CG-узнающие C5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Черепанова, Наталья Александровна

• Черепанова, Наталья Александровна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Черепанова, Наталья Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Ингибирование С5-цитозин-ДНК-метилтрансфераз (Обзор литературы).

1.1. Классификация ингибиторов С5-МТаз.

1.2. Нуклеозидные аналоги 2'-дезоксицитидина-мишени (механизмзависимые ингибиторы).

1.2.1. Необратимые ингибиторы.

1.2.2. Обратимые ингибиторы.

1.3. Применение механизмзависимых ингибиторов в эпигенетической противоопухолевой терапии.

1.4. Использование механизмзависимых ингибиторов для изучения структуры и механизма действия С5-МТаз.

1.4.1. Рентгеноструктурный анализ (РСА).

1.4.2. Взаимодействие с мутантными формами С5-МТаз.

1.5. Ненуклеозидные ингибиторы.

Глава 2. СС-узнающие С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы Бвэ! (вркор^та) и Опт (За (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма (Обсуждение результатов).

2.1.Данные о ферментах.

2.2. Выделение ферментов.

2.3. Используемые олигонуклеотиды.

2.4. Ингибирование Св-узнающих ДНК-метилтрансферазЗБз! и ОппИЗа-СО.

2.4.1 Димерные бисбензимидизолы как ингибиторы М^э! и ОпгМЗа-СО.

2.4.1.1. Действие димерных бисбензимидизолов на каталитическую активность М^в! и ОштиЗа-СБ.

2.4.1.2. Принцип ингибирующего действия БВ(п).

2.4.1.3. Взаимодействие ОВ(п) с ДНК-субстратом.

2.4.1.4. Взаимодействие БВ(п) с Опп^За-СО.

2.4.1.5. Ингибирование метилирующей активности М^ээ! в клетках Е.соН. 50 2.4.2 Пиримидин-2(1Д)-он-содержащие ДНК-дуплексы как ингибиторы ОпгпгЗа-СБ и М^!.:.

2.4.2.1. Образование ковалентных интермедиатов реакции метилирования.

2.4.2.2. Связывание 1ЭптгЗа-СО и М.85я1 с Р-содержащими ДНК-дуплексами.

2.4.2.3. Влияние ОтМЗЬ на образование ковалентного интермедиата реакции метилирования.

2.4.2.4. Молекулярные аспекты образования ковалентного интермедиата ОптгЗа-СЭ и М^ээ! с Р-ДНК.

2.4.2.5. Ингибирование М.йээ! и ОштиЗа-СО/ОшШЬ Р-содержащими ДНК-дуплексами.

2.5. Исследование постадийного взаимодействия М^э! и БппиЗа-СО с ДНК.

2.5.1 «Выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.

2.5.2. Взаимодействие каталитической петли ОпгтЗа-СО с малой бороздкой ДНК при образовании ковалентного интермедиата.

2.5.3. Исследование роли ряда аминокислотных остатков в М.ЗБв! на различных стадиях реакции метилирования.

2.5.3.1 Выбор аминокислотных остатков.

2.5.3.2. Аминокислотные остатки, участвующие в «выпетливании» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.

2.5.3.3. Аминокислотные остатки, участвующие в катализе переноса метильной группы на ДНК.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы и материалы.

3.2. Приборы и методы.

3.3. Общие методики.

3.3.1. Формирование ДНК-дуплексов.

3.3.2. Плавление ДНК-дуплексов.

3.3.3. Приготовление компетентных клеток.

3.3.4.Выделение плазмид.

3.3.5. Выделение БппПЗа-СО и ЭптЛ.

3.3.6. Выделение М^б! и ее мутантных форм.

3.3.7. Определение Ка комплексов ОптгЗа-СО с ДНК и AdoHcy с помощью метода поляризации флуоресценции.

3.3.8. Определение комплексов М^ээ! с ДНК и AdoHcy с помощью метода «торможения» в геле.

3.3.9. Образование ковалентных интермедиатов С5-МТаз с Р-ДНК.

3.3.10. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по защите метилированной ДНК от рестрикции.

3.3.11. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по включению тритиевой метки.

3.3.12. Исследование «выпетливания» методом флуоресценции.

3.3.13. Определение Ка комплексов ОВ(11) с ДНК методом флуоресценции.

3.3.14. Ингибирование активности бисбензимидазолами в клетках Е.соИ.

4. Выводы.

5. Литература.

Список сокращений

БСА - бычий сывороточный альбумин ДТТ- 1,4-дитиотреитол

ИПТГ — изопропил-р-О-тиогалактопиранозид МТаза - ДНК-метилтрансфераза o.e. - оптическая единица ПААГ - полиакриламидный гель

С5-МТаза - ДНК-метилтрансфераза, метилирующая атом углерода С5 остатка цитозина

Синефунгин — iS-аденозил-ь-орнитин Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан Тпл - температура плавления ХС - ксиленцианол

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия РСА - рентгеноструктурный анализ ЯМР - ядерно-магнитный резонанс AdoMet - £-аденозил-ь-метионин AdoHcy - 5-аденозил-ь-гомоцистеин AzaC - 5-азацитозин В - 2-аминопурин

В-ДНК - ДНК. содержащая 2-аминопурин

ВРВ - бромфеноловый синий

DB(n) - димерный бисбензимидазол

Dnmt3a-CD - каталитический домен Dnmt3a d4HCyd— 1-р-2'-дезокси-0-рибофуранозил-пиримидин-2(1//)-он

DZdCyd — 5,6-дигидро-5-аза-2'-дезоксицитидин

ЕОСв — (-)-эпигаллокатехин-З-галлат

Рс1Сус1 — 5-фтор-2'-дезоксицитидин

РС - 5-фторцитозин,

РАМ - б(5)-карбоксифлуоресцеин т5С - 5-метилцитозин т5(1С (М) - 5-метил-2'-дезоксицитидин

КЕМ — К-этилмалеимид

Р- пиримидин-2(1//)-он

Р-ДНК-ДНК, содержащая пиримидин-2(1//)-он

Р- поляризация флуоресценции

4'-8<ЗСус1 — 4'-тио-2'-дезоксицитидин вББ - додецилсульфат натрия гс1Сус1 — 5-аза-2'-дезоксицитидин гСус! — 5-азацшидин кца{ - каталитическая константа

Ка - константа диссоциации

Кт - константа Михаэлиса

У0 - начальная скорость реакции метилирования

Ртах - максимальная скорость реакции метилирования

WT - фермент дикого типа

Для обозначения нуклеотидных звеньев, олигонуклеотидов использовали символы, рекомендованные комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС) и Международного союза биохимиков (ШВ).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «CG-узнающие C5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма»

Метилирование ДНК у эукариот является важной формой эпигенетической информации [1]. От статуса метилирования ДНК в клетках млекопитающих зависят, в частности, их нормальное развитие, регуляция экспрессии генов, геномный импринтинг, поддержание структуры хроматина. В клетках животных и человека метилирование CG-последовательностей в ДНК осуществляется С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазами (С5-МТазами) Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b [2]. С5-МТазы катализируют перенос метальной группы от кофактора, З-аденозил-ь-метионина (AdoMet), к аюму углерода С5 остатка цитозина. AdoMet при этом превращается в З-аденозил-ь-гомоцистепн (AdoHcy). Метилированные CG-участки расположены в ДНК определенным образом, формируя профиль метилирования, который создается de novo С5-МТазами Dnmt3a и Dnmt3b в процессе эмбриогенеза и копируется после каждого раунда репликации [1].

При некоторых заболеваниях, в частности при наличии опухолей, наблюдается изменение профиля метилирования. Тотальное гипометилирование повторяющихся фрагментов ДНК в опухолевых клетках вызывает нестабильность генома [3]. Наряду с этим в первичных опухолях и в опухолевых клеточных линиях происходит гиперметилирование за счет метилирования CG-островков в промоторных областях определенных генов, в том числе генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к их инактивации в процессе канцерогенеза [4-8]. В настоящее время не вызывает сомнений, что С5-МТаза Dnmt3a играет важную роль в различных типах клеток. Выявлена роль функционирования Dnmt3a при развитии таких онкологических заболеваний, как меланома и рак толстого кишечника [9, 10].

В отличие от необратимых изменений в геноме, характерных для опухолевых клеток, гиперметилирование промоторных областей генов как эпигенетический процесс потенциально обратимо. Это делает метилирование ДНК привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. Деметилирование генов-супрессоров опухолей с их последующей реактивацией представляется разумным подходом к лечению злокачественных опухолей. Можно изменять статус метилирования ДНК в клетке путем воздействия на функционирование С5-МТаз с помощью ингибиторов этих ферментов.

Следует отметить, что данные об ингибировании эукариотических С5-МТаз ограничены и относятся, главным образом, к ОппШ. Вопрос об ингибировании важнейшей эукариотической С5-МТазы- ПппиЗа- ранее практически не изучался. Кроме того, механизм ее взаимодействия с ДНК до сих пор остается малоизученным.

Объектами исследования в настоящей работе стали каталитический домен ОппйЗа мыши (Отт^За-СБ) и прокариотическая МТаза Ббб! (М.8б51), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую СС-последовательность и поэтому является привлекательной моделью для изучения эукариотических С5-МТаз.

