Биосинтез, очистка и практическое применение продигиозина-пигмента Serratia Marcescens тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Гурьянов, Иван Дмитриевич

• Гурьянов, Иван Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гурьянов, Иван Дмитриевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика Serratia marcescens

1.2 Бактериальный пигмент продигиозин

1.2.1 Биосинтез продигиозина

1.2.2 Питательные среды и условия культивирования ^ оптимальные для биосинтеза продигиозина

1.2.3 Локализация пигмента в клетках S. marcescens

1.2.4 Методы экстракции и идентификации продигиозина

1.2.5 Биологическое значение продигиозина в жизни продуцента и ^ практическое использование

1.2.6 Цитотоксичность продигиозина

1.3 Продигиозинподобные пигменты

1.4 Биологические маркеры для нефтепродуктов

1.5 Стратегия исследований генотоксичности соединений 46 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 48 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования

2.2 Использованные материалы

2.3 Условия культивирования, определение продуктивности

2.4 Определение концентрации продигиозина

2.5 Получение продигиозина и его экстракционная очистка

2.6 Очистка пигментного препарата

2.6.1 Жидкостная хроматография

2.6.2 Тонкослойная хроматография (ТСХ)

2.7 Физико-химические методы анализа очищенного продигиозина

2.8 Оценка антагонистической активности Serratia marcescens

2.9 Оценка фунгицидной активности препаратов продигиозина

2.10 Методы оценки токсичности

2.10.1 Оценка влияния препаратов продигиозина на рост корней растении

2.10.2 Оценка влияния препаратов продигиозина на накопление биомассы растений

2.10.3 Определение острой летальной токсичности на тест-объекте Paramecium caudatum

2.11 Методы оценки генотоксичности

2.11.1 Тест на токсичность по отношению к Salmonella typhimurium

2.11.2 Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест Эймса)

2.11.3 Микроядерный тест на эритроцитах периферической крови мышей in vivo

2.12 Маркирование и идентификация маркированных нефтепродуктов

2.13 Статистическая обработка результатов 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Подбор высокопродуктивных штаммов

3.1.1 Сравнительная характеристика роста и пигментообразования исследуемых штаммов S. marcescens

3.2 Подбор оптимальной питательной среды

3.2.1 Образование продигиозина при культивировании бактерий на различных средах

3.2.2 Рост и образование продигиозина

Serratia marcescens на модифицированной среде Кинга А

3.2.3 Рост и образование продигиозина Serratia marcescens на модифицированной пептон-глицериновой среде

3.3 Определение оптимального количества посевного материала

3.4 Подбор метода экстракции пигмента из клеток

3.5 Выделение и очистка пигментного препарата продигиозина, его характеристика

3.5.1 Жидкостная хроматография

3.5.2 Тонкослойная хроматография

3.6 Продигиозин, как фактор антагонистической активности S. marcescens

3.6.1 Антагонистическая активность S. marcescens

3.6.2 Характеристика роста фитопатогенных микромицетов на питательных средах с добавлением пигментных препаратов

3.7 Токсическое воздействие препаратов продигиозина на прорастание семян и накопление биомассы растений

3.8 Определение острой летальной токсичности ^ на тест-объекте Paramecium caudatum

3.9 Токсические эффекты продигиозина ^ по отношению к микроорганизмам

3.10 Индукция генных мутаций пигментными препаратами в тесте ^ Эймса

3.11 Микроядерный тест на эритроцитах ^у периферической крови мышей in vivo

3.12 Возможное практическое применение продигиозина 98 3.12.1 Маркирование нефтепродуктов продигиозином ^g и способ идентификации маркированных нефтепродуктов

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биосинтез, очистка и практическое применение продигиозина-пигмента Serratia Marcescens»

Актуальность проблемы. Большинство работ, в области изучения бактериальных пигментов посвящено фототрофам, в то время, как пигменты нефотосинтезирующих микроорганизмов изучены в значительно меньшей степени. Ярко-красный пигмент продигиозин, синтезируемый энтеробактериями Serratia marcescens, представляет собой линейный трипиррол (пиррол, 3-метоксипиррол, 2-метил-З-амилпиррол). Как и многие вторичные метаболиты бактерий, продигиозин приобретает практическое значение в промышленности и медицине. В промышленности продигиозин рекомендуется в качестве красителя для полимеров, поскольку он обладает рядом преимуществ по сравнению с применяемыми в настоящее время органическими и неорганическими пигментами. Разработан способ использования продигиозина для маркирования нефтепродуктов [Гарейшина с соавт., 2003]. Пигмент хорошо растворим в различных марках топлива и легко обнаруживается по характерному спектру поглощения. Продигиозин и продигиозинподобные пигменты, синтезируемые некоторыми видами микроорганизмов, рассматриваются как новое семейство противоопухолевых лекарственных препаратов [Montaner et al., 2000; Llagostera et al., 2005]. Показано, что продигиозин действует, как иммунодепрессант, селективно блокируя пролиферацию Т-клеток киллеров [Han et al., 1998; Azuma et al., 2000], избирательно индуцирует апоптоз различных типов злокачественных клеток [Montaner, Perez-Tomas, 2001; Campas et al., 2003], ингибирует образование метастаз, обладает антиинвазивными свойствами [Perez-Tomas et al., 2003].

