Биотехнологические подходы к разработке препаратов дсРНК как потенциальных противоинфекционных средств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Левагина, Галина Михайловна

• Левагина, Галина Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Левагина, Галина Михайловна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Синтетические индукторы интерферона - двунитевые РНК

2.2 Природные индукторы интерферона на основе дсРНК.

2.3 Методы модификации индукторов интерферонов дсРНК. 26 Ф 2.4 Лекарственные формы индукторов интерферонов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологические подходы к разработке препаратов дсРНК как потенциальных противоинфекционных средств»

Биотехнология является одним из основных направлений современного научно-технического прогресса. Уровень внедрения продуктов, созданных с помощью биотехнологии, очень высок. Так, институт экономических исследований ФРГ (г. Мюнхен) показывает, что примерно 40 процентов выпущенной продукции получают на основе различных биологически активных веществ. Около половины современных биотехнологических продуктов и методов приходится на фармацевтическое производство. По прогнозу, рынок продуктов биотехнологии, основанный на новых методах генной инженерии и клеточной генетики будет приближаться к 90 - 200 млрд. долларов. Поэтому, все актуальней становится решение задач, связанных с разработкой современных высокотехнологичных процессов получения препаратов нового поколения для ветеринарии и медицины.

В настоящее время достаточно остро стоит проблема борьбы с инфекционными заболеваниями в животноводстве. Интенсивные технологии, на которых базируется современное животноводство, обуславливают снижение общей неспецифической и специфической резистентности организма животных. На этом фоне у животных, и особенно у молодняка, в массовых масштабах проявляются инфекционные болезни, вызванные как патогенной, так и в большей степени условно-патогенной микрофлорой. Такие болезни принято называть факторными [1].

Факторные инфекционные болезни довольно широко распространены в промышленном свиноводстве, и, прежде всего, среди поросят-сосунов и отъемышей, и сопровождаются большими потерями в виде низкого уровня сохранности поголовья и прироста живой массы, резким ухудшением качества продукции [2].

К сожалению, универсальных средств, обладающих широким спектром противоинфекционного действия и высокой эффективностью для лечения и профилактики этих заболеваний, нет. Используемые антибиотики не позволяют достичь желаемых результатов, так как их применение приводит к появлению лекарственно устойчивых форм бактерий и вирусов. Поэтому, все большую актуальность приобретают способы профилактики и экстренного лечения инфекционных заболеваний с помощью стимуляторов системы неспецифической резистентности. К которым относятся интерфероны и индукторы интерферона, в том числе синтетического и природного происхождения на основе двуспиральных полирибонуклеотидов. Индукторы интерферона стимулируют выработку эндогенного интерферона и являются перспективными средствами для профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Развернутое изучение полинуклеотидов, как индукторов интерферона, началось после открытия Лампсоном и Хеллеманом (1967) того, что именно двунитевые структуры обладают способностью индуцировать интерферон. Исследования индукторов интерферонов 80 — 90-х годов можно разделить на направления: фундаментальные и прикладные. Фундаментальные исследования определили физико-химические, биологические свойства и их взаимосвязи. Прикладные аспекты изучения индукторов интерферона в конечной цели привели к созданию группы медицинских противовирусных препаратов - индукторов интерферона. В основном, эти исследования проводились в СССР. В последние 10 лет работы были направлены на изучение молекулярных механизмов и ознаменовались открытием рецепторов к дсРНК. Также ведется поиск способов повышения эффективности индукторов интерферона, в том числе и путей пролонгации эффекта их действия.

В результате проведенных исследований 80 - 90-х годов, было отобрано около 10 клинически пригодных индукторов интерферона на основе двуспиральных полирибонуклеотидов: ридостин, ларифан, амиксин, полудан, полигуацил, мегасин, рифастин. И только ридостин, мазевая форма ридостина и полудан официально были разрешены для применения в медицинской практике. Препараты Вестин для ветеринарии и Ридостин для медицины [3] разработаны в НИКТИ БАВ ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» на основе дсРНК из киллерного штамма У-438 дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае.

Созданный на основе дсРНК ЗассЬаготусез сегеУ1з1ае, препарат ридостин (вестин) является стимулятором интерфероногенеза различных звеньев иммунной системы, не вызывает побочных эффектов и выделяется из экологически безопасного продуцента, что отвечает современным требованиям, предъявляемым к фармакологическим препаратам.

Положительными свойствами индукторов интерферона, содержащих дсРНК, является их видонеспецифичность, т.е. они обладают способностью стимулировать интерфероногенез и противоинфекционную устойчивость у животных различных видов и классов (рыбы, птицы, телята, свиньи и т.д.) и широкий спектр противоинфекционной активности. Показан положительный эффект от применения препарата дсРНК бактериофага £2 для профилактики и лечения острых вирусных заболеваний у телят, ягнят[4,] показано, что препарат дсРНК бактериофага £2, введенный с профилактической целью поросятам, обладает выраженным противовирусным действием в отношении вируса болезни Ауэски [5]. Прудниковым С.И. (1996) и Аликиным Ю.С. (1996,1998) экспериментально была подтверждена способность ридостина стимулировать систему неспецифической устойчивости и образование интерферона у свиней. Учитывая остроту проблемы, связанную с ассоциативными инфекционными заболеваниями у свиней и поросят, представляется перспективным продолжить поиск и исследования эффективных средств на основе дсРНК.

Из-за ряда нерешенных технологических проблем и высокой цены, препарат, несмотря на высокую эффективность, не нашел широкого применения в практике.

Лимитирующими факторами для масштабного получения препарата дсРНК ЗассЬаготусеБ сегеу1з1ае и его широкого использования является: низкая продуктивность источника получения дсРНК, высокая энергоемкость, громоздкая система разрушения дрожжей, высокая стоимость используемого сырья.

Работы, по получению природных дсРНК в опытно-промышленных масштабах немногочисленны и проводились они лишь в 80-90 годах.

Так, технология культивирования зараженных РНК-геномными бактериофагами биомассы бактерий Escherichia coli штамма Q13, высокие выходы дсРНК (237-495 мг/л) позволили нарабатывать продукт в препаративных количествах, достаточных для его всестороннего клинического изучения и опытно-промышленного получения [6]. Из биомассы E.coli амбермутанта бактериофага f2 susn получили первый препарат дсРНК, который был разрешен для проведения клинических испытаний, а из биомассы E.coli бактериофага f6 - для доклинических испытаний. Однако оба эти источника являются экологически небезопасными. Кроме того, дсРНК из биомассы бактериофага f6 обладает ярко выраженным мутагенным эффектом [7].

