Биология микромицетов рода Eremothecium - продуцентов эфирного масла и рибофлавина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Шпичка, Анастасия Иосифовна

• Шпичка, Анастасия Иосифовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Шпичка, Анастасия Иосифовна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВИДЫ РОДА ЕЯЕМОТНЕСШМ: ХАРАКТЕРИСТИКА И 11 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

1.1. Характеристика видов рода ЕгетоЖесшт

1.1.1. Таксономическое положение

1.1.2. Морфологическое описание

1.1.3. Эколого-физиологические особенности

1.1.4. Химический состав метаболитов

1.2. Перспективы практического использования биологически 24 активных соединений

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Поддержание рабочей коллекции

2.3. Методы исследования

2.4. Условия проведения опытов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ

ОНТОГЕНЕЗА У ВИДОВ Е. А8НВУ1 СШЫЛЕ1ШОга 1935 И Е. G0S5FP//KURTZMAN

3.1. Жизненные циклы и возрастные изменения

3.2. Динамика роста и развития в культуре

3.3. Оценка биологической активности

4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ 54 ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

4.1. Компоненты питательной среды

4.2. Физико-химические факторы

4.3. Условия подготовки инокулята

5. СОЗДАНИЕ НОВЫХ ФОРМ С КОМПЛЕКСОМ ПОЛЕЗНЫХ 71 СВОЙСТВ И ПРИЗНАКОВ

5.1. Скрининг перспективных источников эфирномасличного сырья

5.2. Разработка методики отбора высокоактивных вариантов по 84 комплексу биологически активных соединений

5.3. Получение и характеристика штамма Е. а$кЪу{ 810-88Ь-Ш

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А. Микроорганизмы - продуценты рибофлавина. Приложение Б. Ароматобразующие микроорганизмы.

Приложение В. - Сравнительная характеристика компонентов розового и эремотецевого масел.

Приложение Г. Лабораторный регламент биотехнологии эремотецевого масла (проект).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОС - ароматообразующие соединения;

АТФ - аденозинтрифосфат;

БАД - биологически активная добавка к пище;

БАС - биологически активные соединения;

БТС - биотехнологическое сырье;

ГТФ - гуанозинтрифосфат;

КЖ - культуральная жидкость;

МТС - монотерпеновые спирты;

ФАД - флавинадениндинуклеотид;

ФМН - флавиномононуклеотид;

ФЭС - (З-фенилэтиловый спирт ({3-фенилэтанол).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биология микромицетов рода Eremothecium - продуцентов эфирного масла и рибофлавина»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. На протяжении длительного времени традиционным источником летучих душистых веществ были эфирные масла, получаемые из растений. Однако трудности плантационного культивирования эфироносов и недостаток сырья существенно лимитируют развитие парфюмерно-косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. Кроме того, качество таких эфирных масел может сильно варьировать в зависимости от ряда условий, сложно поддающихся контролированию.

В связи с этим представляется особенно важным поиск альтернативных источников получения летучих душистых веществ с применением биотехнологических подходов (Krings, Berger, 1998; Bicas et al., 2010). В частности, ранее показана возможность применения микроорганизмов, способных продуцировать соединения с различными направлениями запаха путем как их синтеза de novo, так и биоконверсии дополнительно введенных в питательную среду предшественников ароматообразующих веществ (Soetaert, Vandamme, 2010). Так, за рубежом внедрены в производство способы получения 4-декалактона с персиковым запахом (BASF), макроциклических компонентов мускуса (Nippon MiningCo., Quest International), ванилина (Evolva) и других ароматизаторов (Janssens et al., 1992; Bomgardner, 2012).

Биотехнология розового эфирного масла, одного из ценнейших масел в мире, до сих пор не разработана. Было выявлено, что количество синтезированного масла в клеточной культуре розы на порядок ниже, чем в лепестках интактного растения. При этом состав экстрагируемых масел отличался от розового масла, полученного из растения (Егорова, Ставцева, 2006). В 90-е годы прошлого века была показана возможность получения ароматического продукта на основе штаммов Eremothecium ashbyi Guilliermond 1935 и Е. gossypii Kurtzman 1995, сходного по составу с эфирным маслом из свежих цветков розы (Бугорский, Семенова, Родов, 1990;

Бугорский, Семенова, 1991). Поэтому актуальна разработка биотехнологии эфирного масла на основе микромицетов рода Егето^есшт.

Цель работы - исследовать биологические аспекты технологии получения ароматических продуктов при глубинном культивировании штаммов ЕгетоЛесшт.

Задачи исследования:

• выявить особенности онтогенеза видов ЕгетоЛесшт',

• исследовать влияние посевного материала, физико-химических параметров ферментации и компонентов питательных сред на продуктивность изучаемых культур;

• изучить состав вторичных метаболитов и закономерности их накопления в зависимости от условий ферментации;

• усовершенствовать методические аспекты отбора высокоактивных вариантов с определенным содержанием значимых компонентов в смеси биологически активных соединений;

• разработать проект лабораторного регламента биотехнологии эремотецевого масла.

Научная новизна. Впервые обобщены сведения по видам рода ЕгетоЖесшт, способных синтезировать летучие душистые вещества. Получены новые данные о состоянии и характере развития микроморфологических структур, накапливающих эфирное масло и рибофлавин. Изучено влияние компонентов питательной среды, физико-химических условий, состояния инокулята на продуктивность глубинной культуры и состав синтезируемого эфирного масла. Впервые осуществлен скрининг ароматообразующей способности рабочей коллекции штаммов Е. аяИЬуг ОшШегтопс! 1935 и Е. gossypii КиЛгтап 1995, и выявлены перспективные культуры для селекции производственных штаммов. Показаны антимикробные свойства масла, синтезируемого микроорганизмами. Предложены методические подходы отбора

высокоактивных вариантов и штаммов, синтезирующих комплекс биологически активных соединений.

Практическая значимость работы. На основе комплексной оценки выявлены лучшие штаммы и определены биотехнологические параметры их культивирования, которые рекомендованы для внедрения в производство. Усовершенствованные методические подходы для отбора вариантов и (или) штаммов с заданным составом целевого продукта осуществляются в селекции продуцентов эфирных масел. Разработан проект лабораторного регламента биотехнологии эремотецевого масла. Результаты исследования используются в научно-исследовательских работах и в учебных курсах Пензенского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Уровень накопления рибофлавина и эфирного масла в культуре ЕгетоШесшт связан с формированием некоторых клеточных структур в онтогенезе.

2. Компоненты питательной среды, физико-химические условия, состояние инокулята существенно влияют на качественный и количественный состав биологически активных соединений, синтезируемых Е. аякЬуг ОшШегтопс! 1935 и Е. gossypii КиЛгтап 1995.

3. При отборе высокоактивных вариантов и селекции штаммов с измененным компонентным составом вторичных метаболитов целесообразно использование предлагаемых методических подходов, заключающихся в анализе соотношений главных компонентов целевого продукта.

Апробация работы. Основные положения, выводы и предложения диссертационного исследования прошли многократную апробацию на XXI и XXII Внутривузовских научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава и студентов ПГУ (Пенза, 2010; 2011); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции,

инновации, приоритеты» (Самара, 2011); I и II Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2011; 2012 - дипломы I степени); IV Международном студенческом научном форуме (Москва, 2012); Международной молодежной научной школе «Современные биоинженерные и ядерно-физические технологии в медицине» (Саратов, 2012 - Гран-При); II и III Международных научно-практических конференций «Современные проблемы медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2012; 2013 - дипломы I степени); VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013); Международной научно-практической Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013); 77-й итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения профессора П. Г. Макарова и 90-летию со дня рождения доцента Б. М. Зельмановича (Красноярск, 2013); VII Всероссийской (81-й Итоговой) студенческой научной конференции, посвященной 90-летию СНО СамГМУ «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты» (Самара, 2013 - диплом за лучший доклад); V Республиканской научно-практической конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Проблемы и перспективы развития современной медицины» (Беларусь, Гомель, 2013); II Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования» (Пенза, 2013); III Международной научно-практической конференции «Аромакоррекция психофизического состояния человека» (Украина, Ялта, 2013).

Полученные данные легли в основу инновационных разработок по получению ароматического продукта с запахом розы на основе биотехнологического сырья и комплексной технологии получения рибофлавина и эфирного масла, которые были представлены на конкурсе

«У.М.Н.И.К.» (2012), III Межрегиональном форуме «1№ЮМЕЭ-2013», Образовательно-промышленном форуме «Инновационное образование -локомотив технологического прорыва России», XI ярмарке «Российским инновациям - Российский капитал» (Нижний Новгород, 2013) и многочисленных региональных выставках.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой и областями исследований специальности 03.01.06 «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)» в данном диссертационном исследовании отражены некоторые биотехнологические аспекты селекционных исследований в прикладной микробиологии; оптимизации процессов биосинтеза; изучения и разработки технологических режимов выращивания микроорганизмов-продуцентов для получения продуктов метаболизма, направленного биосинтеза биологически активных соединений и других продуктов, изучения их состава.

