Деградация атразина по механизму окислительного связывания, катализируемого грибной лакказой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Давидчик, Валентина Николаевна

• Давидчик, Валентина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Давидчик, Валентина Николаевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лакказы: распространение и роль в окружающей среде.

1.1.1. Ферментативная активность почв.

1.1.2. Общая характеристика лакказ как представителей оксидоредуктаз.

1.1.3. Физиологические функции лакказ.

1.1.4. Участие лакказы в процессах трансформации ксенобиотиков гуминовыми кислотами.

1.2. Гуминовые кислоты и их функции в биосфере.

1.2.1. Общая характеристика состава и структуры гуминовых кислот.

1.2.2. Взаимодействие гуминовых кислот с ферментами.

1.2.3. Участие гуминовых кислот в деградации ксенобиотиков.

1.3. Атразин: применение и поведение в окружающей среде.

1.3.1. Общая характеристика и применение атразина.

1.3.2. Поведение атразина в окружающей среде.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение и характеристика лакказы Coriolus hirsutus.

2.1.1. Жидкофазное культивирование Coriolus hirsutus.

2.1.2. Выделение и очистка лакказы Coriolus hirsutus.

2.1.3. Определение активности лакказы.

2.2. Выделение, физико-химическая и биологическая характеристика препарата гуминовых кислот.

2.2.1. Выделение гуминовых кислот угля.

2.2.2. Элементный анализ.

2.2.3. Эксклюзионная хроматография.

2.2.4. ЯМР спектроскопия.

2.2.5. Оценка биологической активности (биотест).

2.3. Отбор и характеристика почвенных образцов.

2.3.1. Отбор почвенных образцов.

2.3.2. Определение кислотности.

2.3.3. Определение содержания органического углерода.

2.3.4. Определение содержания обменных катионов.

2.3.5. Определение гранулометрического состава.

2.4. Определение атразина и его основных метаболитов.

2.5. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде.

2.5.1. Взаимодействие лакказы с атразином.

2.5.2. Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами.

2.5.3. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами.

2.6. Изучение влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гетерогенной среде.

2.6.1. Изучение кинетики адсорбции атразина почвами.

2.6.2. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с почвами.

2.7 Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов.

2.7.1. Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов на перлите.

2.7.2. Проведение лабораторно-вегетационных экспериментов на почве.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ.

3.1. Выделение и характеристика лакказы.

3.2. Выделение, физико-химическая и биологическая характеристика препарата гуминовых кислот.

3.2.1. Характеристика физико-химических свойств гуминовых кислот.

3.2.2. Характеристика биологических свойств гуминовых кислот.

3.3. Отбор и характеристика почвенных образцов.

3.4. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде.

3.4.1. Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами.

3.4.2. Взаимодействие лакказы Coriolus hirsutus с атразином.

3.4.3. Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами.

3.5. Исследование влияния лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гетерогенной среде.

3.6. Оценка возможности использования лакказы Coriolus hirsutus в биотехнологиях очистки почв, загрязненных атразином.

3.6.1. Исследование влияния лакказы на детоксификацию атразина гуминовыми кислотами на перлите.

3.6.2. Исследование влияния лакказы на детоксификацию атразина гуминовыми кислотами в почвенной среде.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Деградация атразина по механизму окислительного связывания, катализируемого грибной лакказой»

В связи с возрастающим загрязнением окружающей среды в целом и земельных ресурсов в частности, остро стоит вопрос создания эффективных биотехнологий для детоксификации загрязненных почв. Одной из доминирующих групп ксенобиотиков в почвах являются гербициды, широко применяемые для контроля численности сорной растительности. Однако неправильное использование гербицидов (превышение доз внесения, нарушение схем применения и др.) часто приводит к негативным последствиям - загрязнению сельскохозяйственной продукции, почв, грунтовых и поверхностных вод.