Другими перспективными источниками природных дсРНК являются непатогенные дрожжи Saccharomyces cerevisiae киллерных штаммов.

Продуктивность дрожжей Saccharomyces cerevisiae киллерных штаммов биомассы дрожжей по дсРНК при культивировании в ферментерах объемом 4м3, составляла 70-90 мг дсРНК на 1кг биомассы [8]. Для обеспечения промышленного выпуска дсРНК и препарата ридостин, это является явно недостаточным. Решение данной проблемы, на наш взгляд, можно решить двумя способами. Первое — повысить продуктивность дрожжей Saccharomyces cerevisiae киллерных штаммов, как по накоплению дсРНК в клетке, так и по увеличению съема биомассы дрожжей с 1 литра питательной среды. Второе - разработать новые лекарственные формы дсРНК, которые позволили бы снизить содержание дсРНК в лечебной дозе препарата при сохранении биологических свойств и эффективности, или пролонгировали действие активного начала, обеспечивали полную или частичную защиту дсРНК от деградирующих систем организма.

В последние годы разработан ряд технологических приемов создания новых лекарственных форм биологически активных веществ путем создания композиционных препаратов с различными носителями и полимерами.

Это позволяет решить вопросы снижения содержания основного биологически активного вещества, обеспечивает, зачастую, пролонгированное действие препарата, уменьшает токсическое действие БАВ, обеспечивает сохранение структуры действующего начала. К физическим носителям лекарств относят гидрогели, гидрофобные и биодеградируемые полимеры (поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиэлектролитные комплексы, ионообменные смолы, полигидроксиалкил-метакрилаты, а также природные полисахариды). Одним из приемов получения эффективных препаратов является использование методов физической иммобилизации полимеров с биологически активными веществами. Для этих целей широко используются поливинилпирролидоны и полисахариды.

Исследователи неоднократно пытались повысить эффективность и индукторов интерферона, продлить период повышенной активности системы неспецифической резистентности организма путем использования различных полимеров: ДЭАЭ-декстрана, альбумина, протамина, сефарозу, поли-Ь-лизин совместно с интерфероногенами [9,10.11].

Для пролонгирования действия индукторов интерферона в ряде работ была использована способность поливинилпирролидона (ПВП) к комплексо-образованию. Описаны методы получения комплексов природного госсипола (низкомолекулярный индуктор ИФ) с водорастворимым малотоксичным полимером - поливинилпирролидоном [12]. Данные по сравнительному изучению токсичности и противовирусной активности госсипола и его комплексов с ПВП в культурах фибробластов эмбрионов кур показывают, что такие лекарственные формы обладают низкой токсичностью, проявляя при этом выраженную противовирусную активность, причем активность комплексов зависит, как от молекулярной массы (М), так и от процентного содержания низкомолекулярного компонента.

Было показано, что комплексообразование полинуклеотидов ДЭАЭ-декстраном, альбумином, протамином или неомицином [12,11,13,14], гистонами [1510], поли-Ь-лизином [16], повышают стабильность и активность препаратов как интерфероногенов.

Предпринятые попытки повысить эффективность индукторов интерферона путем использования различных полимеров совместно с интерферо-ногенами, в том числе и с дсРНК, показали перспективность таких подходов для создания новых препаратов индукторов интерферона.

В доступной литературе не найдено данных по созданию различных модифицированных форм дсРНК ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае с перспективными полимерами поливинилпирролидоном (ПВП) и полиглюкином (ПГ). Это предопределило дальнейшие исследования.

Представлялось обоснованным оптимизировать основные стадии технологического процесса получения дсРНК дрожжей ЗассЬаготусез сегеу1з1ае в промышленных масштабах. Оценить возможность создания более эффективных лекарственных форм индукторов интерферона дсРНК БассИаготусез сегеу1з1ае с использованием водорастворимых полимеров, провести экспериментальное исследование физико-химических свойств и логических эффектов, разработать схему применения препаратов, оценить профилактическую и терапевтическую эффективность препаратов при инфекционных болезнях поросят в условиях широкого производственного эксперимента.

Цель исследования: Оптимизация технологии получения дсРНК БассИаготусез сегеу!з1ае и разработка новых композиционных препаратов с улучшенными свойствами на основе дсРНК и полимеров.

Задачи исследования: усовершенствовать состав среды для культивирования дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае киллерных штаммов в промышленных масштабах;

- изучить возможность использования газодинамического метода дезинтеграции для разрушения клеток дрожжей;

- разработать составы новых лекарственных препаратов, содержащих дсРНК и полимеры, как средств борьбы с инфекционными заболеваниями;

- оценить влияние полимеров на физико-химические и биологические свойства действующего начала (дсРНК) в препаратах;

- оценить профилактическую и терапевтическую эффективность вновь разработанных препаратов при инфекционных болезнях поросят.

Научная новизна

Экспериментально доказана возможность замены источника аминного азота - пептона и углеводного питания - мелассы на автолизат пекарских дрожжей и сахар для производства биомассы киллерных дрожжей БассИаготусез сегеу1з1ае в производственном масштабе. Применение разработанного нового состава среды позволило повысить содержание дсРНК в 1 кг более чем в 3 раза.

Впервые экспериментально продемонстрирована эффективность использования модифицированной газодинамической вихревой мельницы для дезинтеграции микроорганизмов дрожжей в жидком потоке, что выразилось в увеличении выхода целевого продукта на 20-30 % и уменьшении энергозатрат в 2 раза.

Впервые экспериментально показана возможность использования приемов физической иммобилизации дсРНК дрожжей БассИаготусез сегеу1Б1ае с полисахаридами (ПГ) и с синтетическими полимерами (ПВП).

Разработан состав и технология получения препаратов дсРНК-ПГ и дсРНК-ПВП. Содержание дсРНК - 2,4% , ПВП - 30% являются оптимальными для композиции дсРНК-ПВП. Для препарата дсРНК-ПГ оптимально содержание дсРНК - 4,2%, ПГ - 70%.

