Частота спонтанных и индуцированных hprt-мутаций в лимфоцитах, их модуляция антиоксидантами и молекулярный анализ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Подлуцкий, Андрей Яковлевич

• Подлуцкий, Андрей Яковлевич
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Подлуцкий, Андрей Яковлевич

Содержание работы:

Раздел страница

Введение

1. Раздел: Обзор литературы

1.1 Спонтанные и индуцированные мутации и

методы мониторинга

1.2 Антимутагенные системы клетки.

Антиоксидантная защита и репарация ДНК

1.3 HPRT-маркер. Анализ генных мутаций

по HPRT—локусу

2. Раздел: Материалы и методы

3. Раздел: Результаты и обсуждение

3.1 Методы оценки HPRT мутаций и пролиферативной активности нормальных и мутантных клеток

3.2 Исследования уровня спонтанных и гамма индуцированных HPRT мутаций в лимфоцитах

мышей разного возраста

3.3 Модуляция частоты мутаций диетическими

антиоксидантами

3.4 Сравнительный молекулярный анализ спонтанных и индуцированных мутаций в составе HPRT гена

3.4.1 Исследования спектра HPRT мутаций,

возникающих in vivo в лимфоцитах человека

3.4.2 Исследования молекулярного спектра HPRT мутаций

в лимфоцитах, обработанных in vitro мутагеном

4. Выводы 84 Acknowledgements 85 Использованная литература

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Частота спонтанных и индуцированных hprt-мутаций в лимфоцитах, их модуляция антиоксидантами и молекулярный анализ»

Введение

Исследование реакции живых организмов на дейст вие физических и химических факторов техногенного загрязнения среды представляет важнейшее направление экологической биофизики. Ключевое место в этих исследованиях занимает проблема генетических последствий действия физических и химических агентов. Радиационные и химические мутагены, вводимые в среду обитания, представляют значительную опасность для всего живого и для генофонда человечества (Экоцид в СССР) [1]. Молекулярные защитные системы организма, механизмы репарации ДНК несовершенны, и они не полностью обеспечивают целостность генетической программы человека от мутагенного и канцерогенного действия этих агентов. Имеющиеся данные указывают на то, что происходит существенный рост врожденных аномалий и раковых заболеваний в популяциях населения, проживающих на загрязненных территориях. Экономические, социальные и этические последствия этих процессов очень велики (Фогель и Мотульски, 1990; Дубинин, 1994) [2, 3]. Поэтому организация генетического мониторинга, особенно в экологически напряженных регионах, для оценки наследственного здоровья населения является актуальной задачей. Имеющиеся методы и подходы для генетического мониторинга далеки от совершенства, и поэтому требуется как создание новых, так и совершенствование уже существующих методик. Существующие методы, пригодные для использования в мониторинге популяции человека, весьма ограничены. Среди них основное место занимают методы определения хромосомных повреждений (анализ хромосомных аберраций, микроядерный анализ) и методы определения соматических генных мутаций (Шевченко, 1996; обзор Albertini et al., 1990) [4, 5]. В последнее времы развиваются разнообразные методы для количественного и качественного анализа мутаций у человека и животных, эти методы различаются по анализу вариабельности различных последовательностей ДНК и изменению свойства нуклеотидов в отдельных локусах, анализ мутаций в ДНК различных тканей с использованием трансгенных животных, по анализу разнообразных структурных нарушений и аддуктов в ДНК и другие (Garner et al, 1991)[6].

Однако не все методы являются одинаково доступными как по степени

дороговизны так и методическим трудностям для оценки частоты генных

3

мутаций у человека и экспериментальных животных. Наибольшее применение для оценки частоты генных мутаций в клетках человека in vitro и in vivo находит метод на анализе мутаций по гену гипоксантингуанинфосфорибозил трансферазе (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase - HPRT enzyme) (Albertini, 1982) [7]. В основе метода лежит различие между нормальными и мутантными по HPRT гену клетками в утилизации 6-тиогуанина (6-ТГ): нормальные клетки гибнут в присутствии 6-ТГ с вероятностью 100%, тогда как мутантные клетки (не способные вовлекать 6-ТГ в синтез ДНК) никак не реагируют на присутствие этого аналога пурина в среде (ссылка). С использованием метода оценки мутаций по HPRT гену выполнены многочисленные исследования на клетках человека и других млекопитающих, тем не менее, остается много неясного в решении различных задач применением данного метода. Недостаточно изучены вопросы зависимости частоты HPRT мутаций в клетках периферической крови от различных условий физиологического статуса человека и животных, от условий питания и возраста, не до конца понятен молекулярный механизм возникновения мутационных нарушений в исследованиях hprt локуса ДНК, при действии различных физических и химических факторов. А это чрезвычайно важно не только с позиций использования метода в биомониторинге и биодозиметрии, но и для понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза, развитии дегенеративных процессов, связанных со старением организма, и их модуляции. Целью настоящего исследования являлось изучение частоты спонтанных и индуцированных HPRT мутаций в лимфоцитах in vivo в зависимости от возраста организма, сравнение молекулярной природы HPRT мутаций и выяснения возможности снижения уровня этих мутаций in vivo диетическими антиоксид антами.

1. Обзор литературы.

1.1. Спонтанные и индуцированные мутации и методы мониторинга.

Важнейшим свойством живых организмов является их способность передавать стабильную генетическую информацию от поколения к поколению. Вместе с тем, генетический материал способен изменяться в определённой степени, и эта изменчивость играет первостепенную роль в эволюции живых организмов. Такие изменения, происходящие в наследственных структурах (ДНК, ген, хромосома, геном) принято называть мутациями. С возникновением мутаций в половых и соматических клетках связано развитие множества патологий человека. Убедительными примерами связи мутаций со здоровьем человека являются исследования в области онкологических и генетических заболеваний. В последние годы широкое развитие получили исследования, посвященные изучению связи мутационных нарушений в геноме с развитием дегенеративных процессов с возрастом человека. В основе спонтанных мутаций лежит возникновение структурных повреждений и ошибки репликативного и репарационного синтеза в молекуле ДНК (Umar and Kunkel, 1996) [8]. Как показывает множество исследований ДНК в нормально метаболизирующей клетке подвержена структурным нарушениям благодаря действию различных эндогенных факторов (Lindahl, 1993) [9]. Среди спонтанных повреждений ДНК следует отметить апуринизацию и апиримидинизацию, которые возможны благодаря мобильности N-гликозидной связи основания с сахаром. Высвобождение основания из ДНК (чаще пурины, чем пиримидины) происходит в результате расщепления N-гликозидной связи и зависит от pH среды, температуры, ионной силы среды и вторичной структуры ДНК. Расщепление N-гликозидной связи может происходить не только спонтанно, но катализируется ферментами семейства ДНК-гликозилаз при возникновении структурных нарушений в основаниях ДНК. Эти спонтанные структурные нарушения (повреждения) оснований

возникают в результате эндогенных факторов. К таким изменениям относится окисление (например, образование 8-окси-2-дезоксигуанина, тиминовые гликоли и др.) в результате действия эндогенных активных форм кислорода, дезаминирование цитозина и гуанина и неэнзиматическое метилирование пуринов и пиримидинов путём переноса метальной группы с S-аденозилметионина (Lindahl, 1993) [2]. Серьёзным источником генных мутаций являются ошибки во время репликации ДНК и не эффективность пострепликативной репарации (система репарации неправильных пар оснований) (Modrich and Lahue, 1996) [10].

Как показано в ряде исследований, в процессе старения происходит накопление различных спонтанных повреждений ДНК и увеличение частоты генных и хромосомных мутаций (обзор Mullaart et al., 1990) [11]. Чем больше делений и репликационных кругов проходит клетка, тем больше вероятность появления спонтанных генных или хромосомных мутаций (Barnett and King, 1995) [12]. Также хорошо известно, что вероятность появления генных или хромосомных мутаций увеличивается для потомства рожденного от пожилых родителей, что свидетельствует о накоплении повреждений в ДНК не только в соматических, но и в половых клетках (Vishwanath and Shannon, 1997; Gaulden, 1992) [13, 14]. В результате загрязнения среды обитания радиационными и химическими мутагенами происходит увеличение частоты мутаций в соматических и зародышевых клетках. Основные закономерности образования спонтанных и индуцированных мутаций - являются общими для всех живых организмов. Хотя количественные и качественные характеристики могут различаться в зависимости от условий эксперимента и самого объекта исследований. Особой эффективностью по индукции мутаций обладают -ионизирующая радиация (включая радионуклиды), УФ-свет, химические соединения способные взаимодействовать с ДНК. Они вызывают разнообразные повреждения в ДНК, которые могут быть успешно репарированы или могут быть реализованы в генные или хромосомные

мутации, что может привести к гибели клетки или злокачественному перерождению. Поэтому поврежденность генома в клетках животных и человека может быть оценена как по определению различных повреждений ДНК, так и по мутациям.

В настоящее время существуют разные методы, которые позволяют судить о степени генотоксичности того или иного воздействия на животных, человека или культуру клеток. Но все разнообразие таких методов и подходов можно объединить в две большие группы, первая, методы так или иначе связанные с возникновением и обнаружением повреждений ДНК (адцукты ДНК, разрывы цепей ДНК, сшивки ДНК) и, вторая группа, связанная с проявлением мутационных изменений в ДНК.