Наиболее опасным с точки зрения функционирования биогеоценозов является загрязнение высокоустойчивыми гербицидами, одним из наиболее распространенных представителей которых является сим-триазиновый гербицид атразин (2-хлор-4-этиламино-6-изопропиламино-сим-триазин) [Ralebitso et. al., 2002]. Этот гербицид используется в качестве селективного препарата против двудольных сорняков на ряде сельскохозяйственных культур, а также в качестве гербицида сплошного действия для невозделываемых площадей (газонов и территорий промышленного использования). Время его жизни в почве составляет от нескольких недель до четырех лет и более. Одной из основных особенностей сим-триазиновых гербицидов в целом и атразина в частности является их высокая персистентность, т.е. устойчивость в окружающей среде, и мобильность, т.е. способность перемещаться из почвы в сопредельные среды. Указанные характеристики определяют высокую опасность атразина для окружающей среды: предельно-допустимая концентрация (ПДК) атразина в почве составляет 0.5 мг/кг [Письмо Министерства., 1993], а в воде - 3 мкг/л [Ларина, 2002]. Описан ряд негативных эффектов воздействия триазиновых гербицидов, атразина в частности, на представителей растительного и животного мира. В настоящее время накоплены данные о генотоксичности атразина и его влиянии на организм человека.

Для большинства гербицидов, включая сим-триазины, первичным процессом при попадании в почву является их адсорбция почвенными коллоидами, главным образом минералорганическими. Органическое вещество в составе минералорганических комплексов играет ведущую роль в этом процессе. Согласно литературным данным, гуминовые кислоты (ГК) составляют 85-90% от общего содержания органического вещества почв и являются основным компонентом минералорганических комплексов, поэтому при попадании в почву атразин взаимодействует главным образом с ГК.

Несмотря на то, что сорбционные процессы между атразином и компонентами органического вещества хорошо изучены [Weber et al., 1996], единого мнения о механизме связывания ГК с этим гербицидом не существует. Одной из наиболее распространенных гипотез является связывание по механизму гидрофобного взаимодействия и образование комплексов с переносом заряда [Piccolo et al., 2000]. При связывании атразина происходит уменьшение его свободной концентрации в почве и, как следствие, снижение токсичности [Piccolo et al., 1998]. Однако при изменении условий может происходить десорбция гербицида, что приводит к увеличению его мобильности и, соответственно, токсичности.

В процессах взаимодействия ксенобиотиков с органическим веществом принимают участие ферменты окислительного действия. По литературным данным [Filip et al., 1985] эти ферменты способны катализировать или инициировать реакции деградации, полимеризации, синтеза, связывания и включения ксенобиотиков в гумусовые кислоты почв. Ферментативное связывание некоторых ксенобиотиков является важным природным процессом, который влияет на их поведение (т.е. активность и персистентность) в водной и почвенной средах [Zahir et al., 2001]. В экспериментах [Hatcher, 1993; Nanny, 1996], проводимых in vitro, было показано ковалентное связывание ароматических ксенобиотиков (2,4-дихлорфенолов и пентохлорфенолов) с ГК и фульвокислотами (ФК), катализируемое ферментативными комплексами. Предполагаемый авторами механизм детоксификации ксенобиотиков был назван механизмом окислительного связывания. Для атразина возможность окислительного связывания с ГК практически не изучена, а существующие литературные данные противоречивы. В ряде исследований было показано [Lesan et al., 2000], что внесение пероксидазы не увеличивало адсорбционную способность почв по отношению к атразину, а в некоторых вариантах даже приводило к снижению последней. Влияние других оксидоредуктаз, таких как лакказа, на связывание атразина почвами не изучено. Однако показано, что высшие и низшие грибы участвуют в процессах трансформации атразина, и одним из ключевых ферментов этого процесса является лакказа (n-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2).

Отличительными чертами данного фермента являются: высокая активность в почве в течение круглого года [Criquet et al., 2000], широкая субстратная специфичность и высокая термо- и рН-стабильность. Кроме того, лакказа является единственной оксидоредуктазой, экстрагируемой из почвы в составе ГК [Ruggiero, 1984]. Основными продуцентами лакказы в почвах являются грибы «белой гнили», представителем которых является Coriolus hirsutus. Именно эта группа базидиомицетов наиболее распространена в почвенном гумусово-аккумулятивном горизонте. Следовательно, базидиальные грибы и продуцируюемые ими ферменты, в частности лакказа, несомненно, являются активными участниками трансформации ксенобиотиков в почвах, хотя и механизм данного процесса не изучен.

