Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислорода тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Юдина, Наталья Юрьевна

• Юдина, Наталья Юрьевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Юдина, Наталья Юрьевна

Содержание

Список сокращений

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Биохимическое потребление кислорода (БПК)

1.1.2. Методы определения БПК5

1.1.2.1 Стандартный метод

1.1.2.2 Фотометрический метод

1.1.2.3 Манометрический метод

1.2 Методы определения БПК с использованием биосенсоров

1.2.1 Типы БПК-биосенсоров в зависимости от вида преобразователя22

1.2.1.1 Биосенсоры на основе биолюминисцентных бактерий

1.2.1.2 Микробные биотопливные элементы

1.2.1.3 Амперометрические БПК-биосенсоры

1.2.1.3.1 Электрохимические БПК-биосенсоры на основе редокс-медиаторов

1.2.3.1.2 Амперометрические БПК-биосенсоры на основе кислородного электрода

1.2.2 Тип биологического материала используемого в БПК-биосенсорах

1.2.2.1 Биосенсоры на основе индивидуальных культур

1.2.2.2 Биосенсоры на основе ассоциаций микроорганизмов

1.2.3 Коммерческие БПК-биосенсоры

1.3 Особенности биохимии дрожжевых клеток

1.3.1 Особенности дрожжей ОвЪагуотусв8 Иатвпи

1.3.1.1 Строение дрожжей ОвЪагуотусв8 Иатвпи

1.3.1.2 Влияние солености среды на дрожжи О. ИатвпИ

1.3.1.3 Применение дрожжей О. ИатвпИ

1.3.2 Особенности дрожжей Агхи1а adeninivorans

1.4 Методы иммобилизации клеток

1.4.1 Иммобилизация клеток путем включения в массу носителя

1.4.2 Гидрогели

1.4.3 Использование гидрогелей в биодатчиках

1.4.5 Гидрогели в биосенсорах

1.4.6 Биосенсоры на основе ферментов, иммобилизованных в гидрогели

1.4.7 Биосенсоры на основе целых клетокмикроорганизмов, иммобилизованных в гидрогели

2. Экспериментальная часть

2.1 Получение поливинилового спирта, модифицированного N винилпирролидоном

2.2 Регистрация ИК-спектров

2.3 Регистрация ЯМР-спектров модифицированного поливинилового спирта и исходных веществ

2.4 Определение доли сшитого поливинилового спирта, модифицированного ^винилпирролидоном

2.5 Культивирование клеток микроорганизмов

2.6 Проведение биосенсорных измерений

2.7 Заполнение и проверка качества электрода Кларка

2.8 Иммобилизация дрожжей с применением диализной мембраны

2.9 Иммобилизация микроорганизмов в гидрогель модифицированного поливинилового спирта

2.10 Определение ростовых параметров микроорганизмов

2.11 Сканирующая электронная микроскопия

2. 12 Определение БПК5 стандартным методом разбавления

3. Обсуждение результатов

3.1. Выбор биологического материала для создания БПК-биосенсора на

основе индивидуальной культуры микроорганизмов

3.2 Составление искусственных ассоциаций микроорганизмов

3.2.1 Кривые роста дрожжей

3.2.2 Изучение стабильности во времени созданных ассоциаций

3.3 Разработка матрицы на основе гидрогеля поливинилового спирта модифицированного К-винилпирролидоном, подходящей для иммобилизации микроорганизмов

3.3.1 Влияние соотношения компонентов и времени синтеза на долю сшитого полимера

3.3.2 ИК-спектроскопия образцов модифицированного поливинилового спирта

3.3.3 ЯМР-спектроскопия образцов модифицированного поливинилового спирта и исходных веществ

3.4 Иммобилизация дрожжей О. Натвпи ВКМ У-2482 в гидрогель поливинилового спирта, модифицированного К-винилпирролидоном

3.4.1 Зависимость ответа биосенсора от биохимического потребеления кислорода

3.3.2. Нижняя граница определяемых содержаний и предел обнаружения

3.4.3. Рабочий диапазон

3.4.4 Операционная стабильность

3.4.5 Долговременная стабильность

3.4.6 Основные характеристики разработанных биочувствительных элементов на основе дрожжей иммобилизованных в модифицированный поливиниловый спирт

3.4.7 Субстратная специфичность дрожжей ОвЪагуотусв8 Натвпи, иммобилизованных в поливиниловый спирт, модифицированный N винилпирролидоном

3.5 Иммобилизация ассоциаций микроорганизмов

3.6 Влияние состава исследуемых проб на окислительную способность дрожжей ОвЪагуотусв8 Натвпи ВКМ У-2482 и ассоциации дрожжей О. angusta, А. adвninivorans, О. Натвпи

3.6.1 Влияние pH-среды

3.6.2 Определение зависимости окислительной активности дрожжей от температуры среды

3.6.3 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе хлорида натрия

3.6.4 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе ионов тяжелых металлов

3.7 Анализ образцов воды

3.8 Использование результатов исследования для создания экспериментального образца биосенсорного анализатора БПК «Эксперт - 009»

Выводы

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

Список литературы

Список сокращений

БПК - биохимическое потребление кислорода

БТЭ - биотопливный элемент

BKM - Всероссийская коллекция микроорганизмов

ГГС - смесь глюкозы и глутаминовой кислоты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДДС - додецилсульфат натрия

ДДБС - додецилбензосульфат натрия

ИК - инфрокрасная спектроскопия

МНПВО - многократно нарушенное полное внутреннее отражение

НАДН - Никотинамидадениндинуклеотид

ПВС - поливиниловый спирт

ПДК - предельно-допустимые концентрации

ПНДФ - природоохранные нормативные документы федеративные

РАН - Российская академия наук

УФ - ультрофиолетовый

ХПК - химическое потребление кислорода

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

OECD - Организация Экономического Сотрудничества и Развития N-ВП - N-винилпирролидон

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислорода»

Введение

В настоящее время актуальной является разработка методов и аппаратуры для экспресс-анализа природных и сточных вод. Список объектов, для которых данный тип анализа актуален, включает образцы сточных вод (муниципальных и промышленных), образцы вод, полученных из объектов окружающей среды (реки, озера, водохранилища). Одним из параметров, определяющим загрязненность проб воды, является биохимическое потребление кислорода (БПК). БПК отражает количество кислорода в мг/дм3, потребленное при окислении биоразлагаемых органических соединений. Стандартная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПК10 или БПК20, соответственно). В соответствии с мировой практикой эффективным подходом для экспресс оценки БПК является разработка биосенсоров, на основе иммобилизованных микроорганизмов, окисляющих широкий круг органических веществ [1], за рубежом создан ряд коммерческих БПК-биосенсоров на основе биореакторов.