Схема 1. Механизмы возникновения и проявления мутаций, воздействие

На Схеме 1 показана взаимосвязь процесса появления мутаций и последующих изменений в жизни клетки или организма. Можно заметить, что образование повреждений в ДНК является одним из первичных этапов в

структурные нарушения и образование адцуктов

репарация

канцерогенезе. Многие химические канцерогены вызывают образование ковалентно связанного с ДНК продукта (аддукта), который может приводить к возникновению и закреплению мутаций или другой тип повреждений ДНК в генах контролирующих рост и деление клеток, что приводит к ненормальному росту и раку. Чем более сильным канцерогеном является какое либо химическое вещество, тем выше уровень вызываемых им повреждений ДНК. Существующие методы анализа адцуктов ДНК позволяют напрямую определять количество повреждённых оснований в геноме после воздействия кокого-либо агента (НеттЫа е1 а1., 1994) [15]. Например, используя метод 32Р-роз11аЬеШп§, было показано наличие полициклических ароматических адцуктов в лимфоцитах шахтовых рабочих в Силезии, южного региона Польши (СгсуЬо\узка е1 а1., 1993) [16]. Уровень адцуктов был в 8,7 раза выше для рабочих по сравнению с контрольной группой, а для курящих рабочих уровень аддуктов был выше в 12,8 раза. С помощью методов определяющих степень повреждённости ДНК (Ник-трансляция, Комета-метод в нейтральных или щелочных условиях, образование аддуктов ДНК и др.) - можно судить о влиянии того или иного генотоксичного агента на структурную целостность ДНК. Такие методы довольно чувствительны в определении повреждений ДНК вызванных однократным воздействием высокой дозы генотоксина. Такое воздействие в реальной жизни хотя и происходит в результате аварии на промышленном производстве или в случае природных катастроф все же довольно редки и не затрагивают большинства населения. С другой стороны, большинство людей урбанизированных регионов на протяжении всей жизни подвергаются хроническому воздействию низкого уровня радиации, ультрафиолету и факторов урбанизации (загрязнение воздуха и воды). В этом случае, при хроническом воздействии низких доз генотоксина, методы определяющие структурную целостность ДНК зачастую оказываются малоэффективными. На помощь приходят методы позволяющие анализировать хромосомные аберрации, микроядра, методы определения генных мутаций - т.е. методы, которые используют в биомониторинге и биодозиметрии (ссылки см. ниже).

С помощью этих методов удаётся определить мутационный груз для определённой популяции людей или животных заданного региона. Такие эпидемиологические данные позволяют судить о степени воздействия факторов окружающей среды на генетический материал человека или животных.

Остановимся вкратце на наиболее часто используемых методах, для мониторинга в человеческой популяции. В основном, из-за чувствительности, воспроизводимости результатов, доступности материала и оборудования, в биомониторинге человеческой популяции используются следующие методы: анализ хромосомных аберраций (а), анализ микроядер (Ь), анализ мутаций по НРЮГ локусу (с), анализ мутаций Гликофорина А (й), анализ мутаций в рецепторе Т-клеток (е), анализ мутаций по НЬА-А локусу (/). Как можно видеть, перечисленные методы делятся на две категории: первая, анализ хромосомных повреждений (методы а и А), и вторая, анализ генных мутаций (методы с-/). Каждый из названных методов имеет свои достоинства и ограничения, до сих пор не найдено идеального метода для мониторинга человеческой популяции. Первая категория методов анализирует появление повреждений генетического материала на уровне хромосом, в зависимости от степени воздействия внешних факторов, увеличивается количество клеток (обычно используются клетки периферической крови) в которых наблюдаются отклонения от нормы в кариотипе (появление необычных хромосом). Метод анализа хромосомных аберраций существует в нескольких модификациях, отличающихся между собой по изучаемым аберрациям (например, определение дицентриков, определение хромосомных транслокаций, появление слипшихся хромосом, укорачивание хромосом, появление микроядер). До конца не поняты молекулярные механизмы, приводящие к появлению хромосомных аберраций. Вместе с тем это один из наиболее чувствительных методов в биомониторинге, с помощью этих методов можно определять стабильные повреждения хромосом через несколько лет после вызвавшего их воздействия. Одной из особенностей раковых клеток является нестабильность генома, или появление большого количества нестабильных хромосомных повреждений. Недостатком этой группы методов является их

трудоемкость, хотя в последнее время появилась возможность автоматизации процесса выявления и подсчета аберрантных клеток. Методы анализа генных мутаций (методы c-f) построены на выявлении мутантных по какому-либо гену клеток среди нормальной популяции клеток. Метода анализа мутаций по HPRT локусу использует лимфоциты периферической крови, методика основана на способности пролиферации мутантных клеток в присутствии 6-Тиогуанина (Albertini et al., 1982, O'Neill et al., 1990) [17,18]. Для проведения исследований требуется 20-30 мл периферической крови. При анализе Т-лимфоцитов людей переживших атомную бомбардировку, показана дозовая зависимость в количестве мутантных клеток (Hakoda et al., 1988)[19]. Также показана возможность использовать этот метод в in vitro исследованиях (Sanderson et al., 1984)[20]. Ограничение - чувствительность данного метода падает со временем после воздействия повреждающего агента.

Метод анализа мутаций Гликофорина А основан на выявлении мутаций в одной из форм Гликофорина А в эритроцитах периферической крови (Langlois et al., 1986, Grant and Bigbee, 1993) [21, 22]. Нормальный эритроцит имеет на поверхности мембраны две аллельные формы Гликофорина А - М и N. Если же произошла мутация в одной из аллелей, то на мембране эритроцита присутствует только одна из оставшихся молекул гликопротеина и такой эритроцит (МО или N0) отмечается как мутантный при флуоресцентном анализе. Так как мутации происходят в эритробластах (клетках предшественниках эритроцитов) и не исчезают со временем, то данная методика является одной из самых чувствительных даже через значительное время после воздействия генотоксина. Для анализа достаточно 1 мл периферической крови, но не существует адекватной in vitro модели использования этой методики. Ограничения: без автоматизации - довольно трудоемкий метод, с автоматизацией (использование проточного флуориметра) - дорогой; только половина (50%) человеческой популяции имеют гетерозиготный Гликофорин А в форме MN - необходимый для анализа, остальная часть популяции - гомозиготная (ММ или NN) - для исследований не подходит.

Анализ мутаций в рецепторе Т-клеток основан на особенности строения рецепторов ар на CD3 клетка (T-cell receptor -TCR) (Kyoizumi et al., 1996) [23]. Большинство Т-лимфоцитов CD3 ряда имеют на мембранной поверхности гетеродуплекс состоящий из цепей а и (3. Если происходит мутация в одном из генов, кодирующих эти цепи, то рецептор вообще не возникает. В результате такую мутантную клетку можно обнаружить с помощью антител, как CD3 негативную клетку среди CD4 позитивных клеток. В среднем около 300 мутантных клеток приходится на один миллион нормальных, что в 10 раз больше чем HPRT мутаций. При анализе мутаций в TCRap локусе людей переживших атомную бомбардировку не было обнаружено дозовой зависимости. Однако при анализе мутаций в Т-клетках людей, прошедших химио- или радиотерапию метод показал высокую чувствительность от дозы применявшегося воздействия. Метод невозможно использовать в in vitro исследованиях. Ограничения - резкое падение чувствительности в зависимости от времени воздействия, требует дорогостоящего оборудования.

Метод анализа мутаций по HLA-A локусу основан на использовании моноклональных антител для клеток экспрессирующих HLA-A2 или -A3 антиген (Janatipour et al., 1988, Kushiro et al., 1992) [24, 25]. С помощью специфичных антител и их компонентов можно отделить мутантные по этим двум локусам клетки от нормальных клеток. Не было показано дозовой зависимости от облучения людей переживших атомную бомбардировку и количеством мутаций по HLA-A локусу, однако метод довольно чувствителен в определении повреждений вызванных недавним воздействием генотоксина. Вероятно, in vivo существует негативная селекция против мутантных клеток. С помощью этой модели возможно изучение гомологичной рекомбинации, конверсии и дупликации генов, а также возникновение больших делеций. Ограничения - резкое снижение чувствительности в зависимости от времени воздействия; метод может быть использован только на гетерозиготных по данному гену людях; использование цитофлуориметра делает его дорогостоящим, а прямое клонирование мутантных клеток - трудоемким в популяционных исследованиях.

Наиболее широко используемым, доступным и еще перспективным остаётся метод оценки мутаций по локусу HPRT. Это один из самых чувствительных методов, сравнительно недорогой, можно проводить популяционные исследования, возможность проводить исследования как в условиях in vivo, так и in vitro. Также большим плюсом HPRT метода является возможность молекулярного анализа этих мутаций, а значит, на молекулярном уровне изучать процесс возникновения мутаций и проблем мутагенеза в целом.

В настоящее время всё шире внедряются в фундаментальные и прикладные исследования новые методы оценки мутагенеза на уровне целого организма и в клетках in vitro. К таким методам можно отнести весьма перспективное направление для изучения мутагенеза во всех без исключения клетках разных тканей - использование в исследованиях трансгенных животных (review: Pandolfi, 1998; Neuberger et al., 1998)[26,27]. А также метод определения мутаций по микро- мини-сателитным вариациям (Hanford et al., 1998)[28]. Использованием последнего метода была анализирована частота мутаций у населения, подвергшегося низкоинтенсивному радиационному облучению в результате чернобыльской катастрофы. Так было показано, что для детей рождённых в Могилёвской области, Белоруссия, после Чернобыльской аварии, вдвое увеличилась частота мутаций по минисателлитному локусу по сравнению с контрольной группой детей (Dubrova et al., 1996, 1997) [29, 30]. Это совпадает с возрастанием числа раковых заболеваний для людей проживающих в загрязнённых радиацией территориях.

1.2. Антимутагенные системы клетки. Антиоксидантная защита и репарация ДНК.

Как было отмечено в предыдущем разделе, геном нормально метаболизирующей клетки постоянно подвержен структурным изменениям в результате действия разнообразных эндогенных и экзогенных факторов. Защиту генетического материала от повреждающих агентов прежде всего

осуществляют эволюционно формировавшиеся системы антиоксидантной защиты макромолекул и системы репарации ДНК. Несомненно важную роль в структурной стабилизации и защиты играют белки хроматина и компактная укладка ДНК в клеточном ядре (Nygren а1., 1995) [31]. Однако мы рассмотрим здесь системы антиоксидантной защиты и репарации ДНК, как системы обеспечивающие клеточный антимутагенез.