Личный вклад автора. Проведение опытов, анализ литературных, экспериментальных данных и оформление полученных результатов осуществлен автором самостоятельно, в соответствии с планом, согласованным с научным руководителем. ГЖХ-анализ образцов ароматических продуктов выполнен совместно с Даниловой И.Л., с.н.с. ИЭЛК и ИСХК. Вклад автора в подготовке и написании совместных публикаций составляет 50-90%.

Связь с тематическими планами НИР. Диссертационные исследования проведены в рамках задания по теме «Фармакогностические и технологические аспекты изучения новых источников лекарственного сырья растительного и микробного происхождения, лекарственных форм и препаратов на его основе» (№ госрегистрации 01201062254), Гранта Министерства образования и науки РФ 4.4052.2011 «Фарммикробиологические и биотехнологические аспекты получения эфирного масла и рибофлавина на основе культуры ЕгетоЖесшт».

Публикация результатов исследования. На основе полученных результатов было подготовлено и опубликовано 27 научных публикаций, в том числе 6 статей в журналах перечня ВАК и 4 - в международных журналах на английском языке.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 163 страницах компьютерного текста, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений, включает 22 таблиц, 36 рисунков, 4 приложения. Список использованной литературы состоит из 167 источников, в том числе 124 - иностранных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. ВИДЫ РОДА EREMOTHECIUM: ХАРАКТЕРИСТИКА И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ

1.1. Характеристика видов рода Eremothecium

1.1.1. Таксономическое положение

Согласно современной классификации род Eremothecium включает в себя 5 видов и относится к семейству Eremotheciaceae, классу Hemiascomycetes {Saccharomycetes) (Kurtzman, Fell, 1998): Царство: Fungi Отдел: Ascomycota

Класс: Hemiascomycetes (Saccharomycetes) Порядок: Saccharomycetales Семейство: Eremotheciaceae Род: Eremothecium Виды:

E. cymbalariae Borzi (1888)

E. ashbyi (syn. Crebrothecium ashbyi, Spermophthora gossypii) (Guilliermond ex Routien) Guilliermond (1935)

E. coryli (syn. Nematospora coryli, Nematospora nagpuri) (Peglion) Kurtzman (1995)

E. gossypii (syn. Ashbya gossypii, Nematospora gossypii) (Ashby and No well) Kurtzman (1995)

E. sinecaudum (syn. Holleya sinecauda, Nematospora sinecauda) (Holley) Kurtzman (1995). Данная классификация основана на результатах С. P. Kurtzman'а по анализу рибосомальной ДНК видов, тесно связанных между собой родов Ashbya, Eremothecium, Holleya, Nematospora. Было отмечено незначительное расхождение в нуклеотидной последовательности, которое позволило

объединить их в один род ЕгетоЖесшт нового семейства Егвт(Якее¡асеае и доказать их монофилетичность (КиЛгтап, 1995).

1TSI-5.8S-1TS2

У

ж

-у/

1?

— I- A pu¡,угрягк* MMil

| Lw™. Д* laA-inw

У -_ ir«, фЬтл SUHM

~sf Щ ы.-Г.* /гыят^е тчвв

Lp- JW jfttwв«* Т»2'2вО

4 1- iw AJbrM^Aíi ZS2'2»0

-/ 2r5t'2E?

■ f r«n 224-1S4

■/ ».,&» 2Я1/206 -■-/ bm!» 3S3.W

«' ! 1-^ bf«« геялгег

А (дата,-V ^íJFWWtt* \ jwa^i« 3« 1,-J4«

i ч /4<№uui звжда« ' \ *.W<J> зав.чм Ч ^¿i 'J» I.í ! (i 36 1/Í J4

v ч^г.asea« •i

- « MW» «?•?»)

К»««» ¿(-.К-ли M«3S A alW.n*. «Ai. 2SH<2»4 A ÍM»t*l/»r.44r» 2ЯЭТСЗ ■ i. latliMu "¿2тщ h tr'l~¿ü~ К wnfdwf 2S3-14S

f- ^ '!<4<.vi'-

'-A. /vt» мг 562.11»

A *.-tfi/.'o< Z3?.'Ü<2

* zwhw

>4 iatihikwut 31M1M >4 o «u»«»* JJ4.VS0

«nM,» asrfjss

Аи/йда 216/2-13 - i. hilit/tf 177>21»

-/ « - A 1НИГ0

ГТ1&-* r »i»,«,^,»« гве.ют

I- , arb.^rJ* зев 71J

' / 'ri. wi.r, ,, ii* 1Í1Ü'

v íw«í,-f.'M ire-iíí - <í rfe«*,-«»^ >0>r»4

cz

w*'/ n*i aitait

etfv / /,>rw<H.'j4 212'ÍHI

У л-fn > ZS4'-¿2*3.

í 1___I— J

—I »»Л Jb

■ A /W-'-J-rjíf 2i№"2»

• A 1«.'ÍIÍ J»1t0

V ttuj/wn tfi'HS »*— * *•>«»«.»

IHH 1 *— A. «■■-"!/. riIK Ib'vft *

r- A ví '

I a Д»*» »«.W

' ' A »un»«

- A JMtinuniu 41№Ж48

- f t¡mnWm 7tr.11 i

-i, JOS'JI»

- *

У. ..('fii'í 2QÍYÍ 14 „ Ví^.^ü^ti'f.JM 51M1S «r H iviV»>n 2MS.41»

¡ L. A<// fcibn 1MS1S

I,....._ м ........* ,

50

]

/ / r— if Hfd

A rtBCÍÍ,"f*

S . •* i *• !l mm

j jf^^ww«—

it m\»r«i<>«»»'i}14

it «я» гвггэ1 ít J» 4*vm

>! r—— >i

- » wl (нфщкш

-37V1S3

Рис. 1.1. Анализ монофилетичности видов «комплекса БассИаготусез» по фрагменту 1Т81-5.88-1Т82. Ветви с прерванной линией показывают, что смежные таксоны отличаются друг от друга длиной фрагмента или внутренняя таксономическая однородность сомнительна, и, таким образом,филогенетические позиции таксона не определены (КиЛгшап, КоЬпе«, 2003).

Предпосылками для проведения данного анализа С.P. Kurtzman'om (1995) являлись предположения L.R. Batra (1973) и J.A. von Агх'а (1977) о конгенеричности представителей этих родов, основанные на их фенотипической схожести, хотя ранее по выявленным морфологическим и физиолого-биохимическим видовым особенностям L.R. Batra выделил рода Eremothecium, Ashbya, Nematospora семейства Nematosporaceae, порядка Ascoideales, подкласса Hemiascomycetidae, класса Hemiascomycetes (Batra, 1973; von Arx et al., 1977).

В последних исследованиях была подтверждена целесообразность их объединения в один род и семейство при проведении филогенетического анализа дивергенции генов рДНК (18S, 26S, внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS), генов ядра (фактора элонгации 1а, актин-1, РНК-полимеразы И, пируваткиназы), митохондриальных кодирующих генов (рДНК малой субъединицы, цитохромоксидазы II), генов рРНК и полном сравнении геномов отдельных видов (Kurtzman, Robnett, 2003; Prillinger et al., 1997; Sudeshna S., Chandra T.S., 2011; Wendland, Walther, 2011).

1.1.2. Морфологические описания

Как было упомянуто выше, несмотря на фенотипическую схожесть видов рода Eremothecium, каждый вид имеет свои культурально-морфологические особенности, которые являются дифференциальными при их идентификации, проведении макро- и микроскопического исследований. Ниже приводится совокупность макро- и микроморфологических признаков, характерных для каждого отдельного вида.