Для создания биочувствительных элементов БПК-сенсоров

используют либо ассоциации микроорганизмов (активный ил, искусственные консорциумы), способные окислять широкий спектр органических соединений, однако БПК-биосенсоры на их основе недостаточно стабильны из-за изменения состава консорциума [2]; либо индивидуальные культуры микроорганизмов с определенными потребительскими свойствами (стабильность при работе, способность окислять различные классы органических веществ, устойчивость при иммобилизации и к воздействию негативных факторов окружающей среды) [3].

Ключевым моментом в формировании стабильного

биочувствительного элемента БПК-биосенсора является иммобилизация микроорганизмов, от которой зависит сама возможность измерения сигнала, операционные характеристики сенсора, чувствительность. Метод иммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах

температур, значений pH и осмотических давлений, обеспечивать хорошую воспроизводимость при серийном производстве рецепторных элементов. Эффективные методы получения иммобилизованных клеток связаны с процессами включения их в природные и синтетические гидрогели, протекающими, как правило, в мягких условиях и обеспечивающими высокий уровень диффузии субстратов и продуктов, а также полную невозможность для клеток покинуть матрицу [4]. В качестве синтетического гелеобразователя используют поливиниловый спирт (ПВС). Однако применение ПВС в качестве основы рецепторного элемента биосенсорного анализатора малоэффективно, так как он образует тонкие, растворимые в воде пленки с низкой механической прочностью. Новым подходом при иммобилизации микроорганизмов для создания распознающих элементов биосенсоров является использование N-винилпирролидона для модификации ПВС. Получение механически прочных пленок гидрогеля с иммобилизованными микроорганизмами обеспечит технологическую возможность тиражирования расходных биочувствительных элементов для модификации кислородных электродов оксиметров амперометрического типа. Таким образом, для создания биосенсора для экспресс определения БПК необходимо произвести выбор эффективного биокатализатора и способ его иммобилизации.

Цель работы

Разработка биотехнологических основ создания амперометрического биосенсора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода на основе индивидуальной культуры и ассоциаций микроорганизмов.

Задачи работы

1. Выбрать биологический материал составляющий основу биочувствительного элемента БПК-биосенсора, по способности дрожжей родов Ogataea, Candida, Debaryomyces, Arxula окислять широкий спектр

органических субстратов, по устойчивости при иммобилизации на кислородном электроде и стабильности при работе.

2. Разработать полимерную матрицу на основе поливинилового спирта, модифицированного К-винилпирролидоном для создания нерастворимого сетчатого материала, подходящего для иммобилизации микроорганизмов, что обеспечит технологические возможности тиражирования расходных биочувствительных элементов.

3. Составить устойчивые во времени искусственные ассоциации микроорганизмов, создать на их основе рецепторные элементы и определить характеристики БПК-биосенсоров. Сравнить основные характеристики биосенсоров на основе индивидуальной культуры, искусственных и естественных (активный ил) ассоциаций микроорганизмов иммобилизованных в гидрогель поливинилового спирта модифицированного К-винилпирролидоном.

4. Изучить влияние особенностей состава исследуемых проб (рН, соленость и присутствие соединений тяжелых металлов) и условий анализа (температуры) на окислительную способность дрожжей, иммобилизованных в модифицированный ПВС.

5. Разработать методику определения БПК с использованием биосенсорного анализатора.

6. Провести апробацию БПК-биосенсоров на образцах природных и сточнвх вод и сравнить результаты со стандартным методом. На основе полученных результатов совместно с ООО «Эконикс-Эксперт» разработать экспериментальный образец биосенсорного анализатора БПК.

Научная новизна

Показано, что иммобилизация микроорганизмов, происходящая непосредственно в процессе формирования сетчатой структуры поливинилового спирта, модифицированного К-винилпирролидоном, позволяет получать биочувствительные гидрогели для использования в

биотехнологии. Методом ЯМР-спектроскопии установлена структура поливинилового спирта сшитого при участии ^винилпирролидона.

Впервые проведено сравнение основных характеристик микробных амперометрических биосенсоров на основе индивидуальной культуры, искусственных и естественных (активный ил) ассоциаций микроорганизмов, иммобилизованных в гидрогель поливинилового спирта модифицированного ^винилпирролидоном.

Впервые установлено, что дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 способны к окислению широкого спектра органических веществ в сильносоленых средах и при наличии ионов тяжелых металлов в концентрациях, превышающих ПДК, что позволяет использовать их для создания биочувствительных элементов биосенсоров.

Практическая значимость

Иммобилизация целых клеток микроорганизмов в гидрогель поливинилового спирта модифицированного ^винилпирролидоном, позволяет получать стабильные биокатализаторы, которые можно использовать для серийного изготовления биораспознающих элементов сенсоров.

Сформированы биосенсоры кюветного типа для определения биохимического потребления кислорода на основе индивидуальной культуры и ассоциаций микроорганизмов, характеризующиеся высокой чувствительностью и экспрессностью, и превосходящие мировые аналоги по данным характеристикам. Работа вносит практический вклад в разработку быстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяет в перспективе производить недорогие и эффективные анализаторы воды.

Совместно с малым инновационным предприятием ООО «Эконикс-Эксперт» изготовлен экспериментальный образец амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения БПК, в результате чего разработка подготовлена к промышленному выпуску.

Разработана и аттестована в Госстандарте методика определения БПК с использованием биосенсорного анализатора.

По результатам работы получено 2 патента: патент на полезную модель № 117918 от 28.10.2011 «Устройство для определения степени загрязнения воды биоразлогаемыми органическими веществами», патент на полезную модель № 164144 от 21.10.2015 «Устройство для экспресс-анализа индекса биохимического потребления кислорода».

Место проведения работы

Работа выполнялась на кафедре химии Естественнонаучного института ФГБОУ ВО Тульского государственного университета при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062 и государственного задания в сфере научной деятельности Минобрнауки РФ (Задание №2014/227, проект № 1764). Автор работы является победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2011 г. (№10022р/16818, г. Тула).

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011, 2013, 2015 гг.) (медали конкурса); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2011 (диплом победителя конкурса), 2012, 2013, 2014 (диплом победителя конкурса), 2016; I Конгрессе молодых ученых (Санкт-Петербург, 10-13 апреля 2012 г); IX Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2014» (Светлогорск, 22 - 28 июня 2014 г. (диплом победителя конкурса)); Всероссийской научно-практической

конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем» (Киров, 2009, 2011, 2014 гг.); «Методы анализа и контроля качества воды» (Москва, 6 июня 2012 г.); IV международной конференции «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 20-24 сентября 2016г.). По теме диссертации опубликовано 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, из них 2 статьи индексируемых в Web of Science, 27 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

1. Литературный обзор 1.1. Биохимическое потребление кислорода (БПК)

Важнейшей характеристикой сточных и поверхностных вод является биохимическое потребление кислорода (БПК)— количество растворенного кислорода (мг), необходимое для окисления всех биоразложимых органических отходов, находящихся в 1 дм3 воды [2]. БПК не включает расходование кислорода на нитрификацию. Полученный результат характеризует суммарное содержание биохимически окисляющихся органических примесей в воде, БПК характеризует способность воды к самоочищению.