Антиоксидантные защитные системы, которые включают как низкомолекулярные антиоксиданты, так и антиоксидантные ферменты, предохраняющие от возникновения повреждений, снижают окислительный стресс в клетке и тем самым осуществляют защиту клетояных макромолекул, нуклеиновых кислот, белков и липидов. Рассмотрим процесс возникновения повреждений посредством свободных радикалов и роль антиоксидантных систем, т. к. в процессе образования энергии образуется огромное число свободных радикалов и многие повреждающие агенты внешней среды также вызывают образование радикалов.

Энергия, необходимая клетке, образуется в митохондриях в процессе каталитического распада органического вещества - при этом как побочный продукт образуются так называемые "свободные радикалы" - соединения, которые обладают высокой реагенной активностью, способные окислять макромолекулы клетки: ДНК, липиды, белки (ЬосИзЬ е1 а1., 1995)[32]. И хотя повреждение липидов и белков может отрицательно сказаться на клетке (повреждение мембраны, или даже привести к апоптозу клетки), именно повреждение ДНК нарушает структурную целостность генома и может привести к возникновению мутаций.

Упрощённо процесс образования энергии выглядит следующим образом: митохондрии используют кислород и глюкозу для образования энергии, или

Глюкоза + Кислород = Энергия + СОг + НгО

или упростив ещё раз - это преобразование кислорода в воду

е е

е

е

02 *Ог~ *Н202"

ОН

Н20

Около 1012 Ог молекул используется каждой клеткой для получения необходимой энергии. Приблизительно 2% составляют "утечки" частично преобразованного кислорода, т. е. приблизительно 1010 молекул Ог* и Н2О2 -образуется каждый день. Другими источниками эндогенных активных форм кислорода, повреждающими клеточные макромолекулы, являются нейтрофилы или клетки способные к фагоцитозу, а также субклеточные пероксисомы, продуцирующие перекиси. Например, фагоциты разрушают бактериальные или другие гибнущие клетки и клеточные элементы с помощью мощного "выстрела" оксидантов: NO, 02", Н202, ОН". Подавляющее большинство таких высокоактивных молекул преобразуется в безвредные соединения с помощью антиоксидантных систем (Ames et al., 1993) [33].

Схема 2. Показана модель появления повреждений в ДНК.

внешнее воздействие

В митохондриях находятся специальные ферменты утилизирующие свободные радикалы - супероксиддисмутаза, глютатион пероксидазы, каталазы. Эти ферменты превращают свободные радикалы в неактивные соединения. Или же свободные радикалы будут перехвачены антиоксидантами — веществами образующими стабильный комплекс со свободными радикалами. Чем надёжнее система антиоксидантной защиты клетки, тем меньше повреждений вызывают свободные радикалы. Большинство низкомолекулярных антиоксидантов - это витамины или витаминоподобные вещества синтезирующиеся в клетке или поступающие с пищей. Наиболее хорошо изученными низкомолекулярными антиоксидантами являются витамины А, Е и С. Рассмотрим несколько подробнее каждый из этих витаминов.

Витамин Е - жирорастворимая смесь производных токола, среди которых а-токоферол является наиболее биологически активным веществом (обзор: Wolf et al., 1998) [34]. Основная роль а-токоферола в живых организмах это защита липидов мембраны от окисления, посредством блокирования свободных радикалов. Но антиоксидантный эффект витамина Е также сказывается в обеспечении стабильности генетического материала, т.к. продукты окисления липидов и жирных кислот (пероксиды, гидропероксиды, альдегиды, кетоны, эпоксиды и др..) являются высокотоксичными мутагенными веществами, способными повреждать ДНК напрямую. Защитный эффект Витамина Е от воздействия различных генотоксичных факторов, образующих свободные радикалы, был продемонстрирован во многих экспериментах: у-радиация и метилнитрозомочевина (Чережанова с соавт., 1983) [35], бензоперен и УФ индуцированный мутагенез (Bershtein et al., 1979) [36]. Однако как показали исследования Витамин Е не влияет на "электрофильный" мутагенез вызванный, например, тринимоном или циклофосфамидом. Подробнее возможные механизмы действия витаминов описаны в обзоре - Odin, 1997 [37].

Витамин А и провитамин А (или (3-каротин) относятся к ретиноидам. Ретиноиды способны перехватывать свободные окси радикалы посредством связывания их с длинной полиэнной цепью (polyene chain). Результаты экспериментов с использованием Витамина A in vitro довольно противоречивы, вероятнее всего из-за взаимодействия ретиноидов в таких условиях с кислородом воздуха. Но в in vivo моделях Р-каротин и ретиноиды демонстрируют ясный антимутагенный эффект при воздействии бензопирена, бисульфана, метилметансульфаната и thio-tepa (прямой мутаген)(Коск, 1997)[38].

Витамин С или аскорбиновая кислота - является одной из активных частей метаболизма живой клетки, входя в несколько электрон-транспортных процессов (Banhegyi et al., 1997)[39]. В целом ряде экспериментов in vitro были получены противоречивые данные касающиеся мутагенного или антимутагенного действия аскорбиновой кислоты. Анализируя эти эксперименты приходим к выводу, что при использовании Аскорбиновой кислоты в низкой концентрации процесс перехвата Ог* является доминантным, при использовании высокой концентрации аскорбиновая кислота проявляет мутагенные свойства. Аскорбиновая кислота ингибирует мутагенную активность других генотоксинов в экспериментах in vivo, значительно снижает число индуцированных хромосомных разрывов (Sram et al., 1983,1986) [40, 41].Так же было показано что аскорбиновая кислота не только способна напрямую проявлять антиоксидантную активность инактивируя Ог и НО* но и способна активировать системы перехватывающие Н2О2 и ОН*. Витамин С ингибирует также образование нитрозоаминов, реагируя с N-нитрозокомпонентами

АК + N2O3 —» ДАК + NO (дигидроаскорбиновая кислота и закись азота)

Кроме перечисленных выше витаминов антиоксидантную активность проявляют еще целый ряд природных соединений. Это мелатонин, глутатион, убихинон, витамин Д, витамин В и другие.

Но наряду с низкомолекулярными антиоксидантами, функцию перехватчиков свободных радикалов в клетке выполняют специальные антиоксидантные ферменты, превращающие свободные радикалы в менее активные соединения, принимающие участие в метаболизме клетки. К таким ферментам относятся: супероксид дисмутаза, глютатион пероксидаза, каталаза (Orr and Sohal, 1994; Przedborski and Schon, 1998)[42, 43]. Хотя клетки организма обеспечены антиоксидантной системой защиты макромолекул, наблюдается их постепенное окислительное повреждение, что свидетельствует о недостаточной эффективности этих молекулярных защитных систем. Более того, увеличение окислительных повреждений макромолекул клетки в процессе старения сопровождается снижением антиоксидантной активности (King et al., 1997)[44].

Во многих исследованиях было показано, что количество свободных радикалов в крови и тканях увеличивается при старении организма. Это может быть связано как с внешними так и с внутренними причинами: изменение (уменьшение) потребления антиоксидантов при старении, изменение диеты - спектр причин: от социально-экономических до генетических, ухудшение работы защитных ферментов - перехватчиков радикалов. Но также одной из проблем в старости является истощение иммунной системы, что приводит к таким явлениям как хроническая инфекция и хроническое воспаление. Лейкоциты и другие фагоциты атакуют бактерии, паразиты и вирус-зараженные клетки с помощью мощной оксидантной смеси. Это защищает организм от инфекции, но вызывает повреждение ДНК и приводит к появлению мутаций (Shacter et al., 1990; Yamashina et al., 1986)[45, 46]. При недостатке антиоксидантов в результате хронического воспаления или инфекции, свободные радикалы вызывают повреждение ДНК, при

ослаблении в процессе старения репаративных систем, и если возникшие повреждения затрагивают тумор-супрессорные гены, то неизбежно возникает рак (см. схему 3). Хроническая инфекция ответственна приблизительно за треть всех случаев возникновения рака в мире. Например вирусные гепатиты В и С инфицируют около 500 миллионов человек в год, в основном Азия и Африка, и являются основной причиной вызывающей карциному печени (Beasley 1988; Tabor and Kobayashi, 1992)[47, 48].

Схема 3. Изменения в организме, происходящие в процессе старения

старение

nI/

истощение иммуннои системы

хронические воспаления и инфекции \|/

постоянно повышен уровень оксидантов в крови

I

недостаток антиоксидантов •

I

возникновение мутации

канцер сердечно-сосудистые заболевания и др.

Курение вызывает не только мутагенез, но и является дополнительным источником оксидативного стресса (Peto et al., 1992)[49] ответственно за 3 миллиона летальных исходов от рака и болезней сердца. При сохранении существующего уровня курения (и нет оснований предполагать, что число курящих уменьшится) эта цифра возрастет до 10 миллионов к 2000 году. Свободно-радикальная гипотеза старения была предложена более 3-х десятков лет назад D. Harman и R. Gerschman (Harman, 1956; Gerschman et al., 1954)[50,

51]. Хотя сейчас факт, что оксидативный стресс является одним из ключевых этапов в процессе старения не вызывает сомнения (обзор Нагшап, 1994)[52], не до конца ясны молекулярные механизмы приводящие к этому явлению. Выделяют, по крайней мере, три возможных механизма:

а) свободные радикалы реагируют с различными биологическими структурами и молекулами, вызывая возможные повреждения. Возникшие повреждения не репарируются полностью и накапливаются со временем - в результате этого происходит постепенное ухудшение взаимодействия клеточных систем. Хотя эта гипотеза довольно привлекательна (8оЬа1, 1993)[53], она не может объяснить некоторые экспериментальные результаты. Например, хотя и существует разница в общей повреждённости тканей старых и молодых животных - этого кажется не достаточным, чтобы объяснить феномен старения (или этого достаточно? если повреждения возникают в критических местах -"где тонко, там и рвётся"). Или, например, не наблюдается ожидаемого линейного увеличения концентрации оксидативно-повреждённых биомолекул в зависимости от возраста. Так же трудно объяснить, почему возникшие повреждения не репарируются до конца, а накапливаются. (Но с другой стороны, если повреждения возникли в ДНК и это привело к возникновению мутации, то репарация не возможна в принципе и такие повреждения ДНК будут накапливаться, если не приводят клетку к апоптозу.)

