экспрессии Толл-подобных рецепторов..............51

1.8. Культивирование дендритных клеток..................................................52

1.9. Анализ фенотипа дендритных клеток..................................................52

1.10. Уровень цитокинов............................................................................................52

1.11. Бактерицидная активность лейкоцитов..........................................53

1.12. Характеристика поверхностных антигенов мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей........................... 53

1.13. Протективная активность................................................................................54

1.14. Превентивная активность сыворотки..................................................54

1.15. Опсонизирующая активность сыворотки..............................55

1.16. Методы статистической обработки данных................................55

ГЛАВА 2. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ТЕТРА-, ГЕКСА- И ОКТАСАХАРИДА............ 56

2.1. Ингибирование антител к капсульному полисахариду S.pneumoniae серотипа 14 синтетическими олигосахаридами с разной длиной цепи....................................................................... 56

2.2. Исследование способности специфических антител к бактериальному капсульному полисахариду связывать тетра-, гекса-

и октасахарид в составе биотинилированных коныогатов............ 59

2.3. Отработка условий для разработки экспериментальной ИФА тест-системы на основе конъюгированного гексасахарида........... 64

2.3.1. Выбор оптимальной концентрации гексасахарида, конъюгированного с БСА, для сорбции на планшетах..............................64

2.3.2. Специфичность конъюгированного гексасахарида, 65 сорбированного lia планшете

ГЛАВА 3. АКТИВАЦИЯ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМ ГЕКСАСАХАРИДОМ, КОНЪЮГИ-РОВАННЫМ С БСА......................................................... 68

3.1. Действие конъюгированного гексасахарида на экспрессию Толл-подобных рецепторов............................................................................................................68

3.2. Влияние конъюгированного гексасахарида на фенотип дендритных клеток и продукцию ими цитокинов........................ 71

3.3. Влияние конъюгированного гексасахарида на уровень цитокинов

в сыворотке крови мышей................................................... 75

3.4. Бактерицидная активность сыворотки крови мышей, иммунизированных конъюгированным гексасахаридом............. 77

ГЛАВА 4. АКТИВАЦИЯ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМ ГЕКСАСАХАРИДОМ, КОНЪЮГИРО-ВАННЫМ С БСА.............................................................. 80

4.1. Антительный ответ к капсульному полисахариду при иммунизации конъюгированным гексасахаридом........................ 80

4.2. Протективная активность конъюгированного гексасахарида в отношении S. pneumoniae серотипа 14....................................... 85

4.3. Превентивные свойства сыворотки крови мышей, иммунизированных конъюгированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия............................... 88

4.4. Опсонизирующая активность сыворотки мышей, иммунизированных конъюгатом гексасахарида........................ 91

4.5. Действие конъюгированного гексасахарида на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов мышей....................................... 92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................... 97

ВЫВОДЫ..................................................................... 105

АЛГОРИТМ ОЦЕНКИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОСАХАРИДОВ.................. 107

ЛИТЕРАТУРА................................................................. 112

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Действие синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 14, на активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа»

ВВЕДЕНИЕ

Streptococcus pneumoniae — этиологический фактор многих тяжелых заболеваний детей и взрослых [18, 182]. Подавляющее большинство штаммов пневмококка имеет капсулу, которую рассматривают как основной фактор вирулентности, а полисахарид, входящий в ее состав, как главный протективный антиген [75]. По химической структуре капсульного полисахарида идентифицировано более 90 серотипов S. pneumoniae [88], 20 из которых вызывают до 90% заболеваний [7].

Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции полисахаридными и конъюгированными вакцинами, защищающими от 80-90% серотипов штаммов S. pneumoniae, выделяемых от пациентов при заболеваниях пневмококковой этиологии, привела к значительному снижению заболеваемости во всех возрастных группах населения [1, 15-17, 74].

В то же время, показано, что применение традиционных вакцин на основе капсульных полисахаридов вызывает замещение доминирующих серотипов пневмококка [22], не предотвращает появления антибиотикоустойчивых штаммов [90, 130, 137, 157] и новых серотипов этого возбудителя [83, 133, 134], а состав применяемых зарубежных вакцин, как правило, не учитывает региональных особенностей распространения штаммов пневмококка и возможное изменение эпидемиологической ситуации в России.

Наряду с этим, к недостаткам конъюгированных полисахаридных вакцин относятся: сложная технология их получения; не всегда успешное проведение ковалентного связывания нескольких полисахаридов с белком-носителем из-за их высокой молекулярной массы и недостаточной степени очистки антигенов [61, 135]; слабая иммуногенность капсульных полисахаридов некоторых актуальных серотипов пневмококка [18]; работа с патогенной живой культурой микроорганизмов. Указанные факторы во

многом определяют высокую стоимость таких вакцин и ограничивают их широкое применение в практике.

Исходя из этого, одним из приоритетных направлений современной вакцинологии является разработка синтетических и полусинетических пневмококковых вакцин на основе олигосахаридов, соответствующих фрагментам цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae [53, 153]. Иммунный ответ на олигосахариды, как правило, типоспецифичен, некоторые олигосахариды, конъюгированные с белком, индуцируют даже более высокий уровень антител к капсульному полисахариду, чем традиционные конъюгированные вакцины [81].

В нескольких лабораториях мира был получен ряд синтетических олигосахаридов, в том числе серотипов 1-4, 6А/В, 7F, 8, 9A/V, 14, 17F, 18С, 19A/F, 22F, 23F, 27, 29 [88]. Известная структура углеводных лигандов позволяет точно определить олигосахаридные эпитопы, необходимые для индукции протективных антител. Конъюгаты белков-носителей с некоторыми олигосахаридами, соответствующими фрагментам цепи капсульных полисахаридов различных серотипов, рассматриваются в качестве потенциальных вакцин [80].

Наиболее детально изучены иммунологические свойства

1

тетрасахаридного повторяющегося звена [106, 112, 152-155] капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, который рассматривают как основной кандидат для включения в состав поливалентных вакцин на основе синтетических олигосахаридов клинически значимых штаммов пневмококка. Показано, что олигосахариды с большей длиной цепи, в том числе гексасахарид, также являются иммуногенными, однако их свойства изучены недостаточно.

При проведении настоящего исследования из трех впервые

синтезированных в России (ФГБУ ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН) тетра-,

гекса- и окта- олигосахаридов для углубленного иммунологического

исследования выбран гексасахарид, соответствующий участку цепи

8

капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, клиническая значимость которого подтверждена в ряде эпидемиологических исследований [22, 78, 82, 105, 113, 151]. Гексасахарид является наиболее перспективным для исследования, так как содержит в своем составе помимо тетрасахаридного повторяющегося звена еще два дополнительных моносахарида и в большей степени соответствует химическому строению бактериального капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14. Это позволило нам моделировать в эксперименте иммунный ответ, сходный с действием пневмококковых вакцин на основе капсульного полисахарида, и исследовать его особенности.

Показано, что синтетические аналоги фрагментов цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, коныогированные с белком-носителем, вызывают Т-зависимый ответ, переключение синтеза антител с IgM на IgG, созревание аффинности антител, продукцию специфических IgG-антител к углеводной составляющей конъюгата и формирование иммунологической памяти [155].

В то же время остается не изученным действие синтетических олигосахаридов, в том числе гексасахарида, на активацию эффекторов системы врожденного иммунитета; отсутствуют данные о протективной активности конъюгированных олигосахаридов в опытах активной защиты животных от заражения и превентивных свойствах олигосахарид-специфических антител; не исследовано их влияние на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей. Всё это определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель. Изучение действия синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированного с белком-носителем, на активацию

эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета.

9

Задачи исследования

1. Дать оценку антигенной активности гексасахарида в сравнении с тетра- и октасахаридом в ИФА.

2. Определить активность основных факторов системы врожденного иммунитета под влиянием конъюгированного с БСА гексасахарида (экспрессия TLRs, созревание дендритных клеток, уровень продукции цитокинов in vitro и in vivo, бактерицидная активность сыворотки крови).

3. Оценить влияние конъюгированного гексасахарида на субпопуляционную структуру лимфоцитов селезенки мышей.

4. Определить особенности формирования гуморального иммунного ответа при иммунизации мышей конъюгированным гексасахаридом (продукция IgG-антител, опсонизирующие и превентивные свойства сыворотки крови).

5. Исследовать протективную активность конъюгированного гексасахарида при моделировании у мышей генерализованной инфекции, вызванной S. pneumoniae серотипа 14.