Е. ashbyi Guiliiermond 1935 при культивировании на агаризованной среде, содержащей 4% солодового и 0,5% дрожжевого экстрактов, при температуре 20-22°С образует бледные колонии диаметром 5 мм, постепенно приобретающие локально ярко-желтую окраску вследствии экскреции рибофлавина. Колонии сухие с четким дольчатым краем, гладкие, позже на

поверхности образуются радиальные борозды. Гифы имеют дихотомическое ветвление, шириной 2-6 мкм, септированные. В клетках содержатся желтые игольчатые кристаллы. Конидии формируются редко. Сумки имеют эллипсоидальную или веретеновидную форму (10-18 мкм х 50-110 мкм), образуются интеркалярно в длинных цепочках. В аске содержатся 8-16 спор, высвобождающиеся после автолиза сумки при старении. Аскспоры равномерно распределены в спорангии, гиалиновые, тонкие, серповидные, закругленные с одного конца и заостренные с другого (рис. 1.2 - слева). Споры имеют следующие размеры: 2-3,5х 20-30 мкм. На агаре с дрожжевым экстрактом споруляция отмечалась на 5-7 день при температуре 25°С (Гарибова, Лекомцева, 2005; Полщук, Маланюк, Дуган, 2011; Krneta-Jordi, 1962).

Е. gossypii Kurtzman 1995 формирует бледные, позднее желтеющие колонии диаметром 20 мм при культивировании на агаре с 4% солодового и 0,5% дрожжевого экстрактов. Колонии гладкие, мелкохлопьевидные, влажные, морщинистые в центре, с четким дольчатым краем. Гифы дихотомически ветвятся, шириной 2-6 мкм. В некоторых клетках содержатся игольчатые кристаллы рибофлавина. Эллипсоидальные бластоконидии (2,2-3x4,5-7 мкм) формируются латерально, одиночно или в коротких цепочках. Сумки имеют от булавовидной до веретеновидной формы (10-20x60-200 мкм), интеркалярные, в длинных цепочках. В асках содержатся 12-32 споры, высвобождающиеся при разрыве сумки. Аскоспоры гиалиновые, имеют игольчатую или веретеновидную форму, двухклеточные за счет образования центральной перегородки (рис. 1.2 - справа). Споры (2-3,5x25-35 мкм) имеют терминальный, нитевидный отросток, который может достигать длины до 100 мкм. Отростки слизистые, обусловливающие группирование аскоспор. Спорообразование отмечается через 7 дней культивирования при температуре 25°С (Pridham, Râper, 1950; Batra, 1973; Kurtzman, Fell, 1998; Langet al., 2009).

//

уи

м/

у /

/л?

Рис. 1.2. Аск со зрелыми аскоспорами, аскоспоры: слева - E.ashbyi Guilliermond 1935; справа - Е. gossypii Kurtzman 1995 (Kurtzman, Fell, 1998).

E. coryli Kurtzman 1995 на твердой агаризованной среде, содержащей 10% солодового экстракта, при посеве штрихом образует светло-кремовые немного выпуклые гладкие, вязкие или пленчатые колонии часто с бахромчатым краем и с сильно морщинистой или иногда со слабо складчатой поверхностью при культивировании в течение 1 месяца при температуре 25°С. При микрокопировании трехдневной культуры со среды, содержащей 5% солодового экстракта, наблюдаются яйцевидные, вытянутые, шаровидные и, как правило, полиморфные клетки. Соотношение между разными видами форм клеток изменяется в зависимости от штамма. Размер яйцевидных и сфероидальных клеток варьирует и составляет 1,7-13,9x4,2-14,0 мкм. На среде с кукурузным экстрактом образуются истинные септированные гифы и псевдогифы; артроконидии не формируются; яйцевидные или цилиндрические бластоконидии часто расположены в коротких цепочках в виде мутовки. Аски представляют собой длинные, изогнутые цилиндрические клетки с закругленными концами или имеют иногда неправильную форму (рис. 1.3 - слева). В сумке обычно образуется 8, реже 2-4 и 12-16 аскоспор. При созревании аск разрывается, освобождая веретенообразные споры с длинным, тонким, плетевидным отростком с одного конца. Споруляция отмечается на 2-5 сутки при культивировании на

дрожжево-солодовом агаре при температуре 25°С (Batra, 1973; Kurtzman, Fell, 1998; Leeuw et al., 2006).

\\

Рис. 1.3. Аск со зрелыми аскоспорами, аскоспоры: слева - Е. coryli Kurtzman 1995; справа - Е. cymbalariae Borzi 1888 (Kurtzman, Fell, 1998).

E. cymbalariae Borzi 1888 при культивировании в течение 10 суток при температуре 20-22°С на поверхности агара с 4% солодовым экстрактом или 0,5% дрожжевым экстрактом формирует сухие гладкие колонии, становящиеся хлопьевидными в центре, с отчетливым дольчатым краем диаметром 20 мм желтовато-коричневого цвета, причем позднее пигмент может диффундировать в среду. Гифы несептированные, хрупкие, 2,0-4,0 мкм шириной. Почкующиеся клетки отсутствуют. Аски образуются на концах гиф, часто без четкой базальной септы, терминально вытянутой лимоноподобной формы, размером 12,0-14,0x30,0-65,0 мкм, включая заостренный конец (рис. 1.3 - справа). В аске формируется 8-16 аскоспор в двух противоположных группах с расположенным кнаружи игольчатым концом, высвобождающиеся при его созревании и слипающиеся друг с другом в ромбоидальные конгломераты. Споры имеют треугольную форму с игловидным концом и более широкой частью перед другим и размеры 2x13-16 мкм. Споруляция отмечается на 3 сутки культивирования на дрожжево-солодовом агаре при температуре 20-25°С (Kurtzman, Fell, 1998; Leeuw et al., 2007).

Рис. 1.4. Освобождение аскоспор из разорванного аска, аскоспоры Е. sinecaudum Kurtzman 1995 (Kurtzman, Fell, 1998).

E. sinecaudum Kurtzman 1995 на дрожжево-солодовом агаре при посеве штрихом образует слегка глянцевые плоские кремовые колонии со слабо морщинистой поверхностью, вязкой текстурой, сплошным или немного волнистым краем при культивировании в течение 14 суток при 30°С. На 3 сутки наблюдаются шаровидные, яйцевидные, цилиндрические клетки, расположенные одиночно, в парах или коротких цепочках; псевдогифы образуются на более поздних сроках. В дрожжево-солодовом бульоне на 10 сутки наблюдается осадок, не формируются кольцо или тонкая пленка. Большинство клеток цилиндрические, но встречаются шаровидные, яйцевидые, эллипсоидальные или булавовидные, редко с терминальной выпуклостью. При культивировании на среде с кукурузным экстрактом в течение 9 суток при температуре 30°С формируются плотные псевдогифы с удлиненными до коротких цилиндрическими бластоконидиями. Аски развиваются из увеличенных клеток неправильной формы, которые содержат две связки или грозди из 4 аскоспор (рис. 1.4). Споры игольчатые или иглообразные, которые лежат тупым концом к полюсам аска. Аски имеют размеры 8,0x20,0 мкм, аскоспоры - 1,3-2,5x8,0-14,0 мкм. Отдельные споры имеют гладкую поверхность на тупом конце, выпуклое экваториальное пластинчатое кольцо, концентрические гребни на поверхности половины,

заканчивающейся отростком (Kurtzman, Fell, 1998; Nadal, García-Pedrajas, Gold, 2008).

Таким образом, отличительными морфологическими признаками для видовой идентификации являются форма и размеры спор. Так, Е. ashbyi Guilliermond 1935 имеет заметно изогнутые, серповидные аскоспоры, Е. gossypii Kurtzman 1995 - прямые игловидные длиной более 20 мкм, Е. coryli Kurtzman 1995 - прямые с длинным хлыстовидным отростком, Е. cymbalariae Borzí 1888 - тонкие прямые трехгранные с иглоподобным концом, Е. sinecaudum Kurtzman 1995 - прямые игловидные длиной около 10 мкм.

1.1.3. Эколого-физиологические особенности

Как известно, виды рода Eremothecium являются фитопатогенами, причем инфицирование ими растений осуществляется путем прокола тканей насекомыми. Е. ashbyi Guilliermond 1935, Е. cymbalariae Borzí 1888 и Е. gossypii Kurtzman 1995 поражают виды хлопчатника и цитруса (Билай, 1988; Batra, 1973), но выявлены случаи заражения Е. ashbyi Guilliermond 1935 сои (Kimura, Tokumaru, Kuge, 2008). E. coryli Kurtzman 1995 распространен в тропических и субтропических регионах и вызывает заболевания также у видов хлопчатника и цитруса и, кроме того, лесного ореха, сои, томата (Kurtzman, Fell, 1998; Medranoet al., 2009). E. sinecaudum Kurtzman 1995 поражает семена горчицы (Nadal, García-Pedrajas, Gold, 2008).

Представители рода Eremothecium являются аэробами (Fraile, Zurita, 1967; Ozbas, Kutsal, 1992) и способны к росту в широком диапазоне температур 20...37°С, а Е. coryli Kurtzman 1995 также растут при температуре 40°С (Kapralek, 1962; Krneta-Jordi, 1962; Kurtzman, Fell, 1998).

