Биологические свойства изолятов ВИЧ-1, выделенных от пациентов с территорий СНГ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сахурия, Ирма Бухутиевна

• Сахурия, Ирма Бухутиевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сахурия, Ирма Бухутиевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Этиология и эпидемиология ВИЧ

Молекулярная биология и жизненный цикл вируса иммунодефицита

человека

Генетическая изменчивость ВИЧ

Субтипы ВИЧ-1 и их географическое распространение

Фенотипические свойства различных вариантов ВИЧ-1

Внутриклеточные факторы, влияющие на фенотип ВИЧ-1

Химиотерапия ВИЧ-инфекции и СПИДа

ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ВИЧ-инфицированные пациенты

Клеточные культуры

Вирусные штаммы

Культуры донорских мононуклеаров периферической крови (МПК)

Определение числа жизнеспособных клеток с помощью исключающего

витального красителя трипанового синего

Определение числа жизнеспособных клеток с помощью МТТ-теста

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антигенов ВИЧ-1

Определение ТСГО50

Изоляция ВИЧ в смешанной культуре МПК ВИЧ-инфицированных пациентов и

МПК здоровых доноров

Исследование in vitro фенотипических особенностей изолятов

ВИЧ-1

Азидотимидин (AZT)

Определение цитотоксичности AZT

Определение AZT-чyвcтвитeльнocти изолятов ВИЧ-1

Определение анти-ВИЧ эффективности КЪТ на модели МПК пациента

УЗ-имитирующие синтетические пептиды

ИФА на основе синтетических пептидов

ЧАСТЬ III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 1. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 на различных стадиях инфекции

Глава 2. Изучение биологических особенностей in vitro первичных изолятов ВИЧ-1 субтипа А, циркулирующих среди внутривенных наркоманов на территории бывшего СССР

Глава 3. Разработка экспериментальной системы для комплексной диагностики in vitro анти-ВИЧ-эффективности AZT

ВЫВОДЫ

Список научных публикаций по теме диссертационной работы

Библиографический список

107

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические свойства изолятов ВИЧ-1, выделенных от пациентов с территорий СНГ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) приводит к летальному заболеванию - синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД). По данным ВОЗ, в 1998-ой год человечество вступило с более, чем 30-тью миллионами ВИЧ-инфицированных пациентов. Из них большая часть (21 млн.) проживает на Африканском континенте (главным образом, в центральной и южной Африке); 5.8 млн. - в Юго-Восточной Азии; 12 тыс. - в Австралии, Новой Зеландии и Океании; 1.2 млн. - в Латинской Америке; 860 тыс. - в США и Канаде; 480 тыс. - в Западной Европе; 180 тыс. - в Восточной Европе; около 2 тыс. - в Беларуси; около 10 тыс. - в России. Кумулятивная смертность от СПИДа составила 11.7 млн.. В 1997 г. было выявлено 5.8 млн. новых случаев ВИЧ-инфекции, причем государства бывшего СССР уверенно лидируют по скорости развития эпидемии (ежегодный прирост -более 100%). В контексте сложившейся эпидемиологической обстановки, исследования (включая данную работу), направленные на изучение биологических свойств различных вариантов ВИЧ и эффективности схем химиотерапии этой вирусной инфекции, представляются чрезвычайно актуальными.

Цель работы. Целью данной работы является изучение биологических свойств ряда первичных изолятов ВИЧ-1 in vitro, выделенных от инфицированных пациентов с территории СНГ, установление взаимосвязи между фенотипическими особенностями изолятов, стадией инфекции и клиническими характеристиками заболевания; разработка подходов к созданию индивидуальных схем химиотерапии ВИЧ-инфекции с учетом ее характеристик для конкретного пациента.

Научная новизна работы. Сегодня отсутствует общепризнанная классификация первичных изолятов ВИЧ на основании сравнения их фенотипических свойств. В данной работе проанализирована взаимосвязь между скоростью и уровнем репродукции ряда первичных изолятов ВИЧ-1 в различных

клеточных системах. Впервые изучены биологические свойства вариантов ВИЧ-1 субтипа А, вызвавших резкую эпидемическую вспышку в г. Светлогорске (Гомельская обл. Беларуси). Предложена экспериментальная система для оценки эффективности химиопрепаратов на модели мононуклеаров периферической крови пациента in vitro.

Научно-практическое значение работы. Стоимость эффективной анти-ВИЧ химиотерапии (например, тройных комбинаций AZT+ЗТС+индинавир и т.п.), в настоящее время, чрезвычайно высока (такая терапия оценивается в 20-25 тыс. долларов США ежегодно на одного пациента). Эффективность различных химиопрепаратов ограничивается появлением резистентных вирусных вариантов. Выходом из этой ситуации мог бы оказаться доклинический анализ возможной химиотерапии in vitro. Поэтому развитый в данной работе подход по индивидуальному подбору схем химиотерапии имеет практическое значение.

Характеристики изученных изолятов ВИЧ-1 переданы лечащим врачам соответствующих пациентов в клинику Института иммунологии МЗ РФ, Клиническую инфекционную больницу № 2 г. Москвы, Районную поликлинику г. Светлогорска (Гомельская обл. Беларуси).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 22 рисунка, и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы. Библиографический список включает 231 наименование.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Этиология и эпидемиология ВИЧ.

В 1964 году Говард Тёмин наблюдал, что заражение некоторыми РНК-содержащими вирусами, такими, как вирус саркомы птиц (саркомы Рауса), блокируется ингибиторами синтеза ДНК. В результате этого открытия было высказано предположение, что для репродукции некоторых РНК-содержащих вирусов необходим синтез ДНК. Гипотеза о том, что для вирусов, содержащих РНК, нужна транскрипция ДНК, а ДНК-содержащий провирус служит промежуточным звеном в репликации этих вирусов нашла экспериментальное подтверждение [Temin Н., 1972; Baltimore D., 1976]: был открыт новый фермент -обратная транскриптаза, необходимая для жизненного цикла ретровирусов (от англ. reverse transcriptase - обратная транскриптаза).

С этого момента стали активно развиваться иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции и анализа нового фермента, что привело к открытию первых ретровирусов человека. Был выделен и исследован вирус, вызывающий у человека Т-клеточный лейкоз (HTLV-1) [Poiesz А.Р., 1980]. Позлее был изолирован второй тип ретровируса этого семейства (HTLV-2) [Kalyanaraman V.S., 1982].

К июню 1981 года в CDC (Center for the Disease Control, Атланта, США) поступили сообщения о пациентах с пневмоцистной пневмонией, отягощенной грибковыми заболеваниями. У большинства из пациентов при обследовании было выявлено снижение показателей клеточного иммунитета. Поступившие данные заставили экспертов CDC обратить более пристальное внимание на молодых людей с вторичными иммунодефицитами, на фоне которых развивались тяжелые формы условно патогенных инфекций и некоторые неоплазии, свойственные пожилым людям (например, саркома Капоши). Полученная информация свидетельствовала о появлении новой болезни, названной впоследствии Синдромом Приобретенного Иммунодефицита

(СПИДом), и которая, вероятно, вызывается неизвестным инфекционным агентом [CDC, 1981].

Изучение причин СПИДа в начале 80-х было сфокусировано на различных вирусах, вызывающих иммунодефицитные состояния, - в первую очередь ретровирусах, а так же парвовирусах и вирусах герпеса [Levy J.A., 1993]. Первыми вирус, вызывающий СПИД, в 1983 г. выделили сотрудники лаборатории Люка Монтанье (Институт Пастера, Париж, Франция) и назвали его LAV (от англ. Lymphadenopathy-Associated Virus) [Barre-Sinoussi В., 1983]. В мае 1984 г. Роберт Галло (руководитель лаборатории клеточной биологии опухолей при Национальном институте рака, Бетезда, США) сообщил о выделении этиологического агента СПИДа и, предполагая его взаимосвязь с семейством вирусов HTLV, назвали его HTLV-III (от англ. Human Т cell Leukemia/lymphoma Virus type III - вирус Т-клеточного лейкоза/лимфомы человека III типа) [Gallo R., 1983]. Данные сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей LAV и HTLV-III привели к выводу, что они являются различными вариантами одного и того же вируса [Florino P.M., 1985]. В июне 1986 г. на Международном Вирусологическом Конгрессе в Париже было решено обозначить возбудитель СПИДа как Вирус Иммунодефицита Человека (ВИЧ; HIV - от англ. Human Immunodeficiency Virus) [Gallo R. and Montagnier L., 1987].

В 1986 г. появилось сообщение [ClavelF., 1986] об изоляции нового ретровируса, ассоциированного со СПИДом: на основании клинических данных больным был поставлен диагноз СПИД, однако тестирование сывороток на антитела к ВИЧ-1 дало отрицательный результат. Авторами было показано, что новый вирус родственен ВИЧ-1, и он был назван ВИЧ-2.

Молекулярная биология и жизненный цикл вируса иммунодефицита человека.

ВИЧ относится к семейству Retroviridae, подсемейство Lentivirinae. Кроме него в подсемейство лентивирусов входят вирус инфекционной анемии

лошадей, вирус меди-висна овец, вирус артрита/энцефалита коз и овец, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, вирус иммунодефицита кошек и вирусы иммунодефицита обезьян.