б) другая версия механизма повреждений вызываемых свободными радикалами, основывается на предположении, что основным объектом повреждений оксидантов являются сами митохондрии - в результате снижается способность синтезировать АТФ, главный источник энергии в клетке. Старение представляется как неизбежный процесс вследствие энергетического голодания. Существуют экспериментальные данные, показывающие, что митохондриальные мембраны и ферменты в большей степени подвержены оксидативным повреждениям, чем клеточные

структуры (Wallace et al., 1998)[54]. Но с другой стороны, в экспериментах in vitro не наблюдается значительного изменения потребления кислорода (а значит и выхода энергии) в процессе старения (Hudson et al., 1998)[55]. Поэтому сейчас ещё не представляется возможным определить, является ли энергетическое голодание причиной старения или результатом связанных со старением изменений, в) Третья гипотеза объясняющая механизм влияния свободных радикалов на старение, рассматривает феномен старения как запрограммированный процесс. Оксидативный стресс влияет на скорость старения посредством регуляции генов участвующих в развитии и клеточной дифференциации. Таким образом старение - это продолжение и последняя фаза клеточной дифференциации (Sohal and Allen, 1990; Salas-Vidal et al., 1998) [56, 57]. Однако не до конца понятен механизм регуляции экспрессии генов, и поэтому ещё рано говорить о правильности этой гипотезы.

Анализируя существующую литературу, приходим к выводу, что на сегодняшний день не существует общепринятой теории старения, а число разнообразных гипотез, пробующих объяснить какой-то аспект старения, приблизилось к 300 (Medvedev, 1990) [58].

Репарация повреждений ДНК.

После того как мы рассмотрели выше антиоксидантные системы защиты клетки от возникновения повреждений ДНК, целесообразно рассмотреть следующий, гораздо более сложный механизм защиты генетического материала, а именно репарация ДНК - процесс исправления повреждений возникших в молекуле ДНК. Необходимо отметить, что наряду со значительным прогрессом в этой области в течении последних 10 лет, остаётся довольно много нерешенных вопросов, не все молекулярные механизмы репарации до конца понятны. Большинство наших знаний о репарации были получены при изучении бактериальных систем репарации

и затем были перенесены на клетки эукариот и человека. С одной стороны это говорит об универсальности процессов репарации для про- и эукариот, с другой стороны это может привести к ошибочному упрощению самого механизма репарации. Как мы отметили выше, мутационные повреждения ДНК клетки возникают как при действии эндогенных факторов и нормального метаболизма ДНК (репликация, трансляция), так и в результате экзогенных физических и химических агентов (Схема 4).

Схема 4. Возможные пути появления повреждений ДНК.

Повреждение ДНК

Репарационные системы можно разделить на несколько основных группы: прямая репарация, экцизионная репарация, рекомбинационная репарация, и пострепликативная репарация (Схема 5). В случае прямой репарации повреждение ДНК исправляется-убирается без изменения структуры ДНК.

*Прямая репарация, например, включает в себя такие системы как: энзиматическая фото-реактивация УФ-индуцированных димеров (Екег, 1983)[59], а так же удаление Об-метил аддуктов при участии метилтрансферазы (ЫпёаЫ, 1982) [60]. Репарация двунитевых разрывов может осуществляться с вовлечением молекулярных систем рекомбинации, при этом важным условием эффективности репарации разрыва является

наличие в клетке дополнительной копии повреждённого гена (Kanaar and Hoeijmakers, 1997) [61].

Схема 5. Репарация ДНК в клетках млекопитающих

прямая репарация

рекомбинационная репарация

пострепликативная, репарация неправильных пар

экцизионная репарация

основании и однонитевых разрывов

нуклеотидов

геноспецифичная репарация

нетранскри-бируемой ДНК

избирательная репарация

репарация транскрибирующей

цепи

** Экцизионная репарация может осуществляется двумя механизмами при участии мульти- энзиматических комплексов. Первый механизм - это экцизионная репарация оснований (ЭРО), и второй, более сложный, -экцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН). В том и другом случае экцизионной репарации, удаление удаление повреждений происходит многоступенчато с участием продуктов многих генов. Если в ЭРО участвуют 7-8 белков, то процесс ЭРН обеспечивается участием около 30 белков-ферментов (Ьл^аЫ е1 а1., 1997) [62]. В обоих случаях экцизионной репарации имеются одинаковые стадии удаления повреждения и ресинтеза участка ДНК. Первая стадия включает узнавание (инициация)

повреждения, в случае ЭРО это может быть один специализированный инициирующий фермент - ДНК-гликозилаза, отщепляющая модифицированное основание. В случае ЭРН инициация и экцизия осуществляются сложным комплексом белков-ферментов, включая многосубединичный фактор транскрипции. При этом происходит вырезание повреждённого участка ДНК и дальнейшая её "очистка" -удаление от 12 до 100-150 нуклеотидов. Образовавшаяся брешь достраивается ДНК-полимеразами, и завершается процесс - связыванием концов ДНК-лигазой (Кгокап а а1., 1997) [63]. При ЭРО, после отщепления поврежденного основания, происходит разрыв нити у АП-участка (АП -апуринизация или апиримидинизация), удаление АП-сахарного звена или от одного до 3-х нуклеотидов экзонуклеазой. В последующем, образовавшаяся короткая брешь достраивается ДНК-полимеразой |3 и ДНК-лигазой (См. Схуму 6).

Схема 6. Процесс экцизионной репарации

Вырезание участка ДНК с повреждением,

Синтез ДНК на повреждённом участке, матрица-незатронутая цепочка

ДНК,

Легирование- зашивание разрыва.

Т4 эндонуклеазы (гликозилаза + АР эндонуклеаза) для УФ повреждений или цугАВС ехстискаэе

2) Образование разрывов,

~гп ¡Угттг^Угп ^-гп-

3) Вырезание участка ДНК с повреждением, -ггт/\ I I I I I I I I ¡^ I I I I I

4) Синтез ДНК на повреждённом участке, матрица-незатронутая цепочка ДНК,

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Подлуцкий, Андрей Яковлевич

4.0 Выводы.

1. Показано, что частота спонтанных hprt-мутаций в лимфоцитах селезенки старых (102-114 недельных) мышей на 70-80% выше по сравнению с таковой у молодых (8-14 недельных). Спонтанные мутации в гене hprt клеток мышей увеличиваются с их возрастом в среднем со скоростью 0,16x10"6 за один месяц.

2. Установлено, что у людей занятых производством стирола повышена частота hprt мутаций в лимфоцитах периферической крови. В условиях культивирования in vitro пролиферативная активность hprt" лимфоцитов людей в 3 раза ниже, чем в hprt+ лимфоцитах.

3. Показана линейная зависимость образования hprt мутаций in vivo в лимфоцитах селезенки мышей от дозы их у-облучения. Частота индуцированных hprt мутаций в клетках молодых мышей возрастает в 1,910,7 раза, а у старых в 2,8-13,1 раза, относительно спонтанного уровня, при y-облучении этих животных в диапазоне доз 0,5-5,0 Гр, что указывает на снижение активности клеточных систем защиты генома со старением.

4. Показано, что введение в диету мышей разного возраста антиоксидантной смеси, содержащей витамины С, Е, бета-каротин, рутин, селенит натрия и глюконат цинка, оказывает антимутагенный эффект, выражающийся в 4-5 кратном снижении частоты hprt мутаций, индуцируемых у-радиацией в спленоцитах этих мышей.

5. Получена полная характеристика молекулярного спекра спонтанных (in vivo) мутаций кодируемой части гена hprt в лимфоцитах здоровых людей. Основной вклад в спонтанные мутации hprt-гена вносят транзиции и трансверсии - 76%, мутации со сдвигом рамки считывания - 10%, делеции -10%.

6. Показано, что спектр hprt мутаций, возникающих спонтанно, при инкубации лимфоцитов человека in vitro в течении 12-14 суток, существенно отличается от спектра этих же мутаций, спонтанно возникающих in vivo, а также и от спектра мутаций, индуцируемых оксидом стирола in vitro. В последнем случае значительно преобладают трансверсии ГЦ>ТА и АТУГА.

Acknowledgements:

Автор выражает огромную благодарность всем коллегам и соавторам в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики г. Пущино и в Каролинском Институте г. Стокгольма за помощь в экспериментах и за многочисленные дискуссии о науке и жизни.

Специальную благодарность я выражаю: моему научному руководителю профессору Ажубу Ибрагимовичу Газиеву, взявшего меня в свою лабораторию еще студентом, за многочисленные научные дискуссии, за понимание и неиссякаемое терпение, за поддержку, которую я находил в течении всего этого времени. моему второму научному руководителю профессору Бо Ламберту (Во Lambert), за работу в его лаборатории, за оптимизм и поддержку, за готовность обсуждать мои проекты.

Николай Петровичу Сироте, кто научил меня работать руками во время дишюма-''Comet assay", и за моральную поддержку всё это время. Владимиру Григорьевичу Безлепкину, за практическую помощь и многие часы бесед и дискуссий.

Татьяне Бастловой, кто был моим первым наставником в молекулярной биологии, за помощь и оптимизм. всем сотрудникам лаборатории "молекулярной радиобиологии": Фоменко Л.А., Безлепкиной Т.А., Полтеву В.И., Кузнецовой Е.А., Куцему М.П., Малаховой Л.М., Ушаковой Т.Е., Шулюпиной Н.В., Васильевой Г.В., Ломаевой М.Г.,Плосконосовой И.И., Черникову А.В., Шаткиной Л.В. -за дружелюбие и готовность помочь, поддержку и терпение. сотрудникам лаборатории "environmental medicine": Deniz Meydan, Peter Hackman, Peri Noori, Sai-Mei Hou, Kerstin Holmberg, Anna-May Osterholm, Anders Wennborg for friendliness and helpfulness.