Что касается физиолого-биохимических свойств, то согласно литературным данным по использованию единственных источников углерода межвидовое дифференциальное значение имеет утилизация

раффинозы, цитрата и растворимого крахмала (табл. 1.1) (Batra, 1973; Kurtzman, Fell, 1998).

Таблица 1.1

Сравнительная характеристика использования единственных источников

углерода (по Kurtzman'y, Fell, 1998)

Вид Раффиноза Растворимый крахмал Цитрат

Е. ashbyii + - v

Е. coryli + v -

Е. cymbalariae + v -

Е. gossypii + - w

Е. sinecaudum - + -

Примечание: «+» - положительная; «-» - отрицательная; «v» - вариабельная; «w» - слабая.

Как известно, аскомицеты Е. gossypii Kurtzman 1995 и Е. ashbyi Guilliermond 1935 способны к сверхсинтезу витамина В2, обусловливающего постепенную желтую пигментацию колоний и диффундирующего в среду на более поздних стадиях роста и развития (Миронов, Цибульская, 1971; Галынкин и др., 2003; Foerster, Revuelta, Kraemer, 2001).

В ранее проведенных исследованиях по изучению влияния компонентов питательных сред максимальные уровни биомассы и продукции рибофлавина Е. gossypii Kurtzman 1995 и Е. ashbyi Guilliermond 1935 наблюдались на средах, содержащих как глюкозу, так и подсолнечное масло в качестве субстратов. Более высокая продукция рибофлавина была отмечена у Е. ashbyi Guilliermond 1935 на среде, имеющей в составе молочную сыворотку, по сравнению с глюкозной средой. Более низкие показатели достигались у Е. gossypii Kurtzman 1995 при одинаковых экспериментальных условиях. Это возможно обусловлено тем, что сыворотка, в основном, состоит из лактозы и уровень ассимиляции дисахарида Е. gossypii Kurtzman

1995 ниже, чем глюкозы (Ozbas, Kutsal, 1986; Ertrk, Erkmen, Oener, 1998; Pujari, Chandra, 2000).

Влияние ионов K+ и Na+ на синтез рибофлавина были изучены в специальных опытах с использованием разных по составу сред, но с одинаковым начальным значением pH. Добавление в среду ионов К+, в отличие от варианта с добавлением Na+, стимулирует продуктивность микромицета, кроме синтеза рибофлавина. При этом не только количество, но и соотношение ионов влияет на продуктивность культуры (Бугорский, Семенова, Родов, 1990; Kolonne, Seviour, MacDougall, 1994; Foerster et al., 1998). Кроме того, было показано, что повышение концентрации фосфатов в питательной среде с 0,0015 мМ до 150 мМ увеличивало рост продуцента до 70%, но снижало накопление флавинов в бульоне до 60%. Однако, в это же самое время величина общей концентрации продуцированных флавинов во время роста (специфические флавины) снизилась до 80%. Причем следует отметить, что соотношение рибофлавина к ФМН уменьшилось в 7 раз. Ингибирование синтеза рибофлавина может быть связано с ингибированием повышенной концентрацией фосфатов гуанозинтрифосфат-циклогидролазы, которая катализирует первый этап биосинтеза рибофлавина (Mehta, Modi, 1981). Примечательно, что время конверсии субстрата в рибофлавин в мицелии может быть продлено с целью улучшения продукции рибофлавина. Это может быть достигнуто при добавлении минеральной поддержки (AID PLUS ML-50D, Niigata, Japan). В культуре без нее наблюдались единичные гифы при 108 часах. Этот мицелий был автолизован или пустым внутри. При 120 часах культивирования без минеральной поддержки не наблюдалось ни мицелия, ни интрацеллюлярного рибофлавина. Единственной возможной причиной этого различия может быть электронный заряд минеральной поддержки. В ее присутствии мицелий возможно более стабилен, и продукция рибофлавина может быть продлена (Sung et al., 2003).

Кроме того, при добавлении тиамина в глюкозную питательную среду в культуре Е. gossypii Kurtzman 1995 отмечается высокий уровень синтеза

рибофлавина. Добавление тиамина, инозитола и биотина в среды с глюкозой или молочной сывороткой увеличивает уровень специфического роста до 34% и 97%, соответственно, при этом скорость роста и продукции рибофлавина, напротив, снижаются на средах, содержащих факторы роста и подсолнечное масло (Ozbas, Kutsal, 1991).

Таким образом, для фитопатогенных аэробных микромицетов рода Eremothecium, растущих в широком диапазоне температур, межвидовое дифференциальное значение имеет утилизация раффинозы, цитрата и растворимого крахмала как единственных источников углерода. Также Е. gossypii Kurtzman 1995 и Е. ashbyi Guiliiermond 1935 способны к сверхсинтезу витамина В2, который может быть стимулирован добавлением специфических для каждого отдельного вида компонентов питательных сред.

1.1.4. Химический состав метаболитов

Химический состав видов рода Eremothecium весьма разнообразен и включает как первичные, так вторичные метаболиты, являющиеся ценными БАС.

В исследованиях Погорельской А.Н. и др. (2001) было отмечено, что содержание аминокислот увеличилось более чем в 2 раза при глубинном культивировании Е. ashbyi Guiliiermond 1935 в ферментационной среде на основе клеточного сока розы (табл. 1.2).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шпичка, Анастасия Иосифовна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Билай В.И. Справочник. Микроорганизмы - возбудители болезней растений. - Киев: Наукова думка, 1988. - 550 с.

2. Биотехнологические методы в помощь создания рентабельного эфирномасличного производства с наиболее полной утилизацией отходов / А.Н. Погорельская, Е.Ф. Семенова, П.С. Бугорский, Е.С. Кочетков // Сборник трудов «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты». Выпуск 5. - М.: РАЕН-МААНОИ, 2001 - С. 239-247.

3. Бугорский, П.С. Влияние ионов водорода, калия и натрия на продуктивность гриба Eremothecium ashbyi / П.С. Бугорский, Е.Ф. Семенова, B.C. Родов // Микробиологический журнал. -1990. - Т. 52, № 3. - С. 44-47.

4. Бугорский, П.С. Душистые вещества мицелиального гриба Ashbya gossypii / П.С. Бугорский, Е.Ф. Семенова // Химия природных соединений. - 1991. - № 3. - С. 428.

5. Бугорский, П.С. Состав эфирного масла мицелиального гриба Eremothecium ashbyi / П.С. Бугорский, B.C. Родов, A.M. Носов // Химия природных соединений. - 1986. - №6. — С. 790791.

6. Войткевич, С. А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии. - М.: Пищевая промышленность, 1999. - 284 с.

7. Гарибова, Л.В. Основы микологии. Морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов / Гарибова Л.В., Лекомцева С.Н. // - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2005. - С. 74-75.

8. ГОСТ 31791-2012 РФ. Продукция и сырье эфиромасличное, травянистое и цветочное. Технические условия. - Введ. 2014-0101. - М.: Стандартинформ, 2013 - 24 с.

9. Государственная фармакопея Российской Федерации / «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008.- 704 с.

10. Гуринович, JI.K. Эфирные масла: химия, технология, анализ и применение / JI.K. Гуринович, Т.В. Пучкова. - М.: Школа Косметических Химиков, 2005. - 192 с.

11. ДСТУ 4652:2006. Ол1я еф1рна трояндова. - Введ. 2008-0101. - 13 с.

12. Егорова, H.A. Некоторые итоги и перспективы биотехнологических исследований эфиромасличных растений / Н.А.Егорова, И.В. Ставцева // Эфиромасличные растения и лекарственные растения. Научные труды Института эфиромасличных и лекарственных растений Украинской академии аграрных наук. - 2006. - Выпуск 26. - С. 19-26.

13. Жизнь растений. В 6-ти т. Гл. ред. А. А. Федоров. Т. 2. Грибы. Под. ред. М. В. Горленко. М.: "Просвещение", 1976. -479 с.

14. Иваненко, Е.Ф. Биохимия витаминов / Иваненко Е.Ф. - К.: Вища школа, 1970. - 210 с.

15. Концепция развития эфиромасличной отрасли Крыма / Шляпников В.А., Афонин A.B., Пехова O.A., Сучкова В.М. // Эфиромасличные и лекарственные растения / Научные труды Института эфиромасличных и лекарственных растений УААН, 2006. - Вып. 26. - С. 12-18.

16. Красильников, А.П. Микробиологический словарь-справочник / А.П. Красильников, Т.Р. Романовская. - Минск: Асар, 1999. - 400 с.

17. Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / Кулинский В.И. // Соросовский образовательный журнал. -1999. - №1. - С. 1-7.

18. Куркин, В.А. Фармакогнозия. 2-е изд., перераб. и доп. /

B.А. Куркин. - Самара: ООО «Офорт»: ГОУ ВПО «СамГМУРосздрава», 2007. - 1239 с.

19. Микроскопическая техника: Руководство / Под. ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.

20. Миронов, В.А. Взаимосвязь процессов биосинтеза флавинов и стеринов у Eremothecium ashbyi / В.А. Миронов, М.И. Цибульская // Прикл. биохимия и микробиология. - 1971. - Т. 7, №5. - С. 604-605.

21. Миронов, В.А. Образование монотерпенов аскомицетом Eremothecium ashbyi / В.А. Миронов, М.И. Цибульская // Прикл. биохимия и микробиология. - 1982. - Т. 18, №3. - С. 343-345.

22. Наглядная биохимия / Кольман Я., Рем К.Г.; пер. с нем. 3-е изд. - М.: Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 469 с.

23. О биосинтезе компонентов эфирного масла грибом Eremothecium ashbyi (структурно-функциональные особенности) / А.Н. Погорельская, П.С. Бугорский, Е.Ф. Семенова, Н.П. Бузулукова, Е.И. Горнунг // Вестник Российской академии с.-х. наук. - 2003. - № 1. - С. 83 - 85.

24. Оптимальные условия для прорастания спор гриба Eremothecium ashbyi, продуцента рибофлавина / Л.А. Минеева,

C.М. Розенфельд, А.И. Степанов, В.Г. Жданов // Прикл. биохимия и микробиология.- 1973. - Т. 9, №2.- С. 219-223.

25. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - 800 с.

26. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. - М.: Мир, 1999. - 791 с.

27. ОСТ 10-60-87. Масло эфирное розовое. - 7 с.

28. Платонов, А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов. - М.: Из-во РАМН, 2000. - 52 с.

29. Пол1щук, В.Ю. Морфолого-культуральни бюсинтетичш властивост1 Eremothecium ashbyi Guill. / В.Ю. Штщук, M.I. Маланюк, О.М. Дуган // Науков1 BicTi НТУУ "КПГ. - 2011. - № 3. - С. 74-75.

30. Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Нетрусова. -М.: ИЦ «Академия», 2005. - 608 с.

31. Промышленная микология / В.А. Галынкин, H.A. Заикина, И.В. Миндукшев, H.A. Юрлова. - СПб.: Изд-во СПХФА, 2003.-220с.

32. Сассон, А. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон. - М.: Мир, 1987. - 411 с.

33. Саттон, Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов / Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди - М.: Мир, 2001. - 486 с.

34. Семенова, Е.Ф. Биосинтетическая активность и антимикробные свойства Eremothecium ashbyi Guill. / Е.Ф. Семенова // Известия вузов. Поволжский регион. Серия «Медицинские науки». - 2007. - № 4. - С. 44 - 50.

35. Семенова, Е.Ф. Некоторые результаты биотехнологии ароматических продуктов / Е.Ф. Семенова, Н.И. Богданов // Сб. трудов «Инновационные технологии и продукты». Новосибирск, 2000. - Вып. 4. - С. 9 - 13.

36. Семенова, Е.Ф. Руководство к практическим занятиям по биотехнологии: учеб. пособие / Е.Ф. Семенова, A.B. Кузнецова. -Пенза: Изд-во ПГУ, 2011. - 124 с.

37. Семенова, Е.Ф. Скрининг водорослей - продуцентов летучих душистых веществ / Е.Ф. Семенова // V симпозиум «Основные направления научных исследований по интенсификации эфиромасличного производства» (тезисы докладов). Кишинев, 1990. - С. 199-200.

38. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 февраля 2008 г. № 11197.

39. Справочник технолога эфирномасличного производства. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 184 с.

40. Ступин, A.B. Эйкозаноиды и полиненасыщенные жирные кислоты при хронических воспалительных дерматозах / A.B. Ступин // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2005. - № 1. -С. 88-90.

41. Технология натуральных эфирных масел и синтетических душистых веществ / И.И. Сидорова, H.A. Турышева, Л.П. Фалеева, Е.И. Ясюкевич- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 368 с.

42. Фармакология / Под ред. Аляутдина Р.Н. - 3-е изд., испр. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 592 с.

43. Acetylsalicylic acid as antifungal in Eremothecium and other yeasts / N.J. Leew, C.W. Swart, D.M. Ncango, C.H. Pohl, O.M. Sebolai, C.J. Strauss, P.J. Botes, P.W.J, van Wyk, S. Nigam, J.L.F. Kock // Antonie van Leeuwenhoek. - 2007. - V. 91. - P. 393-405.

44. Adaptation of the filamentous fungus Ashbya gossypii to hyperosmotic stress: different osmoresponse to NaCl and mannitol

stress / Foerster C., Marienfeld S., Wedisch V.F., Kraemer R. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - V. 50. - P. 219-226.

45. A genome-wide transcription analysis of a fungal riboflavin overproduced M. Karos, C. Vilarino, C. Bollschweiller, J.L. Revuelta // Biotechnol. - 2004. - V. 113, №1-3. - P. 69-76.

46. Banthrope, D. V. Biosynthesis of geraniol and nerol and their ß-D-glucosides in Pelargonium graveolens and Rosa dilecta / D. V. Banthrope, G. N. J. Le Patourel, M. J.O. Francis // Biochem. J. -1972.- V. 130. - P. 1045-1054.

47. Batra, L.R. Nematosporaceae (Hemiascomycetidae): taxonomy, pathogenicity, distribution, and vector relations / L.R.Batra // Technical Bulletin № 1469. USDA, Washington, 1973.- 71 p.

48. Baydar, N. G. Phenolic compounds, antiradical activity and antioxidant capacity of oil-bearing rose (Rosa damascena Mill.) extracts / N. G. Baydar, H. Baydar. // Industrial Crops and Products. - 2013. - V. 41. - P. 375-380.

49. Biogenesis of 2-phenylethanol in rose flowers: incorporation of [ H8]-L-phenylalanine into 2-phenylethanol and its ß-D-glucopyranoside during the flower opening of Rosa 'Hoh-Jun ' and Rosa damascena Mill. / S. Watanabe, K. Hayashi, K. Yagi, T. Asai, H. MacTavish, J. Picone, C. Turnbull, N. Watanabe // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2002. - V. 66 (5). - P. 943-947.

50. Biosynthesis of flavin cofactors in man: implications in health and disease / M. Barile, T.A. Giancaspero, C. Brizio, C. Panebianco, C. Indiveri, M. Galluccio, L. Vergani, I. Eberini, E. Gianazza // Current Pharmaceutical Design. - 2013. - V. 19, № 14. - P. 26492675.

51. Biosynthesis of isoprenoids via the non-mevalonate pathway/ W. Eisenreich, A. Bacher, D. Arigonib, F. Rohdich // CMLS, Cell. Mol. Life Sei. - 2004. - V. 61. - P. 1401-1426.

52. Biosynthesis of riboflavin by Ashbya gossypii. Part I. The influence of fats of the animal origin on the riboflavin production / T. Szczesniak, L. Karabin, M. Szczepankowska, K. Wituch //Acta Microbiologica Polonica Ser. B. - 1971. - V. 3. - P. 29-34.

53. Biosynthesis of riboflavin by Ashbya gossypii. Part II. The influence of fats of the animal origin on the riboflavin production / T. Szczesniak, L. Karabin, M. Szczepankowska, K. Wituch // Acta Microbiologica Polonica Ser. B. - 1971. - V. 3. - P. 91-95.

54. Biosynthesis of riboflavin: structure and mechanism of lumazine synthase/ A. Bâcher, M. Fisher, K. Kis, K. Kugelbrey, S. Môrtl, J. Scheuring, S. Weinkauf, S. Eberhardt, K. Schmidt-Base, R.Hurber, K. Ritsert, M. Cushman, R. Ladenstein // Biochem. Soc. Trans. - 1996. - V. 24. - P. 89-94.

55. Biotechnological production of bioflavors and functional sugars/ J.L. Bicas, J. C. Silva, A. P. Dionisio, G. M. Pastore // Ciencia e Technologia de Alimentos. - 2010. - V. 30, №1. - P. 7-18.

56. Biotechnological production of 2-phenylethanol / M.M.W. Etschmann, W. Bluemke, D. Sell, J. Schrader // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2002.-V. 59.-P.1-8.

57. Biotechnological production of vitamins / S. A. Survase, I.B. Bajaj, R. S. Singhal // Food Technol. Biotechnol., 2006. - V. 44 (3). - P. 381-396.