Поданным электронной микроскопии [Gelderblom H.R., 1989] вирионы ВИЧ имеют размер 100-120 нм (рис.1). Наружная мембрана вируса позаимствована у клетки-хозяина и содержит поверхностные вирусные белки: трансмембранный gp41 (от англ. glycoprotein 41 kD) и нековалентно связанный с ним gpl20 (от англ. glycoprotein 120 kD). Нуклеоид вируса имеет форму усеченного конуса с октаэдрической симметрией и состоит из вирусного белка р24. Между поверхностной мембраной и нуклеоидом находится каркас, состоящий из так называемого матриксного вирусного белка р17. Белок р17 миристилирован, и гидрофобный остаток миристиловой кислоты позволяет ему прочно связываться с липидным бислоем. Внутри нуклеоида содержится геном вируса, состоящий из двух молекул одноцепочечной РНК, с которыми связаны белки с молекулярными массами 6 и 7 kD. Кроме того, в нуклеоиде содержатся продукты генов vif и vpu, а также комплекс ферментов: протеаза и обратная транскриптаза (51 и 66 kD), обладающая активностью ДНК- и РНК-зависимой ДНК-полимеразы, РНКазы Н и интегразы (только 66 kD). В зрелых вирионах (в нуклеоиде) содержится регуляторный белок Vpr - продукт гена vpr. Вирионы ВИЧ-2 содержат белок Vpx - продукт гена vpx, составляющий, по-видимому, так называемые латеральные тельца внутри вириона [Haseltine W.A., 1992; Gamier L., 1998].

Процесс ВИЧ-инфекции клетки-мишени можно разделить на следующие стадии (рис.2):

1. Адсорбция вириона на поверхности клетки; рецепция вируса.

2. Слияние (фузия) мембран вируса и клетки; проникновение вируса внутрь клетки (пенетрация).

3. Высвобождение нуклеоида и геномной РНК вируса; обратная транскрипция.

4. Интеграция генома вируса в геном клетки.

Рис. I. Морфология вириона (СеМегЫот 1998).

5. Латентная стадия инфекции (это период времени, в течение которого ДНК провируса интегрирована в геном; но транскрипции и трансляции с генов вируса нет).

6. Активация процесса транскрипции ДНК провируса и последующей трансляции белков вируса.

7. Активная репликация вируса, то есть крупномасштабная наработка всех компонентов вируса и формирование из них зрелых вирионов.

8. Высвобождение дочерних вирионов из клетки-хозяина во внешнюю среду.

Геном ретровирусов состоит из двух одинаковых молекул РНК(+). После проникновения вируса в клетку и освобождения от внешней оболочки и капсида вирусный фермент обратная транскржггаза обеспечивает синтез одкоцепочечной нити ДНК на матрице вирусной РНК (осуществляет этап обратной транскрипции). Геномная РНК имеет размер 9,2 кЬ. она участвует в жизненном

цикле вируса только одни раз, когда ока является матрицей для обратной транскриптазы при биосинтезе комплиментарной ДНК.

Рис.2. Схема жизненного цикла ВИЧ.

Исходная РНК-матрица расщепляется и строится вторая цепь ДНК с использованием первой (синтезированной ранее) уже в качестве матрицы, и такая двунитчатая ДНК в результате интегразной активности 66 kÜ-субъединицы обратной транскриптазы встраивается в хромосомную ДНК (Fields et al,, 1986). ДНК нровируса содержит 9749 пар нуклеотидов. Это увеличение по сравнению с РНК происходит за счет наращивания длинных концевых повторов (от англ. Long Terminal Repeats, LTR), включающих в себя ряд сайтов связывания для факторов регуляции транскрипции и трансляции.

Ретровирус в интегрированном состоянии называют провпрусом. Провйрус может долгие годы ничем себя не проявлять, но рано или поздно он активируется (под воздействием температуры, ультрафиолета), обеспечивая продукцию новых вирусных частиц. Заболевания, вызываемые лентивирусами, чаще всего связаны с поражением иммунной, кроветворной и нервной систем и развиваются по типу медленных инфекций с длительным инкубационным периодом между заражением и клинической манифестацией.

Провйрус содержит в себе следующие гены [Букринский М.И., 1987; Gallo К., 1988; Vogt G.M., 1997; рис.3]:

gag - (от англ. group specific antigens - группоспецифический антиген) -кодирует внутренние белки вируса. Белок-предшественник, Gag. имеет молекулярный вес 55 kD. Эта молекула расщепляется протеазой вируса на следующие компоненты, считая сМ-конца; р17т р24, р7 и рб.

pol - (от англ. polymerase - полимераза) - кодирует вирусные ферменты. Обратная транскриптаза (51 kD и 66 kD) получается из белка рбб путем отщепления фрагмента с С-конпа, при этом интегразной активностью обладает только большая субъединица.

env - (от англ. envelope - оболочка) - кодирует оболочечные вирусные белки (прямой продукт гена, р97.5, после гл и коз и л и р о ва н и я превращается в gp 160 и нарезается на gp 120 и gp4 i),

Как и у других ретровирусов, продукты генов pol и gag считываются в виде общего предшественника (молекулярный вес - 150 kD).

Рис.3. Структура генома ВИЧ.

Помимо структурных, ВИЧ имеет также семь регуляторкых генов: tat - (от англ, transactivator of transcription - ôôàiftâêôèâàôîÔ вирусной транскрипции) - локализован в ДНК провируса в виде двух экзонов: один из них примыкает к З'-концу гена env, а второй расположен в пределах самого гена env. Tat необходим для транскрипции полноразмерной вирусной РНК [Hauber J., 1987, Vogt G.M., 1997]. В отсутствии белка Tat транскрипция вирусного генома прерывается на РНК-транскрипте, состоящем всего из 60-нуклеотидов.

rev - (от англ. regulator of virus - регулятор вируса) - кодирует белок весом 19 kD, фосфорилируемьш посттрансляционно. Показано, что Rev локализуется в ядре клетки-хозяина [Sadaie M.R., 1988J. tro биологическая

функция - обеспечение процесса перехода репликации вируса из ранней стадии экспрессии регуляторных генов в стадию крупномасштабной экспрессии структурных генов ВИЧ. Экспериментально показано, что в отсутствии Rev несплайсированная вирусная РНК активно элиминируется.

vif -(от англ. viral infectivity factor - вирусный инфекционный фактор) кодирует белок с молекулярной массой около 23 kD. Из опытов с направленным мутагенезом гена vif следует, что он не абсолютно необходим для нормальной репликации ВИЧ. Обнаружено, что в отсутствии гена vif образуется меньше зрелых вирионов, чем в случае, когда этот ген присутствует [KanN.C., 1986; Vogt G.M., 1997].

vpr - (от англ. virus protein R - вирусный белок R). Продукт гена vpr -белок, состоящий из 96 аминокислот, и имеющий молекулярный вес 15 kD. Этот белок синтезируется на поздних этапах жизненного цикла вируса и включается в состав зрелых вирионов. Его предназначение - трансактивация транскрипции на ранней стадии инфекции, когда еще не наработано достаточное количество белка Tat [Haseltine W.A., 1992; Garnier L., 1998].

vpu - (от англ. virus protein U - вирусный белок U) - ген, присутствующий только у ВИЧ-1, но не у ВИЧ-2. Кодирует белок с массой 16 kD. Показано, что в клетках инфицированных мутантными по гену vpu вариантами вируса, содержится в 5-10 раз больше поверхностных вирусных белков и продуктов гена pol. Поэтому, возможно, ген vpu играет ключевую роль в морфогенезе инфекции и высвобождению зрелых вирионов [StrebelK., 1988; Garnier L., 1998].

nef - (от англ. negative early factor - отрицательный ранний фактор) -кодирует белок с молекулярным весом 24-25 и 27 kD (две изоформы). Этот белок тесно ассоциирован с мембранами и находится, в основном, в аппарате Гольджи и на мембране ядра. Оказывает транс-супрессорный эффект на репликацию ВИЧ [Ovod V., 1992; Haseltine W.A., 1992].

vpx - (virus protein X) - имеется у ВИЧ-2, но отсутствует у ВИЧ-1. Молекулярный вес продукта - 14 kD. Любопытный факт: Vpx составляет по

массе около 10 % вещества зрелых вирионов ВИЧ-2. В экспериментах in vitro Vpx с высокой авидностью связывается с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами. Функции Vpx in vivo изучены недостаточно [Haseltine W.А., 1992; Vogt G.M., 1997].

Генетическая изменчивость ВИЧ.

Отличительной чертой ретровирусов является необычайно высокая генетическая изменчивость. Частота генетических ошибок для клеток эукариот составляет 10 "7-ИО ошибок/геном/цикл репликации, а для ретровирусов эта величина составляет lO'4-j-lO"^ ошибок/геном/цикл репликации, т.е. на 3+4 порядка выше. Это объясняется, в основном, тем, что обратная транскриптаза, не обладая 3'-5'-экзонуклеазной активностью, не способна исправлять собственные ошибки при синтезе комплиментарной цепи [Roberts J.D., 1988]. Так как геном ВИЧ содержит порядка 10^ нуклеотидов, то становится понятно, что ВИЧ может существовать не иначе, как в виде некоего множества квазивидов. Еще одним молекулярным механизмом увеличения разнообразия вариантов ВИЧ является генетическая рекомбинация [Robertson D.L., 1995; Human retroviruses and AIDS, 1996].

Было показано, что эволюция ВИЧ in vivo идет гораздо быстрее, чем та, которую можно наблюдать при культивировании вируса in vitro [SaagM.S., 1988]. Например, если из организма инфицированного пациента изолируют некий вариант ВИЧ и культивируют его какое-то время in vitro, то уже следующий изолят, полученный от того же пациента, будет существенно отличаться от первого. За тот лее период времени практически не происходит изменений в геноме первого вирусного изолята при культивировании in vitro [FenyoE.M, 1995].

