Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Привалов, Игорь Михайлович

• Привалов, Игорь Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Привалов, Игорь Михайлович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Пространственно-функциональная организация ткани печени.

1.2 Биологически активные в сверхмалых дозах адгезивные белки, выделенные из печени млекопитающих.

1.3 Современное состояние исследований по созданию гепатопротекторных препаратов.

1A Paramecium caudatum - как модель in vitro для изучения биологической активности.

Глава 2 Организация проведения экспериментов, объекты, материалы и методы исследования.

2.1 Организация работы и планирование эксперимента.

2.2 Объекты изучения. Вспомогательные вещества и оборудование

2.3 Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3 Экспериментальное обоснование выбора технологии получения субстанции регуляторных белков печени.

3.1 Разработка технологии экстрагирования печени. Повышение производительности и эффективности процесса извлечения.

3.1.1 Определение оптимального извлекающего состава.

3.1.2 Выбор температурного режима экстрагирования.

3.1.3 Выбор метода экстрагирования.

3.1.4 Определение длительности экстрагирования.

3.2 Получение супернатанта экстракта ткани печени. Выбор оптимальных параметров высаливания и диализа.

3.2.1 Центрифугирование экстракта.

3.2.2 Высаливание белков.

3.2.3 Диализ. Интенсификация процесса диализа.

3.3 Фракционирование экстракта ткани печени методом изоэлектрофокусирования.

Глава 4 Разработка лечебно-профилактического препарата на основе кислых регуляторных белков печени.

4.1 Тритурационные таблетки как оптимальная форма введения исследуемого белка.

4.2 Исследования по выбору вспомогательных веществ.

4.3 Технологическая схема получения таблеток. Характеристика основных этапов.

4.4 Оценка качества тритурационных таблеток «Гепотрит».

4.5 Общая технологическая схема, её основные этапы и параметры.

Глава 5 Фармакологические исследования субстанции регуляторных белков печени КРС и лечебно-профилактического средства, разработанного на их основе.

5.1 Изучение биологической активности исходной субстанции in vitro на модели Paramecium caudatum.

5.2 Изучение гепатопротекторной активности in vitro с использованием первичной культуры гепатоцитов.

5.3 Первичная оценка гепатозащитной активности субстанции кислых регуляторных белков печени.

5.4 Патогенез экспериментального токсического гепатита, инициированного тетрахлорметаном.

5.5 Оценка терапевтической эффективности препарата на модели экспериментального поражения печени.

5.6 Исследование тритурационных таблеток «Гепотрит» на модели Paramecium caudatum.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологические исследования и разработка состава лечебно-профилактического средства на основе регуляторных белков гепатопротекторного действия»

Актуальность темы

В настоящее время сырьевые объекты, полученные с помощью биотехнологии, используются сравнительно редко, в то время как эффективность и перспективность таких объектов на сегодняшний день уже доказана. Особенно интересна группа лекарственных и парафармацевтиче-ских средств нового поколения, основу которых составляют регулятор-ные белки, проявляющие биологическую активность в сверхмалых дозах.

Исследованиями, проведенными институтом элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН и институтом биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, в различных тканях млекопитающих: крови, печени, легком, сердце, тимусе, мозге, сетчатке глаза, поджелудочной, щитовидной, молочной железах была обнаружена группа белков, которые в сверхмалых дозах осуществляют регуляцию гомеостаза на органно - тканевом уровне и получившая название - регуляторные белки (РБ) [64,115,116,118,121].

Белки этой группы представляют собой низкомолекулярные, высо-когликозилированные пептиды со значением молекулярной массы менее 10 кДа. Являясь эндогенными протекторами, при патологии ткани они оказывают влияние на свойства плазматической мембраны клеток, что стимулирует восстановительные и репаративные процессы [16,116].

В настоящий момент выделено уже 50 регуляторных белков, но полностью исследована лишь часть из них и прежде всего недостаточно изучены биотехнологические аспекты, в том числе и масштабирование биотехнологических процессов.

На основе слабокислого белка сыворотки крупного рогатого скота (КРС) созданы лекарственные препараты нового поколения: «Адгелон» -глазные капли, и «Адгелон» для инъекций. Эти лекарственные препараты внедрены в медицинскую практику и успешно применяются в офтальмологии и травматологии. В то время как фракция регуляторных белков, полученная из ткани печени млекопитающих, является в биотехнологическом плане не полностью исследованной, а в плане прикладном — недостаточно востребованной.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является совершенствование биотехнологической схемы получения регуляторного белка из печени крупного рогатого скота и создание на его основе средства с гепатопротекторным эффектом профилактической направленности, его биотехнологическое исследование и определение норм качества.

Для успешной реализации поставленная цель была конкретизирована следующими задачами:

- провести совершенствование основных этапов биотехнологического процесса производства субстанции из печени крупного рогатого скота;

- провести совершенствование и апробацию способа определения специфической биологической активности регуляторного белка печени;

- выбрать и обосновать оптимальный состав лечебно - профилактического средства для перорального применения, разработать для него оригинальную таблетированную форму и определить её нормы качества;

-сконструировать технологическую схему производства и апробировать её в условиях пилотного производства;

- провести фармакологические исследования исходной субстанции кислого регуляторного белка и таблеток, созданных на её основе;

-разработать нормативную документацию на полученные субстанцию и её таблетированную форму.