Целью работы было исследование ингибирования Эпп^За мыши и М.БэзТ из 8р1гор1азта, а также изучение каталитического механизма этих ферментов .

В работе решались следующие задачи: 1) Исследование ингибирования М.ЗзэГ и ОппиЗа-СО с помощью соединений ненуклеозидной природы - димерных бисбензимидазолов, и механизмзависимых ингибиторов - ДНК, содержащих остаток пиримидин-2(1//)-она. 2) Исследование постадийного взаимодействия М^в! и ОштЦЗа-СЭ с ДНК, изучение роли регуляторного фактора ОптОЬ в каталитическом механизме Опт13а и определение роли некоторых аминокислотных остатков на различных стадиях реакции метилирования, проводимой М^Бв!.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Черепанова, Наталья Александровна

4. ВЫВОДЫ

1. Димерные бисбензимидазолы (DB(n)), локализуясь в малой бороздке ДНК, ингибируют каталитический домен Dnmt3a (Dnmt3a-CD) и M.SssI in vitro (IC50 5-77 мкМ). Наибольшим ингибирующим эффектом обладает соединение DB(ll) с 11-звенным метиленовым линкером, соединяющим бисбензимидазольные фрагменты. Наличие АТ-кластеров в составе ДНК-субстрата и увеличение времени инкубирования DB(n) с ДНК приводят к увеличению эффективности ингибирования. DB(n) способны проникать в клетки E.coli и ингибировать активность M.SssI.

2. ДНК-дуплексы, содержащие механизмзависпмый ингибитор ииримидин-2(1//)-он в позиции цитозина-мишени (Р-ДНК), способны образовывать ковалентные интермедиаты с M.SssI и Dnmt3a-CD, причем связь в них является лабильной. В присутствии регуляторного фактора Dnmt3L выход ковалентного интермедиата Dnmt3a-CD с ДНК увеличивается. Обнаружено, что для образования этого интермедиата важны контакты Dnmt3a с группами атомов, экспонированными в малую бороздку ДНК.

3. Р-ДНК способны ингибировать M.SssI и Dnmt3a-CD по конкурентному механизму. Высказано предположение о том, что терапевтический эффект зебуларина может быть обусловлен в том числе и ингибированием Dnmt3a.

4. Dnmt3L стимулирует разгорание флуоресценции комплекса Dnmt3a-CD с ДНК, содержащей 2-аминопурин в позиции цитозина-мишени, что свидетельствует о наличии стадии «выпетливания» метилируемого основания из двойной спирали ДНК в каталитическом механизме Dnmt3a.

5. Замены остатков S145, Q147, Т313 и R232 в M.SssI приводят к значительному уменьшению флуоресцентного сигнала комплекса С5-МТазы с ДНК, содержащей 2-аминопурин, что указывает на участие этих остатков в стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина. Замены остатков Е186 и R230 в M.SssI приводят к снижению выхода ковалентного интермедиата С5-МТазы с ДНК, содержащей пиримидин-2(1Я)-он, что позволяет сделать предположение об их участии в активации метилируемого цитозина в процессе катализа.

Заключение:

Исходя из результатов исследований, проведенных в данной работе, можно сделать вывод, что Р-ДНК обладают большей ингибирующей активностью по отношению к Dnmt3a и M.SssI, чем ингибиторы ненуклеотидной природы - димерные бисбензимидазолы, (табл. 3 и 6). Р-ДНК позволили выявить общие черты в механизме действия Dnmt3a и прокариотических С5-МТаз: в процессе метилирования ДНК с помощью остатка цистеина формируется ковалентный интермедиат, и для его образования необходимы реакционноспособный остаток цистеина и контакты С5-МТазы с малой бороздкой ДНК. Особенностями Dnmt3a являются низкий выход конъюгата, его неустойчивость к нагреванию, повышение выхода конъюгата и разгорание флуоресценции в комплексе с В-ДНК при активации регуляторным фактором Dnmt3L, что коррелирует с низкой метилирующей активностью Dnmt3a in vitro.

С помощью мутантных форм M.SssI удалось выявить остатки, участвующие в «выпетливании» метилируемого цитозина (Serl45, Glnl47, Arg232 и Thr313) и катализе (Cysl41, Glul86 и Arg230). На примере M.SssI была продемонстрирована важность консервативных остатков Serl45 (мотив VI) и Arg230 (мотив VIII) для функционирования С5-МТаз. Важным моментом явилось то, что была показана значимость неконсервативного остатка Gin 147, роль которого была предсказана по данным компьютерного моделирования.

Глава 3. Экспериментальная часть

3.1. Реактивы и материалы

Олигодезоксирибонуклеотиды. Все олигодезоксирибонуклеотиды (табл. 2), а также 18-ти звенные олигодезоксирибонуклеотиды являются коммерческими препаратами (Синтол, Россия). Флуоресцентно-меченные олигодезоксирибонуклеотиды ГвСОС, СОМСгГ, ШАТ(-), МСт^ йМ^ содержали флуоресцентный краситель б(5)-карбоксифлуоресцеин (РАМ,Г), ковалентно присоединенный через аминолинкер -ЫН-(СНг)б- к 5'-концевой фосфатной группе. Соответствующий фосфорамидит для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих пиримидин-2(1 /7)-он, был получен в лаборатории С.Н. Михайлова (Москва, Россия). Все олигодезоксирибонуклеотиды были очищены с помощью гель-электрофореза в 20%-ом денатурирующем ПААГ, элюированы из геля в виде индивидуальных цепей и обессолены в ЗАО «Синтол».

Концентрацию олигодезоксирибонуклеотидов определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера так же, как описано в работе [160]. Молярные коэффициенты экстинкции одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов общей формулой ОрЕрРрС.КрЬ и длиной п рассчитывали с точностью 10% по формуле: ¿СврРрс.к* =[2*(£оре + ЕЕрР + Вррс + . + екрО - еЕ - еР - ес - . - ек]/п. е™ =15.4 о.е./мкмоль, е™с -1А о.е./мкмоль, £™ю =11.5 о.е./мкмоль, с1^ =8.7 о.е./мкмоль, ЕМГ<1Л =13.7 о.е./мкмоль, -10.6 о.е./мкмоль, е^х,а= 12.5 о.е./мкмоль, =11.4 о.е./мкмоль, £™и1л =10.6 о.е./мкмоль, =7.3 о.е./мкмоль, =9.0 о.е./мкмоль,

Срсгг =7.6 о.е./мкмоль, е^рм =12.6 о.еУмкмоль, £™„ас =8.8 о.е./мкмоль, =10.8 о.е./мкмоль, £™р1ГГ =10.0 о.е./мкмоль, =11.7 о.е./мкмоль, =8.1 о.е./мкмоль,

9.5 о.е./мкмоль, £2^р(1Т =8.4 о.е./мкмоль. Для олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих FAM, s были рассчитаны как сумма с соответствующих ^модифицированных цепей и FAM (21000 М-1 см-1).

Ферменты. Препарат M.Hhal (120 мкМ) был любезно предоставлен С.Климашаускасом (Вильнюс, Литва), R.HinóI - коммерческий препарат «Fermentas» (Литва). Препараты рекомбинантных Dnmt3a-CD, Dnmt3L, M.SssI и ее мутантных форм были выделены, как указано ниже.

Плазмиды. Плазмида рЕТ28а, содержащая ген dnmúa, была любезно предоставлена нам профессором А. Елшем (Германия). Плазмида рЕТ41Ь, содержащая ген dnmtSl мыши, была любезно предоставлена Г.Ху (Китай). Плазмида для экспрессии рекомбинантной M.SssI (M.SssI/nH) была сконструирована Друцей В.Л. (Москва, Россия). Плазмида pBHNS-MSssI и сконструированные на ее основе плазмиды с мутациями в гене sssIM получены в лаборатории А. Киша, (Сзегед, Венгрия). Клетки E.coli штамма ER1821 для экспрессии M.SssI, а также исходная плазмида pCAL7, несущая ген M.SssI любезно предоставлены фирмой New England BioLabs (Великобритания). Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически.