Необычайно высокая изменчивость в наибольшей степени свойственна отдельным участкам гена env. Иммунная система человека, одновременно являясь объектом эксплуатации для ВИЧ, активно реагирует на антигены вируса выработкой антител и сенсибилизированных лимфоцитов. Этот фактор играет

важнейшую роль в эволюционных отношениях вирус-хозяин [Bachmann M.F., 1996; Steinman R.M., 1998]. Gpl20, ответственный за проникновение вирусной частицы, представляет собой главную мишень для развития гуморального иммунного ответа и содержит эпитопы для клеточного иммунного ответа [NaraP.L., 1991; Stoff J., 1998]. Под действием иммунной системы идет отбор наиболее вирулентных вариантов ВИЧ, устойчивых к противовирусным антителам, а чрезвычайно высокая вариабельность gpl20 способствует этому. Однако степень изменчивости неодинакова на разных участках gp 120 : пять гипервариабельных доменов (V1-V5) чередуются с относительно консервативными участками (С1-С4). Функциональные ограничения сужают диапазон возможных аминокислотных замен. Наибольшей изменчивостью обладает поверхностный гликопротеин gpl20, и особенно его третий вариабельный (V3) участок, который содержит V3-петлю, фланкированную консервативными цистеинами в позициях 303 и 337, образующими дисульфидную связь. Молекулярная структура УЗ-петли оказывает существенное влияние на биологические свойства вируса: мутации С303

и/или С337 лишают

вирус инфекционности [Ivanoff L.A., 1991]; УЗ-петля является основной мишенью для выработки нейтрализующих антител [Javaherian К., 1990], хотя они и не препятствуют связыванию gpl20 с CD4 [BackN.K.T., 1995] - основным рецептором для проникновения ВИЧ-1 в клетку; имеет место структурное взаимодействие между УЗ-петлёй и С04-связывающим участком gpl20 [Wyatt R., 1992]; УЗ-петля содержит эпитопы для клеточного иммунного ответа [Takahashi Н., 1992; Steinman R.M., 1998]; замены отрицательно-заряженных и нейтральных аминокислотных остатков в позициях 308-327 на положительно-заряженные вызывают переход от моноцитотропности к Т-клеточному тропизму [Jong De J.J., 1992], от низкого уровня репликации (s/1) - к высокому (r/h) [Tersmette M., 1989], от несинцитиеобразующих (NSI) варианта ВИЧ-1 - к синцитиеобразующим (SI) [Tersmette M., 1989; Koot M., 1992]; кроме того, такие замены делают вирус более чувствительным к нейтрализации растворимым CD4 [Moore J.P., 1992], моноклональными антителами против верхушечного УЗ-

эпитопа [Bou-Habib D.C., 1994] и аутологичной сывороткой [Hogervorst Е., 1995]; при наличии указанных замен УЗ-имитирующие пептиды могут успешно блокировать нейтрализацию [Bou-Habib D.C., 1994], что позволяет предположить наличие взаимосвязи между нейтрализуемостью и доступностью линейных эпитопов V3-петли. Примыкающая к V3 область С2, которую принято считать относительно консервативной, может также характеризоваться вариабельностью [Karamov E.V., 1996].

Механизм взаимодействия анти-УЗ антител с верхушечным эпитопом V3-петли в настоящее время изучен недостаточно, но конфигурация конечного связывания при указанном взаимодействии исследована с помощью рентгеноструктурого анализа [Rini J.M., 1993; Ghiara J.B., 1994]. Было показано, что с антителами взаимодействует 6-10 аминокислотных остатков на изгибе V3-петли, которые содержат GPG-мотив вершины. Исследование функциональных особенностей взаимодействия антител ВИЧ-1-позитивных сывороток с V3-эпитопом gpl20 различного аминокислотного состава является необходимым элементом выяснения этого механизма [Щелканов М.Ю., 1998]. В частности, показано, что имеет место существенное влияние аминокислотных последовательностей верхушечного эпитопа V3 gpl20 различных вариантов ВИЧ-1 и V3-имитирующих синтетических пептидов на взаимодействие в ИФА сывороток с этими пептидами. Выяснено [Yudin A.N., 1998], что специфичность данного взаимодействия определяется аминокислотными остатками в положениях 315 и 320 петли V3 (нумерация соответствует штамму ВИЧ-Imn) и зависит от гидрофобности остатков 314, 316, 321-323. Предложена модель функционирования верхушечного эпитопа УЗ-петли в составе комплекса с антителами [Щелканов М.Ю., 1998].

Субтипы ВИЧ-1 и их географическое распространение.

Филогенетический анализ различных вариантов области C2-V3 (С2 -область, примыкающая к V3, которую принято считать полуконсервативной, однако, она может также демонстрировать значительную вариабельность

[Lukashov V.V., 1996]), а также более протяженных последовательностей генов env и gag приводит к разделению ВИЧ-1 на два крупных таксона: М (Major) и О (Outlier). Первый из них подразделяется на десять субтипов (A-J) [Human retroviruses and AIDS, 1996; Shchelkanov M.Yu., 1997]. Эти субтипы филогенетически дистантны - различие в нуклеотидной последовательности V3-области генов env, принадлежащих к одному субтипу, составляют 5-М 7%, в то время как между субтипами - 20-^35%. Важно подчеркнуть, что дистантность между субтипами ВИЧ-1 сохраняется и на уровне аминокислотных последовательностей [Shchelkanov et al., 1998]. Env-субтипы ВИЧ-1 по-разному представлены в различных географических регионах. Первые публикации о том, что изоляты от пациентов Северной Америки и Европы сильно отличаются (за исключением "сигнальных" сайтов, которые были общими для всех изолятов) появились в 1985 году [Benn S., 1985]. Было показано, что генетические вариации сконцентрированы в области гена env и установлено, что в некоторых регионах мира преобладает один или ограниченное число субтипов ВИЧ-1 [Human retroviruses and AIDS, 1996]. Так, например, субтип А доминирует в Северной и Южной Америке, Западной Европе [Barin F., 1996; Lukashov V.V., 1996; Irwin K.L., 1997; Hamers F.F., 1998]; субтипы А, С, D, E, G и FI обнаруживаются в Африке [Kanter A.S., 1997; HoelscherM., 1998]; субтип С обнаружен в Индии [Dietrich U., 1995]; субтип Е - в Таиланде [Pau С.Р., 1993]; субтип F - в Румынии [Apetrei С., 1998] и Бразилии [Couto-Fernandez J.C., 1994]. Восемь различных субтипов ВИЧ-1 (А, В, С, D, Е, F, G и Н) выявлены у ВИЧ-1-инфицированных на территории бывшего СССР [Lukashov V.V., 1995; Bobkov А., 1994, 1997; KaramovE.V., 1996; Leitner et al., 1996; Yudin A.N., 1996; Burunova V.V., 1998; Yaroslavtseva N.G., 1997, 1998; Gorbacheva A.P., 1998; Щелканов М.Ю., 1998; Lukashov V.V., 1998]. Высоко гомогенный субтип А был обнаружен среди внутривенных наркоманов в Белоруссии [Lukashov V.V., 1998], на юге Украины и в Центральной России [Bobkov А., 1994]. Присутствие большого числа субтипов ВИЧ-1, а также высокое генетическое разнообразие в пределах одного субтипа, является одной из характеристик ранней фазы

эпидемии ВИЧ/СПИД [Козлов А.П., 1997], связанной с множественным и независимым проникновением различных вариантов вируса. С развитием эпидемии происходит селекция доминантного субтипа (или субтипов) ВИЧ-1.

Генетическому разнообразию географически различных вариантов ВИЧ-1 соответствует и существенные антигенные отличия. Показано, что антигенные изменения в различных эпитопах ВИЧ-1, в частности, УЗ-петле gpl20 и, как следствие, изменение УЗ-серотипа, можно достаточно просто определить изменением реактивности антител в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с пептидами, имитирующими фрагменты УЗ-петли [Ярославцева Н.Г., 1996, 1997]. При этом отмечено, что наличие антител к V3-имитирующим пептидам коррелирует с нейтрализующей активностью сыворотки.

Фенотипические свойства различных вариантов ВИЧ-1.

Чрезвычайно высокая антигенная изменчивость ВИЧ приводит к широкому разнообразию фенотипических свойств первичных изолятов этого вируса: уровня репродукции, спектра клеточного тропизма и степени цитопатогенности. Фенотипическая классификация ВИЧ включает в себя таксономическую дифференцировку по уровню репродукции (rapid/high- (r/h-) и slow/low- (s/1-) варианты, то есть сильные/быстрые и слабые/медленные) и синцитиеобразующей активности (syncytium-induced/non-syncytium-induced (SI/NSI-), то есть синцитиеобразующие и несинцитиеобразующие варианты. R/h-варианты ВИЧ характеризуются высоким репликативным потенциалом - за короткий срок продукция вирионов при культивировании in vitro быстро достигает своего максимума. Они способны вызывать хроническую инфекцию в культурах клеток лимфобластоидного и моноцитарного ряда. Для s/1-вариантов ВИЧ характерен низкий уровень репродукции, достигающий своего максимума за длительный период [Asjo А., 1986; Fenyo Е.М., 1996]. R/h- и s/1-варианты ВИЧ обладают также различными уровнями цитопатогенности. Кроме того, показано существование вирусных вариантов с промежуточными репликативными характеристиками [Пашкова Т.А., 1998].

Полученные изоляты ВИЧ от одного человека на протяжении определенного времени показывают, что отбор идет в сторону более агрессивных по отношению к макроорганизму вариантов [Fiore J.R., 1990; Хаитов P.M., 1992]. От бессимптомных пациентов изолируются варианты ВИЧ, для которых, как правило, свойственна относительно медленная и низкопродуктивная репликация (так называемые "slow/low" варианты, то есть "медленные/слабые"). По мере того как заболевание прогрессирует, от того же пациента изолируются варианты ВИЧ с быстрой и продуктивной репликацией ("rapid/high", то есть "быстрые/сильные").