Биохимическое окисление различных органических веществ происходит с разной скоростью, зависит от природы вещества и от присутствия именно той микрофлоры, которая адаптировалась к веществам, которые находятся в исследуемой воде. Различают полное биохимическое потребление кислорода (БПКполн.) и биохимическое потребление за определённый период времени (обычно берут период 5 суток - БПК5). Полным биохимическим потреблением кислорода (БПКполн.) считается количество кислорода, требуемое для окисления органических примесей до начала процессов нитрификации [5]. Полная биологическая потребность в кислороде БПКполн. для внутренних водоемов рыбохозяйственного назначения (I и II категории) при 20оС не должна превышать 3 мг/дм3 [6].

В лабораторных условиях наряду с БПКполн. определяется БПК5 -биохимическая потребность в кислороде за 5 суток. Для водоемов, загрязненных преимущественно хозяйственно-бытовыми сточными водами, БПК5 составляет обычно около 70% БПКполн. В поверхностных водах величины БПК5 изменяются обычно в пределах 0,5 - 4 мг/дм3 и подвержены сезонным и суточным колебаниям [6]. В таблице 1 представлены Величины БПК5 в водоемах с различной степенью загрязненности.

Таблица 1. Величины БПК5 в водоемах с различной степенью загрязненности

Степень загрязнения (классы водоемов) БПК5, мг/л

Очень чистые 0,5 - 1,0

Чистые 1,1 - 1,9

Умеренно загрязненные 2,0 - 2,9

Загрязненные 3,0 - 3,9

Грязные 4,0 - 10,0

Очень грязные > 10,0

В зависимости от категории водоема величина БПК5 регламентируется следующим образом: не более 3 мг/дм3 для водоемов хозяйственно-питьевого водопользования и не более 6 мг/дм3 для водоемов хозяйственно-бытового и культурного водопользования. Для морей (I и II категории рыбохозяйственного водопользования) пятисуточная потребность в кислороде (БПК5) при 20оС не должна превышать 2 мг/дм3 [6].

Индекс БПК5 в основном используется: 1) как норматив, разрешающий сброс сточных вод или определяющий необходимость их доочистки до требуемых показателей; 2) на водоочистных сооружениях, соотношение между БПК5 и ХПК (химическое потребление кислорода) показывает долю биоразлагаемых полютантов сточных вод; 3) для определения показателя ХПК/БПК5 на станциях водоочистки для конкретных территорий.

1.1.2. Методы определения БПК5 Оценка индекса БПК5 является одним из наиболее распространенных тестов в области мониторинга воды, однако дисперсия результатов анализа в сертифицированных лабораториях достигает 20% (внутрилабораторный

контроль), и это значение увеличивается при сравнении данных, полученных в разных лабораториях (межлабораторный контроль), что связанно с тем, что популяции используемых микробных сообществ нестабильны [1]. Определение БПК5 производится несколькими методами, которые различаются, в основном, способом измерения количества потребленного кислорода (таблица 2).

Таблица 2. Методы опредления БПК

Название метода

Маркер биодеградации / Преобразователь

Время анализа

Преимущества

Недостатки

Стандартный метод

Растворенный кислород / Йодометри-ческий дозатор Электрохимический датчик

5 суток

• Истинное значение БПК5

• Много отчетов о полевых испытаниях

• Промышленный образец

• Длительное время анализа

• Узкий диапазон измерения (БПК: 0-6 мг/ла)

• Ручное дозирование/ Обслуживание датчиков

• Различие результатов измерения (инокулят)

• Требуется большая рабочая площадь

Моди-фициро-ванный стандартный метод

Растворенный кислород / Оптический датчик

5 суток

• Истинное значение БПК5

• Бесконтактные датчики

• Много отчетов о полевых испытаниях

• Промышленный образец

• Длительное время анализа

• Узкий диапазон измерения (БПК: 0-6 мг/ла)

• Ручное дозирование/ Обслуживание датчиков

• Различие результатов измерения (инокулят)

• Требуется большая рабочая площадь

Фотоме-триче-

Растворенный кислород /

5 суток

• Истинное значение БПК5

• Длительное время анализа

Название метода

Маркер биодеградации / Преобразователь

Время анализа

Преимущества

Недостатки

скии метод

Спектрофотометр

• Готовый к эксплуатации набор

• Достаточно небольшая рабочая площадь

• Много отчетов о полевых испытаниях

• промышленный образец

Узкий диапазон

измерения (БПК:

0-6 мг/ла)

Ручное

дозирование/

Обслуживание

датчиков

Различие

результатов

измерения

(инокулят)_

Маноме-триче-ский метод

Давление Манометр

5 суток

• Широкий диапазон измерений БПК (0700 мг/л)

• Много отчетов о полевых испытаниях

• Промышленный образец

• Длительное время анализа

• Косвенное измерение

• Эквивалент БПК

• Различие результатов измерения (инокулят)

• Требуется большая рабочая площадь

Биосенсор на основе биолю-минис-центных бактерий

Биолюмини-сцентная активность / Люминометр

72 мин

Малое время

анализа

Широкий диапазон измерений БПК (0200 мг/л)

Простой в

употреблении Достаточна небольшая рабочая площадь

Один

люминисцентный

штамм =

ограниченное

количество

биоразлагаемых

веществ

Косвенное

измерение

Смоделированное

значение БПК

Биолюминисцент

ная

нестабильность Мало отчетов о полевых испытаниях Нет

промышленного образца_

/

Название метода

Маркер биодеградации / Преобразователь

Время анализа

Преимущества

Недостатки

Биотопливный элемент

Электродный потенциал / Амперметр

315 мин

Малое время • Косвенное

анализа измерение

Обширный • Различие

диапазон измерений результатов

БПК (0-200 мг/л; измерения

максимум 100 000 (инокулят)

мг/л) • Смоделированное

Низкие значение БПК

эксплуатационные • Мало отчетов о

затраты полевых

Устройство испытаниях

позволяет

проводить

мониторинг в

реальном времени

Промышленный

образец

Редокс-медиатор

Редокс-

медиатор /

Амперметор,

люминометр,

флуориметр

или

спектрофотоме тр

15 мин

Малое время

анализа

Широкий диапазон измерений БПК (0300 мг/л) Промышленный простой в

употреблении образец

(флуоресцентный редокс медиатор), который требует малую рабочую площадь

Смоделированное значение БПК Косвенное измерение Низкая точность эквивалентной оценки БПК5 Мало отчетов о полевых испытаниях