Димерные бисбензимидазолы DB(n) и bis-HT(NMe) были синтезированы в лаборатории А.Л. Жузе (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия) Реактивы: бактотритон, дрожжевой экстракт и бактоагар (Difco, США); изопропил-p-D-тиогалактозид (ИПТГ) (Research Organics Inc, США); Со2+-содержащей смола TALON для металлоаффинной хроматографии (Clontech, США); глутатион сефароза (GE Healthcare, Швеция); среда LB (Amresco, США); бычий сывороточный альбумин (БСА) (Biomed, Польша); трис-(гидроксиметил)-аминометан (Трис), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол и персульфат аммония (Merck, Германия); глицерин, 1,4-дитиотреитол, имидазол, тритон Х-100, фенилметансульфонилфторид (PMSF), AdoHcy, НК№,Ы'-тетраметилэтилендиамин (Sigma, St. Louis, МО, США); лейпептин (MP Biomedicals, США); пепстатин A (Serva, Германия); коктейль ингибиторов протеиназ Complete Mini EDTA-free (Roche, США), [CH3-3H]AdoMet (77 Ки/ммоль) (Amersham Biosciences, Великобритания); ¡ 32 мМ AdoMet (New England BioLabs,) формамид (Fluka, Швейцария), этидия бромид (ЭБ) (Fluka, Швейцария); акриламид, арабиноза, Н№метилен-бисакриламид, мочевина, глицин, додецилсульфат натрия (SDS), NaCl, КС1, КН2РО4, NaH2P04, (ДиаЭм, Россия); MgCb (Panrcac, Испания) красители — маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС) (NEB, Англия); маркеры молекулярной массы белков (Fermentas, Литва); SYBR Green I (Sigma, США); ледяная уксусная кислота (ООО Авогадро); 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота (HEPES) (Amresco, США), канамицин (Синтез, Россия), N-этилмалеимид (Россия), ампициллин (Красфарма,Россия), глутатион (AppliChem, Германия), какодилат натрия (AppliChem, Германия), ДМСО (Pierce, США). Буферные растворы:

A) 25 мМ Трис-НзВОз (рН 8.3), 0.5 мМ ЭДТА; Б) 125 мМ Трис-HCl (рН 6.8);

B) 375 мМ Трис-HCl (рН 8.8);

Г) 62.5 мМ Трис-HCl, рН 6.8, 3% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 8 М мочевина, 5% (об/об) глицерин, 0.1% ВРВ;

Д) 40 мМ Трис-СНзСООН, рН 8.5, 2 мМ ЭДТА, 0.5 мкг/мл бромистого этидия; Е) 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 50 мМ NaCl;

Ж) 250 мМ КС1, 10 мМ HEPES (рН 6,7), 15 мМ СаС12, 55 мМ МпС12; 3) 10 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА;

И) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ имидазол;

К) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 20 мМ имидазол;

Л) 20 мМ КН2Р04-К0Н (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 40 мМ имидазол;

М) 20 мМ КН2Р04-К0Н (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 200 мМ имидазол; Н) 20 мМ HEPES-NaOH (рН 7.5), 100 мМ КС1, 1 мМ ЭДТА;

О) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 5%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100;

П) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 5%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ имидазол;

Р) 20 мМ КН2РО4-КОН (рН 7.5), 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 200 мМ имидазол;

С) 50 мМ Трис-HCl (рН 7.2), 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50%-ный (об/об) глицерин;

Т) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол;

У) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 10 мМ имидазол;

Ф) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 20 мМ имидазол;

X) 50 мМ NaH2P04 (рН 7.8), 300 мМ NaCl, 10%-ный (об/об) глицерин, 0.1%-ный тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 150 мМ имидазол;

X) 10 мМ Трис-HCl (рН 7.9), 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 10%-ный (об/об) глицерин,

Ч) 10 мМ Трис-HCl (рН 7.9), 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный (об/об) глицерин,

Ш) 10 мМ Трис-HCl (рН 7.9), 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 0.1 мг/мл БСА; Используемые кислоты, щелочи и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации «осч».

3.2. Приборы и методы

Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов или плазмид в УФ-области записывали на спектрофотометре Сагу Eclipse (Varían) при комнатной температуре. Оптические измерения проводили в кварцевых кюветах (длина опт. пути 1 см) фирмы «Hellma» (Германия) или «Starna Cell» (США).

Измерения поляризации флуоресценции проводили при 25°С на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían, США) при длине волны возбуждающего света 495 нм и испускаемого -— 520 нм. Значение поляризации флуоресценции (Р) определялось -gl, согласно уравнению: Р =- , где /у и /ь — вертикальная и горизонтальная

Iv+GIh составляющие испускаемого света соответственно, a G — поправочный коэффициент. Спектры флуоресценции. Флуоресценцию 2-аминопурина регистрировали при 25°С на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían) при длине волны возбуждающего света 330 нм с щелями для испускания и поглощения 10 нм. Флуоресценцию DB(11) и его комплексов с ДНК регистрировали при 25°С на спектрофлуориметре «FluoroMax-3» (Jobin Yvon) при длине волны возбуждающего света 350 нм с щелями для испускания и поглощения 5 и 10 нм, соответственно. Все измерения проводились в кювете объемом 45 мкл с длиной опт. пути 0,5 см «Hellma» (Германия).

Препаративное микроцентрифугирование проводили на микроцентрифуге «Eppendorf-5414S» (Германия). Для упаривания микроколичеств водных растворов, а также для \далення следовых количеств этанола и ацетона использовали прибор «Speed Vac» (США). Микрообъёмы растворов дозировали автоматическими дозаторами фирмы Gilson (Франция) и Eppendorf (Германия) с точностью 5%. pH растворов измеряли на потенциометре Model 701А фирмы Orion (США) с точностью до 0,005 pH.

Отмывку фильтров DE81 проводили на шейкере «SciEra» при частоте качаний 8. Стерилизацию буферных растворов и растворов антибиотиков проводили с помощью фильтрования на фильтрах «Milli Por» с размером пор 0,22 мкм. Электрофорез. а) Электрофорез комплексов ДНК-метилтрансферы Sssl с синтетическими субстратами в неденатуриругощих условиях (метод «торможения в геле» или гель-электрофорез) проводили в 8%-ном ПААГ (8% акриламида, 0.4% И^'-метиленбисакриламида в буфере А) при напряженности поля 8.5 В/см. Пробы наносили в объёме 20 мкл. б) Электрофорез Dnmt3a-CD и M.SssI, а также их конъюгатов с Р-ДНК проводили в плоском (10x10x0.075 см) ПААГ по Леммли. Концентрирующий гель: 4% акриламид, 0.104% КТчР-метиленбисакриламид, 0.1% ДСН в буфере Б; разделяющий гель: 12.5% акриламид, 0.33%"Ы,>Г-метиленбисакриламид, 0.1% SDS в буфере В. Пробы наносили в 510 мкл буфера Г.

Прокрашивали гель раствором Кумасси R-250 (СНзС00Н:С2Н50Н:Нг0=1:1:2 и 0.25% Кумасси R-250). Сначала раствор доводили до кипения, затем качали на шейкере «SciEra» при частоте качаний 6 в течение 5-7 мин. Гель отмывали 10%-ным раствором СНзСООН до обесцвечивания фона. Гели сушили на приборе Gel Slab Dryer фирмы Iloefer Scientific Instruments (США).

Для полимеризации всех акриламидных гелей к соответствующим растворам добавляли свежеприготовленный 10%-ный раствор персульфата аммония (из расчёта 50 мкл на 10 мл ПААГ) и НМ,>]',М'-тетраметилэтилендиамин (из расчёта 10 мкл на 10 мл ПААГ). в) Электрофорез плазмид проводили в 0.8%-ном агарозном геле толщиной 3 мм (0.8% агароза в буфере Д) при напряженности поля 5 В/см. г) Электрофорез реакционных смесей после расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Hinöl проводили в 20%-ном ПААГ (20% акриламида, 0.66% К.Ы'-метиленбисакриламида, 7 М мочевина в буфере А) толщиной 0.75 мм при напряженности поля 50 В/см. Пробы наносили в 10 мкл 80%-ного формамида, содержащего 1 М ЭДТА и красители-маркеры ХС (0.1 %) и ВРВ (0.1%).

Положение FAM-меченных соединений определяли флуорографией. Для этого использовали прибор FUJIFILM FLA-3000 (длина волны возбуждения 480 нм, испускания 520 нм). После регистрации флуоресценции гели обсчитывали с помощью программы ImageQuant 5.2.

Радиоактивность эН-меченных препаратов измеряли методами жидко-сцинтиляциоиного счёта, в импульсах в минуту, на счётчике Analytic Tracor Delta 300 (Нидерланды). Для измерения гетерогенного счёта 3Н-меченных препаратов, сорбированных на DE81 фильтрах (Whatman, Berntford, Великобритания), к пробе добавляли 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 (Россия) или Optiphase HiSafe 3 (Perkin Elmer, США). Ошибка счёта не превышала 5%.

3.3. Общие методики 3.3.1. Формирование ДНК-дуплексов

При формировании ДНК-дуплексов FAM-меченная цепь (или цепь, содержащая 2-аминопурин) смешивалась с 1,3-кратным избытком немеченной цепи (или цепи, не содержащей 2-аминопурина) в буфере Е. При формировании остальных субстратов цепи смешивались в соотношении 1:1 в буфере Е. Смеси олигодезоксирибонуклеотидов нагревали до 80-90°С и медленно охлаждали до комнатной температуре.

3.3.2. Плавление ДНК-дуплексов

Плавление проводили в 200 мкл раствора 1 мкМ ДНК-дуплекса в буфере Е (18-ти звенные ДНК-дуплексы) на спектрофотометре «Hitachi», Model 150-20 (Япония). Образец нагревали от 40°С до 95°С с шагом 0,5 градуса/мин. Изменение оптической плотности фиксировали при длине волны 260 нм. Кривые плавления всех используемых ДНК-дуплексов были кооперативными. Значение Тпл определяли как температуру, соответствующую половине высоты кривой плавления.