Научная новизна

Гексасахарид - синтетический аналог фрагмента цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с БСА, ингибировал IgG-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке и характеризовался равнозначной антигенной активностью с конъюгированными тетра-, октасахаридом и бактериальным капсульным полисахаридом (ингибирование ИФА 71-75%).

Впервые на примере разветвленного гексасахарида p-D-Gal-(l —>4)-р-D-Glc-( 1 ■->6)-[p-D-Gal-( 1 ->4)]-p-D-GlcNAc-( 1 ->3)-p-D-Gal-( 1 ->4)-p-D-Glc продемонстрировано стимулирующее действие синтетических олигосахаридов на ряд показателей врожденного и адаптивного иммунного ответа.

Система врожденного иммунитета. Иммунизация мышей конъюгатом

БСА с гексасахаридом увеличивала количество ТЫ12-экспрессирующих

10

клеток в селезенке при отсутствии лиганд-рецепторного взаимодействия с клетками THPl-XBIue™-CD14; стимулировала in vitro появление в среде культивирования зрелых дендритных клеток с фенотипом CDllc+, CD80+, МНС II+ и цитокинов (IL-1Р, IL-6 и TNFa); обеспечивала повышение содержания в сыворотке крови мышей IL-10, IL-10, IFN-y и TNFa; приводила к усилению бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови животных.

Гидроксид алюминия, выбранный в качестве адъюванта для конъюгированного гексасахарида, способствовал повышению всех показателей функциональной активности эффекторов врожденного иммунитета мышей, в том числе, ТТК2-экспонирующих клеток в селезенке; зрелых дендритных клеток с фенотипом CDllc+, CD80+, CD83+, МНС II+, продуцирующих цитокины (особенно интенсивно IL-1P); сывороточных цитокинов (IL-ip, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, GM-CSF, IFN-y, TNFa); бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови животных.

Система адаптивного иммунитета. Впервые показано, что конъюгированный гексасахарид, сорбированный на гидроксиде алюминия, при двукратной иммунизации мышей оказывал стимулирующее влияние на образование преимущественно специфических IgGl-антител с формированием иммунологической памяти.

Впервые установлено, что на фоне высокого уровня IgG-антител к гексасахариду в селезенке мышей сохранялся нормальный уровень CD4+ Т-клеток при снижении числа CD8+ Т-лимфоцитов, что увеличивало иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) с 1,92 до 3,62. Количество В-лимфоцитов (CD5+ и CD19+), NK-клеток и активированных клеток, экспрессирующих молекулы МНС класса II, достоверно превышало соответствующие показатели у интактных животных.

Впервые продемонстрировано, что поствакцинальные антитела к

гексасахариду обладали способностью связывать бактериальный капсульный

полисахарид, а иммунная сыворотка мышей стимулировала фагоцитоз

11

инактивированных бактерий S. pneumoniae серотипа 14 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных животных и защищала мышей от пневмококковой инфекции, вызванной серотипом 14.

Впервые экспериментально доказано, что активная иммунизация мышей коныогированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия, защищала животных от заражения S. pneumoniae серотипа 14. При этом степень защиты была сопоставима с протективной активностью конъюгированного бактериального капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14.

Практическая значимость

Предложенный в работе дизайн иммунологического исследования функциональной активности синтетического гексасахарида может быть использован для оценки качества других синтетических олигосахаридов пневмококка и разрабатываемых синтетических вакцин.

На основе синтетического гексасахарида может быть разработана высокоспецифичная ИФА тест-система, предназначенная для определения напряженности гуморального иммунного ответа к S. pneumoniae серотипа 14 у привитых пневмококковыми вакцинами, оценки формирования постинфекционного иммунного ответа, мониторинга уровня антител к капсульному полисахариду этого серотипа пневмококка в различных популяционных группах населения, а также оценки антигенной активности бактериальных капсульных полисахаридов S. pneumoniae серотипа 14 в лабораторных и производственных условиях.

Сыворотки крови, полученные при иммунизации животных конъюгированным гексасахаридом, могут быть использованы в лабораторных условиях для типирования штаммов S. pneumoniae серотипа 14.

Синтетический гексасахарид, конъюгированный с лицензированным белком-носителем, например, с CRM 197, можно рассматривать в качестве

кандидата для конструирования пневмококковой вакцины против S.

12

pneumoniae серотипа 14, а также для получения лечебных сывороток, иммуноглобулинов и моноклональных антител к данному серотипу пневмококка.

Реализация результатов исследования

Материалы диссертации используются в цикле лекций кафедры эпидемиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и кафедры эпидемиологии ГОУ ДПО РМАПО Минздрава России.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 16 Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям, 2-5 апреля 2014 г. (г. Кейптаун, Южная Африка); 9 Международном симпозиуме по пневмококкам и пневмококковым заболеваниями, 9-13 марта 2014 г. (г. Хидерабад, Индия).

Апробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова «18» марта 2015 г. Протокол № 2.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №11-04-01187-а «Исследование иммунобиологических свойств олигосахаридов, отвечающих фрагментам капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 14, для разработки подходов к синтезу гликоконъюгатной пневмококковой вакцины» (2011-2013 гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 2 - в материалах международных конференций, 1 - в электронном ресурсе.

Структура и объём работы. Материал диссертации изложен на 135 страницах, проиллюстрирован 13 таблицами, 1 схемой и 10 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 189 источников (их них - 20 отечественных и 169 зарубежных авторов).

Личный вклад автора в проведенное исследование

Состоит в непосредственном участии в планировании исследования, сборе биологического материала, выполнении лабораторных исследований по оценке показателей врожденного и адаптивного иммунитета, проведении аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, интерпретации, анализе и статистической обработке полученных результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Конъюгат БСА с синтетическим гексасахаридом активирует ключевые эффекторы врожденного иммунитета: повышает уровень 1Ы12-позитивных клеток селезенки, вызывает созревание дендритных клеток, стимулирует продукцию цитокинов, увеличивает бактерицидную активность сыворотки крови.

2. Гексасахарид, конъюгированный с БСА, после двукратной

иммунизации мышей в присутствии гидроксида алюминия повышает

количество В-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров в селезенке

14

мышей, приводит к продукции опсонизирующих IgG-антител, формированию иммунологической памяти и защищает животных от заражения S. pneumoniae серотипа 14.

Теоретическая значимость исследования

На примере синтетического гексасахарида, соответствующего фрагменту цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, продемонстрированы особенности активации иммунной системы организма, моделирующие действие бактериального капсульного полисахарида. Полученные данные расширяют представление о действии синтетических олигосахаридов пневмококка на иммунную систему организма, что позволяет оптимизировать подходы к разработке синтетических пневмококковых вакцин и диагностики пневмококковой инфекции.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Ахматов, Элвин Альтафович

выводы

1. Показано, что гексасахарид обладает сопоставимой по величине антигенной активностью с тетра- и октасахаридом в составе конъюгатов с БСА, ингибируя специфические IgG-антитела в антимикробной кроличьей сыворотке соответственно на 75, 71, 74%; в сыворотке к бактериальному КП поствакцинальные антитела к тетра-, гекса- и октасахариду выявляются в титрах 3,4; 3,4 и 3,7 (в Logio).

2. Установлено, что антитела к гексасахариду способны связывать бактериальный КП, ингибируя активность иммунной сыворотки соответственно на 76,5; 81,2 и 83,6%), при концентрациях КП 0,25; 0,5 и 1 мкг.

3. Продемонстрировано, что конъюгированный гексасахарид активирует экспрессию TLR2, вызывает созревание дендритных клеток (CD11с+, CD80+ и МНС 1Г), продуцирующих цитокины IL-lß, IL-6 и TNFa; повышает концентрацию в сыворотке крови мышей IL-lß, IL-10, IFN-y и TNFa; увеличивает бактерицидную активность лейкоцитов крови иммунизированных гликоконъюгатом мышей.

4. Показано, что добавление гидроксида алюминия к конъюгированному гексасахариду увеличивает численность TLR2-позитивных клеток селезенки мышей и зрелых дендритных клеток; повышает продукцию цитокинов дендритными клетками; расширяет спектр и увеличивает концентрацию сывороточных цитокинов (IL-lß, IL-5, IL-6, ILIO, IL-17, GM-CSF, IFN-y, TNFa); усиливает бактерицидную активность лейкоцитов крови иммунизированных мышей.

5. Выявлено, что образование IgG-антител к гексасахариду происходит только после двукратного введения мышам гликоконъюгата (оптимальная доза 10 мкг по углеводу), сорбированного на гидроксиде алюминия; гликоконъюгат без адъюванта не вызывает специфического антителообразования.