Биосенсор с иммобилизован-ными клеткам и

Растворенный кислород / Электрохимиче ский или

оптический датчик

10 мин

Прямое измерение Малое время

анализа

Широкий диапазон измерений БПК (0500 мг/л) Устройство позволяет проводить мониторинг в

реальном времени

Диффузия

(кислорода,

химических

веществ) в

полимерную

матрицу

Нестабильность

иммобилизованны

х клеток

Мало отчетов о

полевых

испытаниях

Смоделированное

значение БПК

Нет

промышленного

Название метода Маркер биодеградации / Преобразователь Время анализа Преимущества Недостатки

образца

Биореактор Растворенный кислород / Электрохимиче ский или оптический датчик 20 мин • Прямое измерение • Малое время анализа • Широкий диапазон измерений БПК (0500 000 мг/л) • Устройство позволяет проводить мониторинг в реальном времени • Много отчетов о полевых испытаниях • Промышленный образец • Требуется большая рабочая площадь • Смоделированное значение БПК • Различие результатов измерения (инокулят) • Необходимость калибробки

а Без разбавления проб

1.1.2.1 Стандартный метод

Стандартный метод определения БПК5 регламентированный ПНДФ [7] состоит из следующих операций: проба, потенциально загрязнённая органическими веществами, помещается в специальные склянки (рисунок 1); аэрируется и засевается микробной популяцией. Затем сосуды герметично закрывают и инкубируют в темной комнате при температуре 20 ° С. После инкубационного периода (5-дней) измеряется количество остаточного растворенного кислорода во всех анализируемых образцах и оценивается БПК. Концентрацию растворенного кислорода определяют в соответствии со стандартами или йодометрически (метод Винклера), или с помощью электрохимического датчика (кислородного электрода Кларка).

Коммерчески доступен полуавтоматический вариант стандартного метода (рисунок 1б), где электрохимический датчик вводится в закрытый сосуд для измерения концентрации растворенного кислорода в режиме

реального времени, что позволяет фиксировать кинетику деградации органических веществ. Кроме этого фирмой «Scalar» (Нидерланды), создан прибор для автоматического определения БПК стандартным методом (рисунок 1в).

11

а б в

Рисунок 1. Оборудование для проведения стандартного метода определения БПК

Модификацией стандартного метода является использование оптического датчика, в основе которого лежит химический индикатор (динамический гаситель флуоресценции), взаимодействующий с кислородом и уменьшающий флуоресцентное излучение флуорофора, пропорциональное растворенному в анализируемом образце кислороду. Главным преимуществом этих датчиков является то, что они по сравнению с электрохимическими аналогами требуют меньшего ухода и обслуживания. Кроме того, при их использовании анализируемый образец не подвергается изменениям во время эксперимента, потому что растворенный кислород не расходуется сенсором и измерению содержания кислорода не мешает скорость потока или электромагнитные поля.

Стандартный метод измеряет потребление растворенного кислорода для оценки величины БПК (таблица 2). Тем не менее, у данного теста есть некоторые ограничения: значительное различие результатов анализа (> 20%), в основном, из-за используемой микробной популяции; необходима подходящая рабочая площадь; продолжительность анализа (обычно 5

суток) не удовлетворяет промышленным нуждам (экспресс-скрининг органических загрязнителей для мониторинга сточных вод), диапазон измерения органических загрязнителей ограничен количеством растворенного кислорода. Кроме того, этот анализ нецелесообразен для мониторинга процессов на водоочистных сооружениях в режиме реального времени. Из-за данных ограничений разрабатываются новые методы оценки БПК, как альтернатива стандартному.

1.1.2.2 Фотометрический метод

Для уменьшения рабочей площади для проведения БПК-тестов, корпорации «Hach Lange» (LCK 555) и «Macherey Nagel» (BOD5-Nanocolor) предлагают фотометрическое определение растворенного кислорода до и после 5-ти дневной инкубации анализируемой пробы [1] . В разработке фирмы «Hach Lange» используются реагенты, образующие красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации растворенного кислорода. Измерение растворенного кислорода в методике от компании «Macherey Nagel» основано на методе Винклера (йодометрический метод). Оба этих метода обеспечивают косвенную оценку БПК.

1.1.2.3 Манометрический метод

Манометрический метод основан на уменьшение давления в сосуде с пробой, которое вызвано убылью кислорода в процессе биологического окисления органических веществ. Изменение давления фиксируется с помощью манометра и пересчитывается на содержание растворенного кислорода, необходимое для оценки индекса БПК. Коммерческое распространение получили 6 манометрических датчиков для определения БПК5: BODTrak (Hach Lange, Германия), Quick Scan BOD Analyzer (Challenge technology, США), OxiTop, OxyDirect (Tintometer, Германия),

BOD EVO Sensor (Velp Scientifica, Италия) и CI-B5 BOD ANALYZER (FanYuan Instrument, Китай) (рисунок 2).

Рисунок 2. Манометрические датчики OxiTop для определения БПК

Манометрический метод очень распространен в промышленном секторе, поскольку прост в использовании и позволяют измерять БПК в образцах с высоким уровнем органических соединений без разбавления (0700 мг/дм3 по сравнению с 0-6 мг/ дм3 стандартного метода), что достигается с помощью конструкции прибора улавливающей большой объем кислорода [1] . 1.2 Методы определения БПК с использованием биосенсоров Согласно определению Международного Союза по чистой и прикладной химии (IUPAC), биосенсор (biosensor) - это интегральная система, которая способна воспринимать и преобразовывать специфичную количественную или полуколичественную аналитическую информацию с использованием биологического распознающего элемента (биохимического рецептора), находящегося в тесном контакте с преобразователем [8]. Биосенсор представляет собой комбинацию биологического компонента и инструментального средства измерения (физико-химического анализатора). Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал, иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с

определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем того или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде [9].

Исследования по созданию БПК - биосенсоров проводятся с конца 70-х годов прошлого века [10-11], но разработки таких систем интенсивно продолжаются и в настоящее время [1,3]. Следует отметить, что с помощью биосенсоров возможно быстрое определение БПК (БПКбс), которое не всегда идентично величине традиционного БПК5. В последнее время развиваются новые подходы в биосенсорном анализе БПК, которые позволяют достичь приемлемой корреляции между показаниями биосенсора и традиционных методов. Корреляция данных, полученных с помощью биосенсорного анализатора, с данными, полученными методом БПК5, могут иметь значения порядка 0,67 - 0,99 [1].