3.3.3. Приготовление компетентных клеток

На чашку Петри с LB-агаром, переносили небольшое количество клеток из музея BL21(DE3) Е. coli (или ER1821 Е. coli) и растили в течение ночи при 37°С. Затем небольшим количеством клеток с чашки Петри инокулировали 30 мл среды SOB, содержащей 300 мкл 2М раствора Mg2+ (стерильный водный раствор IM MgCl2 и 1М MgS04). Клетки выращивали при 18°С с интенсивной аэрацией (частота вращения шейкера 200-250 об/мин) до достижения мутности раствора 0,6 OD600, после чего клеточную культуру охлаждали во льду в течение 10 мин и осаждали клетки центрифугированием в течение 10 мин при 2500 g (при 4°С), как описано в [161]. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 10 мл охлаждённого буфера Ж, инкубировали 10 мин во льду и осаждали клетки центрифугирование (10 мин, 2500 g, 4°С). Супернатант удаляли, клетки осторожно ресуспендировали в 2,5 мл охлаждённого ТВ и добавляли ДМСО до конечной концентрации 7%. Всё осторожно перемешивали вращением пробирки и инкубировали 10 мин во льду. Полученную суспензию расфасовывали по 200 мкл в охлаждённые пробирки и немедленно замораживали в жидком азоте (хранили при -70°С) или сразу же проводили трансформацию. Для трансформации к компетентным клеткам добавляли 10-30 нг плазмиды в объёме 1-5 мкл и инкубировали 30 мин во льду, периодически встряхивая. После этого проводили «heat shock» (инкубировали клетки 90 сек при 42°С), помещали пробирку с клетками в лед на 5 мин и добавляли 800 мкл среды SOB, 10 мкл 2М раствора Mg2+ и 20 мкл 1М глюкозы. Клетки инкубировали в течение одного часа при 37°С. Затем растирали 20-200 мкл клеточной культуры на чашке Петри с LB-агаром, содержащим подходящий антибиотик (концентрации 50 мкг/мл ампициллина или 75 мкг/мл канамицина), и растили при 37°С в течение ночи. Затем скалывали 1-2 колонии с чашки Петри и инокулировали 20 мл среды LB с антибиотиком. Клетки выращивали в течение ночи.

3.3.4.Выделсние плазмид

Клеточную культуру Е.coli BL21 (DE3) или ER1821 выращивали до мутности 0,8 ODéoo при 37"С при интенсивном перемешивании. Откручивали при 10000g 1-2 мин, тщательно отбирали супернатант и ресуспендировали в растворе для ресуспендирования (GeneJet Plasmid Miniprep Kit, Fermentas, Литва), добавляли последовательно лизисный и нейтрализующий растворы, центрифугировали осадок при 10000g 5 мин, далее наносили раствор на колонку с сорбентом, промывали этанол содерл<ащим буфером, и смывали плазмиду 50 мкл буфера 3.

3.3.5. Выделение Dnmt3a-CD и DnmtL

Выделение каталитического домена Dnmt3a, содержащего шесть аминокислотных остатков гистидина на tV-коицс, проводили в клетках BL21(DE3) Е. coli с использованием плазмиды рЕТ28а (Novagen), содержащей ген Dnmí3a-CD, как описано в [101]. «Ночную культуру» (20 мл) Е. coli BL21(DE3) с плазмидой, содержащей ген Dnmt3a-CD в среде LB с канамицином (75 мкг/мл) разбавляли в ~50 раз средой LB с тем же антибиотиком.

Клеточную культуру выращивали при 30°С с интенсивной аэрацией. Экспрессию белка инициировали добавлением 1 мМ раствора ИПТГ при достижении мутности раствора 0.5

OD600. Затем клеточную культуру растили в течении 4-х часов при 30°С, после чего клетки осаждали центрифугирование на центрифуге Beckman Coulter J2-21 (США) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE Sonifier (Crawley,

Великобритания) в 15 мл буфера И. Выделение белка проводили в присутствии ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонилфторида (PMSF) (17 мкг/мл) и коктейля ингибиторов протеиназ Complete Mini EDTA-free (Roche) в соответствии с инструкцией.

Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4°С (30 мин, 13000 об/мин) на центрифуге Eppendorf MiniSpin. Супернатант пропускали через колонку с 600 мкл Со2 содержащей смолы TALON, для аффинной хроматографии (BD Biosciences Clontech), уравновешенную буфером И. Колонку промывали 20 мл буфера И, 20 мл буфера К и 10 мл буфера JI. Белок элюировали 1 мл буфера М. Элюированный белок диализовали при

4°С в буфере Н в течение ночи, и добавляли глицерин до конечной концентрации 40%.

После диализа препарат фермента хранили при -20°С. Чистота конечного препарата

Dnmt3a-CD определялась с помощью гель-электрофореза в 12.5% ПААГ в присутствии

0.1% SDS и составляла >95% (рис.6). Концентрацию Dnmt3a-CD определяли по методу

87

Бредфорд, используя БСА в качестве стандарта, концентрацию фермента рассчитывали как концентрацию мономерной формы.

Экспрессию Dnmt3L, содержащего кластер Hiss на N-конце белка и GST-таг на С-конце проводили точно так же, как экспрессию Dnmt3a-CD.

Выделение Dnmt3L с помощью металлоафиной хроматографии проводили аналогично Dnmt3a-CD с той разницей, что клеточную культуру разрушали в 15 мл буфера О, колонку с Со2+-содержащей смолой TALON уравновешивали также буфером О. Колонку промывали 80 мл О, и 40 мл буфера П. Белок элюировали 1 мл буфера Р. Элюированный белок диализовали при 4°С в буфере С в течение ночи.

3.3.6. Выделение M.SssI и ее мутантных форм

Ночную культуру» (10 мл) Е. coli ER1821, трансформированную плазмидой pCAL/nH (несущую ген M.SssI) или pBHNS-MSssI в среде LB с ампициллином (50 мкг/мл) разбавляли в 50 раз средой LB с тем же антибиотиком. Выращивали при 37°С с интенсивной аэрацией в течение ~3 ч до мутности 0,6 OD600, после этого проводили индукцию 1 мМ ИПТГ или 0,1% арабинозы и растили клетки ещё около 4 ч при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге Beckman Coulter J2-21 (США) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE Sonifier (Crawley, Великобритания) в 15 мл буфера Т с добавлением ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонилфторида (17 мкг/мл), лейпептина (5 мкг/мл) и пепстатина А (1 мкг/мл). Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4°С на микроцентрифуге. Все стадии выделения белка проводили при 4°С. Супернатант пропускали через колонку с 650 мкл Со2+-содержащей смолы TALON для аффинной хроматографии (BD Biosciences Clontech). Колонку промывали последовательно 10 мл буфера Т, затем 20 мл буфера У и 20 мл буфера Ф. Белок элюировали 1 мл буфера X.

Далее проводили диализ против буфера Ц при 4°С в течение ночи, затем против буфера Ч и добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при -20°С.

3.3.7. Определение Ка комплексов Dnmt3a-CD с ДНК и AdoHcy с помощью метода поляризации флуоресценции

Изучение связывания Dnmt3a-CD с ДНК проводили методом поляризации флуоресценции путем прямого титрования FAM-меченных олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов С5-МТазой Dnmt3a-CD, как описано ранее [141]. Значение поляризации флуоресценции (Р) определяли согласно уравнению Р = (/v -G/h)/(/v + 1ь), где Iv и 1ь - вертикальная и горизонтальная составляющие испускаемого света соответственно, С - поправочный коэффициент. ДНК-дуплекс (10 нМ), содержащий FAM-метку в одной из цепей, инкубировали с 0,1 мМ AdoHcy в буфере Н и измеряли значение поляризации флуоресценции ДНК-дуплекса в отсутствие фермента (/о). Затем к смеси добавляли аликвоты раствора Dnmt3a-CD и через 2 мин после добавления фермента фиксировали значение поляризации флуоресценции. Измерения проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse («Varían»). Полученные данные представляли в виде зависимости Р от концентрации Dnmt3a-CD. Кривые титрования каждого ДНК-дуплекса С5-МТазой воспроизводили не менее 3 раз и анализировали в программе Origin 7.5 соответствии уравнением Хилла:

Р-Р0) [£]" (Рт-Р0) [£]" + ' где Ро и Рт - значения поляризации флуоресценции свободной и полностью связанной FAM-меченной ДНК; [Е] - концентрация Dnmt3a-CD; п - коэффициент Хилла.

3.3.8. Определение К& комплексов М.Звв! с ДНК и АйоНсу с помощью метода торможения» в геле

РАМ меченные ДНК Св/вМГ, РС/ОМГ, ГМС/СР, ССР/СМГ (15 нМ) инкубировали с 0.1 мМ Лс1оНсу и М.Бэз! (0-350 нМ) в буфере Ш, содержащем 8% глицерин и 0.1 мМ Ас1оНсу в объеме 20 мкл в течение 5 мин при 20°С и затем 30 мин при 4°С. После электрофоретического разделения тройных комплексов от свободных ДНК-дуплексов (условия см. выше) проводили радноавтографию геля. Константы диссоциации рассчитывали методом нелинейной регрессии по уравнению (2) [51], в качестве параметров которого использовали экспериментальные зависимости степени образования комплекса от общей концентрации фермента:

У = Г[Я]0 + [Е]0 + Ка - д/([5]0 + [Е]0 + К, )2 - 4 • [Е]0 - [5]01 (2) где у - экспериментально определяемая по «торможению» в геле степень связывания

ГГС1

ДНК-дуплекса (у = ■——),

Э]о и [Е]о - общие концентрации ДНК-дуплекса и фермента соответственно, - константа диссоциации комплекса М.ЗээЬДНК-АсЬНсу.