В исследованиях установлено влияние поливинилпирролидона и полиглюкина на физико-химические, структурные свойства дсРНК:

- повышается устойчивость дсРНК композиционных препаратов с полиглюкином и поливинилпирролидоном к действию нуклеаз крови человека на 10-30 %;

- использованные полимеры повышают уровень растворимости дсРНК препарата, причем скорость растворения препарата зависит от вида полимера;

- не изменяется первичная, вторичная и конформационная структура двойной спирали дсРНК при получении композиционных препаратов дсРНК с полимерами ГГВП и ПГ

Выявлено, что комплексы дсРНК-ПВП и дсРНК-ПГ обладают различными уровнями биологических эффектов:

- комплекс дсРНК-ПВП приводит к пролонгации активности перитонеальных макрофагов мышей до 5 суток. Стимулирует синтез интерферона до 2 суток при меньшем в 3-4 раза содержании дсРНК, чем в выбранном для сравнения референс препарате - ридостине;

- комплекс дсРНК с полиглюкином при меньшем в 2 раза содержании дсРНК, чем в ридостине имеет сопоставимые показатели фагоцитоз-стимулирующей и интерферониндуцирующей активности.

Новые препараты на основе дсРНК обладают выраженными профилактическими свойствами при инфекционных болезнях поросят.

Комплекс дсРНК-ПВП способствует повышению терапевтической и лечебно-профилактической эффективности антибактериальных препаратов.

Получены два патента на изобретения: Патент № 2172631 «Индукторы интерферона пролонгированного действия»; Патент № 2215781 «Питательная среда для культивирования киллерных дрожжей БассИаготусез сегеу181ае»; и

Положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ лечения и профилактики желудочно-кишечных инфекционных болезней поросят в условиях промышленного свиноводства» по заявке № 2004111 060/14 (011839) от 30 03 2004.

Практическая значимость работы

1. Разработанный состав среды, позволил усовершенствовать технологию производства биомассы киллерных дрожжей 8ассЬаготусез сегеУ181ае и внедрен в производство в ООО «Диафарм» (г. Бердск, Новосибирской области).

2. Разработанный способ дезинтеграции дрожжей внедрен в промышленное производство получения дсРНК из киллерных штаммов дрожжей 8ассЬаготусез сегеу1з1ае в ООО «Диафарм» и позволил более полно извлекать целевую фракцию нуклеотидного материала при меньших энергозатратах.

3. Композиции дсРНК-ПВП и дсРНК-ПГ могут быть рекомендованы для создания на их основе новых форм индукторов дсРНК киллерных дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае для применения в ветеринарии, обладающих пролонгированным действием.

4. Разработан способ лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней поросят в условиях промышленного свиноводства и рекомендован для использования в хозяйствах. Методические рекомендации «Иммуномодуляторы нуклеиновой природы в профилактике болезней поросят» утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 1 от 17января 2006г) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от «17» января 2006г.). На защиту выносится:

- Состав среды для культивирования дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу!з5ае в промышленных масштабах.

- Способ разрушения дрожжей ЗассЬагошусез сегеУ1з1ае газодинамическим методом дезинтеграции в модернизированной вихревой мельнице.

- Состав новых препаратов дсРНК и различных полимеров, данные о физико-химических, структурных и биологических свойствах препаратов.

- Результаты профилактической и терапевтической эффективности новых форм индукторов интерферонов при инфекционных болезнях поросят.

Апробация работы

Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, одобрены на межвузовском совещании ученых Института медицинской биотехнологии ГНЦ ВБ «Вектор» и ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН 2 декабря 2005г.

Материалы были доложены:

IIIV Международная конференция и дискуссионный научный клуб Новые информационные технологии в медицине и экологии - Украина. Крым. Гурзуф.2000 - с. 105-106.

IX Международная конференция и дискуссионный научный клуб Новые информационные технологии в медицине и экологии - Украина. Крым. Ялта-Гурзуф.2001-с.173.

Российско-Канадский коллоквиум ISTC (МНТЦ) Canadian biological sciences colloquium. Moscow, 15-17 September 2004, p. 268-273.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Получено 2 патента на изобретения. Патент № 2172631 «Индукторы интерферона пролонгированного действия»; Патент № 2215781 «Питательная среда для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae»; и

Положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ лечения и профилактики желудочно-кишечных инфекционных болезней поросят в условиях промышленного свиноводства» по заявке № 2004111 060/14(011839) от 30 03 2004.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 135 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 9 рисунками. Список литературы содержит 173 источника, из них 51 - зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Левагина, Галина Михайловна

5. ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована технология производства биомассы киллерных дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1Б1ае путем замены источника аминного азота из дорогостоящего пептона на автолизат пекарских дрожжей и источника углерода из нестандартизуемого источника - мелассы - на сахар. Это позволило повысить содержание дсРНК в 1 кг дрожжей более, чем в 3 раза, по сравнению с содержанием дсРНК в биомассе, выращенной на среде с мелассой и пептоном в промышленном масштабе. Себестоимость производимой биомассы снижается более, чем в 10 раз

2. Использование модифицированной газодинамической вихревой мельницы для дезинтеграции микроорганизмов дрожжей в жидком потоке привело увеличению выхода целевого продукта на 20-30 % и уменьшению энергозатрат в 2 раза.

3. Использование приемов физической иммобилизации дсРНК из дрожжей ЗассИаготусеБ сегеу1з1ае с полисахаридами (ГТГ) и с синтетическими высокомолекулярными полимерами (ПВП) позволило создать новые препараты пролонгированного, противоинфекционного и иммуномодулирующего действия.

4. Установлено влияние ПВП и ПГ на физико-химические, структурные и биологические свойства дсРНК, что выразилось в следующем:

- повышалась устойчивость дсРНК к действию нуклеаз крови человека композиционных препаратов дсРНК с поливинилпирролидоном и полиглюкином на 20-30%, 10-15% соответственно

- использованные полимеры повышали уровень растворимости препаратов, причем скорость растворения препарата зависела от вида полимера.

5. ПВП и ПГ в составе композиционных препаратов не изменяет первичную, вторичную и конформационную структуру дсРНК.

6. Комплекс дсРНК-ПВП до 5 суток сохраняет высокую( 150,1%) фагоцитозстимулирующую активность.

Высокомолекулярный ПВП, введенный в композиции с дсРНК, приводит к усилению интерферониндуцирующей активности комплексного препарата через 24 ч после введения опытным животным в 2,0 раза выше по сравнению с препаратом ридостин и в 2,5 раза через 48 ч при меньшем в 3-4 раза содержании дсРНК, чем в ридостине.

Комплекс дсРНК-ПГ сохраняет высокую интерферониндуцирующую и фагоцитозстимулирующую активность при меньшем (в 2 раза) содержании дсРНК, чем в ридостине.