ВИЧ имеет основной рецептор на клетках - CD4. Ранние экспериментальные работы показали, что молекулы CD4 экспрессируются подклассом человеческих Т-лимфоцитов, а именно Т-хелперами [Redmond S., 1984], и сейчас они используются как специфические маркеры для описания этого класса клеток. Молекулы CD4 участвуют вместе с Т-клеточным рецептором в распознавании антигенных детерминант, экспрессированных на поверхности антигенпрезентирующих клеток [Lifson J.D., 1989]. CD4 является одноцепочечным гликопротеином, включающим в себя 433 аминокислоты. В Т4-лимфоцитах основная масса CD4 экспрессирована на наружной мембране клетки. Так как молекула CD4 является трансмембранной, она подразделяется на внеклеточный участок, состоящий из 372 аминокислот, внутримембранный участок из 23-х аминокислот, и цитоплазматический участок, состоящий из 38 аминокислот. Внеклеточный участок, который состоит из 4-х доменов (V1-V4), имеет значительный процент гомологии с вариабельными областями молекул иммуноглобулинов. Самый наружный N-концевой домен называется VI доменом и имеет 35% гомологии по аминокислотному составу с V-областью к-цепи иммуноглобулинов. И, предполагается, что именно в этом домене локализовано место, непосредственно связывающееся с gpl20 ВИЧ. Прямое связывание вирусного оболочечного белка gpl20 с молекулой CD4 на клетке или растворимой формой CD4 было продемонстрировано в 1984 году [Dalgleish A.G., 1984], причем эта связь является высокоавидной: константа

диссоциации gpl20 и CD4 составляет 10~9 М. Укороченные варианты CD4 и его рекомбинанты, содержащие только VI-домен, были способны ингибировать ВИЧ-инфекцию в культуре клеток [Arthos J., 1989; Bates P.A., 1989]. Детальное картирование этого домена с помощью сайт-направленного мутагенеза и анти-CD4 моноклональных антител [Arthos J., 1989; Bates P.A., 1989; Sattentau O.J., 1989; Wilks D., 1990] позволило определить два принципиально важных участка: первый, в районе аминокислот 38-70, который распознается блокирующими антителами, и по-видимому, является первичным рецепторным сайтом; второй, в районе 75-100 может играть решающую роль в процессе вирусиндуцированного слияния клеток (образовании синцитиев), что было показано с помощью мутантных молекул CD4 человека и обезьяны [Camerini D., 1990]. Работы по направленному мутагенезу выявили, что в непосредственном связывании с gpl20 задействован участок молекулы CD4 с 31 по 57 аминокислоту. Кроме области непосредственного связывания есть также участки, модификация которых дистантно влияет на реакционную способность самого сайта связывания, вплоть до полного исчезновения этой реакционной способности [Mizukami Т., 1988]. Об этом свидетельствует, например, тот факт, что блокировать связывание CD4 с gpl20 могут не только анти-С04 антитела, конкурирующие с gpl20 за сам сайт связывания, но и направленные к другим участкам молекулы CD4. Но одного только связывания вириона с рецептором CD4 на клеточной мембране еще недостаточно для проникновения внутрь клетки. После собственно рецепции вируса следует цепь молекулярно-биохимических событий. После связывания вирусного gpl20 с клеточным CD4 происходит также быстрое фосфорилирование цитоплазматического участка молекулы CD4, катализируемое клеточной протеинкиназой. Кроме того, к началу 90-х годов стало понятно, что экспрессии одного CD4 на мембране клетки-мишени недостаточно - необходимо присутствие других молекул на поверхности клеточной мембраны [Harouse J.M.., 1991] (поиск корецепторов для проникновения ВИЧ в клетку будет рассмотрен нами далее).

Таблица 1. Прямые клетки-мишени для ВИЧ в организме человека.

Тип дифференцированных клеток Наличие рецептора СБ

КРОВЕНОСНАЯ СИСТЕМА:

Т4-лимфоциты +

Т8-лимфоциты +

Клетки Лангерганса/дендритные клетки +

Моноциты/макрофаги +

В-лимфоциты +

Эозинофилы +

Мегакариоциты +

НЕРВНАЯ СИСТЕМА:

Нейроны +

Микроглия +

Астроциты ?

Фибробластоподобные клетки мозга -

Клетки эндотелия кровеносных сосудов мозга -

О л игод ендр оциты ?

ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА:

Эпителиальные клетки кишечника ?

М-клетки ?

ДРУЕИЕ:

Клетки хорионтрофобласта плаценты +

Сперматозоиды +

Опосредованное через рецептор СБ4 проникновение внутрь клетки-мишени является специфическим путем. Известны также неспецифические пути инфицирования (независимые от молекулы СБ4): например, проникновение, опосредованное рецепцией иммунного комплекса ВИЧ-антитело клеточным

рецептором для Бс-фрагмента молекул иммуноглобулинов. Неспецифическим путем инфицируются также клетки, имеющие рецептор для гамма-интерферона: вирион проникает внутрь, в комплексе с ним. ВИЧ инфицирует и другие клетки, не экспрессирующие CD4 рецептор или его подобие, но точные молекулярные механизмы этих путей инфицирования пока не установлены. По-видимому, в организме способов инфицирования клеток ВИЧ больше, чем удается смоделировать в культуре клеток in vitro. Типы клеток, для которых установлен факт ВИЧ-инфекции, перечислены в табл. 1.

Таким образом инфекцию ВИЧ нельзя считать локализованной только в иммунной системе человека - ВИЧ пантропен. Вирус обнаруживают иммуногистохимическим и микроцитофлуорометрическим методом, полимеразной цепной реакцией, гибридизацией нуклеиновых кислот in situ и т.д..

Тропизм вируса зависит, с одной стороны, от естественного разнообразия ВИЧ, с другой стороны, от природного разнообразия клеток-мишеней и способов их инфицирования. Изоляты ВИЧ-1, тестируемые in vitro, демонстрируют различный цитотропизм. Одни изоляты эффективно реплицируются в Т-клеточных линиях (Т-тропные) или в других линиях клеток человека, экспрессирующих CD4, но при этом имеют низкий уровень репликации в клеточных линиях моноцитарного происхождения. Другие вирусные изоляты селективно инфицируют преимущественно моноциты/макрофаги (М-тропные) и слабопродуктивны в лимфобластоидных клеточных линиях. Более того, некоторые изоляты ВИЧ-1 обладают двойным тропизмом, т.е. как Т-, так и М-тропностью [Berger Е.А., 1997]. Характерно, что в течение асимптоматичной фазы ВИЧ-инфекции от пациента, как правило, изолируются М-тропные варианты вируса. Позднее, при прогрессии заболевания, от того же пациента изолируются уже Т-тропные варианты. Причем Т-тропные изоляты имеют чаще всего фенотип r/h и SI, в то время, как М-тропные варианты вируса чаще всего бывают s/1 и NSI фенотипа [Asjo А., 1986; FenyoE.M., 1996; Bastiani L., 1997; Almond N.M., 1998].

Свойства клеточного тропизма у различных вариантов ВИЧ, как показывает опыт, способны изменяться и при культивировании in vitro. Если свежевыделенный из организма пациента пул ВИЧ-1 (смесь квазивидов) способен инфицировать мононуклеары периферической крови здорового донора, причем как Т4-лимфоциты, так и моноциты/макрофаги, то после культивирования in vitro в течение длительного времени биологические свойства вируса изменяются. При этом так называемые лабораторные штаммы ВИЧ, адаптированные к размножению в лимфобластоидных клеточных линиях, уже не способны эффективно инфицировать линии клеток моноцитарного ряда, хотя in vivo моноциты/макрофаги несомненно являются мишенью для ВИЧ [Hwang, 1991].

Выше уже упоминалась роль gpl20 в ВИЧ-индуцированном слиянии мембран и недостаточность присутствия одного лишь CD4-penemopa на поверхности клетки-мишени. Согласно последним данным, для успешной пенетрации вириона необходимы кофакторы (корецепторы) адгезии и проникновения, находящиеся на цитоплазматической мембране клетки-мишени. Такими кофакторами проникновения оказались хемокиновые рецепторы, в большинстве своем принадлежащие к двум суперсемействам: СС и СХС [Endres M.J., 1996; Berger Е.А., 1997]. Молекулы этих хеморецепторов состоят из семи трансмембранных сегментов, связывающихся с G-белками. Елавным отличием их друг от друга является расположение двух первых остатков цистеина (у СС-хеморецепторов они находятся по соседству, а у СХС-хеморецепторов -разделены одним аминокислотным остатком).

Для Т-тропных изолятов характерны корецепторы проникновения, принадлежащие суперсемейству СХС: CXCR4 [Endres M. J., 1996]; L5 [HerzongH., 1993]; D2S201E [Federsppiel В., 1993]; hFB22 [Jazin E.., 1993]; FIM89 [Nomura H., 1993]; LESTR [LoetsherM., 1994]. М-тропные варианты ВИЧ используют молекулы СС суперсемейства: CCR1, CCR4 [DragicT., 1996], CCR2B, CCR3 [Doranz B.J., 1996], CCR4, CCR5 [Simmons G., 1996], RANTES [Alkhatib G., 1996]. При изучении генов ВИЧ-1 было показано, что спектр

клеточного тропизма, репликативный потенциал и цитопатогенный эффект ВИЧ-1 программируются всего лишь малыми участками последовательностей нуклеотидов в пределах гена env. При сравнении изолятов, обладающих различным клеточным тропизмом, а значит, использующим различные наборы корецепторов, обнаружилось различие в УЗ-петле gpl20. Дальнейшие исследования этой области генома ВИЧ-1 подтвердили ведущую роль структуры V3-петли gpl20 в изменении цитотропизма вируса, хотя не менее важным оказалось ее взаимодействие с другими участками молекулы, в частности, VI- и У2-областями [Berger Е.А., 1997].