3.3.9. Образование ковалентных интермедиатов С5-МТаз с Р-ДНК

Реакционные смеси содержали 100-200 нМ Р-содержащего РАМ-меченного дуплекса, 0,1 мМ Ас1оМе1 или АёоНсу, 2 мкМ М.Зээ! (ее мутантную форму), 2 мкМ Опт13а-СБ, 300 нМ

ОпгШЗа/ОпгЩЗЬ или 1 мкМ М.НЬа1 в буфере Н или Ш . В экспериментах с КЕМ С5

МТазы преинкубировали в присутствии 5 мМ КЕМ 10 мин при комнатной температуре, и только потом добавляли в реакционные смеси. В экспериментах с ОВ(11) соответствующий ДНК дуплекс был преинкубирован с различными концентрациями

ОВ(11) в течение 3 суток. После инкубирования при 4 °С в течение 60 мин и при комнатной температуре 10 мин в смеси был добавлен БОБ до концентрации 1%. Далее

90 половину каждой смеси нагревали при 65°С 5 мин. Образцы наносили в 12.5%-ный ПААГ по Лэммли, содержащий 0.1% SDS и анализировали с помощью электрофореза. Выходы конъюгатов были рассчитаны как соотношение интенсивности флуоресценции полосы конъюгата к общей интенсивности флуоресценции (связанного и не связанного ДНК-дуплекса).

3.3.10. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по защите метилированной ДНК от рестрикции а. Ингибирование M.SssI и Dnmt3a-CD дгшерньши бисбензимидазолами. FAM-меченные дуплексы fGCGC/CGCG или fuAT(-)/dAT(-) (300 нМ) инкубировались в присутствии различных концентраций бисбензимидазолов (0,1-200 мкМ) в буфере Н или UI, в течении трех суток при 4°С или 10 минут при 25°С. В реакционную смесь добавлялись Dnmt3a-CD (или M.SssI)) и AdoMet до концентрации 2 мкМ и 25 мкМ, соответственно. Смесь инкубировали 40 мин при 37°С. б. Ингабировачие M.SssI ДНК, содержащими пиргшидгш-2(1 Н)-он. Реакционные смеси содержали 300 нМ FAM-меченного дуплекса fGCGC/CGCG, 700 нМ немеченого дуплекса GCGC/CGCG, 0-2,5 мкМ ингибиторов PG/GM и MG/GP, 80 нМ M.SssI и 25 мкМ AdoMet в буфере III. Смесь инкубировали 30 мин при 37°С.

Далее ДНК высаживали из реакционной смеси этанолом в присутствии 0,4 М ацетата натрия. Осадок промывали 80%-ным этанолом, остатки этанола упаривали на SpeedVac. Степень метилирования определяли по защите от рестрикции прометилированных дуплексов эндонуклеазон Hin6I, ДНК расщепляли 1 ед.акт R.Hin6I в течение ночи в 20 мкл Tango-буфера (Fermentas, Литва). Реакционные смеси упаривали на SpeedVac и ресуспендировали в 10 мкл 80%-ном формамиде. Продукты реакции разделяли в 20%-ном денатурирующем ПААГ с 7М мочевиной. Полученные гели анализировали с помощью прибора FILIIFILM FLA-3000. Степень метилирования (М) определяли как соотношение количества метилированной ДНК к общему количеству

ДНК, основываясь на интенсивностях флуоресценции соответствующих полос в программе Image Quant 5.2. Для того, чтобы определить концентрацию, снижающую активность фермента на 50% (IC50) были построены зависимости относительной степени метилирования (R, %) от концентрации ингибитора. Значения R были рассчитаны по формуле R=(M-Menzyme free)/(Mmh,b,tor free - Menzyme frcc)xl00, где Menz>mo free и Mmhlbltor free -значения M для реакционных смесей, не содержащих фермента или ингибитора, соответственно. Кривые были подвергнуты регрессионному анализу в программе Origin 6.0 с использованием экспоненициальной функции R - R0+ А-е[П" , где вводными параметрами являлись R и концентрация ингибитора [I] (мкМ); a Ro и t являлись зависимыми параметрами для регрессионного анализа. Все данные демонстировали высокие коэффициенты корреляции (более 0,95). Значения IC50 были найдены с использованием полученных параметров. Для DB(4,5), когда предполагаемое значение IC50 превышало используемый диапазон концентраций ингибитора, его оценивали с помощью экстраполяции экспоненциальной функции к 50%-ному ингибированию. Значения стандартных ошибок были рассчитаны на основе 3-6 измерений.

3.3.11. Определение 50%-ных ингибирующих концентраций по включению тритиевой метки

Уровень метилирования ДНК (% метилирования) определяли по включению тритиевой метки, происходящему в процессе переноса метальной группы от [СНз-3H]AdoMet к ДНК в ходе ферментативной реакции. Реакции проводили в течение 30 мин при 37° в 10 мкл буфера Н. Реакцию инициировали добавлением фермента. Реакционные смеси наносили на ионообменные фильтры DE81 (Whatman), которые обрабатывали, как описано ранее [51], и определяли количество перенесенных метальных групп, как описано в [162].

1. Определение 1С$о. ДНК, содержащими пиримидин-2(1Н)-он. Реакционные смеси содержали 0,5 мкМ ДНК-дуплекса 30ÇG/30GÇ, 50 нМ Dnmt3a-CD/Dnmt3L, 1,3 мкМ

CH3-3H]AdoMet и 0-3 мкМ ингибитора PG/GM или MG/GP. Были построены кривые зависимости метилирования (в %) от концентрации ингибитора. Значения IC50 определяли как концентрации ингибиторов, вызвавшие 50%-ное уменьшение выхода реакции метилирования.

2. Определение К,. Реакционные смеси, содержащие 150-1500 нМ ДНК-дуплекса 30CG/30GC, 150 нМ Dnmt3a-CD/Dnmt3L, 2 мкМ [CH3-3H]AdoMet, инкубировали в присутствии 0-200 нМ ДНК-дуплекса MG/GP. Количество перенесенных метальных групп определяли, как описано выше. Из этих данных рассчитывали начальные скорости реакции метилирования (Fq). Зависимости Vq от концентрации субстрата были построены и подвергнуты регрессионному анализу в программе Origin 8.0, из них были получены значения констант Михаэлиса Кт и максимальной скорости Fmax. Далее эти данные были линеаризованы в двойных обратных координатах для нахождения К,.

3.3.12. Исследование «выпетливания» методом флуоресценции Способность С5-МТаз «выпетливать» основание-мишень была оценена с помощью флуоресцентной спектроскопии. Реакционные смеси, содержащие В-ДНК, исследовали на спектрофлуориметре «Сагу Eclipse» (Varían) с щелями возбуждения и испускания 10 нм. Флуоресценцию измеряли при 25 °С в кварцевой кювете «Hellma» с длиной оптического пути 5 мм с длиной волны возбуждения 330 нм в случае. Реакционные смеси содержали 200 нМ соответствующего ДНК-дуплекса, 0,1 мМ AdoMet, и соответствующую С5-МТазу. Использовали буфер Н в случае Dnmt3a-CD и буфер Ш в случае M.SssI и ее мутантных форм. Различные концентрации С5-МТаз (См Sssi 2 мкМ, Соштза-сп 2 мкМ, CDnmt3acD/Dnmt3L 0.4 мкМ) инкубировали с В-ДНК (200 нМ) в присутствии AdoMet или AdoHcy (0.1 мМ) при 37 °С 20 мин, и затем записывали спектр флуоресценции (350-400 нм). Спектры флуоресценции корректировались вычитанием из них контрольного спектра, полученного для реакционной смеси, в которой вместо В-содержащего ДНК-дуплекса использовался дуплекс GCGC/CGMC.

3.3.13. Определение^ комплексов DB(ll) с ДНК методом флуоресценции

Реакционные смеси содержащие 50 нМ DB(ll) и 0-20 мкМ ДНК-дуплекса GCGC/CGCG в буфере Е., инкубировали при 4° 3 суток или при 25° 10 мин. Спектры флуоресценции регистрировали в диапазоне 380-630 нм с длиной волны возбуждения 350 нм. Из значений флуоресценции при 460 нм по гиперболическому уравнению были рассчитаны константы диссоциации для комплексов DB(11) с ДНК 1-го и Ш-го типов.

3.3.14. Ингибирование активности M.SssI бисбензимидазолами в клетках E.coli Клетки штамма ER1821 были трансформированы плазмидой pBHNS, несущей M.SssI дикого типа, либо мутантную форму M.SssI R230A. Ночная культура разбавлялась 1:50 LB средой, содержащей 50 мкМ димерных бисбензимидазолов и L-арабинозу для индукции экспрессии С5-МТаз. Рост клеток фиксировали, снимая значение А600 после двух часов культивирования при 37°С при интенсивном перемешивании. Далее клетки инокулировали в 3 мл среды, содержащей 50 мкМ димерных бисбензимидазолов. Клетки культивировали до мутности 0,8 СЮбоо при 37°С при интенсивном перемешивании. Из этих клеточных культур выделялись плазмиды, как описано в 3.3.4, равные количества которых были подвергнуты расщеплению 10 ед. акт. R.HinóI в 20 мкл Tango-буфера (Fermentas) в течение 30 минут и проанализированы с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Черепанова, Наталья Александровна, 2010 год

1. Bird, А. (2002). DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 16, 6-21.

2. Hermann, A., Gowher, H., and Jeltsch, A. (2004). Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cell Mol Life Sci 61, 2571-2587.