В связи с большой практической значимостью продигиозина возникает необходимость в наработке больших количеств пигмента и снижении его стоимости. Высокая стоимость пигмента тормозит, в частности, использование его в качестве маркера нефтепродуктов. Кроме 6 того, неизученным остается вопрос о мутагенности, генетической токсичности продигиозина. Для изучения этих свойств необходимы высокоочищенные препараты продигиозина. В представленной работе предполагается разработать эффективную схему получения продигиозина и изучить некоторые биологические эффекты пигмента.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в следующем: разработать эффективную схему получения бактериального пигмента продигиозина; определить его токсические и генотоксические свойства и установить возможности практического применения. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• подобрать высокопродуктивные по биосинтезу пигмента продигиозина штаммы Serratia marcescens, оптимизировать питательную среду и условия культивирования для получения продигиозина в лабораторных и полупромышленных масштабах;

• получить и охарактеризовать высокоочищенный пигментный препарат с привлечением физико-химических методов;

• установить токсичные и безопасные концентрации продигиозина для растений, простейших и микроорганизмов;

• определить мутагенные свойства препаратов продигиозина с использованием основных методов генетической токсикологии;

• определить возможность применения пигмента в качестве фунгицидного агента для защиты растений от фитопатогенных микромицетов;

• оценить возможность и перспективность использования продигиозина в качестве биологического маркера нефтепродуктов и разработать более точный метод идентификации маркера. Научная новизна. Проведена сравнительная оценка токсичности пигментных препаратов по отношению к прокариотическим и эукариотическим организмам. Получены приоритетные данные о генотоксических эффектах продигиозина. Показано отсутствие генотоксического воздействия очищенного продигиозина в тесте Эймса и микроядерном тесте in vivo. Определены антагонистические свойства продигиозина в отношении фитопатогенных микромицетов, Оценка возможности применения пигмента в качестве фунгицидного агента для защиты растений проведена с учетом определения эффективной и безопасной концентрации продигиозина.

Практическая значимость. Разработана дешевая, простая в приготовлении питательная среда для культивирования Serratia marcescens — штамма-продуцента продигиозина, способствующая высокому выходу пигмента. Разработан метод получения высокоочищенного пигментного препарата. С учетом использования продигиозина в различных отраслях биотехнологии (красителя полимеров, маркера нефтепродуктов) результаты, полученные в данной работе, позволяют определить возможную экологическую опасность при попадании пигмента и связанных с ним продуктов производства в окружающую среду. Выявленная фунгицидная активность продигиозина, как одно из проявлений токсического эффекта, может служить аргументом в пользу разработки методов применения данного препарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов. Упрощенный метод идентификации продигиозина и хорошая растворимость в различных марках топлива позволяют рекомендовать пигмент в качестве маркера нефтепродуктов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования автора по тематике диссертационной работы поддержаны федеральными программами «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП.2.1.1.1005, РНП.2.1.1.3222. Грант АН РТ, № 03-3.5-33/ 2006 (Г) 2006 г. Индивидуальный грант КГУ (2008). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. 8

Масс-спектроскопические исследования проведены в лаборатории ИОФХ им. Арбузова. Микроядерный тест проведен в лаборатории ИОФХ им. Арбузова.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана эффективная схема получения продигиозина; с применением хроматографических методов получен и охарактеризован препарат продигиозина высокой степени очистки.

2. В тестах in vitro и in vivo впервые установлены особенности генотоксического влияния продигиозина, определена возможность возникновения мутаций в клетках Salmonella typhimurium ТА 100 и индукции хромосомных повреждений эритробластов у млекопитающих.

3. Установлены антагонистическая активность штамма Serratia marcescens АТСС 9986 и фунгицидная активность продигиозина. Определены эффективные нетоксичные концентрации пигмента при использовании продигиозина для защиты растений. ^

4. Разработан и рекомендуется к применению новый способ идентификации нефтепродуктов, маркированных пигментом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 2-й международной конференции «Наука-бизнес-образование биотехнология-биомедицина-окружающая среда» (Пущино, 2005), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2006), XLV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007), Региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений» (Казань, 2007), Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2007), I международной практическая конференция «Микробная биотехнология - новые подходы и решения» (Казань, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. 9

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 142 страницах, содержит 8 таблиц и 44 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 163 источников, из них 133 на иностранном языке и приложения.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Гурьянов, Иван Дмитриевич

выводы

1. Штаммы Serratia marcescens АТСС 9986 и ВКМ В-851 являются перспективными продуцентами продигиозина. Модифицированная среда Кинга А рекомендуется для получения продигиозина при использовании в качестве продуцентов штаммов Serratia marcescens АТСС 9986 и ВКМ В-851.

2. Применяемый в работе метод очистки пигментного препарата позволяет получить высокоочищенный продигиозин, что подтверждено методами тонкослойной хроматографии, ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометр ии.

3. Продигиозин (0.1мкг/мл - 2мкг/мл) оказывает существенное токсическое воздействие на растения, выражающееся в ингибировании прорастания корней и накопления биомассы; на тестерный штамм Paramecium caudatum и фитопатогенные микромицеты родов Fusarium и Alternaria. Очистка продигиозина приводит к усилению его фунгицидного эффекта и фитотоксичности, но снижает токсический потенциал по отношению к простейшим.

4. Результаты изучения генотоксичности очищенного продигиозина в тесте Эймса и микроядерном тесте на эритроцитах мышей позволяют причислить продигиозин к веществам с незначительной мутагенной активностью.

5. Возможно использование продигиозина в качестве фунгицидного агента для защиты растений от фитопатогенных микромицетов в концентрациях от 0.05 мкг/мл до 0.1 мкг/мл, не оказывающих фитотоксическое воздействие.

6. Препарат продигиозина может быть использован для маркирования различных нефтепродуктов, где его содержание определяется по интенсивности характерных спектральных линий в области длин волн

А=300.600нм при рН ниже 7, в отсутствие проявляющих реактивов.