Т-тропные штаммы ВИЧ-1 плохо инфицируют клетки нервной ткани. При изучении редких изолятов, обладающих нехарактерным тропизмом, было показано, что в последовательности GPGR V3-петли gpl20 присутствовали замены пролина на серии, аланин или треонин [Shimizu N.S., 1994], то есть главным образом верхушечная часть УЗ-петли несет ответственность за тропность вируса к различным линиям клеток. При точечных мутациях в УЗ-петле и замене в ней положительно заряженных аминокислот на отрицательные также будут изменяться биологические свойства вируса: тропизм к Т-клеточным лимфобластоидным линиям будет утерян. При изучении взаимосвязи между генотипом и фенотипом вирусного изолята было выяснено, что изменения в V3-области меняет не только спектр клеточного тропизма - достаточно несколько точечных аминокислотных замен в УЗ-области, чтобы вирус из s/1-варианта превратился в r/h-вариант, а его цитопатогенные свойства изменились от NSI до SI [Jong De J.J., 1992]. Обнаружилось, что для штаммов ВИЧ с SI-фенотипом характерно по меньшей мере два положительно заряженных остатка в верхушке УЗ-петли. Такая структура позволяет создавать сильное электростатическое взаимодействие с остатками Сахаров молекулы CD4 [Bhattacharyya D., 1996]. Это свойственно всем вирусным изолятам с SI-фенотипом и может определять их биологические свойства. Но до сих пор точная корреляция между структурой gpl20 и фенотипом ВИЧ однозначно не установлена и нуждается в дальнейшем исследовании.

Существует взаимосвязь между нейтрализационными свойствами изолятов ВИЧ и спектром клеточного тропизма. Так, если провести селекцию вирусов, которые бы стали хорошо культивироваться в клетках нервной ткани, а до этого обладали двойной М- и Т-ропностью, то моноклональные антитела, эффективно нейтрализующие изоляты ВИЧ до отбора уже не будут эффективны по отношению к полученным селектированным штаммам [McKnight А., 1995].

Анализ синцитиеобразующей активности клинических изолятов ВИЧ-1 показал [Пашкова Т.А., 1998], что на стадии В2 и С2 (классификация CDC) SI-варианты встречаются только для серотипа D, а на стадии ВЗ спектр SI-вариантов достаточно широк (А-, В- и С-серотипы). Кроме того, если сравнивать количество SI и NSI вариантов на стадиях А2, В2, ВЗ, С2 и СЗ, то можно сделать вывод, что на стадии ВЗ в основном изолируются вирусы с SI-фенотипом. IIa более ранних стадиях заболевания (А2 и В2) преимущественно изолируются NSI-варианты ВИЧ-1. Более высокий уровень экспрессии вирусных антигенов регистрируется для r/h-вариантов ВИЧ-1 с SI-фенотипом. Однако не для всех SI-вариантов характерно быстрое достижение пика репликации [Пашкова Т.А., 1998]. Тем не менее, взаимосвязь между серо- и фенотипом различных вариантов ВИЧ нуждается в дальнейшей детализации.

Внутриклеточные факторы, влияющие на фенотип ВИЧ-1.

Промоторы-энхансеры ВИЧ-1 расположены в последовательности U3 LTR. Область U3 обычно имеет длину 454 нуклеотида и содержит сайты связывания для многих транскрипционных факторов. Некоторые из них представлены на рис.4.

Генетические исследования в культурах клеток показывают, что активации промоторов ВИЧ, в первую очередь, способствуют NF-kB, Spl, ТАТАА-бокс (положения от +1 до -105 [Berkhout В.,1992]. Тем не менее, и другие связывающиеся с ДНК факторы, вероятно, также способствуют репликации ВИЧ in vivo. Сайты связывания для АР-1 и COUP (представитель суперсемейства стероидных/тироидных рецепторов [Coney A.J., 1991]) были

обнаружены между -324 и -354 позициями в U3. И COUP, и АР-1 экспрессируются в человеческих Т-клетках, и, таким образом, могут конкурировать друг с другом за сайты связывания в провирусной ДНК при ВИЧ-1-инфекции [Baldwin А., 1994].

-357 -324 AP-1/coup

-254 -216 NFAT

-174 -159 USF/NRF

-105 -80 NFkB

-45 Sp1 WA

TAR

LEF-1 -142-122

PRDII-BF1

LBP LBP IST

USF PRDII-BF1 YY1 -17 +25

Рис.4. Расположение сайтов в U3 и R для некоторых ДНК-связывающих белков.

Между -216 и -254 позициями обнаружен мотив связывания для ядерного фактора из активированных Т-клеток (NFAT; [Shaw J.P., 1988]). NFAT является промежуточным звеном в цепи передачи сигнала, инициированного антигенным рецептором Т-клеток. Последние данные позволяют предположить, что NFAT -связанная активность зависит от трёх отдельных полипептидов: NFATp, Fos и Jun [McCaffrey P.G., 1993].

Между -159 и -174 позициями имеется консенсус последовательностей для связывания USF. USF был сначала охарактеризован как позитивный активатор позднего транскрипционного фактора аденовирусов [Gregor P.D., 1990]. Интересно отметить, что USF также связывает ещё одну последовательность (-5 к +1), которая окружает инициатор ВИЧ-1 [Hu Y., 1993]. Взаимодействие USF с сайтом, примыкающим к началу инициации, активирует мощную экспрессию с ТАТАА-бокса [Hu Y., 1993]. Был клонирован и

охарактеризован отличающийся от USF фактор (TFE3), который однако связывается с теми же самыми последовательностями ДНК [Beckmann Н., 1991].

В LTR ВИЧ-1 имеются мотивы NF-kB [Niederman Т.М., 1992] и Spl [Jones К.А., 1986]. Эти последовательности непосредственно участвуют в вирусной репликации [Millhouse S., 1998], вирусной транскрипции [Jones К.А., 1985] и Tat-трансактивации [Harrich D., 1997]. Более подробное обсуждение биохимических и функциональных свойств NF-kB и Spl представлено в многочисленных обзорах [Jankowski J.M., 1987; Letovsky J., 1989; Dynan W.S., 1989].

Имеется ряд сообщений о сайтах для ДНК-связывающих белков в геноме ВИЧ-1, которые расположены ниже +1 позиции [Mallardo М., 1996]. Эти сайты включают мотивы NF-kB, а также сайты для АР-1, АР-3, DBF-1 Spl [Baldassarre F., 1995].

Химиотерапия ВИЧ-инфекции и СПИДа.

После установления инфекционной природы СПИДа и выделения в 1983-1984 гг. этиологического агента - ВИЧ [Barre-Sinoussi F., 1983], для лечения этого заболевания был предложен ряд подходов, эффект которых был изучен как на моделях in vitro, так и в клинике. Терапевтические мероприятия, примеряемые в настоящее время в лечении больных СПИДом, можно разделить на две группы. Целью первой группы мероприятий является воздействие непосредственно на репродукцию вируса [Lori F., 1994; HavlirD.V., 1998; Hammer S.M., 1998; DeGruttola V., 1998], второй - лечение вторичных инфекций, коррекция иммунных нарушений, неврологических расстройств и других патологических нарушений, обуславливаемых ВИЧ-инфекцией [Хаитов P.M., 1992; Pantaleo G., 1998; Vella S, 1998].

В настоящее время показано, что подавление репродукции ВИЧ возможно практически на всех стадиях жизненного цикла вируса (по крайней мере, in vitro), а именно:

1. Адсорбция вируса на клетке мишени и проникновение вируса в клетку подавляется:

■ нейтрализующими антителами;

■ растворимым белком CD4 либо пептидами, имитирующими различные его области;

■ соединениями полисахаридной природы.

2. Этап обратной транскрипции:

■ антисмысловыми олигонуклеотидами;

■ антителами к ревертазе;

■ модифицированными нуклеозидами и соединениями ненуклеозидной природы, ингибирующими процесс обратной транскрипции.

3. Трансактивация:

■ антисмысловыми олигонуклеотидами к фрагментам генов tat и vpr;

■ антителами к Tat и Vpr.

4. Гликозилирование белков ВИЧ:

■ ингибиторами гликозилирования.

5. Протеолитическое расщепление белков-предшественников функционально-активных белков ВИЧ:

■ ингибиторами протеиназ.

Кроме того, имеется целый ряд воздействий, обладающих неоднозначно охарактеризованным механизмом подавления ВИЧ (ультрафиолет, кислород, озон, тепловой шок, антиоксиданты и др.). Большинство исследователей сходятся во мнении, что наиболее предпочтительной мишенью для химиотерапии ВИЧ является стадия обратной транскрипции и ключевой элемент этой стадии - вирусная ревертаза (Краевский A.A., 1992; Kraevsky A.A., 1992; Карамов Э.В., 1994).

Азидотимидин (AZT, АЗТ, зидовудин, ретровир, 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин) является одним из основных химиопрепаратов для терапии ВИЧ-инфекции и профилактики СПИДа [Baizarini J., 1993]. Его применение улучшает клиническое состояние пациентов, предотвращает возникновение

"оппортунистических" инфекций, продлевает жизнь некоторым больным в среднем на 1-1.5 года (имеется в виду, без комбинаций с другими химиопрепаратами - см. далее). Показано, что эффективность азидотимидина при СПИДе связана с подавлением репликации ВИЧ. Содержание маркеров ВИЧ-инфекции - вирусного белка р24 [Vrang L., 1987] и количества копий вирионной РНК в плазме [DeGruttola V., 1998] - снижается у больных СПИДом не менее чем в 5-10 раз. Установлено, что для проявления антивирусного эффекта AZT должен проникнуть в клетку и подвегнуться фосфорилированию с помощью клеточных киназных систем. Трифосфат АЗТ является субстратом для вирусной обратной транскриптазы и ингибирует синтез вирус-специфической ДНК. Первый возможный механизм ингибирования - это терминация элонгации вновь синтезируемой цепи провирусной ДНК, так как З'-ОН группа в AZT замещена ^-группой [Larder В., 1991]. Другим механизмом анти-ВИЧ активности считают конкуренцию трифосфорилированной формы AZT и dTTP за связывание с обратной транскриптазой ВИЧ.