58. Biotechnological routes in flavour production / S. A. Dubai, Y. P. Tilkari, S.A. Momin, I.V. Borkar // Advanced Biotech. - 2008. -March.- P. 20-31.

59. Bomgardner, M. M. The sweet smell of microbes / M. M. Bomgardner // Chemical & Engineering News. - 2012. - V.90, №29. -P. 25-29.

60. Bouvier, F. Biogenesis, molecular regulation and function of plant isoprenoids / F. Bouvier, A. Rahier, B. Camara // Progress in Lipid Research, 2005. - V. 44. - P. 357-429.

61. Bulgarian rose oil of white oil-bearing rose / N. Nedkov, A. Dobreva, N. Kovacheva, V. Bardarov, A. Velcheva // Bulgarian Journal of Agricultural Science. - 2009. - V. 15, № 4. - P. 318-322.

62. Chemical composition and antioxidant activity of the extract and essential oil of Rosa damascena from Iran, population of Guilan / N. Yassa, F. Masoomi, S.E. Rohani Rankouhi, A. Hajaiakhoondi // DARU. - 2009. - V. 17, № 3. - P. 175-180.

63. Chemler, J. A. Biosynthesis of isoprenoids, polyunsaturated acids and flavonoids in Saccharomyces cerevisiae / J. A. Chemler, Y. Yan, M. A.G. Koffas // Microbial Cell Factories. - 2006.- V. 5.- P. 2029.

64. Chopra, I. Tetracycline Antibiotics'. Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance /1. Chopra, M. Roberts //Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2001. - V. 65, № 2. - P. 232-260.

65. Christen, P. Producción de aromas porfermentación en medio solido / P. Christen // Tópicos de investigacióny posgrado. - 1995. - V. IV (2). -P. 102-109.

66. Cold storage of oil rose (Rosa damascena Mill.) flowers/ S. Kazaz, S. Erbas, H. Baydar, T. Dilmacunal, M. Ali Koyuncu // Scientia Horticulturae. - 2010. - V.126. - P. 284-290.

67. Collin, H.A. Secondary product formation in plant tissue cultures / H.A. Collin // Plant Growth Regulation. - 2001. - V. 34. - P. 119134.

68. Contasti, V. Riboflavin production by Candida guilliermondii from liquid brewery waste / V. Contasti, S. Bahar // Acta Cient. Venez. - 1988. - V. 39. - P. 69-74.

69. Correlation of isocitratelyase activity and riboflavin formation in the riboflavin overproducer Ashbya gossypii / G. Schmidt, K.P. Stahmann, B. Kaesler, H. Sahm // Micribiology.- 1996.- V. 142.- P. 419-426.

70. Cseke, L. Structure and evolution of linalool synthase / L. Cseke, N. Dudareva, E. Pichersky // Mol. Biol. Evol. - 1998. - V.l 5(11). - P. 1491-1498.

71. Debitsky, V.M. Metabolites produced by nitrogen-fixing Nostoc species / V.M. Debitsky, T. Rezanka // Folia Microbiol. - 2005. - V. 50, №5. - P. 363-391.

72. Demain, A.L. Metabolites, Primary and Secondary // Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalystand Boiseparation. Eds. M.C. Flickinger, S.W. Draw. - Wiley Interscience, John Wiley and Sons Inc., New York, USA, 1999. - V. 3. - P. 17131732.

73. Demain, A. L. Riboflavin oversynthesis / A. L. Demain // Annu. Rev. Microbiol. - 1972. - V. 26. - P. 369-388.

74. De novo biosynthesis of vanillin in fission yeast and baker's yeast / E. H. Hansen, B. Lindberg Moller, G. R. Kock, C. M. Buenner, C. Kristensen, O. R. Jensen, F. T. Okkels, C. E. Olsen, M. S. Motawia, J. Hansen // Applied and Enviromental Microbiology. - 2009. - V. 75, № 9.- P. 2765-2774.

75. De novo synthesis of monoterpenes by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts / F. M. Carrau, K. Medina, E. Boido, L. Farina, C. Caggero, E. Dellacassa, G. Versini, P. A. Henschke // FEMS Microbiology Letters. - 2005. - V. 243. - P. 107-115.

76. Erdogan, G. Turkey rose oil production and marketing: a review on problem and opportunities / G. Erdogan // Journal of Applied Sciences. - 2005. - V. 5, № 10. - P. 1871-1875.

77. Ertrk, E. Effects of various supplements on riboflavin production by Ashbya gossypii in whey / E. Ertrk, O. Erkmen, M. Oener // Tr. J. of Engineering and Environmental Science.- 1998.-V. 22.-P. 371-376.

78. Fedorovich, D. Iron uptake by the yeast Pichia guilliermondii. Flavinogenesis and reductive iron assimilation are co-regulated processes / D. Fedorovich, O. Protchenko, E. Lesuisse // Biometals. -1999. - V. 12, №4. - P. 295-300.

79. Flavin coenzymes, flavinogenesis and reproduction by Ashbya gossypii / P. Cerletti, R. Strom, M. G. Giordano, D. Barra, S. Giovenco // The Journal of Biochemistry. - 1965. - V. 57, № 6. - P. 773-786.

80. Flavor-active wine yeast / A. G. Gordente, C. D. Curtin, C. Varela, I. S. Pretorius // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2012. - P. 1-18.

81. Formation and degradation of lipid bodies found in the riboflavin-producing fungi Ashbya gossypii / K.-P. Stahmann, C. Kupp, S. D. Feldmann, H. Sahm // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1994. - V. 42. -P. 121-127.

82. Foerster, C. Carrier-mediated transport of riboflavin in Ashbya gossypii / C. Foerster, J.L. Revuelta, R. Kraemer // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2001. - V. 55. - P. 85-89.

83. Fraile, E. R. Respiratory activity of the mycelium of Eremothecium ashbyi / E. R. Fraile, V. E. Zurita //Applied Microbiology. - 1967. - V. 15, № 6. - P. 1262-1265.

84. GB/T 22443-2008 Rose oil. - 13 p.

85. Genetic engineering of Bacillus subtilis for the commercial production of riboflavin / J.B. Perkins, A. Sloma, T. Hermann, K. Theriault, E. Zachgo, T. Erdenberger, N. Hannett, N.P. Chatterjee, V. Williams, G.A. Rufo Jr., R. Hatch, J. Pero // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V. 22. - P. 8-18.

86. Haeusler, A. Microbial production of natural flavors / A. Haeusler, T. Muench // ASM News. - 1998.-V. 63, №10. - P.551-559.

87. Horiuchi, J. Industrial application of fuzzy controlto large-scale recombinant vitamin B2 production / J. Horiuchi, K. Hiraga // J.Biosci. Bioeng. - 1999. - V. 87. - P. 365-371.

88. Identification of sesquiterpene synthases from Nos toe punctiforme and Nostoc sp. / S. A. Agger, F.Lopez-Gallego, T. R. Hoye, C. Schmidt-Dannert // Journal of Bacteriology. - 2008. - V. 190, №8. - P. 6084-6096.

89. Industrial biotechnology: sustainable growth and economic success / Ed. by Soetaert W., Vandamme E.J. // Willey-VCH, 2010. -523 p.

90. Improvement of riboflavin production using mineral support in the culture of Ashbya gossypii / H. L. Sung, H. Ming, E.Y. Park, J. S. Choi // Food Technol. Biotechnol. - 2003.- V. 41 (2). - P. 137-144.

91. ISO 9842:2003 Rose oil. - 15 p.

92. Isolation of Ashbya gossypii mutant for an improved riboflavin production targeting for biorefinery technology / E.Y. Park, J.H. Zhang, S. Tajima, L. Dwiarti // Journal of Appl. Microbiol.- 2007.-V.103.-P. 468-476.

93. Jianping, J. Identification of volatile compounds produced by Kluyveromyces lactis / J. Jianping // Biotechnology techniques. -1993. - V. 7, № 12. - P. 863-866.

94. Jimenez, A. Metabolic engineering of the purine pathway for

riboflavin production in Ashbya gossypii / A. Jimenez, M.A. Santos, J.L. Pompejus // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - V. 71, №10. - P. 5743-5751.

95. Kalingan, A. E. Application of agro-industrial by-products for riboflavin production by Eremothecium ashbyii NRRL 1363 / A. E. Kalingan, M. R. V. Krishnan // Appl. Microbiol.Biotechnol. - 1997. -V. 47.-P. 226-230.