114

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю к.б.н. Юсуповой Дельбэр Вафовне за предоставление интересной темы диссертационной работы и научное руководство.

Автор также благодарит:

Клочкова В.В. за проведение ЯМР-спектроскопии,

Карамову Н.С. и Маргулис А.Б. за помощь в освоении методов генетической токсикологии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обзор литературы показывает, что основные сведения о продигиозине были получены исследователями в первой половине прошлого столетия: расшифрована структурная формула пигмента, получены высокоочищенные препараты пигмента и изучены его основные свойства, установлены основные этапы биосинтеза.

В 90-е годы прошлого века исследователи вновь заинтересовались продигиозином и продигиозинподобными пигментами в связи с обнаружением иммунносупрессивной и противоопухолевой активности этих соединений. В многочисленных работах исследуются механизмы противоопухолевого действия продигиозинов, регуляции биосинтеза на генетическом уровне, клонирован кластер генов, кодирующих пигмент. Результаты изучения противоопухолевой активности продигиозинов говорят о том, что продигиозины представляют собой новый многообещающий класс противоопухолевых препаратов для фармакологической индустрии. Разрабатывается программа по созданию синтетических продигиозинов с меньшей токсичностью. Одновременно разрабатываются методы использования продигиозина в промышленности в качестве красителя и маркера.

Из всего выше сказанного следует, что на сегодняшний день продигиозин имеет практическую значимость, и актуальными становятся работы по разработке новых дешевых производственных питательных сред и новых методов, стимулирующих рост и биосинтез пигмента бактериями. Большое значение приобретает также изучение влияния продигиозина на организмы различного эволюционного уровня при попадании пигмента в окружающую среду, выяснение его токсических и генотоксических эффектов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования

Отбор высокоэффективных продуцентов пигмента, проводили среди штаммов Serratia marcescens из коллекции НИЛ ББФ Казанского университета (табл. 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гурьянов, Иван Дмитриевич, 2008 год

1. Воробьева, Л.И. Промышленная микробиология Текст. / Л.И.Воробьева.- Москва: Изд-во Моск. ун-та, 1989.-С.115-118.

2. Габутдинов, М.С. Полимерная красящая композиция-концентрат Текст. / М.С. Габутдинов, И.Н. Рязанцева, И.Ф. Черевин и др. -Патент Р.Ф. № 2129136,по заявке № 97106747 с приоритетом от 23.04.97.

3. Дубинин, Н.П. Новое в современной генетике Текст. / Н.П.Дубинин //- М.: 1986. -С. 12-15.

4. Егоров, Н.С. Практикум по микробиологии Текст. / Н.С. Егоров.-Москва: Изд-во Моск. ун-та, 1976.-С.153-154.

5. Знаменская, Л.В. Влияние неорганического фосфата на рост и биосинтез щелочной внеклеточной РНКазы Bacillus intermedius Текст. / Л.В. Знаменская, М. Н. Капранова, Г.И. Клейнер, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1982. - Т.51, №5. - С.776-779.

6. Ильинская, О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности. Методическое руководство / О.Н. Ильинская, А.Б. Маргулис. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 2005. - 31с.

7. Казанская, Т.Б. Микробиология Текст. // Т.Б. Казанская, Р.П. Анохина. 1974. - Т.43. - С.546-547.

8. Красители для бензинов и ДТ. ООО «РУСКОЛОР» Электронныйресурс. 2008. — Режим доступа :http://www.euromarker.ru/kras benzin/ Дата доступа : 12.05.2008.116

9. Красители и маркеры для дизельного топлива и бензинов.

10. Компания «НАТЭК-КОЛОР».- 2008.- Режим доступа : http://www.natec-color.ru/prod.php?id=3 Дата доступа : 12.05.2008.

11. Лещинская, И.Б. Нуклеазы бактерий / И.Б. Лещинская, В.И. Варламов, Б.М. Куриненко Текст. // Нуклеазы бактерий, Казань: Изд-во Казанского университета, 1991, - 232с.

12. Лория, Ж.К., Микробиология Текст. // Ж.К. Лория, Б. Брюннер, Н.С. Егоров. 1977. - Т.46. - С.440-446.

13. Маркеры для нефтепродуктов. ООО «РУСКОЛОР» Электронный ресурс. 2008. - Режим доступа : http://www.euromarker.ru/marker/ -Дата доступа : 12.05.2008.

14. МЗ СССР. Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому испытанию новых лекарственных средств. — М.: 1982. С.21-59.

15. Определитель бактерий Берджи в 2-х томах / перевод с англ. под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снипа, Дж. Стейли, С. Уильямса // М.: Мир (перевод 9 американского издания, 1994), 1997, Т.1, - 432с.

16. Официальный сайт компании «ЛУКОЙЛ» Электронный ресурс. -2008. Режим доступа : http://www.lukoil.ru.- Дата доступа : 12.05.08.

17. Северина, Л.О. Липазы грамотрицательных бактерий Текст. / Л.О. Северина, Н.А. Башкатова // Прикладная биохим.микробиол., 1981, -Т. 17, вып.2,-С.181-196.

18. Трутко, С.М. Роль процесса биосинтеза продигиозина в регуляции окислительного обмена продуцента Текст. / С.М. Трутко, В.К. Акименко // Микробиология. 1989. - Т.58, №3. - С. 723-729.

19. Феофилова, Е.П. Пигменты микроорганизмов Текст. / Е.П. Феофилова. М.: Наука, 1974. - 218 с.