Это обусловило актуальность и важность проведения исследований, направленных на изучение влияния лакказы на механизмы адсорбции и десорбции атразина ГК в растворенном и иммобилизованном состоянии. Данные исследования позволят не только установить возможность окислительного связывания этого гербицида с ГК при участии лакказы, но и оценить роль фермента в процессе детоксификации ксенобиотиков сим-триазиновой природы, что даст основу биотехнологическим подходам к рекультивации загрязненных территорий.

Целью работы являлось исследование влияния лакказы на процессы взаимодействия атразина с гуминовыми кислотами в растворенном и иммобилизованном состоянии для установления механизма деградации гербицида in vivo.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать грибную лакказу базидиомицета Coriolus hirsutus;

- провести отбор и характеристику почвенных образцов из различных почвенно-географических зон;

- исследовать взаимодействия, протекающие в гомогенной системе лакказа - атразин - растворенные ГК, в том числе изучение процессов взаимодействия фермента с гуминовыми кислотами;

- исследовать взаимодействия, протекающие в гетерогенной системе лакказа - атразин - почвенные частицы, в том числе изучение процессов адсорбции/десорбции атразина и роли фермента в данном процессе;

- оценить возможность детоксификации почвы, загрязненной атразином, с помощью системы лакказа-ГК.

1. обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Давидчик, Валентина Николаевна

выводы

1. Установлено формирование ферментативно активного комплекса лакказа-ГК нековалентной природы. Высказано предположение об определяющей роли Ван-дер-вальсовых, гидрофобных, п-пи СН- л взаимодействий.

2. Показано стабилизирующее действие ГК на ферментативную активность лакказы; установлено, что стабилизирующее действие более выражено при стрессовых (рН 6.5), чем при оптимальных (рН 5.0) для фермента условиях.

3. Исследование трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК показало, что лакказа снижала уровень адсорбции гербицида ГК; наблюдаемый эффект связан с процессами модификации ГК и образованием их комплексов с лакказой.

4. Установлено, что процесс трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК-редокс-медиатор в значительной степени определяется используемым редокс-медиатором; эффективным редокс-медиатором, вызывающим 60% трансформацию гербицида в исследованной системе, является 1-гидроксибензотриазол.

5. Изучена трансформация атразина в гетерогенной системе лакказа-атразин-иммобилизованные ГК. Показано, что в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ изотерм адсорбции и десорбции, а так же увеличение количества необратимо связанного гербицида.

6. Проведенные лабораторно-вегетационные эксперименты показали возможность детоксификации атразина в почвенных условиях путем его связывания с ГК по механизму окислительного связывания при участии лакказы; при этом необходимые для протекания процесса редокс-медиаторы присутствуют, по-видимому, непосредственно в почве.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Давидчик, Валентина Николаевна, 2007 год

1. Александрова JI.H. Органическое вещество почвы и процессы еготрансформации. JL: Наука, 1980.

2. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во1. Моск. Ун-та, 1970,488с.

3. Аронов С.Г. Гуминовые кислоты. В.: Химическая энциклопедия. М.:

4. Советская энциклопедия, 1988, т. 1, с. 618.

5. Беленький Б.Г. и Виленчик JI.3. Хроматография полимеров. М., 1978.

6. Белькевич П.И., Чистова JI.P. Торф и проблема защиты окружающей среды.

7. Минск: "Наука и техника", 1979, 64 с.

8. Березовский М.Я., Немова Г.Н. Особенности применения гербицидовпроизводных сим-триазина на торфяных почвах. Агрохимия. 1973, Т. 12, с. 102-110.

9. Вадюнина А. Ф., Корчагина 3. А. Методы исследования физических свойствпочв. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1986.416 с.

10. Вайткявичус Р.К., Вельжите В.А.,Ченас Н.К. Выделение и кинетическиепараметры лакказы Polyporus anicoporus. // Биохимия, 1984, Т.49, № 6, с. 1000-1003.

11. Варфоломеев С.Д., Наки А., Побочин А.С., Ярополов А.И. Функциональнаяактивность ферментов и пути ее регулирования// Изд-во МГУ, под ред. Северина С.Е., 1997, с. 97-124.

12. Глебова Г.И. Гиматомелановые кислоты почв. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1985,740 с.