Научная новизна исследований

Впервые на основе комплексных биологических, биотехнологических, биофармацевтических исследований разработано оригинальное лечебно-профилактическое средство гепатопротекторного действия, содержащее регуляторные белки печени, сохраняющее их органоспецифиче-ские функции и обладающее биостимулирующим действием на гомологичный орган.

Экспериментально установлены оптимальные параметры технологического процесса производства регуляторного белка из печени КРС, позволяющие апробировать его в опытно-промышленных условиях, и создана научно-обоснованная, модифицированная технология производства исходного компонента на основе регуляторного белка печени.

Впервые научно обоснован и экспериментально установлен состав и способ получения таблетированной формы для исследуемых регулятор-ных белков.

Установлены и обоснованы основные технологические параметры производства. Для подтверждения подлинности включенной в таблетиро-ванную форму субстанции использовали модифицированный метод биотестирования на наличие мембранотропного эффекта, для установления биологической активности исходной субстанции методом in vitro применили биологический тест на модели Paramecium caudatum, результаты которого позволили опосредованно подтвердить гепатопротекторный эффект данной субстанции.

Проведены фармакологические исследования и практически доказано, что тритурационные таблетки, полученные на основе регуляторных белков печени, по своей терапевтической активности эквивалентны лекарственному препарату «Карсил», который выпускается фармацевтическими предприятиями.

Установлено так же, что разработанный лечебно профилактический препарат оказывает выраженное гепатозащитное действие при остром токсическом поражении печени.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработаны и предложены к применению тритурационные таблетки гепатопротекторного действия с условным названием «Гепотрит».

Результаты проведенных комплексных физико-химических и технологических исследований позволили предложить для промышленного освоения технологическую схему производства, объединяющую в единый процесс стадии получения собственно субстанции регуляторного белка печени и тритурационных таблеток на её основе.

Гепатозащитная активность разработанного препарата, доступность исходных ингредиентов, а также эффективность и воспроизводимость технологии являются обоснованием целесообразности производства лечебно-профилактического средства «Гепотрит».

Внедрение результатов исследований в практику.

На лечебно-профилактическое средство — тритурационные таблетки гепа-топротекторного действия, полученные на основе кислого регуляторного белка печени крупного рогатого скота, разработан комплект нормативных документов: технологическая инструкция на приготовление биологически активной добавки к пище — тритурационные таблетки «Гепотрит» и технические условия (ТУ 9358-027-45713216-08). Получен акт технологической апробации на опытную партию тритурационных таблеток от ООО НПФ «ФИТЭКО» (г. Ростов-на-Дону). На усовершенствованную технологию производства субстанции составлен лабораторный регламент и утвержден на производствах: ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания» г. Москва, ООО « Биотехнология-07» г.Нальчик

Положения, выносимые на защиту

• Результаты обоснования мотивации разработки гепатозащитного средства на основе кислого регуляторного белка печени КРС.

• Результаты совершенствования биотехнологической схемы многофакторного процесса выделения кислого регуляторного белка из печени КРС: выбор оптимальных параметров экстрагирования, очистки и концентрирования.

• Результаты исследований по обоснованию состава и технологии получения тритурационных таблеток, содержащих кислый регуляторный белок.

• Результаты биотестирования и биологического исследования субстанции кислого регуляторного белка и разработанных тритурационных таблеток на модели Paramecium caudatum.

• Результаты фармакологического исследования гепатопротекторного действия разработанных тритурационных таблеток, содержащих кислый регуляторный белок печени КРС.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на 65-й юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, апрель 2007 г.), ежегодной научной региональной конференции Пятигорской государственной фармацевтической академии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2008г.), конгрессе «Человек и лекарство» (г. Краснодар, 1819 октября 2008 г.).

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 работ. В научных изданиях, входящих в перечень ВАК, опубликованы 3 работы.

Связь задач исследования с планом НИР учреждения, где выполнялась диссертация.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 160 странице машинописного текста в компьютерном наборе, содержит 23 таблицы, 31 рисунок, 168 литературных ссылок. Состоит из введения, обзора литературы, главы второй, по

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Привалов, Игорь Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные в данном исследовании результаты, можно заключить следующее.

Создание новых гепатопротекторных средств, повышающих резистентность печени к действию химических агентов и способных усиливать регенеративные процессы, является актуальной проблемой биологии и медицины. Одним из перспективных направлений расширения спектра гепатопротекторов следует считать поиск гепатозащитных средств среди соединений животного происхождения.

Нами рассматривалось создание лекарственного препарата на основе кислого регуляторного белка, выделенного из печени крупного рогатого скота.

По предварительным исследованиям РБП стимулирует функцию паренхиматозных клеток печени, что обеспечивает восстановление нарушенной структуры ткани печени и тормозит развитие в ней патологических процессов.

Разработанный препарат предполагалось использовать в качестве протектора, предотвращающего развитие цирроза печени различной этиологии, а также как лечебно-профилактическое средство в реабилитационный период после заболевания вирусными гепатитами и после де-токсикации организма.

В связи с этим, необходимо было провести исследования по совершенствованию биотехнологической схемы получения субстанции кислого регуляторного белка из печени, адаптировать её для печени КРС, провести расширенное изучение специфической активности и эффективности гепатозащитного действия полученной субстанции на моделях in vitro и in vivo в сравнении с эталонными гепатопротекторами. Необходимо было создать лечебно-профилактическое средство, разработать технологию его производства и провести его комплексное исследование.

Разработанная ранее методика выделения регуляторных белков легла в основу первой стадии технологического процесса получения кислого регуляторного белка из печени крупного рогатого скота.