20. Филимонова, М.Н. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Характеристика фермента Текст. / М.Н. Филимонова J1.A. Боратова, И.Б. Воспельникова, О.В. Желтова // Биохимия, 1981, - Т.46, №9, -С.1660-1665.

21. Фонштейн, JLM. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем Текст. / JI.M. Фонштейн, С.К. Абилев, Е.В. Бобринев // Методические указания. М.- 1985.- 34с.

22. Фонштейн, JI.M. Микроорганизмы как индикаторы мутагенной активности химических соединений и их метаболитов Текст. / JI.M. Фонштейн, А.А. Шапиро, С.К. Абилев // Итоги науки и техники ВИНИТИ, сер. Биология.-1975,- №5,- 690с.

23. Хроматография в тонких слоях Текст. / под ред. Э. Шталя, пер. с нем. канд. техн. наук М.И. Яновского. М.:Мир, 1965. - 508 с.

24. Чигалейчик, А.Г., Хитиназа Serratia marcescens ВКМБ-851 / А.Г. Чигалейчик, Д.Л. Пириева, С.С. Рылкин // Прикладная биохимия и микробиология. 1976. - Т.12. — С.581-586.

25. Энтеробактерии. Руководство для врачей Текст. / под ред. акад. В.И. Покровского. М.Медицина, 1985. - 319с.

26. Юсупова, Д.В. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНК Текст. / Д.В. Юсупова, Р.Б. Соколова, О.В. Порфирьева, А.З. Пономарева//Микробиология, 1991, Т.60, вып.2, - С.279-284.

27. Юсупова, Д.В. Нуклеодеполимеразная активность бактерий в связи с некоторыми особенностями их физиологии Текст. / Д.В. Юсупова //- Казань. Изд.КГУ. 1978. - с.204.

28. Юсупова, Д.В. Питательная среда для выращивания Serratia marcescens 24 — продуцента нуклеазы Текст. / Д.В. Юсупова, Р.Б. Соколова, З.А. Виестуре // Авторское свидетельство №992568, опубликовано 30.01.83. Бюллетень №4.

29. Яснова, JI.H. Изучение динамики накопления экстрацеллюлярных белков Serratia marcescens и их нуклеазной активности в процессе роста клеток Текст. / JI.H. Яснова, Л.И. Пучкова // Микробиология. -1976. Т.45. - С.979-983.

30. Akatsuka, Н. Lipase secretion by bacterial hybrid ATP-binding cassette exporters: molecular recognition of the Lip BCD, Prt DE Fand Has DEF exportes Text. / H. Akatsuka, R. Biner, E. Kawai, et al. // J.Bacteriol. -1997. V.179. P.4754-4760.

31. Akatsuka, H. Overproduction of the extracellular lipase is closely related to that of metallopotease in Serratia marcescens Text. / H. Akatsuka, E. Kawai, K. Omori, S. Komatsubara et al. // J. Ferment.Bioeng. 1996. V.81. - P.l 15-120.

32. Ames, B. N. Mutagenesis and carcinogenesis: endogenous and exogenous factors Text. / B. N. Ames // Environ. Mol. Mutagen. 1989. - V. 14. N. 16.- P. 66-77.

33. Ames, B.N. Durston An improved bacterial test system for defection and classification of mutagens and carcinogens Text. / B.N. Ames, F.D. Lee // Procl. Nac. Akad. Sci. USA. 1973. - V.70.N.3. - P.782.

34. Ang, S. The role of RsmA in the regulation of swarming motility in Serratia marcescens Text. / S. Ang, Yu-Tze Horng, Jwu-Ching Shu, Po-Chi Soo, Jia-Hurng Liu // J. Biomed. Sci. 2001. - V.8. N2. - P.160-169.

35. Arab, S. Verotoxin induces apoptosis and the complete, rapid, long-term elimination of human astrocytoma xenografts in nude mice Text. / S. Arab, J. Rutka, C. Lingwood // Oncol. Res. 1999. - V.l 1. - P.33-39.

36. Arab, S. Verotoxins inhibit the growth of and induce apoptosis in human astrocytoma cells Text. / S. Arab, M. Murakami, P. Dirks, B. Boyd, S. Hubbard, D. Lingwood, J. Rutka // J. Neurol. Oncol. 1998. - V.40. -P.137-150.

37. Ashby J., Tennant R.W. Definitive relationships among chemical structure, carcinogenicity and mutagenesity for 301 chemicals tested by the US NTP Text. / J. Ashby, R.W. Tennant // Mut. Res. 1991. - V.257. -P.229-306.

38. Azuma, T. Induction of apoptosis of activated murine splenic T-cells by cycloprodigiosin hydrochloride, a novel immunosuppressant Text. / T. Azuma, N. Watanabe, H. Jagisawa, M. Iwamura, J. Kobayashi // Immunopharmacology. 2000. - V.46. N.l. - P. 29-37.

39. Ball Т.К. Disulfide bound are required for Serratia marcescens nuclease activity Text. / Т.К. Ball, J. Suh, M.Y. Benedik // Nac. Acids. Res. -1992. V.20. - P.4971-4974.

40. Ball, Т.К. Expression of Serratia marcescens extracellular proteins required recA Text. / Т.К. Ball, C.H. Washmuth, S.C. Braunagel, M.Y. Benedik//J. Bacterid., 1990, V.l72. N.l. - P.342-349.

41. Ball, Т.К. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Esherichia coli Text. / Т.К. Ball, P.H. Saurugger, M.Y. Benedik// Gene, 1987. V.57. - P.l 15-120.

42. Banat, I.M. Potential applications of microbial surfactants Text. / I.M. Banat, R.S. Makkar, S.S. Cameotra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. -V.53.-P. 495-508.