3. Eden, A., Gaudet, F., Waghmare, A., and Jaenisch, R. (2003). Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation. Science 300, 455.

4. Jones, P.A., and Baylin, S.B. (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet 3, 415-428.

5. Baylin, S.B., Esteller, M., Rountree, M.R., Bachman, K.E., Schuebel, K., and Herman, J.G. (2001). Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer. Hum Mol Genet 10, 687-692.

6. Baylin, S.B., and Herman, J.G. (2000). DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics. Trends Genet 16, 168-174.

7. Jones, P.A., and Laird, P.W. (1999). Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet 21, 163-167.

8. Jones, P.A., and Baylin, S.B. (2007). The epigenomics of cancer. Cell 128, 683-692.

9. Deng, Т., Kuang, Y., Wang, L., Li, J., Wang, Z., and Fei, J. (2009). An essential role for DNA methyltransferase 3a in melanoma tumorigenesis. Biochem Biophys Res Commun 557, 611-616.

10. Ng, E.K., Tsang, W.P., Ng, S.S., Jin, H.C., Yu, J., Li, J.J., Rocken, C., Ebert, M.P., К wok, T.T., and Sung, J.J. (2009). MicroRNA-143 targets DNA methyltransferases ЗА in colorectal cancer. Br J Cancer 101, 699-706.

11. Jeltsch, A. (2002). Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem 3, 274-293.

12. Kumar, R., Srivastava, R., Singh, R.K., Surolia, A., and Rao, D.N. (2008). Activation and inhibition of DNA methyltransferases by S-adenosyl-L-homocysteine analogues. Bioorg Med Chem 16, 2276-2285.

13. Zingg, J.M., Shen, J.C., Yang, A.S., Rapoport, H., and Jones, P.A. (1996). Methylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosine-5)-DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res 24,3267-3275.

14. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2004). Mechanism of inhibition of DNA methyltransferases by cytidine analogs in cancer therapy. Cancer Biol Ther 3, 1062-1068.

15. Christman, J.K. (2002). 5-Azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene 21, 5483-5495.

16. Gabbara, S., and Bhagwat, A.S. (1995). The mechanism of inhibition of DNA (cytosine-5-)-methyltransferases by 5-azacytosine is likely to involve methyl transfer to the inhibitor. Biochem J 307 (Ptl), 87-92.

17. Osterman, D.G., DePillis, G.D., Wu, J.C., Matsuda, A., and Santi, D.V. (1988). 5-Fluorocytosine in DNA is a mechanism-based inhibitor of Hhal methylase. Biochemistry 27, 5204-5210.

18. Taylor, C., Ford, K., Connolly, B.A., and Hornby, D.P. (1993). Determination of the order of substrate addition to Mspl DNA methyltransferase using a novel mechanism-based inhibitor. Biochem J 291 (Ft 2), 493-504.

19. Hurd, P.J., Whitmarsh, A.J., Baldwin, G.S., Kelly, S.M., Waltho, J.P., Price, N.C., Connolly, B.A., and Hornby, D.P. (1999). Mechanism-based inhibition of C5-cytosine DNA methyltransferases by 2-H pyrimidinone. J Mol Biol 286, 389-401.

20. Zhou, L., Cheng, X., Connolly, B.A., Dickman, M.J., Hurd, P.J., and Hornby, D.P. (2002). Zebularine: a novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. J Mol Biol 321, 591-599.

21. Kumar, S., Horton, J.R., Jones, G.D., Walker, R.T., Roberts, R.J., and Cheng. X. (1997). DNA containing 4'-thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res 25, 2773-2783.

22. Flynn, J., Fang, J.Y., Mikovits, J.A., and Reich, N.O. (2003). A potent cell-active allosteric inhibitor of murine DNA cytosine C5 methyltransferase. J Biol Chem 278, 8238-8243.

23. Knox, J.D., Araujo, F.D., Bigey, P., Slack, A.D., Price, G.B., Zannis-Hadjopoulos, M., and Szyf, M. (2000). Inhibition of DNA methyltransferase inhibits DNA replication. J Biol Chem 275, 17986-17990.

24. Milutinovic, S., Knox, J.D., and Szyf, M. (2000). DNA methyltransferase inhibition induces the transcription of the tumor suppressor p21(WAFl/CIPl/sdil). J Biol Chem 275, 6353-6359.

25. Evdokimov, A.A., Zinov'ev, V.V., Kuznetsov, V.V., Netesova, N.A., and Malygin, E.G. (2009). Design of oligonucleotide inhibitors of the human DNA-methy ¡transferase 1. Mol Biol (Mosk) 43, 418-425.

26. Fang, M.Z., Chen, D., Sun, Y., Jin, Z., Christman, J.K., and Yang, C.S. (2005). Reversal of hypermethylation and reactivation of pl6INK4a, RARbeta, and MGMT genes by genistein and other isoflavones from soy. Clin Cancer Res 11, 7033-7041.

27. Siedlecki, P., Garcia Boy, R., Musch, T., Brueckner, B., Suhai, S., Lyko, F., and Zielenkiewicz, P. (2006). Discovery of two novel, small-molecule inhibitors of DNA methylation. J Med Chem 49, 678-683.

28. Suzuki, Т., Tanaka, R., Hamada, S., Nakagawa, H., and Miyata, N. (2010). Design, synthesis, inhibitory activity, and binding mode study of novel DNA methyltransferase 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 20, 1124-1127.

29. Villar-Garea, A., Fraga, M.F., Espada, J., and Esteller, M. (2003). Procaine is a DNA-demethylating agent with growth-inhibitory effects in human cancer cells. Cancer Res 63, 4984-4989.

30. Lee, B.H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., and Nelson, W.G. (2005). Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. J Biol Chem 280, 40749-40756.

31. Castellano, S., Kuck, D., Sala, M„ Novellino, E., Lyko, F., and Sbardella, G. (2008). Constrained analogues of procaine as novel small molecule inhibitors of DNA methyltransferase-1. J Med Chem 51, 2321-2325.

32. Lin, R.K., Hsu, C.H., and Wang, Y.C. (2007). Mithramycin A inhibits DNA methyltransferase and metastasis potential of lung cancer cells. Anticancer Drugs 18, 1157-1164.

33. Yokochi, Т., and Robertson, K.D. (2004). Doxorubicin inhibits DNMT1, resulting in conditional apoptosis. Mol Pharmacol 66, 1415-1420.

34. Adams, R.L., and Rinaldi, A. (1987). Effect of echinomycin on DNA methylation. FEBS Lett 215, 266-268.

35. Shvachko, L.P. (2008). Alterations of constitutive pericentromeric heterochromatin in lymphocytes of cancer patients and lymphocytes exposed to 5-azacytidine is associated with DNA-hypomethylation. Exp Oncol 30, 230-234.

36. Киселева, Н.П., Киселев, Ф.Л. (2005). Деметилирование ДНК и канцерогенез. Биохимия 70, 900-911.

37. Vilkaitis, G., Merkiene, Е., Serva, S., Weinhold, E., and Klimasauskas, S. (2001). The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhai methyltransferase. J Biol Chem 276, 20924-20934.

38. Cheng, X., and Roberts, R.J. (2001). AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Res 29, 3784-3795.

39. Bender, C.M., Zingg, J.M., and Jones, P.A. (1998). DNA methylation as a target for drug design. Pharm Res 15, 175-187.

40. Wu, J.C., and Santi, D.V. (1987). Kinetic and catalytic mechanism of Hhai methyltransferase. J Biol Chem 262,4778-4786.

41. Chen, L., MacMillan, A.M., and Verdine, G.L. (1993). Mutational Separation of DNA Binding from Catalysis in a DNA Cytosine Methytransferase. J. Am. Chem. Soc. 115, 5318-5319.

42. Subach, O.M., Khoroshaev, A.V., Gerasimov, D.N., Baskunov, V.B., Shchyolkina, A.K., and Gromova, E.S. (2004). 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction. Eur J Biochem 271, 2391-2399.

43. Jones, P.A., and Taylor, S.M. (1980). Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell 20, 85-93.

44. Constantinides, P.G., Jones, P.A., and Gevers, W. (1977). Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature 267, 364366.

45. Cheng, J.C., Matsen, C.B., Gonzales, F.A., Ye, W., Greer, S., Marquez, V.E., Jones, P.A., and Selker, E.U. (2003). Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine. J Natl Cancer Inst 95, 399-409.

46. Lee, W.J., and Kim, H.J. (2007). Inhibition of DNA methylation is involved in transdifferentiation of myoblasts into smooth muscle cells. Mol Cells 24, 441-444.

47. Santi, D.V., Norment, A., and Garrett, C.E. (1984). Covalent bond formation between a DNA-cytosine methy transferase and DNA containing 5-azacytosine. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 6993-6997.