Согласно результатам исследования, для печени КРС нами определены оптимальные параметры, оказывающие влияние на процесс выделения РБ из ткани печени: экстрагирующий состав, величина рН, соотношение сырье - экстрагент, температурный режим экстрагирования, метод экстрагирования, продолжительность стадий процесса, а также оптимальные параметры очистки РБ из получаемого извлечения. Предложенная технология экстракции печени обеспечивает эффективное использование животного сырья и соответствует принципам ресурсосбережения.

Скрининговые исследования полученной субстанции на модели Paramecium caudatum выявили полное отсутствие острой и хронической токсичности. В хроническом опыте при культивировании Paramecium caudatum добавление раствора регуляторного белка приводило к увеличению темпа размножения более чем в 20 раз. Указанная тенденция сохранялась и при уменьшении концентрации и носила полимодальный характер. Данные исследований «доза — эффект» тесно коррелируют с данными полученными Институтом биологии развития им. Н.К.Кольцова. Максимумы плотности инокулята и максимумы мембранотропной активности наблюдались при одних и тех же концентрациях, что дает основание использовать культуру Paramecium caudatum для определения специфической активности субстанции регуляторного белка печени.

Данные, полученные в настоящей работе, показали также способность субстанции РБ оказывать стимулирующее действие в отношении жизнеспособности гепатоцитов в культуре, подвергшихся интоксикации индометацином.

На отдельной экспериментальной модели in vivo было показано, что применение субстанции РБП уменьшает жировую дистрофию печени, снижает продолжительность гексеналового сна, уменьшает потерю массы животного при интоксикации тетрахлорметаном, что свидетельствовало о гепатозащитном действии субстанции и явилось основанием для создание препарата на её основе.

Правильно подобранные лекарственная форма и её состав должны гарантировать не только удобство применения, точность дозировки, стабильность, но и высокую степень биологической доступности, эквивалентной активности исходной субстанции. Поэтому с учетом совокупности химико-фармацевтических свойств регуляторных белков была выбрана форма введения действующего вещества - тритурационные таблетки.

Подбор вспомогательных веществ и выбор технологической схемы в значительной степени определялся специфической биологической активностью действующего вещества в СМД. В результате комплексной оценки различных веществ и их композиций предложен состав вспомогательных веществ, обеспечивающих регламентируемое качество разработанному лечебно - профилактическому средству.

Были разработаны состав и технологическая схема производства тритурационных таблеток с регуляторным белком печени, даны рекомендации по стадиям технологического процесса.

При нормировании качества тритурационных таблеток «Гепотрит» в качестве критериев стандартизации были рассмотрены: внешний вид, вкус раствора, внешний вид раствора, запах раствора, размеры, прочность на сжатие, прочность на истирание, подлинность. Определение подлинности разработанных таблеток проводили методом биотестирования на наличие специфической активности. Подтвержден мембранотропный эффект, что свидетельствует о подлинности препарата.

Высокая биологическая доступность и выраженные фармакотера-певтические свойства разработанного лечебно- профилактического средства подтверждены результатами оценки его гепатопротекторной активности при экспериментальном CCI4 гепатите. Под влиянием тетрахлорме-тана развивалось тяжелое поражение печени, характеризующееся развитием синдрома цитолиза и холестаза, гипербилерубинемией, жировой дистрофией печени, нарушением гликосинтетической функции печени. Лечебно-профилактическое применение препарата ослабляло вызванную введением CCI4 гиперлипиденимию и противодействовало накоплению в печени триглицеридов. Под влиянием разработанного препарата подвергался обратному развитию синдром холестаза, что проявилось в снижении содержания билирубина и щелочной фосфотазы в крови. Разработанный препарат улучшил барьерную функцию мембран, препятствовал развитию цитолиза гепатоцитов.

Эффективность действия тритурационных таблеток «Гепотрит» сравнима с карсилом, но в отношении нормализации содержания АлАт в сыворотке крови превышает действие этого гепатопротектора. Комбинация исследуемого препарата с экстрактом кукурузных рылец проявила менее выраженный мембраностабилизирующий эффект и не превосходила исследуемый препарат и экстракт кукурузных рылец при раздельном назначении по способности устранять нарушения липидного обмена и стимулировать антитоксическую функцию печени.

Таким образом, разработанный препарат обладает фармакотерапев-тической активностью, эквивалентной исходной субстанции.

На разработанное оригинальное гепатопротекторное средство животного происхождения - тритурационные таблетки «Гепотрит», полученное на основе кислого регуляторного белка печени крупного рогатого скота, разработан комплект нормативных документов: технологическая инструкция и технические условия. Технология их производства апробирована на базе ООО НПФ «ФИТЭКО» . На усовершенствованную технологию производства субстанции составлен лабораторный регламент и утвержден на производствах: ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания»,' ООО « Биотехнология -07».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Привалов, Игорь Михайлович, 2009 год

1. Авдеева, Е.В. Теоретическое и экспериментальное обоснование лекарственных растений, содержащих фенилпрепаноиды, для получения гепатопротекторных и иммуномодулирущих препаратов: Автореф. дис. .. докт. фармац. наук. / Е.В. Авдеева - Пермь, 2006. - 45с.

2. Алейникова, Т.Л. Руководство к практическим занятиям по биохимии / Т.Л. Алейникова, Г.В. Рубцова - М.: Высшая школа, 1988.239с.