Сергею Сидашу, Александру Лисицину, Владимиру Быкову, Алексею Раку- за дружбу и взаимопонимание, без Вас мне было бы намного труднее. моим родителям, за постоянную любовь и заботу, терпение и доброту. моей семье, Наташе и Вике, за всё, шпос веру в меня.

Заключение:

В результате молекулярного анализа мутаций в hprt локусе Т-лимфоцитов человека, обработанных в условиях in vitro оксидом стирола, было показано различие в спектрах индуцированных мутаций и спонтанных мутаций в контрольных клеточных клонах. Так для спектра мутаций, вызванных обработкой оксидом стирола, характерно наличие большего количества замен пар оснований - трансверсий - ГЦ>АТ и АТ>ТА, чем в спонтанном спектре мутаций, возникающих в инкубируемых in vitro клетках.

Вместе тем, исходя из анализа ДНК аддуктов, вызванных действием оксида стирола, основным повреждением принято было рассматривать аддукты Об-гуанина, которые конвертируются в ГЦ>АТ транцизии и мы должны были ожидать увеличения именно таких мутаций при инкубации клеток с ОС, но результаты исследований не оправдали эти ожидания. Поэтому можно предполагать, что такой тип повреждений (0~6-гуанин-аддукт) успешно репарируется в гене hprt и в увеличении числа некоторых трансверсий играют роль другие повреждения. Таким образом, стирол вызывает не только повышение уровня частоты hprt мутаций в условиях in vivo, но спектр индуцированных стиролом мутаций отличен от спектра спонтанных hprt мутаций. На основании данных, полученных в этом разделе работы, можно заключить, что спектр hprt мутаций, спонтанно возникающих in vivo и после инкубации клеток in vitro - существенно различаются, что целесообразно учитывать в дальнейших исследованиях по спонтанному и индуцированному мутагенезу клеток человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Подлуцкий, Андрей Яковлевич, 1998 год

Список литературы

1. Экоцид в СССР, Мерри Фешбах, Альфред Френдли-младший, Москва 1992.

2. Фогель Ф., Мотульски А., Генетика человека, «Мир», Москва, 1990.

3. Дубинин Н.П., 1994, Некоторые проблемы современной генетики, Из-во: Наука, Москва

4. Шевченко В.А., 1996, Оценка генетического риска облучения популяции человека, в кн.: Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье Человека, Москва 1996, стр.: 50-67

5. Albertini R.J., J.A. Nicklas, J.P. O'Neill and S.H. Robinson, 1990, In Vivo somatic mutations in humans: measurement and analysis, Annu. Rev. Genet., 24, 305-326

6. Garner R.C., P.B. Farmer, G.T. Steel and A.S. Wright, Editors, Human Carcinogen Exposure, Biomonitoring and Risk Assessment, Oxford Univercity Press, 1991.

7. Albertini R.J., 1982, Studies with T-lymphocytes: An Approach to Human Mutagenicity Monitoring, In: Banbury Report, 13, Indicators of Genotoxic Exposure, pp. 393-412.

8. Umar A. and T.A. Kunkel, 1996, DNA replication fidelity, mismatch repair and genome instability in cancer cells, Eur. J. Biochem., 238 (2), 297-307.

9. Lindahl Т., 1993, Instability and decay of the primary structure of DNA, Nature, 362, 709-715.

10. Modrich P. and R. Lahue, 1996, Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology, Annu. Rev. Biochem., 65, 101-133.

11. Mullaart E., P.H.M. Lohman, F. Berends, J. Vijg, 1990, DNA damage metabolism and aging, Mutat. Res., 237, 189-210.

12. Barnett Y.A., C.M. King, 1995, An investigation of antioxidant status, DNA repair capacity and mutation as a function of age in humans, Mutat. Res., 338, 115-128.

13. Vishwanath R. and P. Shannon, 1997, Do sperm cell age? A review of the physiological changes in sperm during storage at ambient temperature. Reprod. Fertil. Dev., 9(3), 321-331.

14. Gaulden M.E., 1992, Maternal age effect: the enigma of Down syndrome and other trisomic conditions, Mutat. Res., 296, 69-88.

15. Hemminki K., A. Dipple, D.E.G. Shuker, F.F. Kadlubar, D. Segerback, H. Bartsch, Editors, DNA adducts, IARC Scientific Publications, No 125, Lyon, 1994.

16. Grzybowska E., K. Hemminki, J. Szeliga, M. Chorazy, 1993, Seasonal variation of aromatic DNA adducts in human lymphocytes and granulocytes, Carcinogenesis, 14, 2523-2526.

17. Albertini R.J., Castle K.L., and W.R. Borcherding, 1982, T-cell cloning to detect the mutant 6-thioguanine-resistant lymphocytes present in human peripheral blood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6617-6621.

18. O'Neill J.P., L.M. Sullivan, and R.J. Albertini, 1990, In vitro induction, expression and selection of thioguanine-resistant mutants with human T-lymphocytes, Mutat. Res., 240, 135-142.

19. Hakoda M., M. Akijama, S. Kyoizumi, A.A. Awa, M. Yamakido, M. Otake, 1988, Increased somatic cell mutant frequency in atomic bomb survivors, Mutat Res., 201, 39-48.

20. Sanderson B J., J.L. Dempsey, A.A. Morley, 1984, Mutations in human lymphocytes: effect of X- and UV-irradiation, Mutat. Res., 140, 223-227.

21. Langlois R.G., W.L. Bigbee, R.H. Jensen, 1986, Measurements of the frequency of human erythrocytes with gene expression loss phenotypes in the glycophorin A locus, Hum. Genet., 74, 353-362.

22. Grant S.G., and W.L. Bigbee, 1993, In vivo somatic mutation and segregation at the human glycophorin A (GPA) locus: phenotypic variation encompassing both gene-specific and chromosomal mechanisms, Mutation Res., 288, 163-172.

23. Kyoizumi S., M. Akiyama, J.B. Cologne, K. Tanabe, N. Nakamura, A.A. Awa, Y. Hirai, Y. Kusunoki, S. Umeki, 1996, Somatic cell mutations at the

glycophorin A lokus in erythrocytes of atomic bomb survivors: implications for radiation carcinogenesis, Radiat. Res., 146 (1), 43-52.

24. Janatipour M., K.J. Trainor, R. Kutlaka, D.R. Turner, and A.A. Morley, 1988, Mutations in human lymphocytes studied by an HLA selection system, Mutat. Res., 198, 221-226.

25. Kushiro J., Y. Hirai, Y. Kusunoki, K. Dohi, N. Nakamura, and M. Akiyama, 1992, Development of a flowcytometric HLA-A locus mutation assay for human peripheral blood lymphocytes, Mutat. Res., 272, 17-29.

26. Pandolfi P.P., 1998, Knoking in and out genes and trans genes: the use of the engineered mouse to study normal and aberrant hemopoiesis, Semin. Hematol., 35(2), 136-148.

27. Neuberger M.S., M.R. Ehrenstein, N. Klix, C.J. Jolly, J. Yelamos, C. Rada, C. Milstein, 1998, Monitoring and interpreting the intrinsic features of somatic hypermutation, Immunol. Rev., 162, 107-116.

28. Hanford M.G., B.C. Rashton, L.C. Goven, R.A. Farber, 1998, Microsatellite mutation in cancer cell lines deficient or proficient in mismatch perair, Oncogene, 16, 2389-2393.

29. DubrovaY.E., V.N. Nesterov, N.G. Krouchinsky, V.A. Ostapenko, R. Neumann, D.L. Neil, A.J. Jeffreys, 1996, Human minisatellite mutation rate after Chernobyl accident, Nature, 380 (6576), 683-686.

30. DubrovaY.E., V.N. Nesterov, N.G. Krouchinsky, V.A. Ostapenko, G. Vergnaud, F. Giraudeau, J. Buard, A.J. Jeffreys, 1997, Further evidence for elevated human minisatellite mutation rate in Belarus eight years after the Chernobyl accident, Mutat. Res., 381, 267-278).

31. Nygren J., M. Ljungman, G. Ahnstrom, 1995, Chromatin structure and radiation-induced DNA strand breaks in human cells: soluble scavengers and DNA-bound proteins offer a better protection against single- than doublestrand breaks, Int. J. Radiat. Biol., 68 (1), 11-18.

32. Lodish H., D. Baltimore, A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, J. Darnell, 1995, Molecular Cell Biology, Chapter 17: Cellular Energetics, 739-777, Third Edition, Scientific American Books.

33. Ames B.N., M.K. Shigenaga, T.M. Hagen, 1993, Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7915-7922.

34. Wolf R., D. Wolf, V. Ruocco, 1998, Vitamin E: the radical protector, J.Eur. Acad.Dermatol., 10, 103-117.

35. Чережанова JI.B., Е.Б. Котлярова, К.П. Гарина, 1983, Влияние а-токоферола на семена пшеницы при комбинированном воздействи с мутагеном, Цитология и Генетика, 17, 5, 40-45.

36. Berstein R.L., R. Mahurin, В.М. Hovard, 1979, Apparent antimutagenesis dy some natural products, Microb. Genet. Bull., 47, 16-19.

37. Odin A.P., 1997, Vitamins as antimutagens: advantages and some possible mechanisms of antimutagenic action, Mutat. Res., 386, 39-67.

38. Rock C.L., 1997, Carotenoids: biology and treatment, Pharmacol. Ther., 75 (3), 185-197.

39. Banhegyi G., L. Braun, M. Csala, F. Puskas, J. Mandl, 1997, Ascorbate metabolism and its regulation in animals, Free Radic. Biol. Med., 23(5), 793-803

40. Sram R.J., L. Dobias, A. Postarkova, P. Rossner, L. Janka, 1983, Effect of ascorbic acid profilaxis on the frequency of chromosomal aberration in the peripheral lymphocytes of coal-tar workers, Mutat. Res., 120, 181-186.