43. Barret J.C. Mechanisms of multistep cancerogenesis and carcinogen risk assessment Text. / J.C. Barret // Environ. Heals. Perspect. 1993. -V.100. - P.9-20.

44. Benedik, M.Y. Serratia marcescens and its extracellular nuclease Text. / M.Y. Benedik, U. Struch // FEMS Microbiol.Lett., 1998. - V.165. N.l. -P.l-13.

45. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding Text. / M.M. Bradford // Anal.Biochem. V.2. - P.248-254.

46. Brown, J.M. Apoptosis, p53 and tumor cell sensitivity to anticancer agents Text. / J.M. Brown, B.G. Wouters // Cancer Res. 1999. - V.59. -P.1391-1399.

47. Brown, M.R.W. Low magnesium and phospholipid content of cell wall of Pseudomonas aeruginosa resistant to polymyxin Text. / M.R.W. Brown, W.M. Watkins // Nature (London) 1970. - V. 227. - P. 13601361.

48. Brurberg, M.B. Chitinase В from Serratia marcescens BYJ 200 is exportet to the periplasm without processing Text. / M.B. Brurberg, J.H. Eijsink, A.Y. Heandrik et al. // Microbiol., 1995. - V.141. N.2. - P.123-131.

49. Bunting, M.J. A description of some color variants produced by Serratia marcescens strain 274 Text. / M.J. Bunting// J.Bacteriol.-1940. -V.40. N.2 P.57-62.

50. Cameron, R. Mollecular cellular and tissue reactions of apoptosis and their modulation by drugs Text. / R. Cameron, G. Feuer // Exp. Pharmacol. 2000. - V.142. - P.37-57.

51. Campas, С. Prodigiosin induces apoptosisof В and T cells from B-cell chronic lymphocytic leukemia Text. / C. Campas, M. Dalmau, B. Montaner, M. Barragan, B. Bellosillo, D. Colomer, G. Pons, R. Perez-Tomas, J. Gil, //Leukemia. -2003. V.17. - P.746-750.

52. Castro, A.J. Products from Serratia marcescens Text. / A.J. Castro, A.H. Corwin, FJ. Waxham, A.Z. Beilby // J. Organic. Chem. 1959. -V.24.N.4.-P. 455-459.

53. Chawrai, S.R. Chemoenzymatic synthesis of prodigiosin analogues -exploring the substrate specificity of Pig С Text. / S.R. Chawrai, N.R. Williamson, G.P.C. Salmond, F.J. Leeper // Chem. Commun. Camb. -2008. V.28. N.16. — P. 1862-1864.

54. Chang, S. High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol Text. / S Chang, M Sanada, О Johdo, S Ohta, Y Nagamatsu, A Yoshimoto // Biotech Lett. 2000. - V.22. - P. 1761-1765

55. Chen, E. Frequent mutations in the p53 tumor suppressor gene in human leukemia T-cell lines Text. / E. Chen, M. Haas // Mol. Cell Biol. 1990. -V.10. -,P.5502-5509.

56. Dfaz-Ruiz, C. Prodigiosin induces cell death and morphological changes indicative of apoptosis in gastric cancer cell line HGT-1 Text. / C. Diaz-Ruiz, B. Montaner, R. Perez-Tomas // Histol. Histopathol. 2001, - V. 16. -P.415^121.

57. Filimonova, M.N. Kinetic studies of the Serratia marcescens extracellular nuclease isoforms Text. / M.N. Filimonova, K.L. Krause, MJ. Benedik // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. -V.33. N.6. - P.1229-1236.

58. Francisco, R. Mechanisms of prodigiosin cytotoxicity in human neuroblastoma cell lines Text. / R. Francisco, R. Perez-Tomas, P. Gimenez-Bonafe, V. Soto-Cerrato, P. Gim6nez-Xavier, S. Ambrosio // European J. Pharmacol. 2007. - V.572. - P.l 11-119.

59. Friedhoff P. Kinetic analisis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia marcescens Text. / P. Friedhoff, Y. Meiss, B. Kolmes et al. // Ew. J. Biochem. 1996. - V.241. - P.572-580.

60. Fuqua, C. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators Text. / C. Fuqua, S.C. Winans, E.P. Greenberg // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - v.50. - P.727-751.

61. Garthoff, B. Alternative testing drug research and development the validation issue Text. / B. Garthoff// Toxicol., - 1995, - V.9, - P.789-793.

62. Giri, A. V. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil Text. / A. V. Giri, N. Anandkumar, G. Muthukumaran, G. Pennathur // BMC Microbiol. 2004. - V.4. N1. - P.1-11.

63. Gold L.S. Comparison of target organs of carcinogenicity for mutagenic and non-mutagenic chemicals Text. / L.S. Gold, Т.Н. Slone, B.R. Stern, L. Bernstein // Mut. Res. 1993. - V.286. -P.75-100.

64. Goldschmidt, M.C. Inhibition by temperature of the terminal step in biosynthesis of prodigiosine Text. / M.C. Goldschmidt, C.L. Gott, R.P. Williams // J. Bacteriol. Proc. 1965. -P.92 - 94.

65. Gott, C.L. Amino acid requirement for temperature induced pigmentation in Serratia marcescens Text. / C.L. Gott, R.P. Williams // Texas Rept. Biol. Med. 1964. - V. 22. - P. 225-230.

66. Green, J.A. Studies on pigmentation of Serratia marcescens. IV. Analysis of syntrophic pigment Text. / J.A. Green, R.P. Williams // J. Bacteriol. 1957. - V. 74. N.4. - P. 633-636.