Эффективность применения AZT против ВИЧ-инфекции существенно снижается вследствие существования и селективного отбора AZT-резистентных вирусных вариантов. В 1989-1990 годах одновременно несколько исследовательских групп [Larder В.А., 1989; Boucher C.A.B., 1990; Mohri H., 1990] обнаружили изоляты ВИЧ-1, обладающие пониженной чувствительностью к AZT. Методика выявления таких изолятов обычно состоит в выделении мононуклеаров периферической крови от ВИЧ-инфицированных, длительное время получавших азидотимидин, и сокультивации этих лимфоцитов с мононуклеарами периферической крови здорового донора и/или клетками одной из пермиссивных для ВИЧ трансформированных клеточных линий. После обнаружения продукции вируса, полученные изоляты проверяют на чувствительность к АЗТ с помощью различных тестов. Именно таким способом Larder с соавт. [Larder В.А., 1989] первыми показали, что чувствителтность к азидотимидину для изолятов, полученных от одних и тех же больных до и

после курса AZT-терапии отличается на несколько порядков. Оригинальная модификация этого подхода используется и в данной диссертационной работе.

Сравнение чувствительностей двух вирусных вариантов к химиопрепарату, как правило, осуществляют, сравнивая 50%-ые эффективные дозы (ED50; Effective Dose of 50%-level) этих вирусных изолятов на одной и той же клеточной модели. ED50 определяется как концентрация химиопрепарата, приводящая к снижению уровня репродукции ВИЧ на 50% по сравнению с контрольным образцом без химиопрепарата. Следует подчеркнуть, что величина ED50, вообще говоря, зависит как от использованной дозы заражения, так и от способа детекции уровня вирусной репродукции (поликлональный или моноклональный ИФА, измерение уровня обратной транскриптазы, определение жизнеспособности клеточной культуры, количественный РНК- или ДНК-ПЦР). Так, для AZT-чувствительных вариантов ВИЧ величина ED50 лежит в пределах 0.01-0.05 мкМ; для слабочувствительных к AZT вариантов - 0.05-1.00 мкМ; для AZT-резистентных вариантов - более 1 мкМ [Larder В.А., 1989; Карамов Э.В., 1994].

Наиболее очевидным молекулярным механизмом AZT-резистентности являются мутации в гене pol, кодирующем обратную транскриптазу ВИЧ. Сравнительный анализ генетических последовательностей гена pol AZT-чувствительных и AZT-резистентных вариантов ВИЧ-1 выявил следующие замены, ассоциированные с AZT-резистентным фенотипом: 41 (Met Leu), 67 (Asp -> Asn), 70 (Lys Arg), 215 (Thr -> Phe Tyr), 219 (Lys Gin) [Kellam P., 1992; Larder В., 1991, 1992; Feinberg M., 1997; Degruttola V., 1998]. Было установлено, что первая мутация возникает в ко доне 70, затем - в ко доне 215. Более поздние изоляты включают мутации в позиции 41. После дальнейшей терапии вновь возникает мутация в кодоне 70, вместе с мутациями в позициях 67 и 219 [Boucher С.А., 1992]. AZT-резистентные варианты ВИЧ-1 могут существовать в организме инфицированного пациента еще до начала AZT-терапии [Larder В., 1992]. Описаны случаи реверсии от AZT-резистентных к чувствительным вариантам вируса [Boucher C.A.B., 1993; Degruttola V., 1998].

Помимо мутаций в гене pol, AZT-резистентность может ассоциироваться и с мутациями в гене env, кодирующем поверхностные гликопротеины gp41 и gp 120. Такие мутации могут изменять вирусный фенотип, и в частности - модулировать фузионные свойства gpl20, определяющие синцитиеобразующую активность вируса. Синцитиеобразующие (SI; Syncytium-Induced) варианты ВИЧ в процессе AZT-терапии могут иметь селективное преимущество перед несинцитиеобразующими (NSI; Non-Syncytium-Induced) вариантами, так как способны репродуцироваться минуя стадию обратной транскрипции [Карамов Э.В, 1994].

Аналогичные механизмы лежат и в основе формирования резистентности и к другим ингибиторам обратной транскриптазы. Например, резистентность к ddl (дидезоксиинозин, диданозин) - нуклеозидному аналогу - ассоциирована всего с одной заменой валина на лейцин в 74 кодоне [Clair М.Н., 1991]. Множество работ продемонстрировало появление кросс-резистентности, при которой резистентный вирус, возникающий под селективным давлением одного антивирусного агента является дополнительно резистентным к другому антивирусному препарату. Единственная мутация в 74 кодоне приводит также к резистентности к ddC (дидезоксицитидин, зальцитабин). Замена в 69-ой позиции треонина на аспартат (Thr Asp) наблюдались в вирусах, изолированных от пациентов, получавших ddC [Fitzgibbon J.E., 1992]. Мутация в кодоне 75 (валин -» треонин) приводит к устойчивости к с!4Т (дидегидродезокситимидин, ставу дин). Наличие этой аминокислотной замены несет перекрестную резистентность к ddl и ddC [Lacey S.F., 1994]. Резистентность возникает и к ингибиторам обратной транскриптазы ненуклеозидной природы [Nunberg J.H., 1991; Mellors J.W., 1993; ], и к ингибиторам вирусной протеазы [Roberts N.A., 1990; Otto M.J., 1993].

В настоящее время, надежно установлено, что наиболее эффективным подходом к химиотерапии ВИЧ-инфекции и профилактике СПИДа является комбинация нескольких препаратов. Сочетание действия нескольких препаратов позволяет усилить противовирусный эффект, преодолеть резистентность и

оптимизировать дозы химиопрепаратов. Вместе с тем, следует помнить о таких эффектах, как межлекарственная резистентность, антагонизм и синергичная токсичность химиопрепаратов [Merrill D.P., 1997; Murphy R., 1997]. В частности клинические исследования подтвердили выводы, сделанные при анализе результатов экспериментов in vitro, об антагонизме между AZT и d4T [Hoggard P.G., 1997]. Антагонизм имеет место и при сочетании двух ингибиторов вирусной протеазы или же вирусной протеазы и обратной транскриптазы ненуклеозидной природы [HavlirD.V., 1998].

Наиболее обсуждаемой в последние 2 года была комбинация {индинавир + ламивудин (ЗТС) + зидовудин (AZT)} [Cavert W., 1997; Carpenter С.С.J., 1997; GulickR.M., 1997; HavlirD.V., 1998]. Широкое распространение получила комбинация {d4T + ЗТС}. В контексте сочетания с другими препаратами, у исследователей и клиницистов возобновился интерес к ddl и d4T [Kalathoor S., 1997].

Среди новых эффективных комбинаций следует назвать комбинацию {диданозин (ddl) + ставудин (d4T) + гидроксимочевина (HU)}. Гидроксимочевина ингибирует активность клеточного фермента рибонуклеотидредуктазы, усиливая тем самым метаболизм нуклеозидных аналогов [Lori F., 1994]. При этом, любопытно отметить, что изначально сочетание {ddl + d4T} считалось неудачным из-за синергичной токсичности по отношению к клеткам периферической нервной системы. Однако достаточно низкие дозы этих препаратов оказались пригодными в составе указанного триплекса в субтоксических концентрациях. Применение {ddl + d4T + HU} позволяет в 1()1-3 раз снизить концентрацию РНК ВИЧ в плазме инфицированных пациентов и удерживать вирусную нагрузку на постоянном уровне - причем даже у тех пациентов, которые имели концентрацию CD4+-клеток ниже 200 кл/мм^ [Pollard R., 1996]. Еще лучшего результата удается достигнуть при сочетании указанного триплекса с ингибитором вирусной протеазы, в частности - с нелфинавиром, новым ингибитором вирусной протеазы, успешно прошедшим клинические испытания [Pedneult L., 1997].

Большой интерес проявляется к сочетанию различных ингибиторов вирусной протеазы. Так, хорошие результаты показали {ритонавир + SAQ} (90%-ое снижение вирусной нагрузки) [Cameroon D.W., 1997] и {нелфинавир + SAQ} (100-кратное снижение вирусной нагрузки) [Cravcik S., 1997].

В настоящее время, в стадии клинических испытаний находятся АВТ-378 (ингибитор протеазы, эффективный в сочетании с ритонавиром in vitro), PNU-140690 (непептидный ингибитор протеазы, хорошо сочетающийся с нелфинавиром) и Т-20 (ингибитор ВИЧ-индуцированного слияния мембран) [Havlir D.V., 1998].

Все описанные схемы химиотерапии чувствительны к индивидуальным особенностям инфекционного процесса у конкретного пациента. Кроме того, комбинированная химиотерапия ВИЧ-инфекции является весьма дорогостоящим мероприятием, и уже по чисто экономическим причинам не оставляет лечащему врачу возможности широкого перебора возможных схем. Поэтому большое практическое значение имеет доклинический анализ in vitro эффективности возможных химиотерапевтических подходов, чему и посвящен один из разделов данной диссертационной работы.

ЧАСТЬ II.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ВИЧ-инфицированные пациенты.