41. Sram R.J., M. Cerna, N. Hola, 1986, Effect of ascorbic acid and profilaxis in groups occupationally exposed to mutagens, in: C. Ramel and B. lambert (Eds.), Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B, Liss, New York, 327-335.

42. Orr W.C. and R.S. Sohal, 1994, Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in drosophila melanogaster, Science, 263, 1128-1130.

43. Przedborski S., E.A. Schon, 1998, Loss of ROS - a radical response, Nature Genetics, 18 (2), 99-100.

44. King C.M., H.E. Bristow-Craig, E.S. Gillespie, Y.A. Barnett, 1997, In vivo antioxidant status, DNA damage, mutation and DNA repair capacity in cultured lymphocytes from healthy 75- to 80-year-old humans, Mutat. Res., 377, 137-147.

45. Shacter E., R.L. Lopez, E.J. Beecham, S. Janz, 1990, DNA damage induction by phorbol ester-stimulated neutrophils is augmented by extracellular cofactors. Role of histidine and metals, J. Biol. Chem., 265 (1), 6693-6699.

46. Yamashina K., B.E. Miller, G.H. Heppner, 1986, Macrophage-mediated induction of drug-resistant variants in a mouse mammary tumor cell line, Cancer Res., 46 (5), 2396-2401.

47. Beasley R.P., 1988, Hepatitis B virus. The major etiology of hepatocellular carcinoma, Cancer, 61 (10), 1942-1956.

48. Tabor E., K. Kobayashi, 1992, Hepatitis C virus, a causative infectious agent of non-A, non-B hepatitis: prevalence and structure - summary of a conference on hepatitis C virus as a cause of hepatocellular carcinoma, J. Natl. Cancer, 84 (2), 86-90.

49. Peto R., A.D. Lopez, J. Boreham, M. Thun, CJr. Heath, 1992, Mortality from tobacco in developed countries: inderect estimation from mational vital statistics, Lancet, 339(8804), 1268-1278.

50. Harman D., 1956, Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry, J. Gerontol., 11, 298-300.

51. Gerschman R., D.L. Gilbert, S.W. Nye, P. Dwyer, W.O. Fenn, 1954, Oxigen poisoning and X-irradiation: a mechanism in common, Science, 19, 623-629.

52. Harman D., 1994, Free-radical theory of aging. Increasing the functional life span, Ann. NY Acad. Sci., 717, 1-15.

53. Sohal R.S., The free radical hypothesis of aging: an appraisal of the current status, Aging Clin. Exp. Res., 5, 3-17.

54. Wallace D.C., M.D. Broun, S. Melov, B. Graham, M. Lott, 1998, Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging, Biofactors, 7 (3), 187190.

55. Hudson E.K., N. Tsuchiya, R.G. Hansford, 1998, Age-associated changes in mitochondrial mRNA expression and translation in the Wistar rat heart, Mech. Ageing Dev., 103(2), 179-193.

56. Sohal R.S., R.G. Allen, 1990, Oxidative stress as a causal factor in differentiation and aging: a unifying hypothesis, Exp. Gerontol., 25 (6), 499522.

57. Salas-Vidal E., H. Lomeli, S. Castro-Obregon, R. Cuervo, D. Escalante-Alcalde, L. Covarrubias, 1998, Reactive oxygen species participate in the control of mouse embryonic cell death, Exp. Cell Res., 238 (1), 136-147.

58. Medvedev Z.A., 1990, An attempt at a rational classification of theories of aging, Biol. Rev., 65, 375-398.

59. Eker A.R.M. 1983, Photorepair process, in: G.Montagnoli (Ed) Molecular Models of Photoresponsiveness, Plenum Press, New York, pp. 109-132.

60. Lindahl T., 1982, DNA repair enzymes, Annu. Rev. Biochem.,-51, 61-87.

61. Kanaar R. and J.H. Hoeijmakers, 1997, Recombination and joining: different means to the same ends, Genes Funct., 1 (3), 165-174.

62. Lindahl T., P. Karran, R.D. Wood, 1997, DNA excision repair pathways, Cur. Opinion in Gen. & Devel., 7, 158-169.

63. Krokan H.E., R. Standal, G. Slupphaug, 1997, DNA glycosylases in the base excision repair of DNA, Biochem. J., 325, 1-16.

64. Bohr V.A., 1991, Gene specific DNA repair, Carcinogenesis, 12 (11), 19831992.

65. Toft N.J., Arends M.J., 1998, DNA mismatch repair and colorectal cancer, J. Pathol., 185(2), 123-129.

66. Tsukamoto Y., H. Ikeda, 1998, Double-strand break repair mediated by DNA end-joining, Genes Cells, 3 (3), 135-144.

67. Evans M.K., B.G. Taffe, C.C. Harris, V.A. Bohr, 1993, DNA strand bias in the repair of the p53 gene in normal human and xeroderma pigmentosum group C fibroblasts, Cancer Res., 53 (22), 5377-5381.

68. Scicchitano D.A., I. Mellon, 1997 Transcription and DNA damage: a link to a kink, Environ. Health Perspect., 105 (1), 145-153.

69. Lehmann A.R., 1998, Dual functions of DNA repair genes: molecular, cellular, and clinical implications, Bioessays, 20 (2), 146-155.

70. Seegmiller J.E., F.M. Rosenbloom, W.N. Kelley, 1967, Enzyme defect association with a sex-linked human neurological disorder and excessive purine synthesis, Science, 155, 1682-1684.

71. Lesch M., W.L. Nyhan, 1964, A familial disorder of uric acid metabolism and central nervous system function, Am. J. Med., 36, 561-570.

72. Strauss G.H. and R.J. Albertini, 1979, Enumeration of 6-thioguanine resistant peripheral blood lymphocytes in man as potential test for somatic cell mutation arising in vivo, Mutat. Res., 61, 353-359.

73. Albertini R.J., R.L. Kastle, W.R. Borcherding, 1982, T-cell cloning to detect the mutant 6-thioguanine-resistant lymphocytes present in human peripheral blood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 (21), 6617-6621.

74. O'Neill J.P., L.M. Sullivan and R.J. Albertini, 1990, In vitro induction, expression and selection of thioguanine-resistant mutants with human T-lymphocytes, Mutat. Res., 240, 135-142.

75. Zhang X.B., C. Urlando, K.S. Tao, J.A. Heddle, 1995, Factors affecting somatic mutation frequencies in vivo, Mutat. Res., 338, 189-201.

76. Jones I.M., C.B. Thomas, B. Tucker, C.L. Thompson, P. Pleshanov, I. Yorobtsova, D.H. Moorell, Impact of age and environment on somatic mutation at the hprt gene of T lymphocytes in human, Mutat. Res., 338, 129139.

77. Migeon B.R., Non-random X chromosome inactivation in mammalian cells, Cytogenet. Cell Genet., 80 (1-4), 142-148.

78. Edwards A., H. Voss, P. Rice, A. Civitello, J. Stegemann, C. Schwager, J. Zimmermann, H. Erfle, C.T. Caskey, W. Ansorge, 1990, Automated DNA sequencing of the human hprt locus, Genomics, 6 (4), 593-608.

79. Eads J.C., G. Scapin, Y. Xu, C. Grudmeyer, and J.C. Sacchettini, 1994, The crystal structure of human HPRT with bound GMP, Cell, 78, 325-334.

80. Morley A.A., K.J. Trainor, R. Seshadri, and R.G. Ryall, 1983, Measurement of in vivo mutations in human lymphocytes, Nature, 302, 155-156.

81. Yang T.P., P.I. Patel, A.C. Chinault, J.T. Stout, L.G. Jackson, B.M. Hildebrand, C.T. Caskey, 1984, Molecular evidence for new mutation at the hprt lokus in Lesch-Nyhan patients, Nature, 310, 412-414.

82. Andersson B., S. Fait, B. Lambert, 1992, Strand specificity for mutation induced by (+)-anti BPDE in the hprt gene in human T-lymphocytes, Mutat. Res., 269, 129-140.

83. Cadet J., 1994, DNA damage caused by oxidation, deamination, ultraviolet radiation and photoexcited psoralens, In: DNA addacts: Identification and Biological Significance, IARC Scientific Publications No. 125, Lyon, International Agency for Research on Cancer.

84. Gocke E.F., M.T. Eckhardt, M.T. King, D. Wild, 1983, Autoradiographic detection of 6-TG-resistant lymphocytes of mice: a novel system in somatic mutagenesis testing, Mutation Res., 113, 455-465.

85. Dempsey, J.L. and A.A. Morley (1986), Measurement of in vivo mutant frequency in lymphocytes in the mouse, Environ. Mutagen., 8, 385-391.

86. O'Neill J.P., L.M. Sullivan, R.J. Albertini, 1990, In vitro induction, expression and selecrion of thioguanine-resistant mutants with human T-lymphocytes, Mutat. Res., 240 (2), 135-142.

87. Yang J.L., V.M. Maher, and J.J. McCormick, 1989, Amplification and direct nucleotide sequencing of cDNA from the lysate of low numbers of diploid human cells, Gene, 83, 347-354.

88. Osterholm A.-M., S.Falt, B. Lambert, S.-M. Hou, 1995, Classification of mutations at the human hprt-locus in T-lymphocytes of bus maintenance workers by muliplex -PCR and reverse transcriptase-PCR analysis, Carcinogenesis, 16, 1909-1912.

89. Beyer W.H. (Ed.), i966, CRC Handbook of tables for probability and statistics, 2nd., CRC Press, Boca Raton, FL.

90. Snedecor G.W., W.G Cochran, 1967, Sampling from the binominal distribution. In Snedecor G.W. and W.G. Cochran, Statistical Methods, 6th Edn., The Iowa State University Press, IA, pp223-227.

91. Jones, I.M., K. Burkhart-Schuly and A.V. Carraro (1985), A method to quanttify spontaneous and in vivo induced thioguanine-resistant mouse lymphocytes, Mutation Res., 147, 97-105.

92. Dempsey, J.L. and A.A. Morley (1986), Measurement of in vivo mutant frequency in lymphocytes in the mouse, Environ. Mutagen., 8, 385-391.