1.2.1 Типы БПК-биосенсоров в зависимости от вида преобразователя 1.2.1.1 Биосенсоры на основе биолюминисцентных бактерий

Принцип работы БПК-биосенсоров на основе биолюминисцентных бактерий основан на том, что биолюминесцентное излучение коррелирует с энергией, полученной от утилизации источника углерода в аэробных условиях и индекс БПК оценивается по интенсивности излучения биолюминесценции. В статье [12] описано применение рекомбинантных бактерий Escherichia coli, содержащих гены luxCDABE для определения БПК в течение 2 часов с корреляцией данных R2 = 0,674. Для улучшения корреляции (R2= 0,995) и уменьшения времени отклика (25 минут) в работе [13] использован природный биолюминесцентный штамм Photobacterium phosphoreum. Ограничением при создании биолюминисцентных БПК-биосенсоров является сложность реакции биолюминесценции, так как реакцию регулируют многие внутриклеточные и внеклеточные факторы, которые могут повлиять на оценку индекса БПК. Кроме этого,

биолюминисцентные бактерии чаще всего окисляют достаточно узкий круг органических субстратов, что снижает коэффициент корреляции.

1.2.1.2 Микробные биотопливные элементы

Для устранения кислородного ограничения реакции биодеградации, некоторые научно-исследовательские группы работают над развитием БПК биосенсоров на основе технологии биотопливного элемента (БТЭ). БТЭ состоит из анаэробного с анодом (отрицательный электрод) и аэробного с катодом (положительный электрод) отсеков, разделенных протоннообменной мембраной. В анаэробной ячейке микроорганизмы разлагают органические вещества и генерируют электроны и протоны. Протоны мигрируют из анодного отсека в катодную ячейку через мембрану, в то время как электроны проходят от анода к катоду через внешнюю электрическую схему, где кислород восстанавливается с образованием Н20. Поток электронов через электрическую цепь генерирует измеряемый ток, пропорциональный микробной биодеградационной активности, что позволяет оценить значение БПК в образце [1].

В публикациях [14-16] описаны БТЭ обладающие хорошей корреляцией со значениями БПК5, полученными стандартной методикой (Я2= 0,95-0,98), однако, в большинстве случаев, оценка выполнена только на 3-5 пробах сточных вод. Большинство описанных БТЭ для определения БПК разрабатываются на основе бактериальных штаммов, что сужает спектр окисляемых субстратов в сравнении с дрожжами, и тем самым не позволяет окислять все органические вещества, входящие в состав сточных вод [17].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Юдина, Наталья Юрьевна, 2017 год

Список литературы

1. Jouanneau S., Recoules L., Durand M. J., Boukabache A., Picot V., Primault Y., Thouand G. Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review //Water research. - 2014. - Т. 49. - С. 62-82.

2. Abrevaya X. C., Sacco N. J., Bonetto M. C., Hilding-Ohlsson A., Cortón E. Analytical applications of microbial fuel cells. Part I: Biochemical oxygen demand //Biosensors and Bioelectronics. - f. - Т. 63. - С. 580-590

3. Понаморева О.Н., Арляпов В.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №1. С. 5-15.

4. Демаков B. A., Максимова Ю. Т., Максимов А. Ю. Иммобилизация клеток микроорганизмов: биотехнологические аспекты //Биотехнология. - 2008. - №. 2. - С. 30.

5. Муравьев А.Г. Руководство по определению показателей качества воды полевыми методами. 3-е издание, дополненное и переработанное - СПб.: «Крисмас+», 2004. - 248 с.

6. Экологический мониторинг: шаг за шагом / Е. В. Веницианов, Виниченко В.Н., Гусева Т.В., Дайман С.Д., Заика Е.А., Молчанова Я.П., Сурнин В.А., Хотулева М.В. Под ред. Е.А. Заика. Монография— М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2003. — 252 с

7. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. -М.: 1997. 25 с

8. Handbook of Biosensors and Biochips. / Edited by Marks R. S., Cullen D. C., Karube I., Lowe C. R., Weetall H. 2007. 356 p.

9. Решетилов А. Н. Биосенсоры и биотопливные элементы: исследования, ориентированные на практическое применение (обзор) //Прикладная биохимия и микробиология. - 2015. - Т. 51. - №. 2. - С. 268.

10. Karube I., Matsunaga T., Mitsuda S., Suzuki S. Microbial electrode BOD sensors //Biotechnology and bioengineering. - 1977. - T. 19. - №. 10. - C. 1535-1547.

11. Hikuma M., Suzuki H., Yasuda T., Karube I., Suzuki S. Amperometric estimation of BOD by using living immobilized yeast // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1979. V. 8. P. 289-297.

12. Sakaguchi T., Kitagawa K., Ando T., Murakami Y., Morita Y., Yamamura A., Tamiya E.A rapid BOD sensing system using luminescent recombinants of Escherichia coli //Biosensors and Bioelectronics. - 2003. - T. 19.

- №. 2. - C. 115-121

13. Sakaguchi T., Morioka Y., Yamasaki M., Iwanaga J., Beppu K., Maeda H., Tamiya E. Rapid and onsite BOD sensing system using luminous bacterial cells-immobilized chip //Biosensors and Bioelectronics. - 2007. - T. 22. -№. 7. - C. 1345-1350.

14. Kim B. H., Chang I. S., Gil G. C., Park H. S., Kim H. J. Novel BOD (biological oxygen demand) sensor using mediator-less microbial fuel cell //Biotechnology letters. - 2003. - T. 25. - №. 7. - C. 541-545

15. Kaur A., Kim J. R., Michie I., Dinsdale R. M., Guwy, A. J., Premier G. C. Microbial fuel cell type biosensor for specific volatile fatty acids using acclimated bacterial communities //Biosensors and Bioelectronics. - 2013. - T. 47.

- C. 50-55

16. Tee P. F., Abdullah M. O., Tan I. A. W., Amin M. A. M., Nolasco-Hipolito C., Bujang, K. Performance evaluation of a hybrid system for efficient palm oil mill effluent treatment via an air-cathode, tubular upflow microbial fuel cell coupled with a granular activated carbon adsorption //Bioresource technology.

- 2016. - T. 216. - C. 478-485.

17. Sun J. Z., Kingori G. P., Si R. W., Zhai D. D., Liao Z. H., Sun D. Z., Yong Y. C. Microbial fuel cell-based biosensors for environmental monitoring: a review //Water Science and Technology. - 2015. - T. 71. - №. 6. - C. 801-809

18. Pasco N., Baronian K., Jeffries C., Hay J. Biochemical mediator demand-a novel rapid alternative for measuring biochemical oxygen demand //Applied microbiology and biotechnology. - 2000. - T. 53. - №. 5. - C. 613-618.