В данной работе использовались МПК и сыворотки крови тридцати шести ВИЧ-инфицированных пациентов: двадцать девять из них проходили медицинское наблюдение и курс лечения в Институте иммунологии МЗ РФ (Москва) (лечащий врач - Папуашвили Марина Нодаровна) и в Клинической инфекционной больнице N 2 г. Москвы (лечащий врач - Иванников Евгений Васильевич); семь пациентов - в районной поликлинике г. Светлогорска (Гомельская область Беларуси) (лечащий врач - Гадынская Нина Ивановна). Пациенты находились на различных стадиях ВИЧ-инфекции, и особенности их клинического статуса обсуждаются далее в соответствующих разделах данной главы.

Клеточные культуры.

Использовались следующие лимфобластоидные CD4+ клеточные линии: Н9 [Mann D.L., 1989; Popovic М., 1984; Popovic М., 1984] СЕМ, СЕМ NC", МТ-4, МТ-2, СЕМ-SS [Foley G.M., 1965; NaraP.L., 1987; NaraP.L., 1988] Sup-Tl [Smith S.D., 1984]; а также CD4+ клеточная линия THP-1 моноцитарного происхождения. Все линии клеток содержатся в коллекции клеточных линий группы иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и были получены в рамках программы NIH AIDS Research and Reagent Program. Все перечисленные выше клеточные линии являются суспензионными. Их культивирование осуществлялось в ростовой среде (PC) следующего состава: RPMI-1640 (Институт полиомиелита, Россия), 8-15 % сыворотка плодов крупного рогатого скота (Sigma, США); 300 мкг/мл L-глутамин (Sigma, США); 50-100 мкг/мл сульфат гентамицина (Sigma, США). Клетки выращивали в 50 мл

пластиковых флаконах (Costar, США) при 37°С и 5 % С02. Пересев проводили каждые 3-4 дня; посевная концентрация клеток 2-106 кл/мл.

Монослойные клеточные линии астроцитарного происхождения U373/CD4/ CCR5 и U373/CD4/CXCR4, трансформированные для экспрессии CD4 и CCR5 или CXCR4, культивировали в среде следующего состава: DMEM (Институт полиомиелита, Росия), 10% сыворотка плодов крупного рогатого скота (Sigma, США); 300 мкг/мл L-глутамин (Sigma, США); 50-100 мкг/мл сульфат гентамицина (Sigma, США); ростовой фактор G418 (Sigma, США); 20 ед/мл бычий инсулин (Sigma, США). Пересев производился с помощью трипсин-версеновой смеси (1:1). При заморозке использовали 50 мкг/мл гидромицин В и/или пуромицин. Клетки выращивали в 25 и 50 мл флаконах (Costar, США). Пересев производили каждые 5-6 дней; посевная доза 3-Ю6кл/мл.

Вирусные штаммы.

Использовали культуральный супернатант ВИЧ-1 инфицированных линий H9rf, MT-4IIIB, Sup TlA2i6 из коллекции группы иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В ряде экспериментов были использованы штаммы BH4-lZmb, BH4-lShm-i и ВИЧ-1§11т-2, любезно предоставленный д.б.н. Ереминым Владимиром Федоровичем (НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск) [Рытик П.Е., 1990].

Культуры донорских мононуклеаров периферической крови (МПК).

Выделение МПК из цельной крови здоровых доноров, полученной в результате венепункции с соблюдением всех необходимых медицинских требований, проводили по следующей методике [Лимфоциты, 1990]: 15 мл гепаринизированной (13 ед/мл) крови разводили равным объемом раствора Хенкса или RPMI-1640 (Институт полиомиелита, Россия), стерильно переносили в 50 мл центрифужную пробирку (Costar, США) с предварительно наслоенными

на дно пробирки 15 мл раствора фикол-верографина (1.078 г/см). После центрифугирования (1500 g х 20 мин) на границе раздела фаз наблюдается опалесцирующее кольцо МПК, содержимое которого осторожно отбирается и переносится в стерильную пробирку, разбавляют средой RPMI-1640 (1:2) и центрифугируют (1000 g х 10 мин). Осадок клеток ресуспендируют в PC и после подсчета числа выделенных МПК помещают в 50 мл пластиковые флаконы (Costar, CUTA) из расчета 1-106-2-106 кл/мл и добавляют митогенный стимулятор фитогеммагглютинин (ФГА) до конечной концентрации 5 мкг/мл. Инкубация с ФГА проводится в течение 48 ч при 37°С, 4% С02. Затем МПК переводят в PC, содержащую 1 % природного интерлейкина-2 (ИЛ-2) (Sigma, США). Замену среды проводили каждые 3-4 дня.

Определение числа жизнеспособных клеток с помощью исключающего витального красителя трипанового синего.

Исходный раствор (2 %) трипанового синего (Sigma, США) готовился на основе буферного раствора Хенкса (Институт полиомиелита, Россия) и хранился при +4°С в темном месте не более месяца. Исходный раствор добавляли к исследуемому образцу в разведении 1:10. Визуальный подсчет производили в камере Горяева [Virologische praxis, 1968].

Определение числа жизнеспособных клеток с помощью МТТ-теста.

Суть метода состоит в способности живых клеток редуцировать желтую водорастворимую соль - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана [Mosmann Т., 1983]. Интенсивность этого процесса зависит от уровня дегидрогеназной активности клеток [ПирсЭ., 1962; Lillie R.D., 1968]. После удаления супернатанта и внесения растворителя, измеряемая затем оптическая плотность при 560-600 нм (область поглощения формазана) оказывается связана

прямо пропорциональной зависимостью с количеством живых клеток [Shchelkanov M.Yu., 1993; Vistica D.T., 1991].

Применяя МТТ-метод к ВИЧ-инфицированным клеткам, следует иметь в виду, что на ранних стадиях инфекции такие клетки обладают повышенной дегидрогеназной активностью; а на поздних стадиях - наоборот - пониженной. Это требует введение поправочных коэффициентов в формулы для соответствующих расчетов. Эти коэффициенты можно не учитывать (удельная дегидрогеназная активность ВИЧ-инфицированных и неинфицированных клеток примерно совпадают) в период 3-6 сут после инокуляции в зависимости от вирус-клеточной модели [Щелканов М.Ю., 1998]. Так как мы применяли МТТ-метод на 4-ые сут после инокуляции, описанным эффектом изменения дегидрогеназной активности клеток под действием ВИЧ-инфекции можно пренебречь [ГрибковаН.В., 1996].

В лунки 96-луночного планшета, содержащего по 200 мкл исследуемого материала, вносили 20 мкл раствора МТТ (11мг/мл соли в буфере Хенкса), помещали на 4 ч в термостат (37°С, 5 % С02 и 85% влажность). После отбора супернатанта (с помощью микродозаторных наконечников S-типа [Щелканов М.Ю., 1998]) в лунки вносили по 150 мкл либо DMSO, либо раствора, содержащего 10% тритон Х-100, 0.4% HCl в изопропаноле, после чего инкубировали при 37°С 30 мин. Оптическую плотность измеряли на многоканальном фотометре (Linbro, Flow Laboratories) при 540 нм. Нулевой уровень определяли против 150 мкл растворяющей смеси.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Для определения содержания в исследуемом образце генетического материала ВИЧ использовали количественную ДНК-ПЦР с двумя внутренними стандартами: GS - на маркерный клеточный ген HLA-DQa - продукт рекомбинационной ПЦР с 40-звенной делецией области HLA-DQa; IS - на геном ВИЧ - продукт рекомбинационной ПЦР, содержащий 80-звенную вставку в

области гена pol ВИЧ. Точное число копий ДНК провируса ВИЧ определялось по отношению к удвоенному числу копий HLA-DQa (т.е. количеству клеток) [Yolov A.A., 1995].

ПЦР проводили по стандартной методике [KellogS.E., 1990] в 20-50 мкл смеси, содержащей 20 мМ Tris-HCl, pH 8.8; 50 мМ KCl; 2.5 мМ MgCl2; 170 мкг/мл желатина; dATP, dTTP, dGTP, dCTP по 100 мкМ каждого; праймеры 10-20 пкМ каждого; стандарты GS и IS в концентрациях, подбираемых индивидуально для каждого образца; 1.0-1.5 U Bio-Taq полимеразы; 1 мкг исследуемого образца ДНК. После проведения 30 циклов в режиме 94°С (1 мин) - 55°С (1мин) - 72°С (1мин) амплификационная смесь анализируется гель-электрофорезом в 2% агарозе. Содержание электрофоретически разделенных продуктов ПЦР определяется по соотношению интенсивности флюоресценции полос ДНК, соответствующих мишени и их стандарту, прокрашенных 0.5 мкг/мл бромида этидия. В случае низкого содержания в образце ДНК провируса, амплифицированный продукт либо вводится во 2-ой раунд гнездовой ПЦР с внутренними праймерами в области pol ВИЧ, либо гибридизуется с внутренним радиоактивно-меченным зондом на соответствующую область pol ВИЧ [Yolov A.A., 1995]. В первом случае, после проведения 25 циклов ПЦР по описанной выше методике, амплификационная смесь разделяется в 2% агарозном геле и визуализируется прокрашиванием в 0.5 мкг/мл бромиде этидия. В случае гибридизации, анализ проводится по следующей схеме [ЁловА.А.,

-у л

1994]: 0.2 пкМ меченного Р-зонда в 6 мкл раствора, содержащего 30 мМ NaCl, 6 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 0.002% ВРВ, ХС добавляется к 10 мкл ПЦР-продукта.

Смесь инкубируется 5 мин при 95°С, 15 мин при 55°С и разгоняется в 10 % неденатурирующем полиакриламидном геле. После электрофореза и авторадиографии соответствующие полосы гибридов вырезаются и просчитываются радиоактивности. В любой из описанных методик, отношение количеств амплифицированных продуктов мишени и соответствующего

стандарта отражает их содержание в исходной смеси анализируемого образца [Diviacco S., 1992].