3. Алексеев, В.В. Современные органотерапевтические препараты /В.В. Алексеев, В.Е. Белай, З.К. Бодина и др. - М.: ВНИИМП,1984. 69с.

4. Аношин, Н.М. Теоретические основы массообменных процессовпищевых производств/ Н.М. Аношин — М.: «Пищевая промышленность», 1970.-216с.

5. Архипенко, В.И. Структура и функции межклеточных контактов /В.И. Архипенко, Л.В. Гербильский, Ю.П. Черненко и др. // Структура и функции биологических мембран - М.: Наука. 1975. 77-95.

6. Арчаков, А.И. Молекулярные механизмы взаимодействия четыреххлористого углерода с мембранами эндоплазматического ретикула печени / А.И. Арчаков, И.И. Карузина // Успехи гепатологии. - Рига, 1973.-С.14-23.

7. Арчаков, А.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии / А.И. Арчаков, И.И. Карузина // Вестник АМН СССР. 1988. - № 1 . - 14-23.

8. Балабаньян, В.Ю. Разработка системы скрининга лекарственных веществ антиоксидантного и мембраностабилизирующего типов действия: Автореф. дис. .. канд. фармац. наук/ В.Ю. Балабаньян. — М., 1998.-24с.

9. Балаковский, Д. Методы химического анализа крови /С.Д. Балаковский. - М., 1953. -295с.

10. Беленький, Н.Г. Некоторые вопросы теории и практики производстваорганотерапевтических препаратов / Н.Г. Беленький //Мат. к совещанию научнотехн. совета по координации научно-исслед. работ в мясн. пром. - М . , 1961.- 104с.

11. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия / В.Г. Беликов — М.: Высш.школа, 1993.-Т. 1.-520с.

12. Белобородов, В.В. Методы расчета процесса экстракции растительных масел / В.В. Белобородов - М.: «Пищепромиздат», 1960. — 215с.

13. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия: Руководство для врачей изд-е 2-е./ Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин, - М.: "Универсум паблишинг", 1997. - 426с.

14. Богдан, А.С. Популяция одноклеточных организмов как модель интегральной оценки воздействия вредных факторов/ А.С. Богдан // Тез. докл. Всесоюзной конф. - М., 1989. - 12-13.

15. Борисенко, А.В. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные белки, выделенные из тканей млекопитающих: Дис. .. канд. биол. наук / А.В. Борисенко - М., 2007. - 139с.

16. Буеверов, А.О. Место гепатопротекторов в лечении заболеваний печени/А.О. Буеверов//РМЖ.-2002.-№1. 12-28.

17. Бунятян, Н.Д. Природные антиоксиданты как гепатопротекторы /Н.Д. Бунятян, О.А. Герасимова, Т.С. Сахарова и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1999. — Т. 62.- №2. — 64-67.

18. Бурновский, И.В. Основы экологии свободноживущих инфузорий:Автореф. дис. .. докт. биол. наук / И.В. Бурновский. - М., 1986. 43с.

19. Владимиров, Ю.А Перекисное окисление липидов в биологическихмембранах / Ю.А.Владимиров - М.: Медицина, 1979. - 258с.

20. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологическихмембранах / Ю.А.Владимиров, А.И. Арчаков — М.: Медицина, 1992. — 252с.

22. Гладских, Л.В. Оценка жизнеспособности клеток печени свиней /Л.В. Гладских, М.Ю. Штукарева // Мясная индустрия. - 1993. - № 4. - С . 25-26.

23. Гладских, Л.В. Создание новых тканевых препаратов на основе гепатоцитов для коррекции функции печени: Автореф. дис. .. докт. фармац. наук / Л.В. Гладских - М., 1997. - 40с.

24. Горбаков, В.В. Гептрал - новое средство лечения диффузных болезней печени / В.В. Горбаков, А.В. Калинин, В.П. Галик и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - Т.8, №4. - 98-102.

25. Горбаков, В.В. Опыт применения гептрала в лечении диффузных заболеваний печени / В.В. Горбаков, В.П. Галик, С М . Кириллов // Терапевтический архив. - 1998. - Т.70, № 10. - 82-86.

26. Гордиенко, А.Д. Гепатозащитное действие липофена — нового комбинированного фосфолипидного препарата природного происхождения / А.Д. Гордиенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001. - Т. 64, № 3. - 45-47.

27. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа/ МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336с.

28. Громашевска, Л.Л. Деяки замечание к исследованию активностиаминотрансфераз и толкованию их результатов у больных с патологией печенки / Л. Л. Громашевска // Лабораторная диагностика. — 1997.- №2. - С . 7-11.

29. Грошовый, Т.А. Оптимизация процессов создания и исследованиетаблетированных лекарственных препаратов: Автореф. дис. .. докт. фармац. наук / Т.А. Грошовый. — Харьков, 1989. - 45 с.

30. Губский, Ю.И. АТФ-азная активность митохондрий печени при остромотравлении тетрахлорметаном / Ю.И. Губский // Укр. биохим. журн. — 1982. -Ml.- 46-50.

31. Губский, Ю.И. Коррекция химического поражения печени / Ю.И. Губский. -Киев: Здоров'я, 1989. - 168 с.

32. Губский, Ю.И. Транспорт кальция и перекисное окисление липидов вмикросомах печени при острой интоксикации тетрахлорметаном / Ю.И. Губский, А.П. Заика, Е.Д. Левицкий и др. // Фармакология и токсикология. - 1990. - № 25. - 90-93.