6. Установлено, что ревакцинация, проведенная через 47 дней после второй иммунизации, вызывает быстрое (на 4 сутки) образование анамнестических ^в-антител к гексасахариду, которые сохраняются в сыворотке крови животных до 92 дней.

7. Показано, что введение животным конъюгированного гексасахарида, сорбированного на гидроксиде алюминия, увеличивает соотношение С04/СБ8 лимфоцитов, вследствие снижения числа С08+Т-клеток, стимулирует преимущественно В-лимфоциты, увеличивает пул естественных клеток-киллеров, а также экспрессию МНС класса II на лимфоцитах.

8. Установлено, что сыворотка крови мышей, иммунизированных гликоконъюгатом, сорбированным на гидроксиде алюминия, обладает превентивными свойствами и повышает фагоцитоз убитых нагреванием бактерий пневмококка Б.рпеитотае серотипа 14 нейтрофилами и моноцитами периферической крови интактных мышей.

9. Впервые продемонстрировано, что конъюгат БСА с гексасахаридом, сорбированный на гидроксиде алюминия, обладает выраженной протективной активностью и защищает мышей от заражения З.рпеитотае серотипа 14.

АЛГОРИТМ ОЦЕНКИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОСАХАРИДОВ

1. Оценка антигенной активности олигосахаридных лигандов или их коныогатов с белком-носителем в реакции ингибирования ИФА

- исследуемые гликоконыогаты абсорбируют в лунках 96-луночных планшет «Биомедикал» в концентрации 0,2-0,4 мкг в расчете на лунку (подтверждается экспериментально в каждом конкретном случае).

- ингибирование активности ^в-антител проводят в антимикробной сыворотке (мышиная, кроличья), полученной при многократной иммунизации животных живыми или инактивированными микробными клетками исследуемого серотипа пневмококка. Антимикробная сыворотка, предназначенная для оценки ингибирующей способности олигосахаридов, должна иметь титр ^в-антител к капсульному полисахариду не менее 1:800, а оптическая плотность рабочего разведения сыворотки должна находиться в пределах 0,6-1,0. Результат оценивают по снижению оптической плотности сыворотки и проценту ингибирования активности сыворотки.

- при использовании олигосахаридов ингибирование активности сыворотки проводят не мнее чем четырьмя двукратно убывающими концентрациями лигандов, начиная с концентрации 1 мкг/лунка (при необходимости можно провести дальнейшую раститровку концентрации исследуемого антигена или увеличить кратность его разведения). При использовании конъюгированных олигосахаридов для ингибирования ИФА следует учитывать углеводную нагрузку каждого конъюгата и проводить реакцию, как указано выше.

- для постановки реакции ингибирования ИФА целесообразно использовать биотинилированные конъюгаты олигосахаридов, сорбированные на стрептавидиновых плашках.

2. Определение специфической активности исследуемых олигосахаридов в ИФА.

В лунки планшет, на дне которых абсорбирован конъюгированный олигосахарид, в первый ряд вносят гомологичную сыворотку, в другие ряды — антимикробные сыворотки к гетерологичным серотипам пневмококка. Результат оценивают по титру антител, который к гомологичному серотипу пневмококка должен быть не менее 1:800-1:1600, а к гетерологичным серотипам не более 1:100.

3. Оценка способности сывороток к олигосахаридам связывать бактериальный капсулъный полисахарид

- сыворотку, полученную на 14 сутки после двукратной иммунизации мышей олигосахаридами, конъюгированными с белком-носителем в присутствии адъюванта (например, гидроксида алюминия), проверяют на способность связывать капсульный полисахарид соответствующего серотипа пневмококка в реакции ингибирования ИФА. К рабочему разведению исследуемой сыворотки с оптической плотностью (0,6-1,0) прибавляют бактериальный капсульный полисахарид, начиная с концентрации 1 мкг/ лунка, используя не менее четырех двукратно убывающих концентраций бактериального капсульного полисахарида (при необходимости можно провести дальнейшую раститровку дозы или увеличить кратность его разведения). Результат оценивают по снижению оптической плотности сыворотки при длине волны 450 нм и по проценту ингибирования активности сыворотки.

- способность антител к гексасахариду связываться с капсулой живых микробных клеток проводят в реакции агглютинации на стекле, используя в качестве референс-препарата коммерческие серотиповые сыворотки. Результат учитывают по четырехкрестной системе.

4) Определение тшуногенной активности конъюгированных олигосахаридов

Мышей иммунизируют двукратно внутрибрюшинно с интервалом 14 суток конъюгированным олигосхаридом (разовые дозы 1,25; 2,5; 10; 20 мкг в расчете на углевод) в присутствии адъюванта (например, гидроксид алюминия) и получают сыворотку крови через 2 недели после последней иммунизации. Определяют индивидуальные титры антител, используя на каждую иммунизирующую дозу по 6 мышей. Также получают пуловую сыворотку, которую разливают по аликвотам и хранят при температуте от минус 40 до 80 °С. Титр 1§0-антител к олигосахаридам определяют в ИФА при сорбции на планшетах капсульного полисахарида соответствующего серотипа пневмококка или олигосахаридов, конъюгированных с другим белком-ностителем (для исключения перекрестных реакций). При определении титра антител к олигосахаридам также целесообразно использовать биотинилированные конъюгаты соответствующих олигосахаридов, сорбированные на стрептавидиновых плашках (см. пример ниже).

5. Оценка опсонизирующей активности сыворотки крови мышей

Может быть проведена различными методами, в том числе с помощью проточной цитофлуорометрии. Предпочтительно использовать сыворотку крови, полученную от мышей, иммунизированных наибольшей дозой гликоконъюгата, с высоким титром 1§С-антител к олигосахариду.

5. Оценка превентивных свойств сыворотки иммунизированных мышей

Мышам однократно внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу сыворотки с заранее установленным титром антител и через 2 часа заражают вирулентной культурой пневмококка соответствующего серотипа (если существует адекватная экспериментальная модель на животных). Результат

учитыват по гибели животных в опыте и в контроле (интактные).

109

6. Оценка протектиеной активности конъюгированных олигосахаридов

Мышей иммунизируют как в п.4. и заражают через 14 дней соответствующим серотипом пневмококка (если существует адекватная экспериментальная модель на животных). Вакцинацию проводят с раститровкой дозы гликоконъюгата, что позволяет выявить различия между препаратами.

7. Адъювант

Провести иммунизацию с адъювантом и без адъюванта и определить титр антител к олигосахариду в сыворотке крови мышей. В качестве адъюванта для синтетических олигосахаридных конъюгатов целесообразно использовать соли алюминия, в том числе гидроксид алюминия. В этом случае целесообразно оценивать IgG 1 -ответ.

8. Дополнительные тесты

Определение концентрации цитокинов (IL-ip, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNFa, GM-CSF, IFNy) в сыворотке крови животных; оценка экспрессии поверхностных рецепторов, в том числе Толл-подобного рецептора 2; определение поверхностных маркеров Т- (CD4, CD8) и В-лимфоцитов (CD5, CD 19), NK, NKT.

Во всех исследованиях в качестве рефереис-препарата желательно использовать бактериальный капсульный полисахарид.

Пример использования биотинилированных олигосахаридов для конструирования экспериментальной тест-системы

Стрептавидиновая плашка «Pierce» со связывающей способностью 5 пмоль/лунка (фирма Thermo Scientific, США). Выбрана экспериментальная сорбирующая концентрация 15 пмоль/лунка.

Конъюгированный с биотином тетрасахарид S.pneumoniae серотипа 14 (720 мкг/мл = 548617 пмоль). Разводим 10 мкл биотинилированного тетрасахарида в 37 мл ФСБ с Твином 20. Получаем концентрацию 150 пмоль/мл или 15 пмоль в лунке с объемом раствора 100 мкл.

Конъюгированный с биотином гексасахарид S.pneumoniae серотипа 14 (740 мкг/мл = 452100 пмоль). Разводим 10 мкл биотинилированного гесасахарида в 30 мл ФСБ с Твином 20. Получаем концентрацию 150 пмоль/мл или 15 пмоль в лунке с объемом раствора 100 мкл.

Конъюгированный с биотином октасахарид S.pneumoniae серотипа 14 (520 мкг/мл = 259700 пмоль). Разводим 10 мкл биотинилированного октасахарида в 17 мл ФСБ с Твином 20. Получаем концентрацию 150 пмоль/мл или 15 пмоль в лунке с объемом раствора 100 мкл.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ахматов, Элвин Альтафович, 2015 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Белошницкий Г.В., Королева PLC. Серотиповая характеристика штаммов S. pneumoniae в Москве. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014. - №1(74). - С. 90-97.

