Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Фалалеева, Марина Витальевна

• Фалалеева, Марина Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фалалеева, Марина Витальевна

Использованные сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Методы прямого выявления РНК.

1.1.1 Б л от-гибри диз ация РНК.

1.1.2 Анализ РНК, основанный на её защите с помощью комплементарной РНК от действия РНКаз (ribonuclease protection assay).

1.1.3 Выявление РНК с помощью гибридизации in situ.

1.1.4 Выявление РНК с помощью QP-репликазы.

1.2 Методы обнаружения РНК, основанные на определении её кДНК.

1.2.1 Общая характеристика обратных транскриптаз ретровирусов.

1.2.2 ДНК-микрочипы.

1.3 Полимеразная цепная реакция.

1.3.1 Проведение ОТ-ПЦР в смеси, содержащей одну ДНК-полимеразу.

1.3.2 Рекомбинация, происходящая в ходе ПНР.

1.3.3 Неспецифический синтез ДНК при ПЦР.

1.3.4 Способы обнаружения продуктов ПЦР.

1.3.5 Виды количественной ПЦР.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК»

Многие клеточные события, такие как размножение, рост, дифференцировка и гибель сопровождаются изменением экспрессии генов, и возможность оценивать изменение уровня транскрипции всегда занимала центральное место в исследованиях функции генов. Кроме того, появление и развитие молекулярной медицины привело к более широкому использованию методов количественной оценки уровня РНК в клинической диагностике. Определение уровня мРНК используется во многих диагностических приложениях, таких как отслеживание экспрессии генов, ответственных за лекарственную устойчивость раковых клеток, определение молекулярного ответа при химиотерапии, молекулярная оценка этапа развития опухоли, обнаружение циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком, а также обнаружение бактериальных и вирусных патогенов. Для всех перечисленных приложений наиболее важно определять редкие молекулы.

Редкими молекулами, в данном случае, называются РНК или ДНК, находящиеся в образце в малом количестве среди огромного избытка посторонних (отличных от мишени) нуклеиновых кислот. В связи с этим возникают две главные проблемы при определении редких молекул: одна из них связана с чувствительностью, а другая со специфичностью детекции.

Об ограниченной чувствительности говорят тогда, когда изучаемый образец содержит искомую РНК (мишень), но её невозможно обнаружить по ряду причин, из-за чего исследователь получает ложноотрицательный результат.

По какой причине можно не определить мишень, не смотря на то, что она присутствует в анализируемом образце? Мишени могут деградировать при хранении образца, могут быть потеряны в ходе выделения. Кроме этого, вместе с изучаемой мишенью могут выделяться примеси, являющиеся ингибиторами последующих реакций, служащих для размножения и детекции мишени.

В настоящее время для того, чтобы надежно обнаружить малые количества ДНК, изучаемую мишень размножают при помощи ПЦР. Несмотря на огромное разнообразие методов амплификации, ПЦР является наиболее широко используемым методом (Saiki et al. 1985, Saiki et al. 1988). РНК также можно размножить в ПЦР, если её предварительно перевести в кДНК с помощью обратной транскрипции (ОТ). Теоретически, с помощью ПЦР можно размножить и обнаружить единственную молекулу мишени. Однако, в том случае, когда нужно определить малое число молекул мишени на фоне огромного избытка посторонних нуклеиновых кислот, которые часто присутствуют в анализируемом образце, чувствительность и специфичность ПЦР могут значительно снижаться из-за ограниченной специфичности праймеров (LeDuc et al. 2002). Основной причиной является конкуренция размножению мишени со стороны неспецифического синтеза ДНК, являющегося следствием ошибочной гибридизации праймеров с отличающимися от мишени РНК и ДНК. В связи с этим, даже если мишень не потерялась в ходе выделения и не содержит ингибиторов ОТ-ПЦР, она может быть не выявлена из-за конкуренции со стороны неспецифического синтеза. Проблема ограниченной чувствительности ПЦР была решена в нашей лаборатории (Биохимии вирусных РНК Института белка РАН). Был создан способ размножения нуклеиновых кислот в геле, названный методом молекулярных колоний или наноколоний (Четверин и Четверина 1995). При проведении ПЦР в геле образуются колонии ДНК, росту которых не мешает даже большое число неспецифических колоний благодаря пространственному разделению ампликонов. Данный метод не требует использования внутренних контролей, а простой подсчет мишень-специфичных колоний позволяет прямо определять титр мишени в анализируемом образце.

Вопрос сохранности нуклеиновых кислот при хранении анализируемого препарата был решен в нашей лаборатории ранее (Кравченко и др. 2006). Однако открытыми оставались вопросы, связанные со способами выделения изучаемых мишеней, а также с проблемой низкого выхода стадии обратной транскрипции.