48. Abeles, R.H., and Alston, T.A. (1990). Enzyme inhibition by fluoro compounds, J Biol Chem. 265, 16705-16708.

49. Chen, L., MacMillan, A.M., Chang, W., Ezaz-Nikpay, K., Lane, W.S., and Verdine, G.L. (1991). Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methytransferase. Biochemistry 30, 11018-11025.

50. Friedman, S., and Ansari, N. (1992). Binding of the EcoRII methyltransferase to 5-fluorocytosine-containing DNA. Isolation of a bound peptide. Nucleic Acids Res 20, 3241-3248.

51. Smith, S.S., Kaplan, B.E., Sowers, L.C., and Newman, E.M. (1992). Mechanism of human methyl-directed DNA methyltransferase and the fidelity of cytosine methylation. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 4744-4748.

52. Klimasauskas, S., Kumar, S., Roberts, R.J., and Cheng, X. (1994). Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell 76, 357-369.

53. Gabbara, S., Sheluho, D., and Bhagwat, A.S. (1995). Cytosine methyltransferase from Escherichia coli in which active site cysteine is replaced with serine is partially active. Biochemistry 34, 8914-8923.

54. Champion, C., Guianvarc'h, D., Senamaud-Beaufort, C., Jurkowska, R.Z., Jeltsch, A., Ponger, L., Arimondo, P.B., and Guieysse-Peugeot, A.L. (2010). Mechanistic insights on the inhibition of c5 DNA methyltransferases by zebularine. PLoS One 5. el2388.

55. Dong, A., Yoder, J.A., Zhang, X., Zhou, L., Bestor, T.H., and Cheng, X. (2001). Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methy¡transferase homolog that displays dénaturant-résistant binding to DNA. Nucleic Acids Res 29, 439-448.

56. Sorm, F., Piskala, A., Cihak, A., and Vesely, J. (1964). 5-Azacytidine, a new, highly effective cancerostatic. Experientia 20, 202-203.

57. Issa, J.P. (2005). Optimizing therapy with methylation inhibitors in myelodysplastic syndromes: dose, duration, and patient selection. Nat Clin Pract Oncol 2 Suppl I, S24-29.

58. Herman, J.G., and Baylin, S.B. (2003). Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med 349, 2042-2054.

59. Juttermann, R., Li, E., and Jaenisch, R. (1994). Toxicity of 5-aza-2'-deoxycytidine to mammalian cells is mediated primarily by covalent trapping of DNA methy transferase rather than DNA demcthylation, Proc Natl Acad Sci U S A 91,11797-11801.

60. Li, L.H., Olin, E.J., Buskirk, H.H., and Reineke, L.M. (1970). Cytotoxicity and mode of action of 5-azacytidine on L1210 leukemia. Cancer Res 30, 2760-2769.

61. Yoo, C.B., Jeong, S., Egger, G., Liang, G., Phiasivongsa, P., Tang, C., Redkar, S., and Jones, P.A. (2007). Delivery of 5-aza-2'-deoxycytidine to cells using oligodeoxynucleotides. Cancer Res 67, 6400-6408.

62. Beisler, J.A. (1978). Isolation, characterization, and properties of a labile hydrolysis product of the antitumor nucleoside, 5-azacytidine. J Med Chem 21, 204-208.

63. McGregor, D.B., Brown, A.G., Cattanach, P., Shepherd, W., Riach, C., Daston, D.S., and Caspary, W.J. (1989). TFT and 6TG resistance of mouse lymphoma cells to analogs of azacytidine. Carcinogenesis 10, 2003-2008.

64. Cheng, J.C., Weisenberger, D.J., Gonzales, F.A., Liang, G„ Xu, G.L., Hu, Y.G., Marquez, V.E., and Jones, P.A. (2004). Continuous zebularine treatment effectively sustains demethylation in human bladder cancer cells. Mol Cell Biol 24, 1270-1278.

65. Cheng, J.C., Yoo, C.B., Weisenberger, D.J., Chuang, J., Wozniak, C., Liang, G., Marquez, V.E., Greer, S., Orntoft, T.F., Thykjaer, Т., and Jones, P.A. (2004). Preferential response of cancer cells to zebularine. Cancer Cell 6, 151-158.

66. Newman, E.M., and Santi, D.V. (1982). Metabolism and mechanism of action of 5-fluorodeoxycytidine. Proc Natl Acad Sci U S A 79, 6419-6423.

67. O'Gara, M., Roberts, R.J., and Cheng, X. (1996). A structural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. J Mol Biol 263, 597606.

68. O'Gara, M., Klimasauskas, S., Roberts, R.J., and Cheng, X. (1996). Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. J Mol Biol 261, 634-645.

69. Громова, E.C., Хорошаев. A.E. (2003). Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. Молекуляр. биология 37, 300-314.

70. Wyszynski, M.W., Gabbara, S., and Bhagwat, A.S. (1992). Substitutions of a cysteine conserved among DNA cytosine methylases result in a variety of phenotypes. Nucleic Acids Res 20, 319-326.

71. Robert, M.F., Morin, S., Beaulieu, N., Gauthier, F., Chute, I.C., Barsalou, A., and MacLeod, A.R. (2003). DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat Genet 33, 61-65.

72. Brueckner, В., and Lyko, F. (2004). DNA methyltransferase inhibitors: old and new drugs for an epigenetic cancer therapy. Trends Pharmacol Sci 25, 551-554.

73. Lyko, F., and Brown, R. (2005). DNA methyltransferase inhibitors and the development of epigenetic cancer therapies, J Natl Cancer Inst 97, 1498-1506.

74. Stresemann, C., Brueckner, B., Musch, T., Stopper, H., and Lyko, F. (2006). Functional diversity of DNA methyltransferase inhibitors in human cancer cell lines. Cancer Res 66, 2794-2800.

75. Kim, D., Lee, I.S., Jung, J.H., Lee, C.O., and Choi, S.U. (1999). Psammaplin A, a natural phenolic compound, has inhibitory effect on human topoisomerase II and is cytotoxic to cancer cells. Anticancer Res 19,4085-4090.

76. Goll, M.G., and Bestor, T.H. (2005). Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem 74, 481-514.

77. Chen, S.M., Leupin, W., Ranee, M., and Chazin, W.J. (1992). Two-dimensional NMR studies of d(GGTTAATGCGGT).d(ACCGCATTAACC) complexed with the minor groove binding drug SN-6999. Biochemistry 31,4406-4413.

78. Adams, A., Leong, C., Denny, W.A., and Guss, J.M. (2005). Structures of two minor-groove-binding quinolinium quaternary salts complexed with d(CGCGAATTCGCG)(2) at 1.6 and 1.8 Angstrom resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61, 1348-1353.

79. Patel, K., Dickson, J., Din, S., Macleod, K., Jodrell, D., and Ramsahoye, B. Targeting of 5-aza-2'-deoxycytidine residues by chromatin-associated DNMT1 induces proteasomal degradation of the free enzyme. Nucleic Acids Res 38, 4313-4324.

80. Brana, M.F., Cacho, M., Gradillas, A., de Pascual-Teresa, B., and Ramos, A. (2001). Intercalators as anticancer drugs. Curr Pharm Des 7, 1745-1780.

81. Carter, S.K. (1975). Adriamycin-a review. J Natl Cancer Inst 55, 1265-1274.

82. Hickman, J.A. (1992). Apoptosis induced by anticancer drugs. Cancer Metastasis Rev 11, 121-139.

83. Kiechle, F.L., and Zhang, X. (2002). Apoptosis: biochemical aspects and clinical implications. Clin Chim Acta 326, 27-45.

84. Hsieh, C.L. (2005). The de novo methylation activity of Dnmt3a is distinctly different than that of Dnmtl. BMC Biochem 6, 6.

85. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2001). Enzymatic properties of recombinant Dnmt3a DNA methyltransferase from mouse: the enzyme modifies DNA in a non-processive manner and also methylates non-CpG sites. J Mol Biol 309, 1201-1208.

86. Kumar, S., Cheng, X., Klimasauskas, S., Mi, S., Posfai, J., Roberts, R.J., and Wilson, G.G. (1994). The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res 22, 1-10.

87. Posfai, J., Bhagwat, A.S., Posfai, G., and Roberts, R.J. (1989). Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res 17, 2421-2435.

88. Xie, S., Wang, Z„ Okano, M., Nogami, M„ Li, Y„ He, W.W., Okumura, K„ and Li, E. (1999). Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene 236, 87-95.

89. Gowher, H., and Jeltsch, A. (2002). Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases. J Biol Chem 277, 20409-20414.

90. Bourc'his, D., Xu, G.L., Lin, C.S., Bollman, B., and Bestor, T.H. (2001). Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Science 294, 2536-2539.

91. Hata, K., Okano, M., Lei, H., and Li, E. (2002). Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice. Development 129, 1983-1993.

92. Chedin, F., Lieber, M.R., and Hsieh, C.L. (2002). The DNA methyltransferase-like protein DNMT3L stimulates de novo methylation by Dnmt3a. Proc Natl Acad Sci U S A 99,16916-16921.

93. Suetake, I., Shinozaki, F., Miyagawa, J., Takeshima, H., and Tajima, S. (2004). DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J Biol Chem 279, 27816-27823.