19. Liu L., Zhai J., Zhu C., Gao Y., Wang Y., Han Y., Dong S. One-pot synthesis of 3-dimensional reduced graphene oxide-based hydrogel as support for microbe immobilization and BOD biosensor preparation //Biosensors and Bioelectronics. - 2015. - T. 63. - C. 483-489.

20. Di Lorenzo M., Curtis T. P., Head I. M., Scott K. A single-chamber microbial fuel cell as a biosensor for wastewaters //Water research. - 2009. - T. 43. - №. 13. - C. 3145-3154.

21. Liu J., Bjornsson L., Mattiasson B. Immobilised activated sludge based biosensor for biochemical oxygen demand measurement //Biosensors and Bioelectronics. - 2000. - T. 14. - №. 12. - C. 883-893

22. Lin L., Xiao L. L., Huang S., Zhao L., Cui J. S., Wang X. H., Chen X. Novel BOD optical fiber biosensor based on co-immobilized microorganisms in ormosils matrix //Biosensors and bioelectronics. - 2006. - T. 21. - №. 9. - C. 1703-1709.

23. Raud M., Kikas T. Bioelectronic tongue and multivariate analysis: A next step in BOD measurements //Water research. - 2013. - T. 47. - №. 7. - C. 2555-2562.

24. Seo K. S., Choo K. H., Chang H. N., Park J. K. A flow injection analysis system with encapsulated high-density Saccharomyces cerevisiae cells for rapid determination of biochemical oxygen demand //Applied microbiology and biotechnology. - 2009. - T. 83. - №. 2. - C. 217-223.

25. Dhall P., Kumar A., Joshi A., Saxsena T.K., Manoharan A., Makhijani S.D., Kumar R. // Sens. Act. B. -2008. - T. 133. - № 2. - C. 478-483.

26. Suriyawattanakul L., Surareungchai W., Sritongkam P., Tanticharoen M., Kirtikara K. The use of co-immobilization of Trichosporon cutaneum and Bacillus licheniformis for a BOD sensor. Appl Microbiol Biotechnol. - 2002. T. 59. - № 1. - C. 40-44.

27. Yang Z., Suzuki H., Sasaki S., Karube I. Disposable sensor for biochemical oxygen demand // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1996. -T. 46. - C. 10 - 14.

28. Tag K., Lehmann M., Chan C., Renneberg R., Riedel K., Kunze G., Measurement of biodegradable substances with a mycelia-sensor based on the salt tolerant yeast Arxula adeninivorans LS3. // Sensors and Actuators B. - 2000. - № 67. - C. 142-148.

29. Bonetto M. Celina, Sacco Natalia J., Ohlsson Astrid Hilding, Eduardo Cortón. Assessing the effect of oxygen and microbial inhibitors to optimize ferricyanide-mediated BOD assay// Talanta. -2011. -T. 85. - № 1. - C.455-462.

30. Wang J., Bian C., Li Y., Tong J., Sun J., Hong W., Xia S. A renewable BOD microsensor based on magnetically functionalized microorganism and ultramicroelectrode array //Sensors, -2015. IEEE. -C. 1-4.

31. Li Y., Sun J., Wang J., Bian C., Tong J., Li Y., Xia S. A single-layer structured microbial sensor for fast detection of biochemical oxygen demand //Biochemical Engineering Journal. - 2016. - T. 112. - C. 219-225.

32. Raudkivi K., Tutt M., Talpsep E., Kikas T. Pseudomonas putida P67. 2 and Pseudomonas flourescens P75 based microbial sensors for biochemical oxygen demand (BOD) measurements in phenolic wastewaters of oil shale industry //Oil Shale. - 2008. - T. 25. - №. 3. - C. 376-387.

33. Testing Methods for Industrial Waste Water, JIS K3602, Japanese Industrial Standard Committee, Tokyo, 1990.

34. Standard methods for the examination of water and wastewater. Washington: Amer. Publ. Health Association, 1992. P. 5.1-5.6.

35. Liu J., Mattiasson B. Microbial BOD sensors for wastewater analysis //Water Research. - 2002. - T. 36. - №. 15. - C. 3786-3802.

36. Raud M., Tenno T., Jogi E., Kikas T. Comparative study of semi-specific Aeromonas hydrophila and universal Pseudomonas fluorescens biosensors for BOD measurements in meat industry wastewaters. // Enzyme and Microbial Technology. - 2012. - T. 50, - № 4-5. - C. 221-226.

37. Organization for Economic Corporation and Development (OECD), OECD Guidel. Testing Chem., 1991, 209, 1.

38. Xiufen L., Fangshu G., Zhaozhe H. Treatment of syntetic wasterwater by a novel MBR with granular sludge developed for controlling membrane fouling. // Separation and Purification Technology 2005. -№ 46. - С. 19-25.

39. Mark A. Jordan, David T. Welsh, Peter R. A ferricyanide-mediated activated sludge bioassay for fast determination of the biochemical oxygen demand of wastewaters.// Water Research. - 2010. - Т. 44,- № 20. - С. 5981-5988.

40. Kumlanghan A., Kanatharana P., Asawatreratanakul P., Mattiasson B., Thavarungkul P. Microbial BOD sensor for monitoring treatment of wastewater from a rubber latex industry. // Enzyme and Microbial Technology. 2008. - Т.42. № 6. - С. 483-491.

41. Баланов П. Е., Иванченко О. Б. Синтез теплоты дрожжевыми клетками при сбраживании пивного сусла //Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств». - 2013. - №. 3

42. Прозоркина Н. В., Рубашкина Л. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. - Ростов н/Д : Феникс, 2002. - 416 с.

43. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - 456 с.

44. Бурьян Н. И. Микробиология виноделия. - С.: Таврида, 2003. -560 c.

45. Cano-Garcia L., Flores M., Belloch C. Molecular characterization and aromatic potential of Debaryomyces hansenii strains isolated from naturally fermented sausages //Food Research International. - 2013. - Т. 52. - №. 1. - С. 42-49.

46. Padilla B., Manzanares P., Belloch C. Yeast species and genetic heterogeneity within Debaryomyces hansenii along the ripening process of traditional ewes' and goats' cheeses //Food microbiology. - 2014. - Т. 38. - С. 160-166.

47. Herrera R., Ramos J. Intracellular sodium distribution in the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii //Yeast. - 2015. - T. 32. - C 192-205.

48. Michan C. et al. Salt and oxidative stress tolerance in Debaryomyces hansenii and Debaryomyces fabryi //FEMS yeast research. - 2013. - T. 13. - №. 2.

- C. 180-188.

49. Kurtzman C.P., Fell J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study. Peoria, Illinois, USA, Elsevier., 1998. - 1055p.