2. Брико Н.И. Распространенность и возможности профилактики пневмококковых инфекций в мире и России / Н. Брико // Вакцинация. — 2009. — Сентябрь. - www.privivka.ru

3. Ванеева Н.П., Воробьев Д.С., Грищенко Н.В., Курбатова Е.А., Ястребова Н.Е, Калина Н.Г., Елкина С.И., Зубков А.В., Апарин П.Г., Львов В.Л.,.Михайлова Н.А и др. Изучение перекрестной активности антигенных препаратов Streptococcus pneumoniae. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2012. -№5. - С.36-42.

4. Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Волох Ю.В., Кудряшов А.В., Маркова М.Е., Романенко Э.Е., Батуро А.П., Михайлова Н.А. Изучение протективной активности белоксодержащего комплекса антигенов Streptococcus pneumoniae в гомологичной системе. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. -№1.-С. 21-26.

5. Генинг М.Л. Стереонаправленный синтез фрагментов внеклеточного полисахаридного адгезина Staphylococcus aureus. Дис канд хим. наук. М. 2008. - 132 с.

6. Козлов Р.С. Пневмококки: уроки прошлого — взгляд в будущее. МАКМАХ. 2010.-С.25.

7. Козлов Р.С., Чагарян А.Н., Козлова Л.В., Муравьев А.А. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской Федерации. Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2011. - Т. 13. - №2. - С. 177-187.

8. Курбатова Е.А., Ахматов Э.А., Ахматова Н.К., Воробьев Д.С., Егорова Н.Б., Батуро А.П., Романенко Э.Е., Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Цветков Ю.Е., Нифантьев Н.Э. Действие гидроксида алюминия на систему врожденного иммунитета и иммуногенность бактериальных и синтетических антигенов Streptoccoccus pneumoniae. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. - №6. - С.59-66.

9. Курбатова Е.А., Воробьев Д.С., Егорова Н.Б., Елкина С.И., Калина Н.Г., Токарская М.М., Батуро А.П., Романенко Э.Е., Маркова М.Е., Грищенко Н.В., Овечко H.H., Волох Ю.В., Злыгостев С.А., Михайлова H.A. Влияние штамма-продуцента и среды культивирования на перекрестную антигенную активность водорастворимых антигенов Streptococcus pneumoniae. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. - №1. — С.26-33.

10. Миронов К.О., Платонов А.Е., Козлов P.C. Идентификация и серотипирование российских штаммов Streptococcus pneumoniae с применением методик, основанных на ПЦР. Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2011. — Т.13.- №4. —С.104-113.

11. Муравьев A.A., Чагарян А.Н., Братусь Е.В., Перцева Т.А., Карпов И.А., Качанко Е.Ф. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам серотипов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих в раличных регионах Беларуси и Украины, выделенных у детей до 5 лет и пациентов старше 65 лет. Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2013. - Т. 15. - №2.-С. 147-158.

12. Нифантьев Н.Э., Бакиновский JT.B., Кочетков Н.К. Синтез капсулярного полисахарида S. pneumoniae, тип 14. Сообщение 3. Поликонденсация мономера и характеристика полисахарида.

Биоорганическая химия. 1987. - Т. 13. - №8. - С. 1102-1108.

13. Резолюция заседания общественного координационного совета по пневмококковой инфекции в России. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012. - №5 - С.82-83.

14. Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Цветков Ю.Е., Курбатова Е.А., Нифантьев Н.Э. Синтез олигосахаридных фрагментов капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae типа 14 и их неогликоконъюгатов с БСА. Журнал Известия АН. Серия химическая. 2014. - № 2. - С. 511-521.

15. Таточенко В.К., Озерецковский H.A. Иммунопрофилактика. М.

2009.

16. Таточенко В.К. Перспективы развития иммунопрофилактики в России. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.

2010. - №5.-С. 90-98.

17. Таточенко В.К. Пневмококковая инфекция — недооцененная угроза. Журн дет инфекц. 2008. - № 2 . - С.13-17.

18. Харит С.М. Пневмококковые вакцины. В кн.: Вакцины и вакцинация: национальное руководство /под ред. В.В. Зверева, Б.Ф.Семенова, Р.М.Хаитова. -М.: ГОЭТАР-Медиа. 2011. - 880 с.

19. Хоченков Д.А. Роль дендритных клеток мыши в ответе на Т-независимые антигены 2-го типа. Дис канд биол. М. 2012. - 111 с.

20. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: /Учебное пособие /Под ред. Лабинской A.C., Блинковой Л.П., Ещиной A.C. М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - 600 с.

21. Ada G, Isaacs D. Carbohydrate-protein conjugate vaccines. Clin Microbiol Infect. 2003; 9:79-85.

22. Alexandre C, Dubos F, Courouble C, Pruvost I, Varón E, Martinot A. Rebound in the incidence of pneumococcal meningitis in northern

France: effect of serotype replacement. Acta Paediatr. 2010; 99: 168690.

23. Alonso De V, Verheul AF, van Steijn AM, Dekker HA, Feldman RG, Fernandez IM, et al. Epitope specificity of rabbit immunoglobulin G (IgG) elicited by pneumococcal type 23F synthetic oligosaccharide- and native polysaccharide-protein conjugate vaccines: Comparison with human anti-polysaccharide 23F IgG. Infect Immun. 1994; 62: 799-808.

24. AlonsoDeVelasco E, Verheul AF, Verhoef J, Snippe H. Streptococcus pneumoniae: Virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Microbiol Rev. 1995; 59: 591-603.

25. Avanzini MA, Carra AM, Maccario R, Zecca M, Pignatti P, Marconi M, et al. Antibody response to pneumococcal vaccine in children receiving bone marrow transplantation. J Clin Immunol. 1995; 15: 137-44.

26. Avci FY, Kasper DL. How Bacterial Carbohydrates Influence the Adaptive Immune System. Annu Rev Immunol. 2010; 28:29-52.

27. Avci FY, Li X, Tsuji M, Kasper DL. Isolation of carbohydrate-specific CD4(+) T cell clones from mice after stimulation by two model glycoconjugate vaccines. Nature Protocols. 2012; 7:2180-2192.

28. Avci F.Y., Li X., Tsuji M., Kasper DL. Carbohydrates and T cells: A sweet twosome. Semin Immunol. 2013; 25(2): 146-151.

29. Avci FY, Li XM, Tsuji M, Kasper DL. A mechanism for glycoconjugate vaccine activation of the adaptive immune system and its implications for vaccine design. Nat Med. 2011; 17:1602-1610.

30. Bai L, Deng S, Reboulet R, Matthew R, Teyton L, Savage PB, Bendelac A. Natural killer T (NKT)-B-cell interactions promote prolonged antibody responses and long-term memory to pneumococcal capsular polysaccharides. ProcNatl Acad Sei. U. S. A. 2013; 110, 16097-16102.

31. Barrett DJ. Human immune responses to polysaccharide antigens: an analysis of bacterial polysaccharide vaccines in infants. Adv Pediatr.

1985; 32:139-158.

32. Barthelson R, Mobasseri A, Zopf D, Simon P. Adherence of Streptococcus pneumoniae to respiratory epithelial cells is inhibited by sialylated oligosaccharides. Infect Immun. 1998; 66: 1439-44.

33. Benaissa-Trouw B, Lefeber DJ, Kamerling JP, Vliegenthart JFG, Kraaijeveld K, Snippe H. Synthetic polysaccharide type 3-related di-, tri, and tetrasaccharide-CRM197 conjugates induce protection against Streptococcus pneumoniae type 3 in mice. Infect Immun. 2001; 69:4698-4701.

34. Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA, Samuel G, Skovsted IC, Kaltoft MS, Barrell B, Reeves PR, Parkhill J, and Spratt BG. Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS Genet. 2006. 2:e31.

35. Beuvery EC, Van Rossum F, Nagel J. Comparison of the induction of immunoglobulin M and G antibodies in mice with purified pneumococcal type III and meningococcal group C polysaccharides and their protein conjugates. Infect Immun. 1982; 37:15—22.

36. Black S, Shinefield H, Fireman B, Lewis E, Ray P, Hansen JR, Elvin L, Ensor KM, Hackell J, Siber G., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children: Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis. 2000; 19: 187-195.

37. Borrow R, Goldblatt D, Andrews N, Richmond P, Southern J, and Miller E. Influence of prior meningococcal C polysaccharide vaccination on the response and generation of memory after meningococcal C conjugate vaccination in young children. J Infect Dis. 2001; 184:377-380.

38. Breukels MA, Rijkers GT, Voorhorst-Ogink MM, Zegers BJM, Sanders LAM. Pneumococcal conjugate vaccine primes for polysaccharide-

inducible IgG2 antibody response in children with recurrent otitis media acuta. J Infect Dis. 1999; 179: 1152-1156.