33. Гуров, В.А. Производство органопрепаратов / В.А. Гуров. - М.: Пищ.пром., 1976.-171 с.

34. Диагностика и лечение диффузных заболеваний печени. Методическое пособие / Под ред. В.Т.Ивашкина, Н.Д.Юшука. - М., 2003. - 64 с.

35. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки: пер. с англ. / Т. Дэвени,Я. Гергей. - М.: Мир, 1976. - 368 с.

36. Евтушенко, Н.С. Методы контроля консервантов, используемых приизготовлении органопрепаратов и некоторых других лекарственных форм / Н.С. Евтушенко, И.В. Пахомова //Фармация. - 1988. - Т. 37, N 8 . - 76-81.

37. Журавель, Е.В. Фосфолипидные препараты в гепатологии: реалии иперспективы / Е.В. Журавель, СМ. Дроговоз // Провизор. — 1998. Ш2.-С.12-17.

38. Загребельный, Н. Количественные методы определения белка. Обзорная информация ВНИИ СЭНТИ / Н. Загребельный, В.И. Пупкова-М., 1986.-110 с.

39. Заявка на патент РФ № 93025259/14 Способ консервирования интактных клеток печени / Гладских Л.В., Уша Б.В., Бруслик В.Г. и др. // Заявлено 30.04.93. положит, реш. от 23.05.95. - 40 с.

40. Зоров, B.C. Исследование возможностей применения методов корреляционной спектроскопии в биотестировании / B.C. Зоров, А.В.Пожаров // Известия ЛЭТИ. - 1990. - вып. 428. - 32-36.

41. Ильченко, Л.Ю. Гепатопротекторы при хронических заболеванияхпечени / Л.Ю. Ильченко, Т. И. Карлович // Фарматека. - 2007. №8/9.-С. 54-58.

42. Калинина, Э.Н. Патогенетическое обоснование использования цеолитсодержащих препаратов в терапии вирусного гепатита: Автореф. дис. .. канд. фармац. наук / Э.Н. Калинина. - Пятигорск, 2005. - 24 с.

43. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / B.C. Камышников. — М.: МЕДПресс-информ, 2004. - 920 с.

44. Кафаров, В.В. Основы массопередачи / В.В. Кафаров. - М.: «Высшаяшкола», 1972.-245 с.

45. Клиническая биохимия / Под ред. В.А. Ткачука. - 2е изд., испр. идоп. - М.: «Гэотар-Мед». - 2004 г. - 512 с.

46. Колб, В.Г. Справочник по клинической биохимии / В.Г. Колб, B.C.Камышников. - Минск, 1982. - 248 с.

47. Краснов, М.С. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro / М.С. Краснов, Е.П. Гурмизов, В.П. Ямскова и др. // Вестник офтальмологии. - 2005. - Т. 121, №1. - 37-39.

48. Краснов, М.С. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных /М.С. Краснов, Э.Н. Григорян, В.П. Ямскова и др. // Радиционная биология и радиоэкология. - 2003. - N3. — 265-268.

49. Крыжановский, А. Современные лекарственные препараты:Полное практич. руководство / А. Крыжановский, М.Б. Витинова - М.: Рипол классик, 1998. - 1040 с.

50. Кузнецова, Е. Л. Новые данные о молекулярных механизмах гепатобилиарного транспорта / Е.Л. Кузнецова, Е.Н. Широкова, В.Т. Ивашкин // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2006. — № 6. - 8-11.

51. Кучеренко, Н.Е. Биохимия: Практикум / Н.Е. Кучеренко,Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев. - Киев: Выща школа, 1988. -128 с.

52. Кушманова, О.Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / О.Л. Кушманова, Г. М. Ивченко - М.: Медицина, 1983.-272 с.

53. Легин, Г.Я. Консервация косметических изделий и эффективные современные консерванты / Г.Я. Легин, Н.М. Шехтман, В.М. Андреев // Хим. Фармац. журн. - 1983. - Вып. 3. - 1-36.

54. Логинов, А.С. Клиническая морфология печени / А.С. Логинов,Л.И. Аруин - М.: Медицина, 1985. - 239с.

55. Любшина, О.В. Эффективность различных гепатопротекторов припеченочной энцефалопатии/ О.В. Любшина, В.Е. Гречко, А.Л. Верткий и др. // Клиническая медицина. - 1999. - Т.77, № 10. - 17-20.

56. Лященко, В.И. Биотранформация ксенобиотиков - детоксикация илиусиление токсичности / В.И.Лященко, В.Н. Черкаль // Гигиена и санитария. - 1990. - №5. - 56-59.

57. Маев, И.В. Лечение и профилактика печеночной энцефалопатии гепатопротекторами / И.В. Маев, К.Г. Гуревич // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2001.— Т.11, № 4 . - С . 41-45.

58. Маленков, А.Г. Межклеточные контакты и реакция ткани /А.Г. Маленков, Г.А. Чуич - М . : Медицина, 1979. - 135 с.

59. Маленков, А.Г. Тканевоспецифические адгезионные факторы - G1 кейлоны / А.Г. Маленков, Е.А. Модянова, В.П. Ямскова // Биофизика. — 1977. — Т.22.-С.156-157.

60. Маргасюк, Д.В. Исследование регуляторного белка, выделенного изроговицы глаза быка. Выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность / Д.В. Маргасюк, М.С. Краснов, В.П. Ямскова и др. // Офтальмология. - 2005. - Т.2, № 3. - 81-87.