94. Gowher, H., Liebert, K., Hermann, A., Xu, G., and Jeltsch, A. (2005). Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3A and Dnmt3B DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases by Dnmt3L. J Biol Chem 280. 13341-13348.

95. Kareta, M.S., Botello, Z.M., Ennis, J.J., Chou, C., and Chedin, F. (2006). Reconstitution and mechanism of the stimulation of de novo methylation by human DNMT3L. J Biol Chem 281, 25893-25902.

96. Jia, D., Jurkovvska, R.Z., Zhang, X., Jeltsch, A., and Cheng, X. (2007). Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature 449, 248-251.

97. Lin, I.G., Han, L., Taghva, A., O'Brien, L.E., and Hsieh, C.L. (2002). Murine de novo methyltransferase Dnmt3a demonstrates strand asymmetry and site preference in the methylation of DNA in vitro. Mol Cell Biol 22, 704-723.

98. Cheng, X., and Blumenthal, R.M. (2008). Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective. Structure 16, 341-350.

99. Nur, 1., Szyf, M., Razin, A., Glaser, G., Rottem, S., and Razin, S. (1985). Procaryotic and eucaryotic traits of DNA methylation in spiroplasmas (mycoplasmas). J Bacteriol 164, 19-24.

100. Pradhan, S., and Roberts, R.J. (2000). Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain. Embo J 19, 2103-2114.

101. Дарий, М.В., Кирсанова, О.В., Друца, В.Л., Кочетков, С.Н., Громова, Е.С. (2007). Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы Sssl. Молекулярная биология 41, 121-129.

102. Teng, M.K., Usman, N., Frederick, C.A., and Wang, A.H. (1988). The molecular structure of the complex of Hoechst 33258 and the DNA dodecamer d(CGCGAATTCGCG). Nucleic Acids Res 16, 2671-2690.

103. Streltsov, S.A., Gromyko, A.V., Oleinikov, V.A., and Zhuze, A.L. (2006). The Hoechst 33258 covalent dimer covers a total turn of the double-stranded DNA. J Biomol Struct Dyn 24, 285-302.

104. Громыко, A.B. (2009). ДНК-специфичные лиганды на основе димеров Хёхста 33258. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.

105. Pjura, P.E., Grzeskowiak, К., and Dickerson, R.E. (1987). Binding of Hoechst 33258 to the minor groove of B-DNA. J Mol Biol 197, 257-271.

106. Streltsov, S.A., and Zhuze, A.L. (2008). Hoechst 33258-poly(dG-dC).poly(dG-dC) complexes of three types. J Biomol Struct Dyn 26, 99-114.

107. Chen, A.Y., Yu, C., Gatto, В., and Liu, L.F. (1993). DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proc Natl Acad Sei U S A 90, 8131-8135.

108. Link, A., and Tempel, К. (1991). Inhibition of 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase and DNase I activities in vitro by some alkylating substances and antineoplastic agents. J Cancer Res Clin Oncol 117, 549-555.

109. Selby, C.P., and Sancar, A. (1991). Noncovalent drug-DNA binding interactions that inhibit and stimulate (A)BC excinuclease. Biochemistry 30, 3841-3849.

110. Ivanov, A.A., Strel'tsov, S.A., Prikazchikova, T.A., Gottikh, M.B., and Zhuze, A.L. (2008). Synthesis and properties of a symmetric dimeric bisbenzimidazole, a DNA-specific ligand. Bioorg Khim 34, 285-288.

111. Королев, С.П., Ташлицкий, B.H., Смолов, M.A., Громыко, A.B., Жузе, A.JI., Агапкина, and Готтих, М.Б. (2010). Ингибирование интегразы ВИЧ-1 димерными бисбензимидазолами с различной структурой линкера. Молекуляр. биология 44, 718-727.

112. Turner, P.R., and Denny, W.A. (1996). The mutagenic properties of DNA minor-groove binding ligands. Mutat Res 355, 141-169.

113. Кирсанова, O.B., Черепанова, H.A., Громова, E.C. (2009). Ингибирование C5-цитозин-ДНК-метилтрансфераз. Биохимия 74, 1445-1458.

114. Billam, М., Sobolewski, M.D., and Davidson, N.E. (2009). Effects of a novel DNA methyltransferase inhibitor zebularine on human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat.

115. Baubec, Т., Pecinka, A., Rozhon, W., and Mittelsten Scheid, O. (2009). Effective, homogeneous and transient interference with cytosine methylation in plant genomic DNA by zebularine. Plant J 57, 542-554.

116. Gildea, В., and McLaughlin, L.W. (1989). The synthesis of 2-pyrimidinone nucleosides and their incorporation into oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 17, 2261-2281.

117. Zhou, Y., and Ts'o, P.O. (1996). Solid-phase synthesis of oligo-2-pyrimidinone-2'-deoxyribonucleotides and oligo-2-pyrimidinone-2'-deoxyriboside methylphosphonates. Nucleic Acids Res 24, 2652-2659.

118. Kaluzhny, D.N., Mikhailov, S.N., Efimtseva, E.V., Borisova, O.F., Florentiev, V.L., Shchyolkina, A.K., and Jovin, T.M. (2003). Fluorescent 2-pyrimidinone nucleoside in parallel-stranded DNA. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22, 1499-1503.

119. Rathert, P., Rasko, Т., Roth, M., Slaska-Kiss, K., Pingoud, A., Kiss, A., and Jeltsch, A. (2007). Reversible inactivation of the CG specific SssI DNA (cytosine-C5)-methyltransferase with a photocleavable protecting group. Chembiochem 8, 202-207.

120. Maltseva, D.V., Baykov, A.A., Jeltsch, A., and Gromova, E.S. (2009). Impact of 7,8-dihydro-8-oxoguanine on methylation of the CpG site by Dnmt3a. Biochemistry 48, 1361-1368.

121. Мальцева, Д.В., Громова, E.C. (2010). Взаимодействие Dnmt3a мыши с ДНК, содержащей Об-метилгуанин. Биохимия 75, 214-223.

122. Ford, K., Taylor, C., Connolly, В., and Hornby, D.P. (1993). Effects of co-factor and deoxycytidine substituted oligonucleotides upon sequence-specific interactions between Mspl DNA methyltransferase and DNA. J Mol Biol 230, 779-786.

123. Евдокимов, A.A., Зиновьев, B.B., Кузнецов, B.B., Нетесова, H.A., Малыгин, Э.Г. (2009). Конструирование олигонуклеотидных ингибиторов ДНК-метилтрансферазы 1 человека. Молекуляр. биология 43, 455-463.

124. Roberts, R.J., and Cheng, X. (1998). Base flipping. Annu Rev Biochem 67, 181-198.

125. Holz, В., Klimasauskas, S., Serva, S., and Weinhold, E. (1998). 2-Aminopurine as a fluorescent probe for DNA base flipping by methyltransferases. Nucleic Acids Res 26, 1076-1083.

126. Allan, B.W., and Reich, N.O. (1996). Targeted base stacking disruption by the EcoRI DNA methyltransferase. Biochemistry 35, 14757-14762.

127. Martin, C.T., Ujvari, A., and Liu, C. (2003). Evaluation of fluorescence spectroscopy methods for mapping melted regions of DNA along the transcription pathway. Methods Enzymol 371, 13-33.

128. Daujotyte, D., Liutkeviciute, Z., Tamulaitis, G., and Klimasauskas, S. (2008). Chemical mapping of cytosines enzymatically flipped out of the DNA helix. Nucleic Acids Res 36, e57.

129. Reinisch, K.M., Chen, L., Verdine, G.L., and Lipscomb, W.N. (1995). The crystal structure of Haelll methytransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell 82, 143-153.

130. Sharma, V., Youngblood, B., and Reich, N. (2005). Residues distal from the active site that alter enzyme function in M.Hhal DNA cytosine methyltransferase. J Biomol Struct Dyn 22, 533-543.

131. Koudan, E.V., Bujnicki, J.M., and Gromova, E.S. (2004). Homology modeling of the CG-specific DNA methyltransferase SssI and its complexes with DNA and AdoHcy. J Biomol Struct Dyn 22, 339-345.

132. Vilkaitis, G., Dong, A., Weinhold, E., Cheng, X., and Klimasauskas, S. (2000). Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. J Biol Chem 275, 38722-38730.

133. Estabrook, R.A., Lipson, R., Hopkins, B., and Reich, N. (2004). The coupling of tight DNA binding and base flipping: identification of a conserved structural motif in base flipping enzymes. J Biol Chem 279, 31419-31428.

134. Daujotyte, D., Serva, S., Vilkaitis, G., Merkiene, E., Venclovas, C., and Klimasauskas, S. (2004). Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine. Structure 12, 1047-1055.

135. Shieh, F.K., Youngblood, B., and Reich, N.O. (2006). The role of Argl65 towards base flipping, base stabilization and catalysis in M.Hhal. J Mol Biol 362, 516-527.

136. Lau, E.Y., and Bruice, T.C. (1999). Active site dynamics of the Hhal methyltransferase: insights from computer simulation. J Mol Biol 293, 9-18.

137. Cantor, C.R., Warshaw, M.M., and Shapiro, H. (1970). Oligodeoxynucleotide interactions: III. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligodeoxynucleotides. Biopolymers 9, 1059-1077.

138. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.