93. Grdina, D.J., Y. Kataoka, I. Basis and J. Perrin, (1992) The radioprotector WR-2721 reduced neutron-induced mutations of the HPRT locus in mouse splenocytes when administered prior to the following irradiation, Cancirogenesis, 13, 811-814.

94. Albertini, R.J., L.M. Sullivan, J.K. Berman, C.J. Greene, J.A. Stewart, J.M. Silveira and J.P. O'Neill (1988), Mutagenecity monitoring in humans by autoradiographic assay for mutant T-lymphocytes, Mutation Res., 204, 481-492.

95. Albertini, R.J., J.A. Nicklas, J.P. O'Neill and S.H. Robison (1990), In vivo somatic mutations in humans: measurement and analysis, Annu. Rev. Genet., 24, 305-326

96. Morley A.A., S. Cox and R. Holliday, 1982 Human lymphocytes resistant to 6-thioguanine increase with age, Mech. Ageing Dev., 19, 21-26.

97. Trainor, K.J., D.J. Wigmore, A. Chrysostomu, J.I.Dempsey, R. Seshardi and A.A. Morley, 1984, Mutation frequency in human lymphocytes increases with age, Mech. Ageing Dev., 27, 83-86.

98. Dempsey, J.L., M. Pfeiffer and A.A. Orley, 1993, Effect of dietary restriction on in vivo somatic mutation in mice, Mutation Res., 292, 141-146.

99. Saderson, B.J.S., Dempsey J.L., Morley A.A., 1984, Mutations in human lymphocytes: Effect of X- and UV-irradiation. Mutation Res., 140, 223-227

100. Cochrane, J.E. and Skopek T.R., 1994, Mutagenicity of butadiene and its epoxide metabolites: 2. Mutation spectra of butadiene and diepoxybutane at hprt locus in splenic T-cells from exposed B6C3F1 mice. Cfrcinogenesis, 15, 719723

101. O'Neill J.P., L.M. Sullivan and R.J. Albertini, 1990, In vitro induction, expression and selection of thioguanine-resistant mutants with human T-lymphocytes, Mutat. Res., 240, 135-142.

102. Albertini R.J., K.L. Castle and W.R. Borcherding, 1982, T-cell cloning to detect the mutabt 6-TG-resistant lymphocytes present in human peripheral blood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6617-6621.

103. Albertini R.J., J.P.O'Neill, J.A. Nicklas, N.H. Heintz, P.C. Kelleher, 1985, Alterations of the hprt gene in human in vivo-derived 6-TG-resistant T-lymphocytes, Nature, 318, 369-371.

104. Nakajima T., E. Elovaara, F.J. Gonzales, H.V. Gelboin, H. Vainio, and T. Aoyama, 1993, Characterization of human cytochrome P450 isozymes responsible for styrene metabolism. In M. Sorsa, K. Peltonen, H. Vainio and K. Hemminki (eds.), Bytadiene and Styrene: assessment of health Hazards. International Agency for Research on Cancer, Lyon, pp. 101-108.

105. IARC, 1994, Some industrial chemicals, Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. International Agency for Research on Cancer, Lyon.

106. Bastlova, T., P. Vodicka, P. Peterkova, K. Hemminki, B. Lambert, 1995, Styrene oxide - induced HPRT mutations, DNA adducts and DNA strand breaks in cultured human T-lymphocytes, Carcinogenesis, 16, 2357-2362

107. Deubel, W., I.D. Bassukas, W. Schlereth, R. Lorenz, K. Hempel, 1996, Age dependent selection against HPRT deficient T lymphocytes in the HPRT1 heterozygous mouse, Mutat. Res., 351, 67-77.

108. Lesch, M., W.L. Nyhan, 1964, A familial disorder of uric acid metabolism and central nervous system function, Am. J. Med, 36,561-567.

109. Engle S.J., D.E. Womer, P.M. Davies, G. Bovin, A. Sahota, H.A. Simmonds, P.J. Stambrook, J.A. Tischfield, 1996, HPRT-APRT-deficient mice are not a model for lesch-nyhan syndrome, Hum. Mol. Genet., 5 (10), 1607-1610.

110. Cariello N.F. and T.R. Skopek, 1993, Analysis of mutations occuring at the human hprt locus, J. Mol. Biol., 231, 41-57.

111. Steen A-M., K.G. Meyer, L. Recio, 1997, Analysis of hprt mutations occuring in human TK6 lymphoblastoid cells following exposure to 1,2,3,4-diepoxybutane, Mutagenesis, 12, 2, 61-67.

112. Moore D.H., J.D. Tucker, I.M. Jones, R.G. Langlois, P. Pleshanov, I. Vorobtsova, and R. Jensen, 1994, A study of the effects of exposure on cleanup workers at the Chernobyl Nuclear Reactor accident using multiple end points, Radiation Res., 148, 463-475.

113. Slonina N., E. Neronova, T. Kharchenko, A. Nikiforov, 1997, Increased level of chromosomal aberration in lymphocytes of Chernobyl liquidators 6-10 years after the accident, Mutat. Res., 379 (2), 121-125.

114. Ostrosky-Wegman P., R. Montero, A. Palao, C. Cortinas de Nava, F. Hurtado, R.J. Albertini, 1990, 6-Thioguanine-resistant T-Lymphocyte autoradiographic assay. Determination of variation frequencies in individuals suspected of radiation exposure, Mutat. Res., 232 (1), 49-56.

115. Moore D.H., J.D. Tucker, I.M. Jones, R.G. Langlois, P. Pleshanov, I. Vorobstova, R. Jensen, 1997, A study of the effect of exposure on cleanup workers at the Chernobyl nuclear reactor accident using multiple end points, Radiat. Res., 148 (5), 463-475.

116. Bochkov N.P. and N.P. Kuleshov, 1972, Age sensitivity of human chromosomes to alkylating agents, Mutatin Res., 14, 3, 345-353

117. Джохадзе Т.А., Т.А. Лежава, 1994, Изучение структурных мутаций хромосом, индуцированных солями тяжелых металлов, при старении in vivo и in vitro, Генетика, 30, 12, 1630-1632.

118. Tates A.D., Т. Grummt, F.J. van Dam, F. De Zwart, F.J. Kasper, R. Rothe, H. Stirn, A.H. Zwinderman, A.T. Natarajan, 1994, Measurement of Frequencies of HPRT mutants, chromosomal aberrations, micronuclei, sister-chromatid axchanges and cells with high frequencies of SCEs in styrene/dichloromethane-exposed workers, Mutation Res., 313, 249-262.

119. Donner D.B., N.Y. Holbrook, 1990, Alterations in gene expression with aging. In: Handbook of the Biology of Aging, 3-rd edition, Eds.: E.L. Schneider, J.W. Rowe, Acad. Press, San Diego, pp. 97-115.

120. Austad S.N., 1997, Why We Age?, Published by John Wiley & Sons, Inc., New York, Toronto.

121. Medvedev Z.A., 1990, An attempt at a rational classification of theories of ageing, Biol. Rev., 65, 375-398

122. NCR, Mammalian Models for Research on Aging: A report of the Institute of Lab. Animal Resources Committee on Animal Models for Research on Aging, 1981, Natl. Acad. Press, Washington D.C..

123. Balachandra Dass S., S.F. Ali, R.H. Heflich, D.A. Casciano, 1997, Frequency of spontaneous and induced micronuclei in the peripheral blood of aging mice, Mutation Res., 381, 105-110

124. Gerschman R., D.L. Gilbert, S.W. Nye, P. Dwyer, W.O. Fenn, 1954, Oxigen poisoning and X-irradiation: a mechanism in common, Science, 19, 623-629.

125. Orr C., R.S. Sohal, 1994, Extension of Life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophilia melanogaster, Science, 263, 1128-1130.

126. Ames B.N., M.K. Shigenada, and T.M. Hagen, 1993, Oxidants, antioxidants, and degenerative diseases of aging, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7915-7922.

127. Swartz H.M. and K. Mader, 1995, Free radical in aging: theories, facts, and artifacts. In K. Esser and G.M. Martin (eds.), Molecular Aspekts of Aging, Wiley, Chichester, pp. 77-97.

128. Beckman K.B. and B.N. Ames, 1998, The free radical theory of aging matures, Physiol. Rev., 78 (2), 547-581.

129. Stadtman E.R., 1995, The status of oxidatively modified proteins as a marker of aging. In K. Esser and G.M. Martin (eds.), Molecular Aspekts of Aging, Wiley, Chichester, pp. 129-143.

130. Sohal R.S. and W.C. Orr, 1995, Is oxidative stress a casual factor in aging? In K. Esser and G.M. Martin (eds.), Molecular Aspekts of Aging, Wiley, Chichester, pp. 109-127.

131. Stadtman E.R. and B.S. Berlett, 1997, Reactive Oxygen - mediated protein oxidation in aging and disease, Chem. Res. Toxicol., 10, 485-494.

132. Mullaart E., P.H. Lohman, F. Berends and J. Vijg, 1990, DNA damage metabolism and aging, Mutatin Res., 237, 189-210.

133. Bohr V.A. and R.M. Anson, 1995, DNA damage, mutation and fine structure DNA repair in aging, Mutation Res., 338, 25-34.

134. Ames B.N., L.S. Gold, W.C. Willett, 1995, The causes and prevention of cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5258-5265.

135. Anisimov V.N., 1994, Age related mechanisms of susceptibility to cancer. In I.S. Fentiman, S. Monfardini (eds.), Cancer in elderly, Oxford University Press, Oxford, pp. 1-10.

136. Gutler R.G., 1984, Antioxidants, aging and longevity. In W.A. Pryor (Eds.), Free radical in biology, Academic Press, New York, pp. 371-437.

137. Lopez-Torres M., R. Perez-Campo, C. Rojas, S. Cadenas and G. Baija, 1993, Maximum life span in vertebrates: relationship with liver antioxidant enzymes, glutathione system, ascorbate, urate, sensitivity to peroxidation, true malondialdehyde, in vivo H2O2, and basal and maximum aerobic capacity, Mech. Aging Dev., 70, 177-199.