7. Препарат дсРНК-ПВП обладает выраженными профилактическими свойствами при факторных болезнях поросят, повышая их резистентность, продуктивность и уменьшая падеж. Комплекс дсРНК-ПВП способствует повышению терапевтической эффективности антибактериального препарата тиамутин и лечебно-профилактической эффективности левотетрасульфина в условиях широкого производственного эксперимента.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты, полученные при усовершенствовании биотехнологических стадий процесса культивирования биомассы киллерных штаммов дрожжей БассЬаготусез сегеу1з1ае и стадии дезинтеграции дрожжей, внедрены в ООО «Диафарм» и вошли в Промышленные регламенты производства ПР №103.0063.03

Результата научных исследований разработки состава композиций дсРНК-ПВП и дсРНК-ПГ рекомендуется использовать для разработки схем применения препаратов и составления проектов Фармакопейных статей предприятия на лекарственные формы препаратов.

Разработанные и апробированные схемы применения препаратов используются на свинокомплексах ОАО «Кудряшовское» Новосибирской области и ЗАО «Сибирская аграрная группа» Томской области и могут быть использованы для разработки «Наставления по применению».

Для профилактики факторных инфекционных болезней поросят рекомендуется применять препараты дсРНК-ПВП и дсРНК-ПГ поросятам в критические периоды жизни (в зависимости от сроков отъема) на 15, 25, 45 или 30, 38 дни в дозе 0,3 мг/кг.

Для терапии факторных инфекционных болезней поросят рекомендуется сочетанное применение препарата дсРНК-ПВП в дозе 0,3 мг/кг однократно и антибиотиков (10 %-ный раствор тиамутина в дозе 10 мг/кг или левотетросульфин в дозе 0,5 мг/кг) или дсРНК-ПГ в дозе 0,3 мг/кг трехкратно.

Основные положения, полученные автором в процессе работы, вошли в методические рекомендации « Иммуномодуляторы нуклеиновой природы в профилактике болезней поросят», рассмотрены и утвержденны ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол № 1 от «17» января 2006 г) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от «17» января 2006 г).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ у

Как показывает анализ литературных данных, в фармацевтической науке продолжает развиваться направление на создание новых препаратов содержащих различные компоненты, причем компоненты подбираются таким образом, чтобы повысилась биодоступность действующего начала, его специфическая активность, снизилась токсичность. В ряде случаев, этот подход позволяет снизить дозу активного в фармакологическом отношении компонента. Все это может быть отнесено и к индукторам интерферона различной структуры и происхождения, которые в настоящее время уже находят применение как видонеспецифичные препараты, обладающие противоинфекционным и иммуномодулирующим действием. В связи с этим были получены препараты, содержащие индуктор интерферона дсРНК Saccharomyces cerevisiae и полимеры - полиглюкин и поливинилпирролидон. Разработанный способ получения позволил получить стандартные образцы и исследовать их физико-химические свойства. Показано, что при хранении и течение 2 лет основные характеристики препарата не изменяются. При анализе межмолекулярных взаимодействий между полимером и дсРНК было обнаружено, что в композиции дсРНК - ПВП образуются межмолекулярные валентные взаимодействия. С помощью биологического тестирования подобраны концентрации дсРНК и полимеров в композиционных препаратах, обеспечивающих противовирусную, фагоцитозстимулирующую и интерферониндуцирующую активность.

Следует отметить, что такие эффекты, как интерферониндукция, фагоцитоз имели более длительный характер у препарата с синтетическим

115 полимером ПВП, чем при действии индуктора интерферона ридостина и зависели от вида, молекулярного веса используемого полимера.

Дозы дсРНК в препаратах с полимерными носителями были существенно меньше, чем при использовании референс препарата -ридостина.

Таким образом, оптимизация технологического процесса получения дсРНК позволили разработать экономически рентабельную технологию получения дсРНК в промышленных масштабах. Использование метода физической иммобилизации дсРНК с полимерами привело к созданию усовершенствованных препаратов индукторов интерферона дсРНК. Исследования подтверждают, что выбранные подходы к получению композиционных препаратов дсРНК с выбранными полимерами обеспечивают сохранение физико-химических, биологических свойств дсРНК, выявленных проведенными исследованиями индуктора интерферона.

Показано, что композиции обладают таким же спектром биологической активности, как и ридостин, но при меньшем содержании дсРНК. Препараты отнесены к группе малотоксичных препаратов. Они проявляют выраженную профилактическую и лечебно-профилактическую эффективность при инфекционных заболеваниях у поросят в условиях широкого производственного опыта.

Однако механизмы действия препаратов требуют дальнейших исследований, что поможет уточнить дозы, схемы применения и выбрать наиболее эффективную лекарственную форму индукторов интерферона на основе природной дсРНК, как противоинфекционного препарата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Левагина, Галина Михайловна, 2006 год

1. Джупина С.И. Факторные инфекционные болезни животных. Ветеринария. -2001.-№3.- С. 6-9.

2. Пустовар А.Я., Скобельцина Е.С., Гайдамака A.B. Показатели Т-системы иммунитета у поросят при раннем отъеме // Ветеринария.-1985.-№8. -С.-35-6.

3. Патент РФ № 2083221. Индуктор интерферона ридостин.

4. Мозгис В.Я., Андерсон З.Э. и др. Применение индуктора интерферона для профилактики и лечения острых вирусных заболеваний телят// Изв. АН ЛатвССР. -1986. № 11.- С. 108-110.

5. Бояринцев JI.E. Защитное действие дсРНК при болезни Ауэски.//Изучение индуктора интерферона двуспиральной РНК в различных биологических системах - Рига, Зинатне ,1989 - С.59-67.

6. Буйкис А.Х. Опыт получения биомассы бактерий Escherichia coli, содержащей дсРНК//в кн. Изучение индуктора интерферона- двуспиральной РНК в различных биологических системах. Рига «Зинатне», 1989, С 22-29.

7. Дубатолова Т.Д.,. Дужак А. Б, Костомаха А.Н., Масычева В.И. и др Целесообразность оценки мутагенной активности природных индукторов интерферона на основе дсРНК// Биотехнология.-1989.-Т.5, № 3.- С. 381-383.

8. Опытно-промышленный регламент на производство натриевой соли двуспиральной рибонуклеиновой кислоты. /ОПР 1172-2-98.

9. Соколова Т.М., Антонов А.И. Фосфорилирование белков в цитоплазматической и ядерной фракциях человеческих клеток, обработанных двуспиральной РНК и человеческими рекомбинантными интерферонами типа I. //Мол.Ген.Микробиол. Вирусол. 1991. № 13.-С.8-13;

10. Заявка 2476488 Франция заявл.25.02. 80, № 8004040. Levy В.