Другой проблемой является низкая специфичность выявления редких РНК-мишеней, вследствие того, что в ходе анализа образуются ложные мишени, которых до анализа не было в анализируемом образце. Это приводит к получению ложноположительного результата. Ложные мишени могут образовываться, например, в результате ложной рекомбинации РНК на стадии обратной транскрипции. В отличие от истинной рекомбинации, в которой рекомбинантная РНК образуется из других молекул РНК, в ходе ложной рекомбинации из РНК-предшественников образуется рекомбинантная кДНК. Происходит это из-за природного свойства РНК-зависимых ДНК-полимераз ретровирусов, которые обычно используются для обратной транскрипции in vitro, осуществлять рекомбинацию по типу смены матриц. В ходе данной рекомбинации обратная транскриптаза прочитывает одну РНК, используя праймер, затем комплекс обратной транскриптазы и вновь синтезированной кДНК диссоциирует от одной РНК и продолжает синтез на другой (Luo & Taylor 1990, Ouhammouch & Brody 1992). Такой перескок обратные транскриптазы способны осуществлять как между двумя молекулами РНК, так и между двумя участками одной молекулы РНК. Эта рекомбинация может приводить к ложноположительным результатам при изучении такого редкого события, как 8 рекомбинация между молекулами РНК, а также при диагностике. Данная проблема часто остаётся недооцененной многими исследователями. Так техника ОТ-ПЦР широко применяется для размножения продуктов рекомбинации между РНК-содержащими вирусами в препаратах суммарной РНК, выделенных из инфицированных клеток (Jarvis & Kirkegaard 1991, Nagy & Bujarski 1995). Однако суммарная РНК содержит не только изучаемый рекомбинант, но и большое количество исходных вирусных РНК, при обратной транскрипции которых могут образовываться ложные рекомбинанты. Поэтому было необходимо определить частоту образования ложной рекомбинации на стадии обратной транскрипции и оценить ограничение, которые она накладывает на применение ретровирусных обратных транскриптаз для рутинного анализа.

Целью данной работы явилась разработка количественной высокочувствительной и высокоспецифичной молекулярной диагностики, а также определение продуктов рекомбинации РНК с помощью ОТ-ПЦР в отсутствие ложной рекомбинации.

Данная работа была выполнена в лаборатории биохимии вирусных РНК Учреждения Российской Академии Наук Института белка РАН. В диссертации использованы данные, полученные в совместной работе с Е. В. Четвериной, О. В. Трофимовым, А. В. Кравченко, Е. А. Узловой.

Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории: В. И. Угарова, Т. Р. Саматова, Н. Н. Васильева, 3. К. Тнимова, 3. В. Валину, Д. С. Копеина,

A. А. Гордеева, И. А. Дё, А. С. Коновалова, Ю. А. Заболотневу и технический персонал, за помощь в планировании и проведении экспериментов, моральную поддержку, создание дружеской атмосферы, обучение и критичное обсуждение результатов.

Автор благодарен сотрудникам НИИ детской гематологии Минздрава РФ

B. О. Бобрыниной и М. А. Масчану - за предоставление образцов пациентов, больных острым миелоидным лейкозом, ассоциированным с транслокацией t(8;21).

Автор благодарен научному директору ЗАО «Синтол» Я. И. Алексееву за совместную работу в области применения олигонуклеотидов, имеющих LNA-производные.

Особую признательность автор выражает своим научным руководителям А. Б. Четверину и Е. В. Четвериной за искренний интерес, постоянное участие, подробное обсуждение работы на семинарах, помощь в написании диссертации и прекрасную школу научной работы.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РНК

Молекулы РНК содержатся в клетках всех живых организмов, а также во многих вирусах, и выполняют разнообразные функции. В частности, образование мРНК является первым этапом экспрессии генов и первым шагом на пути реализации функции, запрограммированной в геноме организмов. Изменение экспрессии генов находится в основе регулирующих механизмов, которые контролируют клеточные процессы, контролируя нашу жизнь. Высшие эукариоты содержат > 40 ООО генов (Lewin 2004), из которых около 15%, как считается, экспрессируются в какой-либо отдельной клетке, чтобы обеспечить такие разнообразные жизненные процессы, как развитие и дифференцировку, гомеостаз, ответ на повреждение, регуляцию клеточного цикла, старение, запрограммированную клеточную смерть и рак.

Для изучения изменения клеточных процессов следят за появлением или изменением количества определенных РНК. Поскольку большая часть мРНК представлена в клетке в малом количестве (2-100 копий) (Soares et al. 1994, Holstege et al. 1998), то предпочтение отдаётся методам, обладающим высокой чувствительностью и специфичностью. Чувствительность и специфичность особенно важны при выявлении вирусных РНК или РНК-онкомаркеров в диагностических целях.

Существует большое число подходов выявления и оценки количества РНК, среди них методы прямого выявления РНК, а также методы, полагающиеся на определение ДНК-копии этой РНК.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Фалалеева, Марина Витальевна

выводы

1. Разработаны способы выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, обеспечивающие близкий к 100% выход РНК и ее освобождение от ингибиторов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2. Оптимизирована реакция обратной транскрипции (ОТ) в присутствии большого количества посторонних нуклеиновых кислот. Выход кДНК при использовании специфического праймера увеличен до 50% от количества РНК-матрицы.