138. Bezlepkin V.G., N.P. Sirota, A.I. Gaziev, 1996, The prolongation of survival in mice by dietary antioxidants depends on their age by the start of feeding this diet, Mech. Aging. Dev., 92 (2-3), 227-234.

139. Orr W.C. and R.S. Sohal, 1994, Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster, Science, 263, 1128-1130.

140. Sohal B.S., A. Agarvwal, S. Agarwal, and W.C. Orr, 1995, Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and Increases metabolic potential in Drosophila melanogaster, J. Biol. Chem., 270, 15671-15674.

141. Kohn R.R., 1971, Effect of antioxidants on life span of C57BL mice, J. Gerontology, 26, 378-380.

142. Comfort A., I. Youhotsky-Gore and K. Pathmanathan, 1971, Effect of ethoxyquin on the longevity of C3H mice, Nature, 229, 254-255.

143. Boone C.W. and L.W. Wattenberg, 1994, Current strategies of cancer chemoprevention: 13th cancer seminar, Cancer Res., 54, 3315-3318.

144. Keloff G.J., C.W. Boone, V.E. Steele, R.J. Fay, R.A. Luber, J.A. Crowell, and C.C. Sigman, 1994, Mechanistic consideration in chemopreventive drug development, J. Cell. Biochemistry, sy\uppL, 20, 1-24.

145. Meyskens F.L. and K.N. Prasad (Eds.), 1986, Vitamins and cancer, Human cancer prevention by vitamins and micronutrients, Humana Press, Clifton, New Jersey.

146. Hayatsu H., S. Arimoto and T. Negishi, 1988, Dietary inhibitors of mutagenesis and carcinogenesis, Mutation Res., 202, 429-446.

147. Bronzetti G., H. Hayatsu, S. De Flora, M.D. Waters and D.M. Shankel (Eds.), 1992, Antimutagenesis and anticarcinogenesis mechanisms 3, Plenum, New York.

148. El-Nahas, S.M., F.E. Mattar and A.A. Mohamed, 1993, Radioprotective effect of vitamins C and E, Mutation Res., 301,143-147

149. Kuroda Y., A.K. Jaim, H. Tezuka and T. Kada, 1992, Antimutagenisity in cultured mammalian cells, Mutation Res., 267, 201-209/

150. Odin A.P., 1997, Vitamins as antimutagens: Advantages and some possible mechanisms of antimatagenic action, Mutation Res., 386, 39-67.

151. Simic M.G. and D.S. Bergtold, 1991, Dietary modlation of DNA damage in human, Mutation Res., 250, 17-24.

152. Branda R.F., R.J. Albertini, 1995, Effect of dietary components on hprt mutant frequencies in human T-lymphocytes, Mutation Res., 346, 121-127.

153. Barnett Y.A., C.M. King, 1995, An investigation of antioxidant status, DNA repair capacity and mutation as a function of age in human, Mutation Res., 338, 115-128.

154. King C.M., H.E. Bristow-Craig, E.S. Gillespie, Y.A. Barnett, 1997, In vivo antioxidant status, DNA damage, mutation and DNA repair capacity in cultured lymphocytes from healthy 75- to 80-year-old humans, Mutation Res., 377, 137-147.

155. Ames B.N., M.K. Shigenaga and T.M. Hägen, 1993, Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 79157922.

156. Longnecker M.P., P.A. Newcomb, R. Mittendorf, E.R. Greenberg, W.C. Willett, 1997, Intake of carrots, spinach, and supplements containing vitamin A in relation to risk of breast cancer, Cancer Epid., Biom. and Prev., 6, 887-892.

157. Ushakova T., H. Melkonyan, L. Nikonova, V. Gogvadze, A. Zhykova, A. Gaziev, R. Bradbury, 1996, The effect of dietary supplements on gene expression in mice tissues, Free Radical Biol. And Med., 20, 279-284.

158. Ushakova T., H. Melkonyan, L. Nikonova, V. Afanasyev, A. Gaziev, R. Bradbury and V. Gogvadze, 1998, Modification of gene expression by antioxidant dietary supplements in conditions of radiation-induced apoptosis in mouse splenocytes, Free Radical Res., in press

159. Gaziev A.I., G. Sologub, L.A. Fomenko, S.I. Zaichkina, N.I. Kosjakova, and R.J. Bradbury, Effect of vitamin-antioxidant micronutrients on the frequency of spontaneous and in vitro gamma-ray-induced micronuclei in lymphocytes of donors: he age factor, Carcinogenesis, 17, 493-499.

160. Thacker J., 1986, The nature of mutants induced by ionising radiation in cultured hamster cells, #3. Molecular characterization of hprt-deficient mutants induced by y-rays or a-pariticles showing that the majority have deletions of all or part of the hprt gene, Mutation Res., 160,267-275.

161. Park M.S., T. Hanks, A. Jaberabonsari and D.J. Chen., 1995, Molecular analysis of gamma-ray-induced mutations at the hprt locus in primary human skin fibroblasts by multiplex polymerase chain reaction, Radiation Res., 141, 1118.

162. da Cruz A.D., and B.W. Glickman, 1997, Nature of mutations in the human hprt gene following in vivo exposure to ionizing radiation of cesium-137, Environ. Mol. Mutagen., 30 (4), 385-395.

163. Edvards A., H. Voss, P. Rice, A. Civitello, J. Stegemann, C. Schwager, J. Zimmermann, H. Erfle, C.T. Caskey and W. Ansorge, 1990, Automated DNA sequencing of the human hprt locus, Genomics, 6, 593-608.

164. Cariello N.F., 1994, Software for the analysis og mutations at the human hprt gene, Mutation Res., 312, 173-185.

165. Burkhart-Schultz K., C.L. Thompson and I.M. Jones, 1996, Spectrum of somatic mutation at the hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt) gene of healthy people, Carcinogenesis, 17, 9, 1871-1883.

166. Cooper D.N. and M. Krawczak, 1993, Human gene mutation. Bios. Scientific Publishers, Oxford, UK.

167. Greenblatt M.S., W.P. Bennett, M. Hollstein and C.C. Harris, 1994, Mutations inthe p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis, Cancer Res., 54, 4855-4878.

168. Krawczak M., B. Smith-Sorensen, J. Schmidtke, V.Y. Kakkar, D.N. Cooper and E. Hovig, 1995, Somatic spectrum of cancer-associated single basepair substitution in the TP53 gene is determined mainly by endogeneus mechanisms of mutation and by selection. Human Mutation, 5, 48-57.

169. Vogelstein B., K.W. Kinzler, 1993, The multistep nature of cancer, Trends Genet., 9(4), 138-141.

170. Osterholm A-M., T. Bastlova, A. Meijer, A. Podlutsky, N. Zanesi, S.M. Hou, 1996, sequence analysis of deletion mutation at the HPRT locus of human T-lymphocytes: association of palindromic structure with a breakpoint cluster in exon 2, Mutagenesis, 11 (5), 511-517.

171. Cariello N.F., L. Cui, T.R. Skopek, 1994, In vitro mutational spectrum of alfatoxin B1 in the human HPRT gene, Cancer Res., 54, 4436-4441.

172. Andersson B., S. Fait, and B. Lambert, 1992, Strand specificity for mutations indused by (+)-anti BPDE in the hprt gene in human T-lymphocytes, Mutation Res., 269, 129-140.

173. Jensen J.G., C.M.M. van Teijlingen, G.R. Mohn, A.A. van eeland, H. Vrieling, 1994, AT base paire are the main target for mutations at the hprt locus of rat skin fibroblasts exposed in vitro to the monofunctional alkylating agent N-ethyl-N-nitrosourea, Mutagenesis, 9, 417-421

174. Bastlova T., B. Andersson, B. Lambert, and A. Kolman, 1993, Molecular analysis of ethylene oxide-induced mutations at the HPRT locus in human diploid fibroblasts, Mutation Res., 287, 283-292.

175. Yang J.-L., F.-P. Hsieh, P.-C. Lee, H.-J.R. Tseng, 1991, Strand and sequence-specific attenuation of N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced GC to AT transitions by expression of human 06-methylguanine-DNA methyltransferase in Chinese hamster ovary cells, Cancer Res., 54, 3857-3863.

176. McGregor W.G., Y.M. Maher, and J.J. McCormic, 1994, Kinds and locations of mutations induced in the hprt gene of human T-lymphocytes by 1-nitrosopyrene, including those caused by V(D)J recombinase, Cancer Res., 54, 4207-4213.

177. Vrieling H., J. Venema, M.-L. Van Rooyen, A. Van Hoffen, P. Menichini, A.A. van Zeeland, 1991, Strand specificity for UY-induced DNA repair and mutations in the Chinese hamster HPRT gene, Nucleic Acid Res., 19, 2411-2415

178. Fuskoe J.C., L.J. Zimmerman, A. Fekete, R.W. Setzzer, and B.J.F. Rossiter, 1992, Analysis of X-ray-induced HPRT mutations in CHO cells: Insertions and deletions, Mutation Res., 269, 171-183.

179. Vodicka P., T. Bastlova, L. Vodickova, K. Peterkova, B. Lambert and K. Hemminki, 1995, Biomarkers of styrene exposure in lamination workers: levels of Os-guanine DNA adducts, DNA strand breaks and mutant frequencies in hprt gene in T-lymphocytes, Carcinogenesis, 16, 1473-1481.

180. Bastlova T„ P. Vodicka, K. Peterkova, K. Hemminki, and B. Lambert, 1995, Styrene oxide-induced HPRT mutations, DNA adducts and DNA strand breaks in cultured human lymphocytes, Carcinogenesis, 16, 2357-2362.

181. Vodicka P., L. Vodickova, K.Trejbalova, R.J. Sram, and K. Hemminiki, 1994, Persistence of 06-guanine DNA adducts in styrene-exposed lamination workers determined by 32P-postlabelling, Carcinogenesis, 15, 1949-1953.