61. Машковский, М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей, 14е изд-е./ М.Д. Машковский - М.: Новая Волна, 2002. - Т.1. - 540 с.

62. Меркулов, Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов- М.: Высш. шк.- 1963. - 129-142.

63. Методические указания к лабораторным занятиям по биохимии / Подред. В.В. Рудакова. - М.:Медицина, 1986. - 54 с.

64. Минушкин, О.Н. Некоторые гепатопротекторы в лечении заболеваний печени / О.Н. Минушкин // Лечащий врач. - 2002. - № 6. - 5558.

65. Муравьев, И.А. Технология лекарств: Учеб. для учащихся фармац, вузов / И.А. Муравьев - М.: Медицина, 1980. - Т.2. - 783 с.

66. Нидерау, К. Интерферон и эссенциальные фосфолипиды в лечениихронических вирусных гепатитов В и С / К. Нидерау // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 1998. — Т. 9, № 5. - 67-68.

67. Николаенко, А.Н. Концептуальные подходы в разработке высокоэффективных лекарственных препаратов нового поколения класса "Эрбисол" / А.Н. Николаенко // Физический вакуум и природа. - 1999. № 4 . - С . 129-136.

68. О применении препарата легалон при хронических заболеваниях печени /А.Л. Гребнев, B.C. Голочевская, А.С. Кузнецов, И.Н. Дорогунцева // Клиническое значение препарата легалон: Материалы симпоз., 7 апр. .1981г.-М., 1981.-С. 104-107.

69. Оковитый, СВ. Клиническая фармакология гепатопротекторов /СВ. Оковитый // Фарминдекс Практик. - 2002. - №3. - 28-38.

70. Ольшевская, Л.В. Влияние ионов кальция и магния на ультраструктуру контактов клеток печени / Л.В. Ольшевская, Е.А. Модянова // Цитология. - 1971. - T.XIII, №.1. - 37-42.

71. ОСТ 91500.05.001.00. Стандарты качества лекарственных средств.Основные положения. - М.: Изд.-во стандартов, 2001, — 45 с.

72. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот:Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман - М.: Изд-во Наука, 1981. - 536 с.

73. Патобиохимия / Под ред. Е.А. Строева, В.Г. Макаровой, Д.Д. Пескова. - М.: ГОУ ВУНМЦ, 2002. - 234 с.

74. Пономарёв, А.Б. Гос.вет.надзор за безопасностью продукции животного происхождения / А.Б. Пономарёв, А.С. Герасимов, Н.В. Баркова // Ветеринария. - 1998. - № 7. - 3-9.

75. Пономарёв, В.Д. Исследование процесса экстрагирования и технологии препаратов корней солодки: Дис. .. докт. фармац. наук. / В.Д. Пономарёв - Тбилиси, 1972. — 452 с.

76. Пономарёв, В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья /В.Д. Пономарёв - М.:«Медицина», 1976. - 410 с.

77. Практикум по биоорганической химии / Под ред. В.А.Стоник. - Владивосток: Изд-во ДВГУ, 2002. - 156 с.

78. Практикум по биохимии / Под ред. Н.И. Мешковой и акад. СЕ. Севергина. - М.: изд. МГУ, 1979. - 158 с .

79. Радченко, В.Г. Гепасол А в лечении хронических заболеваний печени с проявлениями системной энцефалопатии / В.Г. Радченко, О.Н. Радченко // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2002. - Т. 12, № 2. - 73-76.

80. Ребиндер, П.А. О методе погружения конуса для характеристикиструктурно-механических свойств пластично-вязких тел / П.А. Ребиндер, Н.А. Семененко // Докл. АН СССР, 1949. - Т.64. - 835-838.

81. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии /Под ред. Т.Т. Березова. - М.: Медицина, 1976. - 294 с.

82. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене переработке животных продуктов / Под редакцией профессора. И.В. Щура. М.: Медицина, 1992. - 616с.

83. Рыбакова, Е.Ю. О возможном механизме, лежащем в основе методабиотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах / Е.Ю. Рыбакова // Онтогенез. - 2005.-Т.36,№3.- 234-235.

84. Сампиев, A.M. Исследование полисахаридов кукурузных рылец /A.M. Сампиев, Е. Б. Никифорова //Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 1-2. - 96-98.

85. Саратиков, А.С. Новые гепатопротекторы природного происхождения / А.С. Саратиков, А.И. Венгеровский // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1995. - № 1 . - 8-11.

86. Сахатов, Э.С. Создание твердых лекарственных форм./ Э.С. Сахатов,А.А. Коканов, В.И. Чуешов и др. - Ашгабад, 1992. - 157 с.

87. Сборник технологических инструкций по предубойной подготовке,переработке скота, обработке продуктов и производству технической продукции: Сб. науч. тр. - М.:Пищевая пром., 1979. - 146 с.

88. Скакун, Н.П. Клиническая фармакология гепатопротекторов /Н.П. Скакун, В.В. Шманько, Л.М. Охримович — Тернополь: Збруч, 1995.-272 с.

89. Скакун, Н.П. Экспериментальная фармакотерапия повреждений печени, вызванных индометацином / Н.П. Скакун, Е.В. Климнюк // Фармакология и токсикология. - 1990. - Т.53, №6. - 52-54.

90. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс — М., «Мир», 1985.430 с.