11. Амитина H.H., Тазулахова Э Б., Ершов Ф.И. Эффект сочетанного применения декстран-сульфата с двунитчатыми РНК в отношении продукции интерферона//Антибиотики и медицинская биотехнология, 1985.-№1.С.16-19.

12. Карпович Л.Г., Блоха B.B., Калашникова T.B. и др. Показатели функциональной активности лимфоцитов больных рецидивирующим кожно-генитальным герпесом в процессе лечения герпетической вакциной.// Вопросы Вирусологии.-1986-№ 2-С. 200-204.

13. Кольцов В. Д., Краснова JI.B., Баландин И.Г. и др. Интерферониндуцирующая активность полиИ-полиЦ и его комплексов с поликатионами и их устойчивость к ферментативному разрушению//Бюл. Экспериментальной биологии и медицины. -1983 -№9-С.74-77

14. Фомина А.Н., Николаева О.В, Мощик К.В., Мясненко A.M. Сравнительное изучение биологической активности индукторов интнрферона различной природы при экспериментальных вирусных инфекциях // Индукторы Интерферона -М.-, 1982-С. 116-121.

15. Осидзе Д.В., Селиванов А.В., Груздев К.Н. Перспективы применения индукторов интерферона в ветеринарии //Тез. Докл. 10 Регион. Симпозиум соц. Стран по интерферону. Юрмала, 5-10 сент.М.; Рига, 1988.-С. 94-95

16. Фельдмане Г.Я.,. Дук А.Э, Буйкис А.Х и др. Изучение некоторых биологических свойств природного индуктора интерферона- двуспиральной РНК // Индукторы Интерферона. Рига, Зинатне, 1981 -С.36-42.

17. Ершов Ф. И., Новохатский А. С., Интерферон и его индукторы. М.: Медицина, 1980-С. 6.

18. Lampson GP, Tytell АА, Field АК, Nemes MM, Hilleman MR. Influence of polyamines on induction of interferon and resistance to viruses by synthetic polynucleotides. Proc Soc Exp Biol Med. 1969 Oct; 132(l):212-8. 21. Field AK,

19. Lampson GP, Tytell AA, Nemes MM, Hilleman MR. Inducers of interferon and host resistance, IV. Double-stranded replicative form RNA (MS2-Ff-RNA) from E. coli infected with MS2 coliphage. Proc Natl Acad Sci USA. 1967 Nov;58(5): 2102-8

20. Turner W, Chan SP, Chirigos MA. Stimulation of humoral and cellular antibody formation in mice by poly Ir:Cr. Proc Soc Exp Biol Med. 1970 Jan;133(l):334-8.

21. Фадина В.А., Разворотнкв В. А. Изучение иммуностимулирующего действия препарата дрожжевой дсРНК на клеточный иммунитет у мышей // Антибиотики и химиотерапия.-1988.-Т. 38.-С. 527-529

22. Прудников С.И. Оптимизация системы противоэпизоотических мероприятий в промышленном свиноводстве. Автореф. На соискан. ст. доктора веет, наук., Новосибирск, 1996 44 с.

23. WarnerRC. Studies on polynucleotides synthesized by polynucleotide phosphorylase. III. Interaction and ultraviolet absorption. J Biol Chem. 1957 Dec;229 (2):711-24.

24. Steiner RF, Beers RF /Jr. Polynucleotides. VII. Interaction of polyriboadenylic and polyribouridylic acids. Biochim Biophys Acta. 1959 Jun;33 (2):470-81.

25. Rich A. Formation of two- and three-stranded helical molecules by polyinosinic acid and polyadenylic acid. Nature. 1958 Feb 22;181(4608):521-5.

26. FRESCO JR, ALBERTS BM, DOTY P. Some molecular details of the secondary structure of ribonucleic acid. Nature. 1960 Oct 8;188:98-101.

27. RichA. The molecular structure of polyinosinic acid. Biochim Biophys Acta. 1958 Sep;29(3):502-9.

28. Davies DR, CrickFH, Watson JD. The molecular structure of polyadenylic acid. JMol Biol. 1961 Feb;3:71-86.

29. Miles HT. Infrared spectra of the three-stranded helices formed by polyurdylic acid with polyadenylic acid and with tetraadenylic acid. Biochim Biophys Acta. 1960 Dec 4; 45:196-8.

30. DotyP, Boetker H, Fresco JR, HallBD, Haselkorn R. Configurational studies of polynucleotides and ribonucleic acid. Ann N Y Acad Sci. 1959 Sep 4;81:693-708. Doty P., Reviews of Modern Physics, 31, p. 107, 1959.

31. MILES HT. Quantitative infrared spectra in D20 of some nucleosides, nucleotides, and polynucleotides; a new measure of polynucleotide interaction. Biochim Biophys Acta. 1958 Nov;30(2):324-8.

32. De Clercq E, Merigan TC. Current concepts of interferon and interferon induction. Annu Rev Med. 1970;21:17-46

33. De Clerk E., Tckstein F., Merigan T.C «Ann N Y Acad.Sci», 1970,173, 444.

34. De Clercq E, Wells RD, Grant RC, Merigan TC. Thermal activation of the antiviral activity of synthetic double-stranded polyribonucleotides. J Mol Biol. 1971 Feb 28;56(1):83-100.

35. De Clercq E, Hattori M, Ikehara M. Antiviral activity of polynucleotides: copolymers of inosinic acid and N2-dimethylguanylic of 2-methylthioinosinic. Nucleic Acids Res. 1975 Jan;2(l):121-9.

36. De Clercq E. Synthetic interferon inducers. Top Curr Chem. 1974;52:173-208.

37. Johnston MI, Stollar BD, Torrence PF, Witkop B. Structural features of double-stranded polyribonucleotides required for immunological specificity and interferon induction. Proc Natl Acad Sci USA. 1975 Nov;72(l l):4564-8.

38. Цитотоксичность Интерферониндуцирующая активность модифицированных Pt (11) комплексов поли И • поли (Ц) Н.Н. Носик, А.И. Закабунин, С.А. Козлов и др./ Индукторы интерферона. М. - 1982. - С. 56-59.

39. Ершов Ф.И., Жданов В.М., Клинически перспективные индукторы интерферона// Индукторы интерферона. М., 1982. - С. 7-12

40. Inglot AD. A rich source of replicative ribonucleic acid of Sindbis virus—a potent interferon inducer. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 1970;18(4):401-8.

41. Lago BD, Birnbaum J, Demain AL. Fermentation process for double-stranded ribonucleic acid, an interferon inducer. Appl Microbiol. 1972 Sep;24(3):430-6.