39. Briles DE, Ades E, Paton JC, Sampson JS, Carlone GM, Huebner RC, et al. Intranasal immunization of mice with a mixture of the pneumococcal proteins PsaA and PspA is highly protective against nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 2000; 68: 796800.

40. Briles DE, Hollingshead SK, Nabors GS, Paton JC, Brooks-Walter A. The potential for using protein vaccines to protect against otitis media caused by Streptococcus pneumoniae. Vaccine. 2000; 19 (Suppl 1) : S87-S95.

41. Brown EJ, Joiner KA, Cole RM, Berger M. Localization of complement component 3 on Streptococcus pneumoniae: anticapsular antibody causes complement deposition on the pneumococcal. Capsule Infect Immun. 1983; 39: 403-409.

42. Brueggemann AB, Pai R, Crook DW, Beall B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog 2007; 3:el68.

43. Butler JC. Epidemiology of pneumococcal serotypes and conjugate vaccine formulations. Microb Drug Resist. 1997; 3(2): 125-129.

44. CDC. Prevention of pneumococcal disease: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR. 1997; 46(8): 1-24.

45. CDC. Progress in introduction of pneumococcal conjugate vaccine— worldwide, 2000-2008. MMWR. 2008; 57 : 1 148-51.

46. Christensen P, Hovelius B, Prellner K, Rosen C, Christensen KK, Kurl DN, Larsson L, Stjernquist-Desatnik A, Schalen C. Effects of pneumococcal vaccination on tonsillo-pharyngitis and upper respiratory tract flora. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1985;78(2):161-166.

47. Coffey T, Berron S, Daniels M, Garcia-Leoni ME, Cercenado E, Bouza E, Fenoll A, Spratt BG. Multipal antibiotic resistance S. pneumoniae recovered from Spanish hospitals (1988-1994): novel major clones of serotype 14, 19 F and 15 F. Microbiology. 1996; 142 : 2742-2757.

48. Colling, RG, Pearson TC, and Brown J C. Association of carbohydrate-specific cold agglutinin antibody production with immunization by group C, group B type III, and Streptococcus type XIV streptococcal vaccines. Infect Immun. 1983; 41:205-213.

49. Coutinho A, Moller G. B cell mitogenic properties of thymus-independent antigens. Nature New Biol. 1973; 245:12-14.

50. Cavallari M, Stallforth P, Kalinichenko A, Rathwell DCK., Gronewold TMA, Adibekian A, Mori L, Landmann R, Seeberger PH, & Libero G. Asemisynthetic carbohydrate-lipid vaccine that protects against S. pneumoniae in mice. Nature Chemical Biology. Advance online publication. 2014;. 1-7 www.nature.com/naturechemicalbiology/

51. Crane DT, Bolgiano B, and Jones C.. Comparison of the diphtheria mutant toxin, CRM 197, with a Haemophilus influenzae type-b polysaccharide-CRM197 conjugate by optical spectroscopy. Eur J Biochem. 1997; 246:320-327.

52. Dagan R, Eskola J, Leclerc C, Leroy O. Reduced response to multiple vaccines sharing common protein epitopes that are administered simultaneously to infants. Infect Immun 1998; 66 : 2093-2098.

53. Deng S, Bai L, Reboulet R, Matthew R, Engler DA, Teyton L, Bendelacc A, Savage PB. A peptide-free, liposome-based oligosaccharidevaccine, adjuvanted with a natural killer T cell antigen, generates robust antibody responses in vivo. Chem Sei. 2014; (4): 14371441.

54. Douglas RM, Paton JC, Duncan SJ. Hansman DJ. Antibody response to pneumococcal vaccination in children younger than five years of age. J

Infect Dis 1983; 148:131-137.

55. Duan J, Avci FA, Kasper DL. Microbial carbohydrate depolymerization by antigen-presenting cells: Deamination prior to presentation by the MHCII pathway. Proc Natl Acad Sei USA. 2008; 5105:5183.

56. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA., et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956;. 28 (3) : 350-356.

57. Echchannaoui H, Frei K, Schnell C, Leib SI, Zimmerli W, and Landmann R. Toll-like receptor 2-deficient mice are highly suceptible to Streptococcus pneumoniae meningitis because of reduced bacterial clearing and enhanced inflammation. J Infect Dis. 2002;186:798-806.

58. Eskola J. Polysaccharide-based pneumococcal vaccines in the prevention of acute otitis media. Vaccine. 2000; 19 (Suppl 1) : S78-S82.

59. Feikin DR, Klugman KP, Facklam RR, Zell ER, Schuchat A, Whitney CG. Increased prevalence of pediatric pneumococcal serotypes in elderly adults. Clin Infect Dis. 2005; 41:481-487.

60. Finne J, Leinonen M, Makela PH. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitis. Implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet. 1983; 2 : 355-357.

61. Galan MC, Dumy P, Renaudet O. Multivalent glyco(cyclo)peptides. Chem Soc Rev. 2013; 42:4599-4612.

62. Gilbert C, Robinson K, Le Page RWF, and Wells JM. Heterologous expression of an immunogenic pneumococcal type 3 capsular polysaccharide in Lactococcus lactis. Infect. Immun. 2000; 68:3251— 3260.

63. Gold R, Lepow ML, Goldschneider I, Draper TL, and Gotschlich EC. Clinical evaluation of group A and group C meningococcal polysaccharide vaccines in infants. J Clin Investig. 1975; 56:1536-1547.

64. Goldblatt D. Conjugate vaccines. Clin Exp Immunol. 2000; 119:1—3.

65. Guttormsen HK, Sharpe AH, Chandraker AK, Brigtsen AK, Sayegh MM, Kasper DL. Cognate stimulatory B-Cell-T-Cell interactions are critical for T-cell help recruited by glycoconjugate vaccines. Infect Immun. 1999; 67:6375-6384.

66. Guttormsen HK, Wetzler LM, Finberg RW, Kasper DL. Immunologic memory induced by a glycoconjugate vaccine in a murine adoptive lymphocyte transfer model. Infect Immun. 1998; 66:2026-2032.

67. Guttormsen HK., Baker CJ, Nahm MH, Paoletti LC, Zughaier SM, Edwards MS and Kasper DL. Type III group B streptococcal polysaccharide induces antibodies that cross-react with Streptococcus pneumoniae type 14. Infect Immun. 2002; 70:1724—1738.

68. Hanage WP, Finkelstein JA, Huang SS, Pelton SI, Stevenson AE, Kleinman K et al. Evidence that pneumococcal serotype replacement in Massachusetts following conjugate vaccination is now complete. Epidemics. 2010;2 (2) : 80-84.

69. Hausdorff WP, Bryant J, Kloek C, Paradiso PR, Siber GR. The contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use. Part II. Clin Infect Dis. 2000; 30 : 122-140.

70. Hausdorff WP, Yothers G, Dagan R, Kilpi T, Pelton SI, Cohen R, Jacobs MR, Kaplan SL, Levy C, Lopez EL, Mason EO Jr, Syriopoulou V, Wynne B, Bryant J. Multinational study of pneumococcal serotypes causing acute otitis media in children. Pediatr Infect Dis J. 2002; 21 : 1008-1016.

71. Hausdorff WP. Invasive pneumococcal disease in children: geographic and temporal variations in incidence and serotype distribution. Eur J Pediatr. 2002; 161 (Suppl. 2):S 135-139.

72. Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, et al. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate

vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis. 2000; 30 : 100-121.

73. Heimburg-Molinaro J, Lum M, Vijay G, Jain M, Almogren A, Rittenhouse-Olson K. Cancer vaccines and carbohydrate epitopes.Vaccine. 2011; 29 : 8802-8826.

74. Hutchison BG, Oxman AD, Shannon HS, Lloyd S, Altmayer CA, Thomas K. Clinical effectiveness of pneumococcal vaccine. Metaanalysis. Can Fam Physician. 1999; 45 : 2381-2393.

75. Hyams C, Yuste J, Bax K, Camberlein E, Weiser JN, Brown JS. Streptococcus pneumoniae resistance to complement-mediated immunity is dependent on the capsular serotype. Infect Immun. 2010; 78 : 716725.

76. Idanpaan-Heikkila I, Simon PM, Zopf D, Vullo T, Cahill P, Sokol K, et al. Oligosaccharides interfere with the establishment and progression of experimental pneumococcal pneumonia. J Infect Dis 1997; 176 : 704712.