67. Grimont, P.A.D. Biotyping of Serratia marcescens and Its Use in Epidemiological Studies Text. / P.A. D. Grimomt, F. Grimont // J. Clinical Microb., 1978. - V.8. —N.l. - P.73-83.

68. Grimont, P.A.D. The genus Serratia Text. / P.A.D. Grimont, F. Grimont //Annu. Rev. Microbiol. 1978. - V.32. -P.221-248.

69. Haddix, P.L. Measurement of mutation to antibiotic resistance: ampicillin resistance in Serratia marcescens Text. / P.L. Haddix, E.T. Paulsen, T.F. Werner // J. College Biology Teaching. 2000. - V.26. - P. 17-21.

70. Hajazi, A. Serratia marcescens Text. / A. Hajazi, F.R. Falkiner // J. Med. Microbiol. 1997. - V.46. - P.903-912.

71. Han, S.B. T-cell specific immunosuppression by prodigiosin isolated from Serratia marcescens Text. /S.B. Han H.M. Kim, Y.H. Kim, C.W. Lee, E.S. Jang and K.H. Son et al. II Int J. Immunopharmacol. 1998. - V. 20.-P.1-13.

72. Haun, M. Biological activities and cytotoxicity of l,3-dihydro-2H-indol-2-one derivatives Text. / M. Haun, M.F. Pereira, M.E. Hofrnann, A. Joyas, V. Campos, L.D. Filardy, S.L. De Castro, N. Duran // Bact.Hemistry, -1992.-V.25.-P.21-25.

73. Hertle, R. Serratia type pore forming toxins Text. / R. Hertle, // Curr Protein Pept Sci. 2000. - V.l. N.l. - P.75-89.

74. Hirakata Y. Serratia species, in particular, Serratia marcescens frequently causes bloodstream infections Text. / Y. Hirakata // Nippon Rinsho. — 2002. V.60. N.l 1. -P.2156-2160.

75. Hoive, W. Transgenic tobacco plants which express the chi A gene from

76. Serratia marcescens have enhanced tolerance to Rhizoctonia solani Text. /124

77. W. Hoive, L. Joe, E. Newbiogin et al. // Transgenic Res., 1994 V.3. -P.90-98.

78. Hubert, R.G. Pigment formation in L-forms of Serratia marcescens / R.G. Hubert, C.S. Potter, G.M. Kalmanson, L.B. Guze // J. Gen. Microb. -1969. V.55. N.2. -P.165-167.

79. Hubbard, R. The biosynthesis of Prodigiosin, the tripyrrylmethene pigment from Bacillus prodigiosus (Serratia marcescens) Text. / R. Hubbard, C. Rimington // Biochem. 1950. - V.46. N.2. - P. 220-225.

80. International Organization for Standardization ISO 11269-1: Soil quality-determination of the effect of pollutans on soil flora. Part 1: Methods for the measurement of inhibition of root growth, 1993.

81. Jones, P. A. Performance of the neutral red uptake assay in the COL-IP A international validation study on alternatives to the rabbit eye irritation test Text. / P.A. Jones // Toxicol. 1999. - V.13. - P.325-333.

82. Kataoka, T. Prodigiosin 25-C uncouples vacuolar type H+-ATPase,inhibits vacuolar acidification and affects glycoprotein processing Text. /125

83. Т. Kataoka, М. Muroi, S. Ohkuma, Т. Waritani, J. Magae, A. Takatsulci, S. Kondo, M. Yamasaki, K. Nagai // FEBS Lett. 1995. - V.359. - P.53-59.

84. Katz, D.S. Detection of pigment precursors in white clinical strains of Serratia marcescens Text. / D.S Katz, RJ. Sobleski // J. Cein. Microbiol. -1979. V.9. N.2. - P. 301-303.

85. King, E.O. Pseudomonas P Agar/King A Medium Text. / O.E. King, M.K. Ward, D.E. Raney // J. Lab. And Clin Med. 1954. - V.44. - P. 301307.

86. Lannigan, R. Increased frequency of acceptance of plasmid deoxyribonucleic acid by a nonpigmented strain of Serratia marcescens Text. / R. Lannigan, L.E. Bryan // Microbios Lett. 1980. - V.13. - P. 123 - 127.

87. Makkar, R.S. An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant production and their new applications Text. /R.S. Makkar, S.S. Cameotra // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V.58. - P. 428434.

88. Manderville, R.A. Synthesis, proton-affinity and anti-cancer properties of the prodigiosin-group natural products Text. / R.A. Manderville // Curr. Med. Chem. 2001. - V.l. - P. 195-218.

89. Marks, G.S. Studies of the biosynthesis of prodigiozin in Serratia marcescens Text. / G.S. Marks, L. Bogorad // Proc. Nac. Acad. Sci. U. S. I960.-V. 46. N.l.-P. 25-28.

90. Maron, D.M., Revised methods for the Salmonella mutagenicity test Text. / D.M. Maron, B.N. Ames // Mutat. Res. 1983. - V.l 13. -P.173-215.

91. Matsuyama, T. Extracellular vesicle formation and biosufractant production by Serratia marcescens Text. / T. Matsuyama, T.Murakami, M. Fujita et al. // J. Gen. Microbiol. 1986. - V.132. N.4 - P. 865-875.

92. McGowan, S.J. Bacterial production of carbapenems and clavams: evolution of |3 lactam antibiotic pathways Text. / S.J. McGowan // Trends of Microbiol. - 1998. - V.6. - P.203-208.