42. Doskocil J, Fuchsberger N, Vetrak J, Lackovic V, Borecky L. Double-stranded f 2 phage RNA as interferon inducer. Acta Virol. 1971 Nov;15(6):523.

43. Ложа В.П., Мелдрайс JI.A., Винкело P.A., Фелдмане Г.Я. «Выделение и фракционирование РНК бактерий Escherichia coli, инфицированных РНК-геномными бактериофагами в кн. Индукция и действие интерферона. Рига., 1975, с. 44-58;

44. Ложа В.П., Умбрашко Ю.Б., Муциниеце З.А. Методологические аспекты получения двуспиральной РНК в кн. Индукторы интерферона,1. Рига, 1981, с.30-35.

45. De Clercq Е, De Somer P. Mechanism of the antiviral activity resulting from sequential administration of complementary homopolyribonucleotides to cell cultures. J Virol. 1972 May;9(5):721-31.

46. Gajdosova E, Doskocil J, Mayer V. Dependence of antiviral activity on molecular weight in an interferon stimulator of the natural double-stranded RNA type. Acta Virol. 1973 May; 17(3): 196-202.

47. Nordlund JJ, Wolff SM, Levy HB. Inhibition of biologic activity of poly I: poly С by human plasma. Proc Soc Exp Biol Med. 1970 Feb;133(2):439-44.49

48. Fuchsberger N, Vetrak J, Lackovic V, Borecky L, Doskocil J. Evaluationof the Czechoslovak double-stranded RNA preparation as inducer of interferon in model experiments. Acta Virol. 1972 Nov;16(6):466-76.

49. Умбрашко Ю.Б. Зависимость функциональных свойств природной двуспиральной РНК от ее структурной организации//Вирусы человека и животных: Тез. Докл. Конф. Мол. Ученых. Рига: Зинайне, 1984. - С. 105.

50. Milch Н, Fornosi F. Bacteriophage contamination in live poliovirus vaccine. J Biol Stand. 1975;3(3):307-10

51. AC № 1197462 СССР «Способ получения двуспиральных РНК из микроорганизмов», Дужак А.Б., Лобова Н.Н., Подгорный В.Ф./Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ. № 3493453; Заяв от 24.09.1982.

52. Натриевая соль двуспиральной рибонуклеиновой кислотф ВФС 42-264395. Регистрационное удостоверение 96/50/3/

53. Дужак А.Б., Лохов С.Г., Закабунин А.И. и др.Изучение труктурной организации двуспиральной РНК киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiaeметодом термической денатурации.//Молекулярная биология. 1985. - Т. 19, вып. 6.-С. 1579-1584.

54. ФелдманеГ.Я.,. Умбрашко Ю.Б., Буйкис Ф.А.Х. и др. Физико-химические и биологические свойства двуспиральной РНК индуктора интнрферонаУ/Вопросы вирусологии,-1984 -Т.29 вып. №4-С.463-467

55. Фадина В.А., Разворотнев В.А. Изучение иммуностимулирующего действия препарата дсРНК на клеточный иммунитет у мышей// Антибиотики и химиотерапия.-1988.-Т.ЗЗ, № 7.-С. 527-529.

56. Веревкина К.Н., Даниленко Е.Д., Костомаха А.Н и др. Изменение показателей неспецифической защиты организма мышей при введении двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Вопросы вирусологии.-1989.-Т. 34,№ 1.- С. 69-72.

57. Дужак А.Б., Костомаха А.Н., Лобова H.H., Подгорный В.Ф., Носик H.H., Ершов Ф.И. Антибиотики и медицина// Биотехнология. 1985. - Т. 30, № 1. - С. 19-21

58. Умбрашко Ю. Б. ,Муцениеце 3. А. Выделение и очиска индуктора интерферона- двуцепочечной РНК// Вирусы человека и животных: Тез. докл. конф. мол. ученых Рига: Зинатне,1981.- С. 63.

59. Носик H. Н., Ершов Ф. И. Свойства двуспиральной РНК как индуктора интерферона // Вопросы вирусологии.-1984.-Т. 29, № 5.- С. 599-603

60. Interferon Inducers: Applications in Fish Disease Control. Yuriy S Alikin, Valentina I. Mfsycheva., And Igor S. Shelkunov// Recent Advtnces in Marine Biotechnology.-2001 V.5.- P. 357-3777

61. Носик H.H., Ершов Ф.И., Николаева О.В. и др. Интерферониндуцирующая и противовирусная активность дсРНК дрожжевого происхождения.// Вопросы вирусологии.-l984.-Т. 29, № 6.- С. 718-720.

62. Кнороз М.Ю., Попова О.М., Давыдова A.A. и др. Сравнительное изучение противовирусной активности природных двуспиральных РНК при экспериментальном клещевом энцефалите.// Вопросы вирусологии.-1985.-Т. 30 №6.- С. 697-700.

63. Игнатьев Г. М., Грибенча C.B., Тазулахова Э. Б.и др. Противовирусная активность дрожжевой дсРНК при экспериментальной инфекции, обусловленной острым энцефаломиелитом человека.//Вопр. Вирусологии.-1988.-Т.ЗЗ, № 2.-С. 251-253.

64. Донченко A.C., Аликин Ю.С., Донченко B.C., НаймановД.Н. Индукторы интерферона и перспективы их применения в медицине и ветеринарии: Обзор лит./ВАСХНИЛ. Сиб. отделение ИЭВС и ДВ,НПО «Вектор».НИКТИ БАВ. Новосибирск, 1990- 35-50

65. Hart G., Zamtcnick P.C.,Jin-Yung Tang et al// Proc. Natl.Acad. Sci. USA.2000.vol.97., Nl.p.p.418-423

66. Disney Vd, Haidaris CG, TumerDH// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2003.vol. 100., N4-.p.p.1530-1534

67. Сидельковская Ф.П. Химия N- винилпирролидона и его полимеров. М., 1970. С.- 47-50

68. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. Изд-во «Химия», М, 1986.- С. 12-15.

69. Кирш Ю.Э, Соколова JI.B. Поливинилпирролидон и лекарственные композиции на его основе, способы их получения//Химико- фармацевтический Ж. 1983. - Т. 17, № 6. - С. 711-721.

70. Molyneux P., Ahmed /G-Kolloid-Z. 1973. - Bd 251, S 310-328

71. Жорев И.С., Жорев В.И., Сов. Медицина. 1974. - № 10. - С. 4952, 1975, №7.-С. 62-65.