91. Смирнов, А.Л. Консерванты для продуктов личной гигиены /А.Л. Смирнов, Д. Пател // Вторая Международная научнопрактическая конференция "Биологически активные вещества и новые продукты в косметике" (Тезисы докладов). — 1997. — 22-24.

92. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. - М., 2007.-1522 с.

93. Строев, Е.А. Практикум по биологической химии / Е.А.СтроевМ.:Высщая школа, 1986.-231 с.

94. Тенцова, А.И. Руководство к лабораторным занятиям по заводскойтехнологии лекарственных форм / А.И. Тенцова - М.: Медицина, 1986.-272 с.

95. Ушаков, В.Ф. Адгезионная прочность ультраструктурных элементовконтактов гепатоцитов / В.Ф. Ушаков, Ю.П. Черненко // Биофизика. 1978.- Т.23,№3.-С.558-559.

96. Ушаков, В.Ф. Состояние клеточной поверхности гепатоцитов придействии четыреххлористого углерода / В.Ф. Ушаков, Л.А. Палиенко, К.И. Лившиц и др. // Архив анат., гистол. и эмбриол. -1990.-№12.-С.44-48.

97. Ушкалова, Е.А. Проблемы применения гепатопротекторов /Е.А. Ушкалова // Фарматека. - 2004. - № 4. - 45-55.

98. Хазанов, А.И. Особенности лекарственных и вирусно-лекарственныхпоражений печени /А. И. Хазанов, О. Н. Румянцев. А.В. Калинин и др. // Кремлевская медицина. Клинич. Вести. - 2000. - №1. — 3-10.

99. Харченко, Н.В. Современные гепатопротекторы в комплексном лечении больных хроническим гепатитом / Н.В. Харченко, Т.В. Бородина // Провизор. - 1999. - №5. - 5-12.

100. Чуешов, В.И. Промышленная технология лекарств: В 2 т. /В.И. Чуешов - Харьков: НФАУ МТК-Книга, 2002. - Т.2. - 567 с.

101. Чучалин, B.C. Фармакологические и технологические аспекты разработки новых гепатопротекторных препаратов природного происхождения: Дис. .. докт. фармац. наук. / B.C. Чучалин. - Томск, 2003. 317 с.

102. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред.Н.У. Тица, - М.:«Мир», 1997. - 317с.

103. Эффективность гепатозащитных средств при экспериментальномхроническом гепатите / А.С. Саратиков, А.И. Венгеровский, Н.О. Батурина, B.C. Чучалин // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1996. № 1 . - С . 24-26.

104. Ямсков, И.А. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки кровикрупного рогатого скота: структура и свойства / И.А. Ямсков, А.А. Виноградов, А.Н. Даниленко и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т.37, №1. - 36-42.

105. Ямсков, И.А. Фармакологические препараты нового поколения наоснове ранее неизвестных биорегуляторов-гликопротеинов клеточного микроокружения / И.А. Ямсков, В.П. Ямскова // Рос. хим. ж. (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). - 1998. - Т.42, №3. - 85-90.

106. Ямскова, В. П. Низкомолекулярный полипептид сыворотки кровитеплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию / В.П. Ямскова, М.М. Резникова // Журнал общей биологии. — 1991. — Т. 52,№2,-С. 181-191.

107. Ямскова, В.П Адгезивные белки тканей млекопитающих: Дис. ..докт. биол. наук. / В.П. Ямскова — М., 2003. - 356 с.

108. Ямскова, В.П. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионныефакторы печени и легкого / В.П. Ямскова, Е.А. Модянова, М.М. Резникова и др. // Молекулярная биология. — 1977. — Т.11, №5. - С . 1147-1154.

109. Ямскова, В.П. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих / В.П. Ямскова, Е.Ю. Рыбакова, А.А. Виноградов и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т.40, №4, - 407-413.

110. Ямскова, В.П. Макромолекулярные факторы Са-зависимой адгезииклеток печени / В.П. Ямскова, Н.Б. Туманова // Известия Акад. наук. Серия биол. - 1994. - №5. - 732-737.

111. Ямскова, В.П. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию / В.П. Ямскова, М.М. Резникова // Журнал общей биологии. - 1991. — Т.52,№2.-С.181-191.

112. Ямскова, В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс / В.П. Ямскова // Биофизика. — 1978. - Т.23. 428-432.

113. Ямскова, В.П. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток / В.П. Ямскова, М.М.Резникова // Успехи биологической химии. - 1979. - Т.20. 95-112.

114. Ямскова, В.П. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов / В.П. Ямскова, Н.Б. Туманова, А.С. Логинов // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1990. - №3, - 303-306.

115. Ahmad, F. Detection of free radical formation in various tissues afteracute carbon tetrachloride administration in gerbil / F. Ahmad, D. Cowan, A. Sun // Life Sci. - 1987. - Vol. 41, № 22. - P. 2469-2475.

116. Anderson, H. Adhesion molecules and animal development / H. Anderson// Experientia. - 1990. - V.46- P.2-13.

117. Clarke, H Alpha-glutathione s-transferase (alpha-GST) release, an earlyindicator of carbon tetrachloride hepatotoxicity in the rat / H. Clarke, D.A. Egan, M. Heffernan etal.//Hum. Exp. Toxicol. -1997. -Vol. 16, №3. -P. 154-157

118. Council Directive 76/768 EEC on the approximation of laws of the Member States relating to cosmetic products.- August 1993.- 13 p.