50. Aliakbari E. et al. Degradation of Alkanes in contaminated sites //International journal of Advanced Biological and Biomedical Research. - 2014. -T. 2. - №. 5. - C. 1620-1637.

51. Breuer U. and Harms H. Debaryomyces hansenii — an extremophilic yeast with biotechnological potential. // Yeast., 2006. - T. 23. - C. 415-437.

52. Weete J. D. Lipid biochemistry of fungi and other organisms. -Springer Science & Business Media, 2012.

53. Arous F. et al. Lipid accumulation in the new oleaginous yeast Debaryomyces etchellsii correlates with ascosporogenesis //Biomass and Bioenergy. - 2015. - T. 80. - C. 307-315.

54. Alfredo Cabrera-Orefice, Monica Rosas-Lemus, Sergio Guerrero-Castillo. The branched mitochondrial respiratory chain from Debaryomyces hansenii: Components and supramolecular organization.// Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics., 2014. - 1. - C. 73-84.

55. Gori K. et al. Debaryomyces hansenii strains differ in their production of flavor compounds in a cheese surface model //MicrobiologyOpen. - 2012. - T. 1. - №. 2. - C. 161-168.

56. Minhas A. et al. Conserved Ser/Arg-rich motif in PPZ orthologs from fungi is important for its role in cation tolerance //Journal of Biological Chemistry.

- 2012. - T. 287. - №. 10. - C. 7301-7312.

57. Martinez J. L., Luna C., Ramos J. Proteomic changes in response to potassium starvation in the extremophilic yeast Debaryomyces hansenii //FEMS yeast research. - 2012. - T. 12. - №. 6. - C. 651-661.

58. Prista C., Michan C., Miranda I. M., Ramos J. The halotolerant Debaryomyces hansenii, the Cinderella of non-conventional yeasts //Yeast. - 2016.

- T. 33. - №. 10. - C. 523-533.

59. Chao H.F., Yen Y.F., Ku M.S. Characterization of a salt-induced DhAHP, a gene coding for alkyl hydroperoxide reductase, from the extremely halophilic yeast Debaryomyces hansenii.// BMC Microbiology., 2009. - T.9. - C. 182-185.

60. Turk M., Montiel V., Zigon D., Plemenitas A., Ramos J. Plasma membrane composition of Debaryomyces hansenii adapts to changes in pH and external salinity.// Microbiology., 2007 - № 153. - C.3586-3592.

61. Flores M., Toldra F. Microbial enzymatic activities for improved fermented meats //Trends in Food Science & Technology. - 2011. - T. 22. - №. 2.

- C. 81-90.

62. Golic N. et al. Evaluation of lactic acid bacteria and yeast diversity in traditional white pickled and fresh soft cheeses from the mountain regions of Serbia and lowland regions of Croatia //International journal of food microbiology.

- 2013. - T. 166. - №. 2. - C. 294-300.

63. Dura M.A., Flores M. and Toldra F. // Food Chem. 2004., - T. a86. -C. 385 - 389.

64. Prakash G. et al. Microbial production of xylitol from d-xylose and sugarcane bagasse hemicellulose using newly isolated thermotolerant yeast Debaryomyces hansenii //Bioresource technology. - 2011. - T. 102. - №. 3. - C. 3304-3308.

65. Giersberg M. et al. Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)-An Imperfect Dimorphic Yeast of Biotechnological Potential // Microorganisms in Sustainable Agriculture and Biotechnology. - Springer Netherlands, 2012. - C. 453-468

66. Satyanarayana T., Kunze G. (ed.). Yeast biotechnology: diversity and applications. - Dordrecht : Springer, 2009. - T. 78.

67. Middelhoven W.J., de Jonge I.M., de Winter M. Arxula adeninivorans a yeast assimilating many nitrogenous and aromatic compounds // Antonie van Leeuwenhoek. -1991. - Т. 59. - С. 129-137.

68. Trautwein-Schult A., Jankowska D., Cordes A. Arxula adeninivorans recombinant guanine deaminase and its application in the production of food with low purine content// Journal of molecular Microbiology and Biotechnology. -2014. - Т. 24. - С. 67-81.

69. Jankowska D.A., Trautwein-Schult A., Cordes A.. A novel enzymatic approach in the production of food with low purine content using Arxula adeninivorans endogenous and recombinant purine degradative enzymes // Bioengineered Taylor & Francis Group. - 2015. - Т. 6. -№1. - С. 31-36.

70. Yang X. X., Wartmann T., Stoltenburg R., Kunze G. Halotolerance of the yeast Arxula adeninivorans LS3 //Antonie van Leeuwenhoek. - 2000. - Т. 77. - №. 4. - С. 303-311.

71. Gonzalez-Hernandez J.C., Cardenas-Monroy C.A. and Pena A. Yeast . 2004. - Т.21 - С.403 - 412.

72. Prista C. et al. Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii //FEMS yeast research. - 2005. - Т. 5. - №. 8. - С. 693701.

73. Юрин В. М. Физиолого-биохимические закономерности функционирования иммобилизованных растительных клеток //Труды БГУ. -2012. - Т. 7. - №. 1. - С. 84-98.

74. Корочинский А.В., Верниковский В.В., Степанова Э.Ф. Исследование возможности создания иммобилизованных структур на базе пробиотиков //Успехи современного естествознания. - 2010. - № 5. - С. 3438.

75. Buenger D., Topuz F., Groll J. Hydrogels in sensing applications //Progress in Polymer Science. - 2012. - Т. 37. - №. 12. - С. 1678-1719.

76. Понаморева О. Н. Биосенсоры и биотопливные элементы на основе целых клеток микроорганизмов и выделенных из них ферментов.

Обзор //Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2009. - №. 1.

77. Topuz F., Okay O. Macroporous hydrogel beads of high toughness and superfast responsivity //Reactive and Functional Polymers. - 2009. - Т. 69. -№. 5. - С. 273-280.

78. Xu Y., Sheng K., Li C., Shi G. Self-assembled graphene hydrogel via a one-step hydrothermal process //ACS nano. - 2010. - Т. 4. - №. 7. - С. 43244330.

79. Nicodemus G. D., Bryant S. J. Cell encapsulation in biodegradable hydrogels for tissue engineering applications //Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2008. - Т. 14. - №. 2. - С. 149-165

80. Ganji F., Vasheghani-Farahani S., Vasheghani-Farahani E. Theoretical description of hydrogel swelling: a review //Iran Polym J. - 2010. - Т. 19. - №. 5. - С. 375-398.

81. Peppas N. A., Hilt J. Z., Khademhosseini A., Langer R. Hydrogels in biology and medicine: from molecular principles to bionanotechnology //Advanced Materials. - 2006. - Т. 18. - №. 11. - С. 1345-1360.