77. InostrozaJ, VinetAM, Rétamai G, et al. Influence of patient age on Streptococcus pneumoniae serotypes causing invasive disease. Clin Diagn Lab Immunol. 200; 8 : 556-559.

78. Jamal F, Pit S, Isahak I, Abdullah N, Zainal Z, Abdullah R, Henrichsen J. Pneumococcal infection in hospitalized patients: a four-year study in Malaysia. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1987; 18 : 79-84.

79. Janeway CA, Travers P, Walport M, Chlomchik M. Immunobiology. 6th ed. Garland Science Publishing; New York: 2005.

80. Jansen WT, Snippe H. Short-chain oligosaccharide protein conjugates as experimental pneumococcal vaccines. Indian J Med Res. 2004; 119 : (Suppl). P.7-12.

81. Jansen WT, Hogenboom S, Thijssen MJ, Kamerling JP, Vliegenthart JF, Verhoef J, et al. Synthetic 6B di-, tri-, and tetrasaccharide-protein conjugates contain pneumococcal type 6A and 6B common and 6B-

specific epitopes that elicit protective antibodies in mice. Infect Immun. 2001;69:787-793.

82. Jauneikaitea E., Jefferies JM, Hibberdb ML, Clarkea SC. Prevalence of Streptococcus pneumoniae serotypes causing invasive and non-invasive disease in South East Asia: A review. Vaccine. 2012; 30: 3503- 3514.

83. Jin P, Kong F, Xiao M, Oftadeh S, Zhou F, Liu C, et al. First report of putative Streptococcus pneumoniae serotype 6D among nasopharyngeal isolates from Fijian children. J Infect Dis. 2009; 200 (9): 1375-1380.

84. Joffe MD, Alpern ER. Occult pneumococcal bacteremia: a review. Pediatr Emerg Care. 2010; 6 : 448-454.

85. Johnson HL, Deloria-Knoll M, Levine OS, Stoszek SK, Freimanis Hance L, Reithinger R, et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 2010;7 (10), el000348.

86. Joosten JAF, Lazet BJ, Kamerling JP, and Vliegenthart JFG. Chemo-enzymatic synthesis of tetra-, penta-, and hexasaccharide fragments of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14. Carbohydr Res. 2003; 338:2629-2651.

87. Joosten JAF, Kamerling JP, and Vliegenthart JFG. Chemoenzymatic synthesis of a tetra- and octasaccharide fragment of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 14. Carbohydr Res 2003; 338: 2611-2627.

88. Kamerling JP. Pneumococcal polysaccharides: a chemical view. In: Streptococcus pneumoniae molecular biology and mechanism of disease. Tomasz A. (ed). Mary Ann Libert, Inc. 2000; 81-114.

89. Kato M, Neil TK, Fearnley DB, McLellan AD, Vuckovic S, and Hart DN. Expression of multilectin receptors and comparative FITC-dextranuptake by human dendritic cells. Int Immunol. 2000; 12:1511—

90. Kellner JD. Drug-resistant Streptococcus pneumoniae infections: clinical importance, drug treatment, and prevention. Semin Respir Infect 2001; 16 : 186-195.

91. Khan A, Chen Q, Wu Z-Q, Paton JC, Snapper CM. Both innate immunity and type 1 humoral immunity to Streptococcus pneumoniae are mediated by MyD88 but differ in their relative levels of dependence on Toll-like receptor 2. Infection and immunity. 2005; 73(1) : 298-307.

92. Kikuchi J, Imakiire T, Hyodo T. Minimal change nephritic syndrome, lymphadenopathy and hyperimmunoglobulinemia after immunization with a pneumococcal vaccine. Clin Nephrol. 2002; 58 : 68-72.

93. King JC Jr, Vink PE, Farley JJ, Parks M, Smilie M, Madore D, et al. Comparison of the safety and immunogenicity of a pneumococcal conjugate with a licensed polysaccharide vaccine in human immunodeficiency virus and non-human immunodeficiency virus-infected children. Pediatr Infect Dis J. 1996; 15 : 192-196.

94. Kinjo Y, Illarionov P, Vela JL, Pei B, Gerardi E, Li X, Li Y, Imamura M, Kaneko Y, Okawara A, Miyazaki Y, G'omez-Velasco A, Rogers P, Dahesh S, Uchiyama S, Khurana A, Kawahara K, Yesilkaya H, Andrew PW, Wong C-W, Kawakami K, Nizet V, Besra GS, Tsuji M, Zajonic DM, Kronenberg M. Invariant natural killer T cells recognize glycolipids from pathogenic Gram-positive bacteria. Nat. Immunol. 2011; 12: 966— 974.

95. Knapp S, Wieland CW, van't Veer C, Takeuchi O, Akira S, Florquin S, and van der Poll T. Toll-like receptor 2 plays a role in the early inflammatory response to murine pneumococcal pneumonia but does not contribute to anti-bacterial defense. J Immunol. 2004; 172:3132-3138.

96. Kochetkov NK, Nifant'ev NE, Backinowsky LV. Synthesis of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae typel4.

Tetrahedron. 1987; 43(13): 3109-3121.

97. Koedel U, Angele B, Rupprecht T, Wagner H, Roggenkamp A, Pfister H-W, and Kirschning CJ. Toll-like receptor 2 participates in mediation of immune response to experimental pneumococcal meningitis. J Immunol. 2003; 170:438-444.

98. Kurbatova EA, Vorobiov DS, Semenova IB, Sukhova EV, Yashunsky DV, Tsvetkov YE, Nifantiev NE. Development of approaches to creation of experimental test system for evaluation of antigenic activity of synthetic oligosaccharide ligands related to fragments of the Streptococcus pneumoniae type 14 capsular polysaccharide. Biochemistry (Moscow). 2013; 78 : 819-824.

99. Laferriere CA, Sood RK, de Muys JM, Michon F, and Jennings HJ. Streptococcus pneumoniae type 14 polysaccharide-conjugate vaccines: length stabilization of opsonophagocytic conformational polysaccharide epitopes. Infect Immun. 1998; 66:2441-2446.

100. Laferriere CA, Sood RK, de Muys JM, Michon F, and Jennings HJ. The synthesis of Streptococcus pneumoniae polysaccharide-tetanus toxoid conjugates and the effect of chain length on immunogenicity. Vaccine. 1997; 15:179-186.

101. Landesman SH, Schiffman G. Assesment of the antibody response to pneumococcal vaccine in high-risk populations. Rev. Infect. Dis. 1981; 3: 184-186.

102. Lee LH, Lee CJ, Frasch CE. Development and evaluation of pneumococcal conjugate vaccines: clinical trials and control tests. Crit Rev Microbiol. 2002; 28 : 27-41.

103. Lefeber DJ, Benaissa-Trouw B, Vliegenthart JFG, Kamerling JP, Jansen WTM, Kraaijeveld K, and Snippe H. Thl-directing adjuvants increase the immunogenicity of oligosaccharide-protein conjugate vaccines related to Streptococcus pneumoniae type 3. Infect Immun. 2003;

71:6915-6920.

104. Li H, Nookala S, Re F. Aluminum hydroxide adjuvants activate caspase-1 and induce IL-1 and IL-18 release. The Journal of Immunology. 2007; 178:5271-5276.

105. Lin TY, Shah NK, Brooks D, Garcia CS. Summary of invasive pneumococcal disease burden among children in the Asia-Pacific region. Vaccine 2010; 48:7589-7605.

106. Lindberg B, Lonngren J, Powell DA. Structural studies on the specific type 14 pneumococcal polysaccharide. Carbohydr Res. 1977; 58 : 177186.

107. Lindblad EB. Are mineral adjuvants triggering TLR2/TLR4 on dendritic cells by a secondary cascade reaction in vivo through the action of heat shock proteins and danger signals? Vaccine. 2006; 24: 697-698.

108. Liu Y, Goff RD, Zhou D, Mattner J, Sullivan BA, Khurana A, Cantu C, Altman JD, Teyton L, Bendelac A, Savage PBJ. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Immunol Methods. 2006; 312: 34-39.

109. Looijesteijn PJ, van Casteren WH, Tuinier R, Doeswijk-Voragen CH, and Hugenholtz J. Influence of different substrate limitations on the yield, composition and molecular mass of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris in continuous cultures. J. Appl. Microbiol. 2000; 89:116-122.

110. Malley R, Henneke P, Morse SC, Cieslewicz MJ, Lipsitch M, Thompson CM, Kurt-Jones E, Paton JC, Wessels MR, and Golenbock DT. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100:19661971.

111. Masja N, Groot N, Godefrooij J, Kleerebezem M. Heterologous expression of the pneumococcal serotype 14 polysaccharide in

Lactococcus lactis requires Lactococcal epsABC regulatory genes. Applied and Environmental Microbiology. 2008; 74(3) : 912-915.