13. Гольдфельд М.Г, Карапетян Н.В. Физико-химические основы действиягербицидов. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Биол. химия, 19896 Т. 30, с. 1-144.

14. Захаренко В.А. Гербициды. М. 1990, 238 с.

15. Зинченко В.А. Природа действия гербицидов производных триазина нарастения. М.: Мин-во с-х. ТСХА, 1971,28с.

16. Келдербенк А. Распространение и роль связанных почвой остатковпестицидов. В кн.: Проблемы загрязнения окружающей среды и токсикологии. М.: Мир, 1986, с. 84-117.

17. Ковалевский Д.В. Исследование структуры гумусовых кислот методамиспектроскопии ЯМР 1Н и 13С. Дисс. на соиск. уч. ст. к.х.н. М.: МГУ, 1998.

18. Ковалевский Д.В, Пермин А.Б, Перминова И.В, Петросян B.C. Выборусловий регистрации количественных 13С ЯМР спектров гумусовых кислот. Вестник Московского университета, серия 2 (Химия), 2000, Т. 41, с. 39-42.

19. Кононова М. М. Органическое вещество почвы. М: Изд-во МГУ, 1963.

20. Королева О. В. «Лакказы базидиомицетов: свойства, структура, механизмдействия и практическое применение». Автореферат на соискание д.б.н. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. 2006.

21. Королева О.В, Степанова Е.В, Ландесман Е.О, Васильченко Л.Г,

22. Хромоныгина В.В, Жердев А.В, Рабинович М.Л. Иммуноферментныйанализ разложения гербицида почвенными и древоразрушающими грибами. Прикл. биохим. микробиол. 2002, Т. 38, № 4, с. 413-418.

23. Круглов В.П. Влияние торфяных физиологически активных веществ наинтенсивность течения ростовых процессов. Докл. Всес. Акад. с-х наук им. В.И. Ленина. 1985, Т. 4, с. 16-18.

24. Ларина Г.Е. Комплексная оценка действия гербицидов на компонентыагроценоза. Агрохимия. 2002, № 4, с. 64-74.

25. Лебедева Г.Ф. и др. (Экологические аспекты применения гербицидов). М.:1. Изд-воМГУ, 1990,208 с.

26. Лебедева Г.Ф., Куликова Н.А., Холодов В.А. Загрязнение почв гербицидами.

27. В кн.: Деградация и охрана почв, Изд-во МГУ, Москва, 2002, с. 332-358.

28. Лунев М.И. Пестициды и охрана фитоценозов. М.: Колос, 1992, с. 43-45.

29. Лях С.Н. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука, 1981,274 с.

30. Майер-Боде Г. Гербициды и их остатки. М.: Мир, 1972, 206 с.

31. Мельников Н.Н., Белан В.Г. Сравнительная опасность загрязнения почвыгербицидами производными сим-триазинов и некоторых других шестичленных гетероциклических соединений. Агрохимия. 1997. Т. 2, с.66-67.

32. Мокроносова А.Т. Малый практикум по физиологии растений. М.: Изд. МГУ.1994,183 с.

33. Овчинникова М.Ф. Химия гербицидов в почве. М.: Изд-во МГУ, 1987, 109 с.

34. Орлов Д.С. Свойства и функции гуминовых веществ. М., 1993. с.

35. Орлов Д.С. Химия почв. М., Изд-во МГУ, 1992,259 с

36. Орлов Д.С., Бирюкова О.Н. и Суханова Н.И. Органическое вещество почв

37. Российской федерации. М.: Наука, 1996.256 с.

38. Перминова, И.В. «Анализ, прогноз и классификация гуминовых веществ».

39. Практикум по агрохимии, под ред. В.Г. Минеева, М., Изд-во Московскогоуниверситета, 1989, 304с.

40. Рабинович M.JL, Болобова А.В., , Кондращенко В.И. Теоретические основыдревесных композитов. Кн. I. Древесина и разрушающие ее грибы. М.: Наука, 2001.264 с.

41. Спиридонов Ю.Я., Сметник А.А. Особенности поведения гербицидов в почве.

42. Материалы II Всероссийского совещания «Состояние и перспективы развития гербологии на пороге XXI столетия». Голицыне, 2000. с. 262266.

43. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РФ