82. Deligkaris K., Tadele T. S., Olthuis W., van den Berg A. Hydrogel-based devices for biomedical applications //Sensors and Actuators B: Chemical. -2010. - Т. 147. - №. 2. - С. 765-774.

83. Wu X. J., Choi M. M., Chen C. S., Wu X. M. On-line monitoring of methanol in n-hexane by an organic-phase alcohol biosensor //Biosensors and Bioelectronics. - 2007. - Т. 22. - №. 7. - С. 1337-1344.

84. Jang E., Koh W. G. Multiplexed enzyme-based bioassay within microfluidic devices using shape-coded hydrogel microparticles //Sensors and Actuators B: Chemical. - 2010. - Т. 143. - №. 2. - С. 681-688.

85. Kwan R. C. H., Hon P. Y. T., Renneberg R. Amperometric determination of ammonium with bienzyme/poly (carbamoyl) sulfonate hydrogel-based biosensor //Sensors and Actuators B: Chemical. - 2005. - Т. 107. - №. 2. -С. 616-622.

86. Wang B., Zhang J., Cheng G., Dong S. Amperometric enzyme electrode for the determination of hydrogen peroxide based on sol-gel/hydrogel composite film //Analytica Chimica Acta. - 2000. - Т. 407. - №. 1. - С. 111-118.

87. Lei Y., Chen W., Mulchandani A. Microbial biosensors //Analytica chimica acta. - 2006. - Т. 568. - №. 1. - С. 200-210.

88. Fine T., Leskinen P., Isobe T., Shiraishi H., Morita M., Marks R. S., Virta M. Luminescent yeast cells entrapped in hydrogels for estrogenic endocrine disrupting chemical biodetection //Biosensors and Bioelectronics. - 2006. - Т. 21. - №. 12. - С. 2263-2269.

89. Martínez M., Hilding-Ohlsson A., Viale A. A., Cortón, E. Membrane entrapped Saccharomyces cerevisiae in a biosensor-like device as a generic rapid method to study cellular metabolism //Journal of biochemical and biophysical methods. - 2007. - Т. 70. - №. 3. - С. 455-464.

90. Köster M., Gliesche C. G., Wardenga R. Microbiosensors for measurement of microbially available dissolved organic carbon: sensor characteristics and preliminary environmental application //Applied and environmental microbiology. - 2006. - Т. 72. - №. 11. - С. 7063-7073.

91. Lee K. Y., Mooney D. J. Hydrogels for tissue engineering //Chemical reviews. - 2001. - Т. 101. - №. 7. - С. 1869-1880.

92. Маркизова Н.Ф., Гребенюк А.Н., Башарин В.А., Бонитенко Е.Ю. Спирты. СПб.: Фолиант, 2004. — 112 с.

93. Кобзев Е. Н., Петрикевич С. Б., Шкидченко А. Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытой системе //Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - Т. 37. - №. 4. - С. 413-417.

94. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

95. Lozinsky V. I., Plieva F. M. Poly (vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and

developments //Enzyme and microbial technology. - 1998. - Т. 23. - №. 3. - С. 227-242.

96. Szczesna-Antczak M., Antczak T., Bielecki S. Stability of extracellular proteinase productivity by Bacillus subtilis cells immobilized in PVA-cryogel //Enzyme and microbial technology. - 2004. - Т. 34. - №. 2. - С. 168-176.

97. Aleshina E. Y., Yudanova T. N., Skokova I. F. Production and properties of polyvinyl alcohol spinning solutions containing protease C and polyhexamethylene guanidine //Fibre Chemistry. - 2001. - Т. 33. - №. 6. - С. 421-423.

98. Chang C. C., Tseng S. K. Immobilization of Alcaligenes eutrophus using PVA crosslinked with sodium nitrate //Biotechnology Techniques. - 1998. -Т. 12. - №. 12. - С. 865-868.

99. Lu Y., Kong Q. M., Jing R., Hu X., Zhu P. X. et al. Solid state oxidation of polyvinyl alcohol by hydrogen peroxide-Cu (II) //Polymer degradation and stability. - 2013. - Т. 98. - №. 6. - С. 1103-1109.

100. Kanekiyo M., Kobayashi M., Ando I., Kurosu H., Ishii T., Amiya S. A structural and dynamic study of poly (vinyl alcohol) in the gel state by solidstate 13 C NMR and 1 H pulse NMR //Journal of molecular structure. - 1998. - Т. 447. - №. 1. - С. 49-59.

101. Биохимия : учеб. для вузов / [Т. Л. Алейникова, Л. В. Авдеева, Л. Е. Андрианова и др.]; под ред. Е. С. Северина. - 4-е изд., испр. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 779 с. : ил.

102. Золотов Ю.А., Дорохова Б.Н., Фадеева В.И. Основы аналитической химии Том 1 — M.: Высш. шк., 1996. — 383 c.

103. Карякин А. А., Уласова Е. А., Вагин М. Ю. Биосенсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики //Сенсор. -2002. - Т. 1. - С. 16-24.

104. Гармаш А. В., Сорокина Н. М. Метрологические основы аналитической химии //М.: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова. - 2005.

105. Асулян Л. Д., Камаева О. А., Арляпов В. А., Алферов В. А.. Получение стабильных рецепторных элементов на основе гидрогеля поливинилового спирта для создания БПК-биосенсора // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2016. - №. 1.

106. Pasternak G., Greenman J., Ieropoulos I. Self-powered, autonomous Biological Oxygen Demand biosensor for online water quality monitoring //Sensors and Actuators B: Chemical. -2017. - № 224 - С.815-822.

107. Bobade S., 107 Kalorey D. R., Warke S. Biosensor Devices: A review on their biological applications //Bioscience biotechnology research communications. - 2016. - Т. 9. - №. 1. - С. 132-137.

108. Niyomdecha S., Limbut W., Numnuam A., Asawatreratanakul P., Kanatharana P., Thavarungkul P. A novel BOD biosensor based on entrapped activated sludge in a porous chitosan-albumin cryogel incorporated with graphene and methylene blue //Sensors and Actuators B: Chemical. - 2017. - Т. 241. - С. 473-481.

109. Бузолёва Л.С., Кривошеева А.М. Влияние тяжёлых металлов на размножение патогенных бактерий // Успехи современного естествознания. -2013. - № 7. - С. 30-33.

110. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Appl.Microbiol. Biotechnol. - 1999. - №. 51. - С. 730-750.

111. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М. Физиологические основы устойчивости растений к тяжелым металлам //Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. - 2011.

112. Heddam S., Lamda H., Filali S. Predicting effluent biochemical oxygen demand in a wastewater treatment plant using generalized regression neural network based approach: a comparative study //Environmental Processes. -2016. - Т. 3. - №. 1. - С. 153-165.