112. Mawas F, Niggemann J, Jones C, Corbel MJ, Kamerling JP, and Vliegenthart JFG. Immunogenicity in a mouse model of a conjugate vaccine made with a synthetic single repeating unit of type 14 pneumococcal polysaccharide coupled to CRM 197. Infect Immun. 2002; 70:5107-5114.

113. Mcintosh ED, Fritzell B, Fletcher MA. Burden of paediatric invasive pneumococcal disease in Europe, 2005. Epidemiol Infect. 2007; 1354 : 644-656.

114. Mekada E, and Uchida T. Binding properties of diphtheria toxin to cells are altered by mutation in the fragment A domain. J Biol Chem. 1985; 260:12148-12153.

115. Melin M, Trzcinski K, Antonio M, Meri S, Adegbola R, Kaijalainen T, Kayhty H, Vakevainen M. Serotyperelated variation in susceptibility to complement deposition and opsonophagocytosis among clinical isolates of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 2010; 78 : 5252-5261.

116. Melin M, Jarva H, Siira L, Meri S, Kayhty H, Vakevainen M. Streptococcus pneumoniae capsular serotype 19F is more resistant to C3 deposition and less sensitive to opsonophagocytosis than serotype 6B. Infect Immun. 2009; 77:676-684.

117. Meltzer U, Goldblatt D. Pneumococcal polysaccharides interact with human dendritic cells. Infection and Immunity. 2006; 74 (3) : 1890—1895.

118. Meyer M, Gahr M. Immunological principles of polysaccharide-protein conjugate vaccination. Monatsschr Kinderheilkd. 1993; 141 : 770-776.

119. Mierau I, and Kleerebezem M. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Biotechnol. 2005; 68:705-717.

120. Mitchison NA. T-cell-B-cell cooperation. Nat Rev Immunol. 2004;

4:308-312.

121. Mitchison NA. The carrier effect in the secondary response to hapten-protein conjugates. II. Cellular cooperation. Eur J Immunol. 1971; 1:1825.

122. Mitchison NA. The carrier effect in the secondary response to haptenprotein conjugates. I. Measurement of the effect with transferred cells and objections to the local environment hypothesis. Eur J Immunol. 1971; 1:10-17.

123. Mond JJ, Lees A, and Snapper CM. T cell-independent antigens type 2. Annu Rev Immunol. 1995; 13: 655-692.

124. Morelli L, Poletti L, Lay L. Carbohydrates and Immunology: Synthetic Oligosaccharide Antigens for Vaccine Formulation. Eur J Org Chem. 2011; 29: 5723-5777.

125. Nairn JO, van Oss CJ, Wu W, Giese R. F, and Nickerson PA. Mechanisms of adjuvancy: I-Metal oxides as adjuvants. Vaccine. 1997;15: 1183-1193.

126. Nichol KL, Baken L, Wuorenma J, Nelson A. The health and economic benefits associated with pneumococcal vaccination of elderly persons with chronic lung disease. Arch Intern Med. 1999; 159 : 2437-2442.

127. Nielsen SV, Sorensen UB, Henrichsen J. Antibodies against pneumococcal C-polysaccharide are not protective. Microb Pathog. 1993; 14 : 299-305.

128. Niggemann J, Kamerling JP, Vliegenthart JF. Beta-1,4-galactosyltransferase-catalyzed synthesis of the branched tetrasaccharide repeating unit of Streptococcus pneumoniae type 14. Bioorg Med Chem. 1998; 6 : 1605-1612.

129. O'Brien KL, Wolfson LJ, Watt JP, Henkle E, Deloria-Knoll M, McCall N, Lee E, Mulholland K, Levine OS, Cherian T; Hib and Pneumococcal Global Burden of Disease Study Team. Burden of disease caused by

Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 2009;374 : 893-902.

130. Ongkasuwan J, Valdez TA, Multen KG, Mason EOJr., Kaplan SL. Pneumococcal mastoiditis in children and the emergence of multidrug-resistant serotype 19A isolates. Pediatrics. 2008; 122(1): 34-9.

131. Ovodov YS. Bacterial Capsular Antigens. Structural Patterns of Capsular Antigens. Biochemistry (Moscow). 2006; 71:937-954."

132. Pandya GA, McEllistrem MC, Venepally P, Holmes MH, Jarrahi B, Sanka R, et al. Monitoring the long-term molecular epidemiology of the pneumococcus and detection of potential 'vaccine escape' strains. PLoS One 2011; 6(l):el5950.

133. Park IH, Park S, Hollingshead SK, Nahm MH. Genetic basis for the new pneumococcal serotype, 6C. Infect Immun. 2007;75( (9):4482^1489.

134. Park IH, Pritchard DG, Cartee R, Brandao A, Brandileone MC, Nahm MH. Discovery of a new capsular serotype (6C) within serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol. 2007; 45 (4) : 1225-1233.

135. Peri F. Clustered carbohydrates in synthetic vaccines. Chem Soc Rev. 2013;42:4543-4556.

136. Pichichero ME, Porcelli S, Treanor J, Anderson P. Serum antibody responses of weaning mice and two-year-old children to pneumococcal-type 6A protein conjugate vaccines of differing saccharide chain lengths. Vaccine. 1998; 16 : 83-91.

137. Pietz MW, Maus U, Krug N, Welte T, Lode H. Pneumococcal vaccines: mechanism of action, impact on epidemiology and adaption of the species. Review. International Journal of Antimicrobial Agents. 2008; 32 : 199-206

138. Plotkin S, Orenstein W, Offit P. Vaccines. 5th ed.Fifth ed. Saunders Elsevier Inc; 2008. Section 1. General aspects of vaccination. Chapter 2. Seigrist CA. Vaccine immunology. 17-36.

139. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization—WHO position paper. Wkly Epidemiol Ree. 2007; 82 : 93-104.

140. Pollock KG, Conacher M, Wei XQ, Alexander J, and Brewer J M.Interleukin-18 plays a role in both the alum-induced T helper 2 response and the T helper 1 response induced by alum-adsorbed interleukin-12. Immunology. 2003; 108:137-143.

141. Pomat WS, Lehmann D, Sanders RC, Lewis DJ, Wilson J, Rogers S, et al. Immunoglobulin G antibody responses to polyvalent pneumococcal vaccine in children in the highlands of Papua New Guinea. Infect Immun. 1994; 62 : 1848-1853.

142. Pozsgay V. Recent developments in synthetic oligosaccharide-based bacterial vaccines. Curr Top Med Chem. 2008; 8 : 126-140.

143. Prevention of pneumococcal disease among infants and children — use of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine ans 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. MMWR Recomm Rep. 2010; 59 (RR-11) : 118.

144. Prymula R, Peeters P, Chrobok V, Kriz P, Novakova E, Kaliskova E, Kohl I, Lammel P, Poolman J, Prieels J-P, and Schuerman L. Pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both Streptococcus pneumoniae and non-typeable Haemophilus influenzae: a randomised double-blind efficacy study. Lancet. 2006; 367:740-748.

145. Reinter RR, Kaufhold A, Kuhnemund O, Luttichen R. Serum antibody responses to vaccination with 23-valent pneumococcal vaccine in spleenectomized patients. Int J Med Microbiol Virol Parasitol Infect Dis. 1994; 281 : 481-490.

146. Rennels MB, Edwards KM, Keyserling HL, Reisinger KS, Hogerman DA, Madore DV, Chang I, Paradiso PR, Malinoski FJ, Kimura A. Safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal vaccine conjugated to

CRM 197 in United States infants. Pediatrics. 1998; 101: 604-611.

147. Requejo HI. Polyvalent pneumococcal polysaccharide vaccines; a review of the literature. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 1993; 48 : 130-138.

148. Rijkers GT, Sanders LA, Zegers BJ. Anti-capsular polysaccharide antibody deficiency states. Immunodeficiency. 1993; 5 : 1-21.

149. Robbins JB, Austrian R, Lee CJ, Rastogi SC, Schiffman G, Henrichsen J, et al. Considerations for formulating the secondgeneration pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups. J Infect Dis. 1983; 148 : 1136-1159.

150. Romero-Steiner S, Musher DM, Cetron MS, Pais LB, Groover JE, Fiore AE, et al. Reduction in functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae in vaccinated elderly individuals highly correlates with decreased IgG antibody avidity. Clin Infect Dis. 1999; 29 : 281-288.

151. Rusen ID, Fraser-Poberts MD. Nasopharingeal pneumococcal colonization among Kenyan children: antibiotic resistance, strain types and associations with human immunodeficiency virus type 1 infection. Ped Infect Dis. 1997; 16 : 656-662.