72. Burkhanov SA, Shertaev MM, Saatov TS. Lipid composition of immunocompetent organs of tumor-bearing rats. Biokhimia. 1986 Jun;51(6):970-3.

73. Boni LT, Stewart TP, Alderfer JL, Hui SW. Lipid-polyethylene glycol interactions: I. Induction of fusion between liposomes. J Membr Biol. 1981 ;62(1-2):65-70.

74. Садыков A.C., Ершов Ф. И., Новохатский А.С. и др./в кн. Индукторы Интерферона. Ташкент.- 1978: изд-во Фан. С.212.

75. Мухамедиев М., Ауелбеков С.А., Шарипова З.Т. и др.Полимерные комплексы госсипола и их противовирусная активность.// Хим.-фармац. Ж. -1986.-№4.-С. 450.

76. Кирш Ю.Э., Соколова JI.B., Поливинилпирролидон и лекарственные композиции на его основе, способы из получения(Обзор)//Хим.-фармац. Ж.-1983.-№6.-С. 711-21.

77. Лекарственные средства, применяемые в медицинской практике в СССР/Под ред. М.А. Клюева//М.: Медицина. - 1989. - С. 512.

78. Соколова Т.М., Антонов А.И. Фосфорилирование белков в цитоплазматической и ядерной фракциях человеческих клеток, обработанных двуспиральной РНК и человеческими рекомбинантными интерферонами типа I. //Мол.Ген.Микробиол. Вирусол. 1991. - № 13. - С.8-13;

79. Chang RS, Tabba HD, Не YS, Smith KM. Dextran sulfate as an inhibitor against the human immunodeficiency virus. Proc Soc Exp Biol Med. 1988 Dec;189(3):304-9.

80. Ершов Ф.И., Носик H.H., Тазулахова Э.Б. Продукция интерферона при использовании индукторов разной природы// Индукторы интерферона,-М., 1982.-С 19-24.

81. Ершов Ф.И., Мощик КВ., Поверенный A.M., и др. Индукция выработки ИФН декстрансульфатом.//Бюл. Эксперим. Биол. Мед.-1982 №8 - С.76-77, .

82. Полиглюкин для инъекций ФС 42-3621-98.

83. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. и др., Иммобилизованные ферменты//Биотехнология. Уч. Пособие. Кн.7. М.: Высшая школа.-1987.- С.159.

84. Н.Н. Носик, Э.Б. Тазулахова, A.M. Саийткулов Закономерности продукции интерферона при использовании индукторов разной природы и разных схем их применения./ Индукторы интерферона. М. 1982.-СЛ 9-24.

85. RflterZ, Klein S., Taylor M. Encapsulation of interferons in liposonmes//8 th lnt.Congr. Immunolologov. Budapest, Fug,23-28,1992: Fpstr.- Budapest, 1992 P. 189.

86. Milhaund P.G., Machy P., tt ak/ Fre and liposome encapsulated double stranded RNASs inducts of interferon. J.Interferon Rg. 1991-vol. 1 l,N5-P.261-5.

87. Григорьян C.C., Симонов A.H., Иванова A.M., Ершов Ф.И. Противовирусная активность амиксина, заключенного в липосомы//Вопр. Вирусологии 1988. Т. 33. С.302-5.

88. Препараты на основе конъюгатов полимеров и интерлейкин2: Пат.4902502 США, МКИ4 А 61 К.

89. Будкер В.Г., Вахрушева Т.Е., Киселева Е.В. и др.Получение липосом с лекарственными препаратами.//Хим. Фарм. Журнал-1987-№ 3- С. 347- 52

90. Ершов Ф.И., Мощик КВ., Поверенный A.M., и др. Индукция выработки ИФН декстрансульфатом.//Бюл. Эксперим. Биол. Мед.-1982 №8 - С.76-77.

91. Соколова Т.М., Фатхутдинова Н.Г., Носик P.P. Эффект двуспиральной РНК и интерферонов типа I на репродукцию цитомегаловируса в фибробластах человека. //Бюл. эксперим. биол. мед.- 1991-№ 7 С. 80-88.

92. Rosztoczy I, Siroki О. Priming of interferon production in human embryo fibroblasts by alpha, beta and gamma interferons. Acta Microbiol Hung. 1985;32(4):351-6.

93. Тимофеев И.В., Чаплыгина С. P., Зорин B.B и др. Сравнительное изучение индукторов интерферона, полученных из природных источников// Антибиотики и мед. биотехнол.- 1987 -Т.32, № 2 -С. 144- 7.

94. Нодзима Сигэо, Кимура Тэцуо, Матида Харухико и др. // Заявка 1186818 Япония// Кокай токке кохо. 1989 Сер. 3- 63 С. 92-97

95. Levy В. // Заявка 2476488 Франция Заявл. 25.02.80, № 8004040.

96. Granados EN, Dawidzik J, O'Malley J, McGarry M, Bello J. Poly ICL-CM dextran: an interferon inducer of reduced toxicity. J Interferon Res. 1984 Spring;4(2): 155-60.

97. Hyden H, Holmberg K. A new procedure to immobilize polyriboinosinic-polyribocytidylic acid (poly I:C) on the surface of polymethylmethacrylate and the use of poly I:C in clinical hemoperfusion. Arzneimittelforschung. 1986;36(1):120

98. Ю.Тазулахова Э.Б. Клинически перспективные индукторы интерферона//Бюл. для врачей и медиков.-М. Изд. Фармарус:№ 2 (10).-1996.-С. 45-55.

99. Опытно-Промышленный Регламент па производство биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-448. ОГТР 89

100. Типовая Технологическая Инструкция по определению глюкозы методом Бертрана-Шоорля. ТТИ 10.10.12-89

101. Типовая Технологическая Инструкция по определению аминного азота методом формольного титрования. ТТИ 10.10.16-94.

102. А.С.1197462 СССР. Дужак А.Б., Лобова Н.Н., Подгорный В.Ф. Способ получения двуспиральных РНК из микроорганизмов.// СКТББАВ,- № 3493453. Заявл.24.09.83.

103. ФСП-42-0197076901 Натриевая соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты

104. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. / /Биохимия.-1958, т.23, №5.-С.656 662.

105. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-С. 146.

106. Lowry ОН, Roserbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(l):265

107. ВФС 42-1920-89 Кислота рибонуклеиновая -стандартный образец.

108. Гос.Фармакопея 11 изд. вып.1.

109. ФС 42-344 ВС-90. Фармакопейная статья. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Минздрав СССР.-64 с.