93. Melo, P.S. Cytotoxicity of prodigiosin and benznidazole on V79 cells Text. / P.S. Melo, N. Duran, M. Haun // Toxicol.Lett., 2000. -V.l 16. - P.237-242.

94. Melvin, M.S. DNA binding by 4-methoxypyrrolic natural products. Preference for intercalation at AT sites by tambjamine E and prodigiosin Text. / M.S. Melvin, D.C. Ferguson, N. Lindquist, R.A. Manderville // J. Org. Chem. 1999. - V.64. - P.6861-6869.

95. Miller, M.D. 2.A.A0 Structure for binding to doubl-strendid DNA Text. / M.D. Miller, Y. Tanmer, M. Alpaugh et al. // Nat. Structural. Biology. 1994.-V.l.-P.461-468.

96. Miller, M.D. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implication for catalysis Text. / M.D. Miller, K.L. Krause // Protein. Sci. 1996. - V.5. - P.24-33.

97. Monreal, Y. The chitinase of Serratia marcescens Text. / Y. Monreal, E. Rese // Can J.Microbiol. 1969. - V.l 5. N.7. - P.689-696.

98. Montaner, B. Activation of protein kinase С is required for protection of cells against apoptosis induced by the immunosuppressor prodigiosin Text. / B. Montaner, R. Perez-Tomas // Biochem Pharmcol. — 2002.-V.63. -P.l-7.

99. Montaner, B. DNA Interaction and Dual Topoisomerase I and II1.hibition Properties of the Anti-Tumor Drug Prodigiosin Text. / B.128

100. Montaner, W Castillo-Avila, M. Martinell, R. Ollinger, J Aymami, E. Giralt, R. Perez-Tomas // Toxicol Sci. 2005. - V.85. N.2. - P.870-879.

101. Montaner, B. Prodigiosin from the supernatant of Serratia marcescens induces apoptosis in hematopoietic cancer cell lines Text. / B. Montaner, S. Navarro, M. Piqu<3, M. Viaseca, M. Martinell, E. Giralt // J. Pharmacol. -2000. -V.131. P.585-593.

102. Montaner, B. Prodigiosin induced apoptosis in human colon cancer cell Text. / B. Montaner, R. Perez-Tomas // Life Sci. 2001. - V. 68. N.17.-P. 2025-2036.

103. Montaner, B. The prodigiosins: a new family of anticancer drugs Text. / B. Montaner, R. Perez-Tomas // Curr. Cancer Drug Targets. -2003.-V. 3.N.1.-P. 57-65.

104. Nassif, N. Bacteria quorum sensing in silica matrices Text. / N.Nassif, C.Roux., T.Coradin et al// Materials Chemistry. 2004. - V.14. -P.2264-2268.

105. Ohnishi, Y. Extracellular production of a Serratia marcescens serine protease of in Echerichia coli Text. / Y.Ohnishi, S. Horinouchi // Biosci.Biotechnol.Biochem. 1996. - V.60. N.10. - P.1551-1558.

106. Oiler, A.R. Media effects of sugars on pigmentation and antibioticsusceptibility in Serratia marcescens Text. / A.R Oiler // J. Gen. Appl.

107. Microbiol.- 2006.-V. 52. N. 2. P.l 13-117.129

108. Ordentlich, A. Rhisosphere colonization by Serratia marcescens for the control of sclerotium rolfsii Text. / A. Ordentlich, Y. Eland, J. Chet // Sir.Biol.Biochem. 1987. - V.19. - P.744-751.

109. Perez-Tomas, R. The prodigiosins, proapoptotic drugs with anticancer properties Text. / R. Perez-Tomas, B. Montaner, E. Llagostera, V. Soto-Cerrato // Biochem. Pharm. 2003. - V.66. N.8. - P. 1447-1452.

110. Peter, M.Y. Chitin and chitosan from animal sourses Text. / M.Y. Peter // Biopolimers: Polysaccharides II, Wenheim: Wiley, - VCH, -2002. -P.499-512.

111. Purkayastha, M. Association of pigment with the cell envelop of Serratia marcescens Text. / M.Purkayastha, R.P.Williams//Nature. 1960. - V.187.N.4734. -P.349-350.

112. Qadri, S.M. Induction of prodigiozin biosyntesis after shift-down in temperature of nonprouferation cells of Serratia marcescens Text. / S.M. Qadri, R.P. Williams // Appl. Microbial. 1972. - V. 23. - P. 704709.

113. Raimondi, A. Mutation in Serratia marcescens Amp.С |3 — lactamase producting Text. / A. Raimondi, F. Sistro, H. Nikaido // Aint. Agent. Chemother. 2001. V.45. - P.2231-2339.

114. Rapoport, H. The synthesis of Prodigiosin Text. / H. Rapoport, K.Y. Holden // Proc. National. Acad. Sci. USA. 1962. - V.84. N.20. -P.635-642.

115. Reisner, G.S. Prodigiosin and the metabolism of free amino compounds in Serratia marcescens as a function of iron, marganese and aging Text. / G.S.Reisner// J. Microbiol. 1969. - V.15.-P.405- 408.

116. Rizzo V. Equilibrium and kinetics of rotamer interconversion in immunosuppressant prodigiosin derivatives in solution Text. / V. Rizzo, A. Morelli, V. Pinciroli, D. Sciangula, R. D'Alessio // J. Pharmacol. Sci. -1998. V.88. - P.73-78.

117. Rodrigues, J.A. Cytotoxicity of trans-dehydrocrotonin from Croton cajucara on V79 cells and rat hepatocytes Text. / J.A. Rodrigues, M. Haun, // Planta.Med. 1999. - V.65. - P. 1-5.