119. Decrease in protein kinase and phosphatase activities in the liver nuclei ofrats exposed to carbon tetrachloride / M. Omura, T. Katsumata, H. Misawa, M. Yamaguchi // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 1999. — Vol. 15, № 160(2).-P. 192-197.

120. Freshney, R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4thed. / R. Freshney // Wiley-Liss, New York. -2000. - P . 90-91

121. Gebhardt, R. Oxidative stress, plant-derived antioxidants and liver fibrosis/ R. Gebhardt // Planta Med. - 2002. - №68. - P.89-96.

122. Gordon, A. Effects of Silybum marianum on serum hepatitis Cyir.usRNA, alanine aminotransferase levels and well-being in patients with chronic hepatitis / A. Gordon, D.A. Hobbs, D.S. Bowden, et al. I 1С J Gastroenterol Hepatol. -2006. -№2. - P.75-80.

123. Kataria, M. Hepatoprotective effect of Liv-52 and kumaryasava on carbontetrachloride induced hepatic damage in rats / M. Kataria, L.N. Singh // 1.dian J. Exp. Biol. - 1997. - Vol. 35, № 6. - P. 655-657

124. Kretzschmar, M. The hepatic glutathione system / M. Kretzschmar, W.Klinger// Exp. Pathol. - 1990. - Vol. 38, № 3. - P. 155-164.

125. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - P. 680685.

126. Li, A.P. Primary hepatocyte cultures as in vitro experimental model forxenobiotic metabolism and toxicology / A.P. Li, // Comments Toxicology. - 1998. - Vol.6, №3. -P. 199-220.

127. Margasyuk, D.V. Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localizationand Biological Activity", pp. 47-59 / D.V. Margasyuk, M.S. Krasnov,

128. V. Blagodatskikh et all // In the book "Biochemical Physics Frontal Research". - 2006. - P. 47-49/

129. Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. Electron immunohistochemical studies in normal rat liver / A. Martinez-Hernandez // 1.b. Invest. - 1984. - V.51. - P.57-75.

130. Monohydroperoxides of linoleic acid in endoplasmic lipids of rats exposed to tetrachloromethane / H. Franc, M. Vlegand, M. Steker, D. Thel // 1.pids. - 1987. - Vol. 22, № 10. - P. 689-697.

131. Muriel, P. Prevention by silimarin of membrane alterations in acute CCI4liver damage/ P. Muriel, M. Mourelle //. JAppI Toxicol. - 1990. - P. 7579.

132. Nicola, N. Guidebook to cytokines and their receptors / N. Nicola // ASambook and Tooze Publication.Oxford University Press. O. N.Y.T. — 1994.-P.261.

133. Nishida, K. Gamma-glutamylcysteinylethyl ester attenuates progressionof carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice / K. Nishida, Y. Ohta, I. Ishiguro//Toxicology. - 1998. - Vol. 20, № 126(1). - P. 55-63.

135. Reducing the Use of Laboratory Animals in Biomedical Research: Problems and Possible Solutions The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 29,1999. - P . 283-301.

136. Sailer, R. The use of silimarin in the treatment of liver diseases / R. Sailer,R. Meier, R. Brignoli // Drugs. - 2001. -P. 35-63.

137. Salmi, H.A. Effects of silimarin on chemical, functional and morphological alterations of the liver. A double-blind controlled study / H.A. Salmi, S. Sarna // Scand J Gastroenterol. - 1982. - P. 17-21.

138. Schagger, H. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. / H. Schagger, von G. Jagow // Anal. Biochem. - 1987. - P. 368-379.

139. Schuppan, D. Herbal products for liver diseases: A therapeutic challengefor the new millennium. / D. Schuppan, J. Jia, B. Brinkhaus, E.G. Hahn // Hepatology.- 1999.-Vol. 3 0 . - P . 99-104.

140. Singh, J. Protection of CCL4-induced liver damage in rats by some calcium channel blockers / J. Singh, A.H. Kaur, S.K. Mathur // Indian J. Physiol. Pharmacol. - 1995. - Vol. 39, № 3. - P. 275-278.

141. Sonnenbichler, J. Biochemical effects of the flavolignan silibinin onRNA, protein, and DNA synthesis in rat liver / J. Sonnenbichler // Progn Clin Biol Res.-1986.-Vol. 213, № 3 . - P. 19-31.

142. Sundari, P.N. Does oxidative protein damage play a role in the pathogenesis of carbon tetrachloride-induced liver injury in the rat / P.N. Sundari, G.W. Ramakrishna // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - Vol. 31, № 1362(2-3).-P. 169-176.

144. Tsokos-Kuhn, J. Evidence in vivo for evaluation of intracellular freeС a in the liver after diquat, acetaminophen and CCI4/ J. Tsokos-Kuhn // Biochem. Phar-macol. - 1989. - Vol. 38, №8. - P. 3061-3065.

145. Varghese, L. Silibinin Efficacy against Human Hepatocellular Carcinoma/ L. Varghese, C. Agarwal, A. Tyagi et al. // Clin Cancer Res. - 2005. Vol. 11, №84. - P . 41-48.

146. Waller, R. Evaluation of a role for phosgene production in the hepatotoxicmechanism of carbon tetrachloride and bromteichlormethane / R. Waller, R. Recknagel// Toxicol, and Appl. Pharmacol. - 1982 - Vol.66, №2 - P. 172-181.

147. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice/ R. Westermeier // WeinheimNew York: WILEY-VCH. - 2001. - P.350.