96. Kambourova, R. Volatile substances of the green alga Scenedesmus incrassatulus / R. Kambourova, V. Bankova, G. Petkov // Z. Naturforsch. - 2003. - V. 53. - P. 187-190.

97. Kapralek, H. The physiology of riboflavin production by Eremothecium ashbyi / H. Kapralek // J. gen. Microbiol. - 1962. - V. 29. - P. 408-419.

98. Kazaz, S.The effects of storage temperature and duration on essential oil content and composition rose oil / Kazaz S., Erbas S., Baydar H. // Turkish J. of Field Crops. - 2009. - V. 14, № 2. - P. 89-96.

99. Khan, A. M. Extraction and analysis of essential oil of Rosa species / A. M. Khan, Shoaib-ur-Renman // International Journal of Agriculture & Biology. - 2005. - V. 5, № 6. - P. 973-974.

100. Kimura, S. Eremothecium ashbyi causes soybean yeast-spot and is associated with stink bug, Riptortus clavatus / S. Kimura, S. Tokumaru, K. Kuge// J. Gen. Plant. Pathol. - 2008. - V. 74. - P. 275-280.

101. Kimura, S. Mode of transmission and morphological structures of two Eremothecium species between Riptortu spedestris soybean / S. Kimura, S. Tokumaru, K. Kuge // J. Gen. Plant. Pathol. - 2008. - V. 74. - P. 390-394.

102. Kirby, J. Biosynthesis of plant isoprenoids: perspectives for microbial engineering / J. Kirby, J. D. Keasling // Annu. Rev. Plant Biol. - 2009. - V. 60. - P. 335-355.

103. Klein-Marcuschamer, D. Engineering microbial cell factories for biosynthesis of isoprenoids / D. Klein-Marcuschamer, P. K. Ajikamar, G. Stephanopoulos // TRENDS in Biotechnology. - 2007. - V. 25, № 9. -P. 417-424.

104. Kolonne, S. Effect of pH on exocellular riboflavin production by Eremothecium ashbyii / S. Kolonne, R.J. Seviour, B.M. MacDougall // Biotechnology letters. - 1994.-V.16, № 1. - P. 79-84.

105. Kovacheva, N. Industrial cultivation of oil bearing rose and rose oil production in Bulgaria during 21st century, directions and challenges / N. Kovacheva, K. Rusanov, I. Atanassov // Biotechnol. &Bioutechnol. Eq. - 2010. - №2. - P. 1793-1798.

106. Krings, U. Biotechnological production of flavours and fragrances / U. Krings, R.G. Berger // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1998.-V. 49.-P. 1-8.

107. Krneta-Jordi, M. Cytologishe und physiologishe Untersuchungen an Eremothecium ashbyi Guill. Wirkstoffbedarf und synthese vermoegen als Funktion der Milieuschaffenheit / M. Krneta-Jordi // ArchivfuerMikrobiologie. - 1962. - V. 43. - P. 76-108.

108. Kurtzman, C.P. Relationships among the genera Ashbya, Eremothecium, Holleya and Nematospora determined from rDNA sequence divergence / C.P. Kurtzman // Journal of Industrial Microbiology. - 1995. - V. 14. - P. 523-530.

109. Kurtzman, C.P. Phylogenetic relationships among yeasts of 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analysis / C.P. Kurtzman, C.J. Robnett // FEMS Yeast Research. -2003. - V. 3. - P. 417-432.

110. Ladygina, N. A review on microbial synthesis of hydrocarbons / N. Ladygina, E.G. Dedyukhina, M.B. Vainshtein // Process Biochemistry. -2006. - V. 41. - P. 1001-1014.

111. Lichens as a source of versatile bioactive compounds / T. Mitrovic, S. Stamenkovic, V. Cvetkovic, M. Nikolic, S. Tosic, D. Stojicic // Biologica Nyssana. - 2011. - V. 2, №1. - P. 1-6.

112. Loewus, F. A. myo-Inositol metabolism in plants / F. A. Loewus, P.P.N. Murthy // Plant Science. - 2000. - V. 150. - P. 1-19.

113. Loghmani-Khouzani, H. Essential composition of Rosa damascena Mill, cultivated in Central Iran / H. Loghmani-Khouzani, O.

SabziFini, J. Safari // Scientia Iranica. - 2007. - V. 14, № 4. - P. 316-319.

114. Luckenbach, T. Fatal attraction: Synthetic musk fragrances compromise multixenobiotic defense systems in mussels / T. Luckenbach, I. Corsi, D. Epel // Marine Environmental Research. -2004. - V. 58 (2-5). - P. 215-219.

115. Longo, M. A. Production of food aroma compounds: microbial and enzymatic methodologies / M. A. Longo, M. A. Sanroman // Food Technol. Biotechnol. - 2006. - V. 44, №3. - P. 335-353.

116. Marx, H. Overexpression of the riboflavin biosynthetic pathway in Pichia pastoris / H. Marx, D. Mattanovich, M. Sauer // Microbial Cell Factories. - 2008. - P. 7-23.

117. Massey, V. The chemical and biological versatility of riboflavin / V. Massey // Biochemical Society Transactions. - 2000. - V. 28. - P. 283296.

118. Mehta, H.B. The effect of phosphate on flavinogenesis in Eremothecium ashbyii / H.B. Mehta, V.V. Modi // Appl. Micribiol. Biotechnol. - 1981.- V.ll.- P.131-132.

119. Metabolic engineering of sesquiterpene metabolism in yeast / S. Takahashi, Y. Yeo, B. T. Greenhagen, T. McMullin, L. Song, J. Maurina-Brunker, R. Rosson, J. P. Noel, J. Chappell // Biotechnol Bioeng. - 2007. - May 1, V. 97(1). - P. 170-181.

120. Misawa, N.. Pathway engineering for functional isoprenoids / N. Misawa // Current Opinion in Biotechnology. - 2011. - V. 22. - P. 1-7.

121. Mobility, microtubule nucleation and structure of microtubule-organizing centers in multinucleated hyphae of Ashbya gossypii / C. Lang, S. Grava, T. van den Hoorn, R. Trimble, P. Philippsen, S. L. Jaspersen // Molecular Biology of the Cell. - 2010. - V. 21, № 1. - P. 18-28.

122. Molecular cloning of geranyldiphosphate synthase and compartmentation of monoterpene synthesis in plant cells / F. Bouvier,

C. Suire, A. d'Harlingue, R.A. Backhaus, B. Camara // The Plant Journal. - 2000. - V. 24, № 2. - P. 241-252.

123. Nadal, M. Dimorphism in fungal plant pathogens / M. Nadal, M.

D. Garcia-Pedrajas, S. E. Gold // FEMS Microbiol. Lett. - 2008. - V. 284. - P.127-134.

124. Omeliansky, V.L. Aroma-producing microorganisms / V.L. Omeliansky // J. Bacteriol. - 1923. - V. 8. - P. 393-419.

125. Optimization of riboflavin production by recombinant Bacillus subtilis RH44 using statistical designs / Q. Wu, T. Chen, Y. Gan, X. Chen, X. Zhao // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - V. 76, №4. - P. 783794.

126. Oxylipin covered ascospores of Eremothecium coryli / N.J. Leeuw, J.L.F. Kock, C.H. Pohl, A.S. Bareetseng, O.M. Sebolai, M. Joseph, C.J. Strauss, P.J. Botes, P.W.J, van Wyk, S. Nigam // Antonie van Leeuwenhoek. - 2006. - V. 89. - P. 91-97.

127. Ozbas, T. Comparative study of riboflavin production from two microorganisms: Eremothecium ashbyii and Ashbya gossypii / T. Ozbas, T. Kutsal//Enzyme Microb. Technol.- 1986.- V.8.-P. 593-596.

128. Ozbas, T. Effects of growth factors on riboflavin production by Ashbya gossypii / T. Ozbas, T. Kutsal // Enzyme Microb. Technol. - 1991.-V.13.- P. 594-596.

129. Ozbas, T. Oxygen transfer kinetics of riboflavin fermentation by Ashbya gossypii in agitated fermentors / T. Ozbas, T. Kutsal // Enzyme Microb. Technol. - 1992. -V. 14. - P. 984-991.

130. Physico-chemical analysis and determination of various chemical constituents of essential oil in Rosa centifolia / K. M. Shabbir, R. Nadeem, H. Mukhtar, F. Anwar, M. W. Mumtaz // Pak. J. Bot. - 2009. -V. 41, № 2. - P. 615-620.

131. Phytopathogenic filamentous (Ashbya, Eremothecium) and dimorphic fungi {Holleya, Nematospora) with needle-shaped ascospores as new members within the Saccharomycetaceae / H. Prillinger, W. Schweigkofler, M. Breitenbach, P. Briza, E. Staudacher, K. Lopandic, O. Molnar, F. Weigang, M. Ibl, A. Ellinger // Yeast. - 1997. - V. 13. - P. 945-960.