118. Santer U. Prodigiosin synthesis in Serratia marcescens: isolation of a pyrrolecontaining precursor Text. / U. Santer, Y. Vogel // BBA. -1956. V.19. N.3. - P.578-579.

119. Sato, T. Prodigiosins as a new group of H+/C1— symporters that uncouple proton translocators Text. / T. Sato, H. Konno, Y. Tanaka, T. Kataoka, K. Nagai, H.H. Wasserman, S. Ohkuma // J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P.21455-21462.

120. Shapira, R. Control of plants diseases by chitinase empulsed from cloned DNA in Echerichia coli Text. / R. Shapira, A. Ordenlich, J. Chet, A. Oppenheim // Phytopat. 1989. - V.79. - P. 1246-1249.

121. Sole, M. The effect of pH on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia marcescens Text. / M. Sole, N. Plus, A. Francia et al. // Letters in Applied Microbiology. 1994. - V.19. - P. 341344.

122. Sole, M. The role of pH in 'glucose effect' on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia marcescens Text. / M.Sole, A.Francia, N.Rius et al.// Letter in Microbiology. 1994. -V.25.-P.81-84.

123. Someya, N. Potential of Serratia marcescens strain B2 for biological control of rice sheath blight Text. / N. Someya, M. Nakajima, T. Hibi, K. Akutsu// Biocontrol science and technology. 2005. - V.l5. N. 1. - P.105-109.

124. Suzuki, K. Serratia marcescens 2170 on chitin degradation Text. / K. Suzuki, N. Sugawara, M. Suzuki et al. // Biosci.Biochem., 2005. -V.66. N.2. - P.1075-1083.

125. Tao. Strategy for the Improvement of Prodigiosin Production by a Serratia marcescens Mutant through Fed-Batch Fermentation Text. / Tao, Jin-li, Wang, Xue-dong, Shen, Ya-ling, Wei, Dong-zhi// W. J. Microbiol.

126. Biotechnol. 2005. - V. 21. N.6-7. - P. 969-972.132

127. Thomson, N.R. Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control Text. / N.R. Thomson, M. A. Crow, S.J. McGowan, A. Cox, G.P.C. Salmond // Molecular Microbiology. 2000. - V.36. N.3. - P.539-556.

128. Trias, J. Induction of Yellow Pigmentation in Serratia marcescens Text. / J. Trias, M. Vinas, J. Guinea, J. G. Loren // Apl.Enviroment.Microb, 1988. - V.54. N.12. - P.3138-3141.

129. Vinas, M. Particulate-bound pigment of Serratia marcescens and its association with the cellular enveloped Text. / M. Vinas, J.G. Loren, J. Guinea // Microbios Letters. 1983. - V. 24. N.93. - P. 19-26.

130. Wasserman, H.H. Studies related to the biosinthesis of prodigiosin in Serratia marcescens Text. / H.H. Wasserman, Y.E. Mckeon, U.V. Santer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1960. - V.3. N.2. - P.146-149.

131. Watanabe, T. Genetic analysis of the chitinase system of Serratia marcescens 2170 Text. / T. Watanabe, M. Suzuki, M. Taiyoji, S. Ferrer, M. Regue // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. N.22. - P.7111 -7117.

132. Wei, J.H. Enhanced production of prodigiosin like pigment from Serratia marcescens SM delta R by medium improvement and oil — supplementation strategies Text. / J.H Wei, W.C. Chen // J. BiosciBioeng. -2005.-V. 6.-P.616-622.

133. Williams, R.P. Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens Text. / R.P. Williams, C.L. Gott, S.M. Qadri // J.Bacteriol. 1971. - V. 106. N. 2. - P. 438-443.

134. Williams, R.P. Prodigiosin. In Antibiotics Text. / R.P. Williams, W.R. Hearn, D. Gottlieb and P.D. Shaw (ed.) // Springer Verlag., Berlin. - 1967. -V. 2.-P. 410-432.

135. Williams, R.P. Studies on pigmentation of Serratia marcescens Text. / R.P. Williams,C.L.Gott, J.A.Green//J.Bacteriol. 1961. -V.81. N. 3.- P.376-379.

136. Williams, R.P. Ynhibition by temperature of the terminal step in biosinthesis of prodigiosin Text. / R.P. Williams, M.C. Goldschmidt, C.L. Gott // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. - V.19. N.2. - P. 177181.

137. Williamson, N.R. The biosynthesis and regulation of bacterial prodigiosines Text. / N.R. Williamson, P.C. Fineran, F.J. Leeper, G.P.C. Salmond // Nat. Rev. Microbiol. 2006. - V.4. - P.887-899.

138. Wrede, F. Uber das prodigiosin, der rotten farbstoff dess Bacillus prodigiosus Text. / F. Wrede, O. Hettche // J. Chem. Ber. 1929. - V. 62. -P. 438-443.

139. Yamashita, M. Silika Gel- dependent Production of Prodigiosin and Serrawettins by Serration marcescens in a Liquid Culture Text. / M. Yamashita, Y.Nacagawa, H. and T. Matsuyama// Microbes and Environments. 2001. - V. 16. N. 4. - P.250-254.

140. Yanagida, N.T. Specific excretion of Serratia marcescens protease trough the outer membrane of Esherichia coli Text. / N.T. Yanagida, T. Kosumi, T. Beppu // J.Bacteriol., 1986. - V.166. N.3. -P.937-944.

141. Zhang, J. Antimetastatic effect of prodigiosin through inhibition of tumor invasion Text. / J. Zhang, Y. Shen, J. Liu, D. Wei // Biochem. Pharmacol. 2005. - V.69. N.3. - P.407-414.