110. Rjweley The role of opsonins in non-specific immunity. J Exp Med. 1960 Jan 1 ;111:137-44.

111. Прозоровский K.B., Прозоровская М.П., Демченко B.M. и др. //Фармакол. токсикол.-1978, №4.-С.497 502.

112. Лакин Г.Ф. Биометрия.-М: высшая школа, 1973-434с.

113. Нестерова Г.Ф. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения вирусоподобных плазмид дрожжей Saccharomyces // Генетика.- 1993. -Т.29, №4. -С.581-60.

114. Амосов O.A., Черный Д.И., Любченко Ю.Л., Дужак А.Б., Лобова H.H. Сравнительный анализ строения двуспиральной РНК киллерных штаммов Sacchar. cereviseae. //Молекулярная биология.- 1988.- Т.22. вып.1. - С.224-229.

115. Авторское свидетельство СССЗ № 1730425, кл. C12N1/18,1990

116. Производство хлебопекарских дрожжей» -Справочник. М.-Агропромиздат. - 1990. - С. 45-57.

117. Фихте Б.А., Ушаков И.М., Гуревич Г.А., Полпудников B.C. Дезинтегратор для микроорганизмов ФУГ-1// АС СССР № 514627.

118. Аман С.О., Гольдштик М.А., Лебедев A.B., Правдина М.Х. Низкоскоростное ударное измельчение.//Изв. СО АН СССР. 1989. -Сер.Техн.Наук. - Вып.6. - С.51-57;

119. Фадина В. А. , Масычева В.И., Дубатолова Т.Д //Изучение активности макрофагов в процессе интерферонообразования // в ст. Современные аспектыприменения интерферонов и других иммуномодуляторов //М.,1990 г. //стр. 130.

120. Тимковский A.JI. Структурная организация полинуклнотидных индукторов интенрферона-В кн.: Индукторы интерферона. Рига: Зинатне, 1981, с.52-62.

121. Итоги науки и техники, сер. Вирусология т. 6 с 126-149; Индукторы интерферона. Рига. «Зинатне», 1981, с52-65

122. Воейков B.JI., Решетов П.Д., Набиев И.Р.и др. Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов. М.изд. Наука. 1992.-С.188-198.137. Там же С.168-175

123. Елизарова С.М., Преображенский A.A. Выделение РНК-связывающих белков из экстрактов животных клеток с помощью аффинной хроматографии. / Биохимические методы//М.: Наука. 1980. - С. 43-47.

124. Smith I, Smith Н, Pifko S. Preparation and use of RNA-cellulose columns. Anal Biochem. 1972 Jul; 48(l):27-32.

125. Авторское свидетельство СССР № 1730140, кл. С 12 N 1/18, 1990.

126. Авторское свидетельство СССР № 95295, кл. С 12 N 1/16, 1980.

127. Захаров А.И., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. Л.: Наука, 1984.

128. Авторское свидетельство СССР № 1310425, кл. С 12 N 1/16, 1983.

129. Семенов С.М., Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. -Справочник. М.,1990.

130. Захаров А.И., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генегике дрожжей сахаромицетов. Л.: Наука, 1984.

131. Новиковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей Справочник. М.: Агропромиздат, 1990.

132. Новаковская С.С. «Справочник технология дрожжевого производства». -М. Пищевая промышленность. - 1993.

133. Семихатова Н.М. «Хлебопекарные дрожжи». М. - Пищевая промышленность. -1980.

134. Дезинтеграция микроорганизмов. Материалы всесоюзной конференции. Сборник. Пущино-на-Оке. - 1972. - С 324.

135. ФихтеБ.А., Материалы всесоюзной конф. «Дезинтеграция микроорганизмов», Пущино на Оке.1972.-С.5-15

136. Kydryvtsev A.A., Nikitin V.A., FikhteD.F. «Eur. J. Appl.Microbiol». 1976. v.2.N 4.- P285-96.

137. РоузЭ., Химическая микробиология, Мир, М. 1989г.-С.13

138. Hughes D.E., Wimpennyv W. «Methods in micrjbiology». 1971, v58.-P. 1-54

139. Аман C.O., Гольдштик M.A., ЛебедевА.В., Правдина М.Х. Способ вихревого измельчения и устройство для его осуществления// Патент РФ №2057588. 1996.

140. Патент РФ № 2084269, кл В 01 Д47/06,1997. 157 Патент РФ № 2057588, кл В02 С 19/06,1996.

141. Авторское свидетельство СССР А. С. СССР № 1310425, кл. С 12 N 1/16,89

142. Marshall JJ. Preparation and characterization of a dextran-amylase conjugate. Carbohydr Res. 1976 Jul; 49:389-98.

143. Ringsdorf H.- J. Polimer Sci. Polimer Symp., 1975, N51, p. 135-153.

144. Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J Biol Chem. 1977 Jun 10; 252(11):3578-81.

145. Abuchowski A, van Es T, Palczuk NC, Davis FF. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J Biol Chem. 1977 Jun 10; 252(11):3578-81.

146. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Шкиль H.H., Костина Г.А. и др. Влияние композиций двуспиральных РНК и гиалуроновой кислоты на показатели неспецифической устойчивости мышей//Вопр. Вирусологии.- 3-2003. № 5.-С.26-9.

147. Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Волкова И.П.и др. Разработка мазевой формы индуктора интерферона из дрожжей Saccharomyces cerevisiae: Сб.научн.тр. сотр. НИКТИ БАВ.- Бердск.

148. Вирник А.Д.,Хомяков К.П., Скокова И.Ф.-Успехи химии, 1995, т. 44.-С.1280-1307.

149. Reske-Nielsen Е. Bojsen-Moller., et.al .- Acta paph. Microbial. Scand., 1996, v 84A. P- 297-05.

150. Тимковский А.Л. Сруктурная организация полинуклнотидных индукторов интенрферона-В кн.: Индукторы интерферона. Рига.: Зинатне, 1981, с.52-62.

151. AmstrongW.W. Пат.З 2047097,1990 (Великобритания).

152. Rarpov JV, Antonenko S V, et.al. Effect of interferonogenic molecular complex of yeast RNA- tilorone on DNA, RNA and protein synthesis in vitro//Bul. Exp. Biol Med. 2001 ahr; 131(4): 382-4

153. Bulechev KE, Poryvaev VD, Ryznirov AB et. a.l An intensificaitions antivi: iid intenferon effects of ridostine (an ntenferon inducter) by cationic liposomes in vitro a l intranasal administration// Vopr. Virusol. 2003 Yul-Aug; 48(4): 45-7.