132. Polyunsaturated fatty acids (PUFA) and eicosanoids in human health and pathologies / H. Tapiero, G. Nguyen, P. Couvreur, K.D. Tew // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2002. - V. 56, № 5.-P. 215-222.

133. Potential for Nezara viridula (Hemiptera: Pentatomidae) to transmit bacterial and fungal pathogens into cotton bolls / E. G. Medrano, J. Esquivel, A. Bell, J. Greene, P. Roberts, J. Bacheler, J. Marois, D. Wright, R. Nichols, J. Lopez // Curr. Microbiol. - 2009. - Vol. 59. - P. 405-412.

134. Powers, H.J. Riboflavin (vitamin B-2) and health / H.J. Powers//Am. J. Clin. Nutr. - 2003. - V. 77. - P. 1352-1360.

135. Pridham, T.G. Ashbya gossypii - its sighnificance in nature and in the laboratory / T.G. Pridham, K.B. Raper // Mycologia. - 1950. - V. 2, № 5. - P. 603-623.

136. Production of flavours by microorganisms / L. Janssens, H.L. De Pooter, N.M. Schamp, E.J. Vandamme // Process Biochemistry. - 1992. - V. 27. - P. 195-215.

137. Production and recovery of aroma compounds produced by solid-state fermentation using different absorbents / A. B.P. Medeiros, A. Pandey, L. P.S. Vandenberghe, G.M. Pastore, C. R. Soccol // Food Technol. Biotechnol. -2006.-V. 44, № l.-P. 47-51.

138. Production d'aromes de type lactone par des levure / M. Alchihab, J. Destain, M. Aguedo, P. Thonart // Biotechnol. Agron. Soc. Environ. - 2010. -V. 14, №4.-P. 681-691.

139. Production of essential oils and flavours in plant cell and tissue cultures. A review / Th. Mulder-Krieger, R. Verpoorte, A. Baerheim,

Svendsen, J.J.C. Scheffer // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1988. -V. 13. -P. 85-154.

140. Production of riboflavin by metabolically engineered Corynebacterium ammoniagenes / S. Koizumi, Y. Yonetani, A. Maruyama, S. Teshiba // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2000. - V.53. - P. 674-679.

141. Pujari, V. Statistical optimization of medium components for improved synthesis of riboflavin by Eremothecium ashbyi / V. Pujari, T.S. Chandra // Bioprocess Engineering. - 2000.-V.23.-P. 3003-307.

142. Ramos-Valdivia, A. C. Isopentenyldiphosphateisomerase: a core enzyme in isoprenoid biosynthesis. A review of its biochemistry and function / A. C. Ramos-Valdivia, R. van der Heijden, R. Verpoorte // Natural Product Reports. - 1997.-P. 591-603.

143. Regulation of essential oil production on plants / N.S. Sangwan, A.H.A. Farooqi, F. Shabih, R.S. Sangwan // Plant Growth Regulation. - 2001. - V. 34.-P. 3-21.

144. Research and current profile of Iranian production of damask rose (Rosa damascena Mill.) / M. Haghighi, A. Tehranifar, A. Nikbakht, M. Kafl // Acta horticulturae. - 2008. -V. 769. - P. 499-455.

145. Roberts, S. S. Production and engineering of terpenoids in plant cell culture / S. S. Roberts // Nature Chemical Biology. - 2007. - № 3. - P. 387-395.

146. Rosa damascena - genetic resources and capacity building for molecular breeding / K. Rusanov, N. Kovacheva, K. Stefanova, A. Atanassov, I. Atanassov // Biotechnol.&Biotechnol. Eq. - 2009.- V. 23. - P. 1436-1439.

147. Sabry, S. A.Riboflavin production by Aspergillus terreus from beet molasses / S. A. Sabry, K. M. Ghanem, H. A. Ghozlan // Microbiología. - 1993. - V. 9. -P. 118-124.

148. Schindler, J. Fragrance or aroma chemicals. Microbial synthesis and enzymatic transformation—a review / J. Schindler, R.D. Schmid // Process Biochem. - 1982. - V. 17. - P. 2-8.

149. Schwab, W. Biosynthesis of plant-derived flavor compounds / W. Schwab, R. Davidovich-Rikanati, E. Lewinsohn // The Plant Journal. - 2008. - V. 54. -P. 712-732.

150. Seong, H. L. Microbial production of riboflavin using riboflavin overproduces Ashbya gossypii, Bacillus subtilis, and Candida farmata: an Overview / H. L. Seong, J. S. Choi, E. Y. Park // Biotechnol. Bioprocess Eng.

- 2001. - V. 6.-P.75-88.

151. Serra, S. Biocatalytic preparation of natural flavours and fragrances / S. Serra, C. Fuganti, E. Brenna // TRENDS in Biotechnology. - 2005. - V. 23, № 4. -P. 193-198.

152. Seyhan, U. Tocopherol, carotene, phenolic contents and antibacterial properties of rose essential oil, hydrosol and absolute / U. Seyhan, B.-T. Gulgun, S.-C. Hale // Curr. Microbiol. - 2009. - V. 59. - P. 554-558.

153. Shawl, A.S. Rose oil in Kashimiri India / A.S. Shawl // Perfumer and Flavorist. - 2009.-V.34.- P.2-5.

154. Smith, R.H. A study of the role of inositol in the nutrition of Nematospora gossypii and Saccharomyces carlsbergensis / R.H. Smith // J. gen. Microbiol.

- 1951.-V. 5.-P. 772-780.

155. Stahmann, K.P. Three biotechnical processes using Ashbya gossypii, Candida famata, or Bacillus subtilis compete with chemical riboflavin production / K.P. Stahmann, J.L. Revuelta, H.Seulberger // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2000. - V. 53, №5. - P. 509-516.

156. Sudeshna, S. Isolation and application of pyruvate kinase gene as a genetic marker for phylogenetic studies in the phytopathogenic fungus Eremothecium ashbyi / S. Sudeshna, T.S. Chandra // International journal of advanced biotechnology and research. - 2011. - V. 2, № 4. - P. 457-467.

157. Takagi, M. Microbial transformation processes of aliphatic hydrocarbons / M. Takagi, N. Uemura, K. Furuhashi // Annals of the New York Academy of Sciences. - 1990. - V. 613. - P. 697-701.

158. Terpenoids: opportunities for biosynthesis of natural product drug using engineered microorganisms / P. K. Ajikumar, K. Tyo, S. Carlsen, O. Mucha, T. H. Phon, G. Stephanopoulos // Molecular Pharmaceutics. - 2008. - V. 5, №2.-P. 167-190.

159. Tenson, T.The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the Nascent peptide exit path in the ribosome / T. Tenson, M. Lovmar, M. Ehrenberg // J. Mol. Biol. - 2003. - V. 330. - P. 1005-1014.

160. The genera of yeasts and the yeast-like fungi / J.A. von Arx, L. Rodrigues de Miranda, M. Th. Smith, D. Yarrow // Stud. Mycol. - 1977. - V. 14. - P. 1-42.

161. The yeast, a taxonomic study. Ed. by Kurtzman C.P., Fell J. W. Fourth Edition. - Elsevier Science, 1998. - 1055 p.

162. Using microbial systems in order to obtain fermentation flavorings / Iordan M., Barascu E., Stoica A., Popescu E. C. // Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. - 2009. - V. 15, №1. - P. 34-40.

163. Vaghy, T. Correlation between the morphological variability and riboflavin producing capacity of Eremothecium ashbyii / T. Vaghy //Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. - 1971. - V. 18. - P. 75-80.

164. Vandamme, E. J. Bioflavours and fragrances via fungi and their enzymes / E. J. Vandamme // Fungal Diversity. - 2003. - V. 13. - P. 153-166.

165. Wang, D. The role of prostaglandins and other eicosanoids in gastrointestinal tract / D. Wang, J. R. Mann, R. N. Dubois // Gastroenterology, 2005. - V. 128, № 5. - P. 1445-1461.

166. Waxman, D.J. Penicillin-Binding Proteins and the Mechanism of Action of Beta-Lactam Antibiotics / D.J. Waxman, J. L. Strominger // Annual Review of Biochemistry. - 1983. - V. 52. - P. 825-869.

167. Wendland, J. Genome evolution in the Eremothecium clade of the Saccharomyces complex revealed by comparative genomics / J. Wendland, A. Walther // G3: Genes, Genomes, Genetics. - 2011. - V. 1. - P. 539-548.