3. Показано, что с помощью полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus (Tth-ПНФазы) можно полностью разрушить РНК даже с прочной вторичной структурой. В то же время, РНК можно защитить от Tth-ПНФазы комплементарным олигонуклеотидом либо З'-концевой модификацией.

4. Установлено, что частота ложной рекомбинации РНК при ОТ in vitro превышает Ю-5 на 1 нуклеотид и не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

5. Показано, что ложную рекомбинацию РНК при ОТ можно понизить в 100 или более раз с помощью каждого из следующих способов:

- избирательной деградации одного из субстратов рекомбинации Tth-ПНФазой;

- проведения обратной транскрипции в геле;

- понижения концентрации обратной транскриптазы.

6. С помощью разработанных способов подавления ложной рекомбинации РНК при ОТ удалось размножить практически в отсутствие селекции и изучить продукты рекомбинации РНК, катализируемой QP-репликазой (РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага QP). Установлено, что продукт рекомбинации, включающий оба субстрата рекомбинации целиком, выявляемый при размножении с помощью QP-репликазы как минорный, на самом деле является основным.

7. С помощью разработанных способов выделения нуклеиновых кислот, оптимизированной обратной транскрипции и размножения кДНК в виде молекулярных колоний продемонстрирована возможность специфического выявления РНК-онкомаркера или вирусной РНК с чувствительностью две молекулы РНК-мишени в 100 мкл цельной крови.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фалалеева, Марина Витальевна, 2009 год

1. Гмыль А.П., Агол В.И. 2005. Многообразие механизмов РНК-рекомбинации. Молекуляр. биология, 39, 618—632.

2. Кравченко А.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2006. Сохранность нуклеиновых кислот в гуанидинтиоцианатных лизатах цельной крови. Биоорган, химия, 32, 547-551.

3. Четверин А.Б. 1998. Бактериофаг QP как объект молекулярной биологии. Успехи Биол. Хим., 38, 3—75.

4. Четверин А.Б., Саматов Т.Р., Четверина Е.В. 2006. Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления. Заявка на патент РФ № 2006109271.

5. Четверин А.Б., Четверина Е. В. 2002. Точная диагностика с помощью молекулярных колоний. Молекуляр. биология, 36, 320—327.

6. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1995. Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления. Патент РФ № 2048522.

7. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1995. Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления. Патент РФ № 2048522.

8. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1998. Способ диагностики нуклеиновых кислот. Патент РФ № 2114915.

9. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 1998. Способ клонирования нуклеиновых кислот. Патент РФ № 2114175.

10. Четверин А.Б., Четверина Е.В. 2003. Преодоление проблем ПЦР-диагностики с помошью метода молекулярных колоний. Молекляр. медицина, 2, 30—40.

11. Четверина Е.В. и Четверин А.Б. 2008. Наноколонии: обнаружение, клонирование и анализ индивидуальных молекул. Успехи Биол. Химии, 48, 3—64.

12. Al-Soud A., Radstrom Р. 1998. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. Appl. Environ. Microbiol, 64, 3748-3753.

13. Agranovsky A. 1992. Exogenous primer-independent cDNA synthesis with commercial reverse transcriptase preparations on plant virus RNA templates. Anal. Biochem., 203,163-165.

14. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. 1994. Molecular Biology of the Cell, edn. 3. NY: Garland Publishing.

15. Alimov A.P., Khmelnitsky A.Y., Simonenko P.N., Spirin A.S. and Chetverin A.B. 2000. Cell-frees and affinity isolation of proteins on a nanomole scale. BioTechniques, 28, 338344.

16. Al-Soud, W. A., Radstrom, P. 2001. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol., 39, 485—493.

17. Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. 1977. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(12), 5350-5354.

18. Andras S.C., Power J.B., Cocking E.C., Davey M.R. 2001. Strategies for signal amplification in nucleic acid detection. Mol. Biotechnol., 19(1), 29-44.

19. Asou H., Tashiro S., Hamamoto K., Otsuji A, Kita K, Kamada N. 1991. Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21 chromosome translocation. Blood. 77(9), 2031-2036.

20. Baltimore D. 1970. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature, 27, 1209-1211.

21. Baltimore D., Smoler D. 1971. Primer Requirement and Template Specificity of the DNA Polymerase of RNA Tumor Viruses. Proc. Nat. Acad. Sci., 68, 1507—1511.

22. Battula N., Loeb L.A. 1975. On the fidelity of DNA replication. Characterization of polynucleotides with errors in base-pairing synthesized by avian myeloblastosis virus deoxyribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem., 250(12), 4405—4409.

23. Bengtsson M., Karlsson H.J., Westman G., Kubista M. 2003. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR. Nucleic Acids Res., 31(8), e45.

24. Bermudez-Cruz R.M., Garci'a-Mena J., Montanez C. 2002. Polynucleotide phosphorylase binds to ssRNA with same affinity as to ssDNA. Biochimie 84, 321—328.27