152. Safari D, Dekker HA, de Jong B, Rijkers GT, Kamerling JP, Snippe H. Antibody- and cell-mediated immune responses to a synthetic oligosaccharide conjugate vaccine after booster immunization.Vaccine. 2011. - 29(38):6498-504.

153. Safari D, Dekker HA, Rijkers G, Snippe H. Codelivery of adjuvants at the primary immunization site is essential for evoking a robust immune response to neoglycoconjugates. Vaccine. 2011; 29(4):849-54.

154. Safari D, Marradi M, Chiodo F, Th Dekker HA, Shan Y, Adamo R, Oscarson S, Rijkers GT, Lahmann M, Kamerling JP, Penades S, Snippe IT. Gold nanoparticles as carriers for a synthetic Streptococcus pneumoniae type 14 conjugate vaccine. Nanomedicine (Lond).

2012;7(5):651-662.

155. Safari D, Dekker HAT, Joosten AF. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against S. pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 2008; 76 (10) : 46154623.

156. Schneerson R, Barrera O, Sutton A, Robbins JB. Preparation, characterization,and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. J Exp Med. 1980; 152:361-376.

157. Schreiber JR, Jacobs MR. Antibiotic-resistant pneumococci. Pediatr Clin North Am. 1995; 42 : 519-37.

158. Schwandner R, Dziarski R, Wesche H, Rothe M, and Kirschning CJ. Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by Toll-like receptor 2. J. Biol. Chem. 1999; 274:17406-17409.

159. Sen G, Khan AQ, Chen Q, Snapper CM. In vivo humoral immune responses to isolated pneumococcal polysaccharides are dependent on the presence of associated TLR ligands. The Journal of Immunology. 2005;175:3084-3091.

160. Sharon N, Ofek I. Safe as mother's milk: Carbohydrates as future anti-adhesion drugs for bacterial diseases. Glycoconj J. 2000; 17 : 659-64.

161. Sniadack DH, Schwartz B, Lipman H, Bogaerts J, Butler JC, Dagan R, et al. Geographic and temporal differences in serotype and serogroup distribution of sterile site pneumococcal isolates from children -Implications for vaccine strategies. Pediatr Infect Dis J. 1995; 14 : 503510.

162. Snippe H, van Dam JE, Van Houte AJ, Willers JM, Kamerling JP, Vliegenthart JF. Preparation of a semisynthetic vaccine to Streptococcus pneumoniae Type 3. Infect Immun 1983; 42 : 842-844.

163. Sorensen RU, Leiva LE, Giangrosso PA, Butler B, Javier FC III, Sacerdote DM, et al. Response to a heptavalent conjugate Streptococcus

pneumoniae vaccine in children with recurrent infections who are unresponsive to the polysaccharide vaccine. Pediatr Infect Dis J. 1998; 17 : 685-691.

164. Soubal JP, Peña L, Santana D, Valdés Y, García D, Pedroso J, Cardoso F, González IT, Fernández V, Vérez V. Procedimiento de conjugación del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 6B a toxoide tetánico. Biotecnol Apl. 2013;.30(3) :199-215.

165. Sorensen UB, Henrichsen J, Chen HC, and Szu SC. Covalent linkage between the capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcus pneumoniae revealed by immunochemical methods. Microb Pathog. 1990; 8:325-334.

166. Stein KE. Thymus-independent and thymus-dependent responses to polysaccharide antigens. J Infect Dis. 1992; 165 (Suppl 1) : 49-52.

167. Stephen TL, Fabri M, Groneck L, Roehn TA, Hafke H, Robinson N, et al. Transport of Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide in MHC class II tubules. Plos Pathogens. 2007:3: e32.

168. Straetemans M, Sanders EA, Veenhoven RH, Schilder AG, Damoiseaux RA, Zielhuis GA. Pneumococcal vaccines for preventing otitis media. Cochrane Database Syst Rev. 2002; 2 : CD001480.

169. Sun H, Pollock KG, and Brewer JM. Analysis of the role of vaccine adjuvants in modulating dendritic cell activation and antigen presentation in vitro. Vaccine. 2003; 21: 849-855.

170. Szu SC, Oravec LS. Detection of "neutral" type 7F and type 14 pneumococcal capsular polysaccharides by immunoelectrophoresis. J Clin Microbiol. 1982; 15(6): 1172-1175.

171. Tan TQ. Pneumococcal conjugate vaccines - Implications for community antibiotic prescribing. Curr Opin Microbiol. 2000; 3 : 502507.

172. Tong HH, Mclver MA, Fisher LM, DeMaria TF. Effect of lacto-N-

neotetraose, asialoganglioside-GMl and neuraminidase on adherence of otitis media-associated serotypes of Streptococcus pneumoniae to chinchilla tracheal epithelium. Microb Pathog. 1999; 26 : 111-119.

173. Torling J, Hedlund J, Konradsen HB, and Ortqvist A.. Revaccination with the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine in middle-aged and elderly persons previously treated for pneumonia. Vaccine. 2003; 22:96-103.

174. Trotter CL, McVernon J, Ramsay ME, Whitney CG, Mulholland EK, Goldblatt D, et al. Optimising the use of conjugate vaccines to prevent disease caused by Haemophilus influenza type b, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae. Vaccine. 2008; 26:4434-^4445.

175. Truck J, Lazarus R, Clutterbuck EA, Bowman J, Kibwana E, Bateman EA, et al. The zwitterionic type I Streptococcus pneumoniae polysaccharide does not induce memory B cell formation in humans. Immunobiology. 2013; 218:368-372.

176. Turley SJ, Inaba K, Garrett WS, Ebersold M, Unternaehrer J, Steinman RM, and Mellman I. Transport of peptide-MHC class II complexes in developing dendritic cells. Science. 2000; 288:522-527.

177. Ukkonen P, Varis K, Jernfors M, Herva E, Jokinen J, Ruokokoski E, et al. Treatment of acute otitis media with an antiadhesive oligosaccharide: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2000; 356 : 1398-402.

178. van Dam JE, Fleer A, Snippe H. Immunogenicity and immunochemistry of Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides. Antonie Van Leeuwenhoek. 1990; 58 : 1-47.

179. Velez CD, Lewis CJ, Kasper DL, Cobb BA. Type I Streptococcus pneumoniae carbohydrate utilizes a nitric oxide and MHC II-dependent pathway for antigen presentation. Immunology. 2009; 127:73-82.

180. Verheul AFM, Versteeg AA, de Reuver MJ, Jansze M, and Snippe H.

Modulation of the immune response to pneumococcal type 14 capsular polysaccharide-protein conjugates by the adjuvant Quil A depends on the properties of the conjugates. Infect Immun. 1989; 57:1078-1083.

181. Verheul AFM, Versteeg AA, Westerdaal NAC, van Dam GJ, Jansze M, and Snippe H. Measurement of the humoral immune response against Streptococcus pneumoniae type 14-derived antigens by an ELISA and ELISPOT assay based on biotin-avidin technology. J Immunol Methods. 1990; 126:79-87.

182. Weinberger DM, Harboe ZB, Sanders EA, Ndiritu M, Klugman KP, Rückinger S, Dagan R, Adegbola R, Cutts F, Johnson HL, O'Brien KL, Scott JA, Lipsitch M. Association of serotype with risk of death due to pneumococcal pneumonia: a meta-analysis. Clin Infect Dis. 2010; 51 : 692-699.

183. Weintraub A. Immunology of bacterial polysaccharide antigens. Carbohydr Res. 2003;338:2539-2547.

184. Wenzel RP, Edmond MB. Managing antibiotic resistance. N Engl J Med. 2000; 343 : 1961-1963.

185. Wessels MR, Kasper DL. Antibody recognition of the type 14 pneumococcal capsule. Evidence for a conformational epitope in a neutral polysaccharide. J Exp Med. 1989; 169(6):2121 -1231.

186. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, Harrison LH, Lexau C, Reingold A, et al. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States. N Engl J Med. 2000; 343 : 1917-1924.

187. WFIO. World Health Organisation. Available + from: http://www.who.int/nuvi/pneumococcus/en/ [cited 23.05.11].

188. Zamze S, Martinez-Pomares L, Jones FI, Taylor PR, Stillion RJ, Gordon S, and Wong SY. Recognition of bacterial capsular polysaccharides and lipopolysaccharides by the macrophage mannose receptor. J Biol Chem. 2002; 277:41613-41623.

189. Zysk G, Bongaerts RJ, ten Thoren E, Bethe G, Hakenbeck R, Heinz HP.