Для определения количества свободных вирусных частиц проводили RT/РНК-ПЦР с внутренним стандартом RS на геном ВИЧ-1, представляющим собой транскрипт с амплифицированного продукта ПЦР и содержащий 80-звенную вставку в области pol ВИЧ-1. RT проводится в 20 мкл смеси, содержащей 30 мМ Tris-HCl, 30 мМ KCl, 10 мМ DTT, 6 мМ MgCl2, 10 пкМ праймеров, по 1 мкМ каждого dNTP, 5 U обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (AMV), стандарт RS, РНК-образец, выделенный из 200 мкл плазмы или культурального супернатанта. Смесь инкубируется 1 ч при 37°С, 5 мин при 95°С, 5 мин при 45°С. ПЦР проводится в 40 мкл смеси, содержащей 25 мМ Tris-HCl, 40 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 170 мкг/мл желатина, по 100 мкМ каждого dNTP, 2U Bio-Taq полимеразы и 20 мкл RT смеси. После проведения 30 циклов в режиме 94°С (1 мин) - 55°С (1 мин) - 72°С (1 мин) амплифицируемая смесь анализируется в 2 % агарозном геле [Subert P.D., 1992].

Иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антигенов ВИЧ-1.

Для оценки содержания вирусных антигенов, в работе использовали сэндвич-метод твердофазного поликлонального ИФА [Bukrinsky M.I., 1989; Жданов В.М., 1989], разработанный в группе иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Фракцию у-глобулинов, выделенную из сыворотки крови ВИЧ-1-инфицированных пациентов (хроматография на протеин А сефарозе), разводили в 20 мМ карбонатном буферном растворе, pH 9.6, (КБР) до концентрации 2 мкг/мл и хранили при температуре -20°С. Сорбцию иммуноглобулинов на твердую фазу 96-луночного иммунологического планшета (Costar, США) (100 мкл на лунку) проводили в течение ночи при комнатной температуре. Здесь и далее, этапы постановки ИФА перемежались четырехкратными промывками лунок планшета фосфатным буферным

раствором, рН 7.4, (ФБР) с 0.05% Твин-20 (ФБРТ) (200 мкл на лунку). Блокирующий буферный раствор (ББР; 2 % бычий сывороточный альбумин в ФБР) (100 мкл на лунку) инкубировался 1ч при +37°С. Затем вносились исследуемые образцы (100 мкл на лунку) на 1 ч при +37°С. Детектирование иммунных комплексов проводили с помощью антител кролика против Fc-фрагментов иммуноглобулинов человека, конъюгированных с пероксидазой хрена в блокирующем буфере (1 ч при 37°С). Проявление осуществляли с помощью раствора ортофенилендиамина (0.5 мкг/мл в цитратном буфере) в течении 20 мин при комнатной температуре. Реакция останавливалась 1 M H2SO4. Положительным контролем (п=2) служил клеточный лизат лимфобластоидной клеточной линии МТ-4 [Foley G.M., 1965], хронически инфицированной штаммом ВИЧ-1Шв- Уровень cutoff, отделяющий положительные сигналы от отрицательных, определяли как среднее значение плюс 3 стандартных отклонения оптического сигнала (492 нм) для отрицательных образцов (клеточный лизат неинфицированных МТ-4; п=6) на том же планшете.

Для количественного определения концентрации корового антигена ВИЧ-1 р24 в вируссодержащем супернатанте или в плазме крови ВИЧ-инфицированных пациентов использовали коммерческую набор сэндвич-ИФА на основе анти-р24 моноклональных антител ("Вектор", Новосибирск). При работе с плазмами крови, перед постановкой ИФА проводили разрушение иммунных комплексов буферным раствором глицин-HCl согласно инструкции производителя. Отрицательным контролем служили неинфицированные клетки линии МТ-4.

Определение TCID50.

Согласно определению, ТСЮ50 (от англ. - 50% Tissue Culture Infectious Dose - 50 % инфекционная доза клеточной культуры) есть такая доза инфекционного материала, которая с 50%-ой вероятностью приводит к развитию

выраженного инфекционного процесса в экспериментах in vitro с использованием клеточных культур [Virologische praxis, 1968]. Титрование вирусных изолятов проводили на клетках линий Н9, МТ-4, Sup-Tl или СЕМ-SS в 96-луночных панелях (Costar, США). Разведения ВИЧ-1 готовили в

100 мкл: 10"1, 10"2, 10'12; или (5°-Щ\ (51-Щ\ (512-10)''; или (2ü-10y', i i р i

(2 -10)" , ..., (2 -10)" (в зависимости от содержания инфекционного агента). К вирусным разведениям добавляли по 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 5Т05 кл/мл. Инкубировали 72 ч при 37°С и 5% С02. За конечную точку титрования принимали такое разведение вируса, при котором еще наблюдалось синцитиеобразование (для SI-изолятов) и статистически достоверное превышение cut off в ИФА на 4-ые сутки после начала инфекции. Вычисление ТСЮ50 проводили с помощью линейно-логарифмической интерполяции [ReedL., 1938].

Изоляция ВИЧ в смешанной культуре МПК ВИЧ-инфицированных пациентов и МПК здоровых доноров.

МПК ВИЧ-инфицированных пациентов выделяли из цельной гепаринизированной (13 ед/мл) крови, полученной в результате венепункции с соблюдением всех медицинских предосторожностей, по методике, описанной выше для донорских МПК. После выделения и подсчета МПК проводили их сокультивацию с донорскими МПК (в соотношениях 1:2, 1:1 или 1:0.5) в 2 мл PC, содержащей 1 % ИЛ-2 и 5 мкг/мл полибрен. Каждые 4 дня осуществляли смену PC с помощью микродозаторных наконечников S-типа [Щелканов М.Ю., 1998], минимизирующих примесь околодонной клеточной суспензии при отборе супернатанта. Собранный супернатант тестировался в ИФА на предмет содержания вирусных антигенов. После определения содержания вирусных антигенов и инфекционности (ТСГО50) вируссодержащий супернатант помещали в коллекцию штаммов и изолятов ВИЧ группы иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, где он хранится при температуре -70°С с

соблюдением требований техники безопасности при работе с инфекционно опасным материалом.

Исследование in vitro фенотипических особенностей изолятов ВИЧ-1.

Заражение клеток (50 ТСГО50) линий Н9, МТ-4, СЕМ, СЕМ-SS, SupTl, U373, U373/CD4/CCR5, U373/CD4/CXCR4 и ТНР-1 проводили в 24-луночных планшетах (5-105 кл) изолятами, полученными от пациента по описанной выше методике. Через 6 ч с помощью S-наконечников [Щелканов М.Ю., 1998] удаляли супернатант и после трёхкратной промывки с помощью RPMI-1640 вносили 2 мл PC. Каждые 4 дня в течение 24 суток заменяли PC, а также проводили визуальный мониторинг жизнеспособности клеток и синцитиеобразования. Отобранный супернатант использовали для определения содержания вирусных антигенов. SI-фенотип констатировался в том случае, если детектировались вирусные антигены в ИФА, а в секторе обзора обнаруживали синцитии размером более 4-х средних клеточных диаметров (объектив L32/0.40 Leiz, Еермания).

Азидотимидин (AZT).

В экспериментах использовался AZT (5'-азидо-2',3'-дидезокситимидин, ретровир, зидовудин), синтезированный по описанной ранее методике [ХорлинА.А., 1987] в лаборатории д.х.н., академика РАН Краевского Александра Антоновича (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН). Химическая структура и чистота препарата были подтверждены спектроскопическими и рентгеноструктурными методами [Краевский A.A., 1992].

Определение цитотоксичности AZT.

Индексом цитотоксичности (С/(с); от англ. - Cytotoxic Index) данной называется выраженная в процентах доля погибших клеток по отношению к

количеству жизнеспособных клеток в контроле без химиопрепарата (с = 0) в отсутствие инфекции, т.е.

. \

С/(с)= 1-^-100%,

где z(c) - концентрация жизнеспособных клеток при концентрации химиопрепарата, равной с, в отсутствие инфекции. 50%-ой цитотоксической дозой, обозначаемой CDp (от англ. - р% Cytotoxic Dose), называется концентрация химиопрепарата, удовлетворяющая соотношению:

CI(CDp) = p%.

Наибольшее распространение в вирусологии получила 50%-ая цитотоксическая доза СЦ0.

В данной работе, цитотоксичность AZT определялась на модели лимфобластоидной клеточной линии Н9. Вычисление С1{с) проводили с помощью представленной выше формулы, определяя МТТ-методом количество жизнеспособных клеток в присутствие различных концентраций AZT (0, 10~4, 10°, ..., 10"", ..., 10"и М). Значение CD50

рассчитывали с помощью линейно-логарифмической интерполяции [Reed L., 1938].

Определение AZT-чувствительности изолятов ВИЧ-1.

5-104 клеток, предварительно преинкубированных в течение 30 мин в PC с различными концентрациями AZT (0, 10"4, 10"5, ..., 10"", ..., 10"" М), инокулировали первичными изолятами ВИЧ-1 (5-Ю2 ТСГО50 в 200 мкл PC) в 96-луночном планшете (Costar, США). Через 4 ч вируссодержащую PC удаляли и заменяли на PC без вируса, содержащую прежнюю концентрацию AZT. Через 4 дня определяли жизнеспособность клеток (МТТ-методом) и содержание вирусных антигенов в супернатанте. На основании этих данных, для каждой концентрации AZT определяли индекс эффективности El (с) (от англ. -Efficiency Index) и VI(с) (от англ. - Viability Index). Индексом эффективности

данной концентрации химиопрепарата с называется выраженный в процентах уровень подавления репродукции вируса по сравнению с контролем без химиопрепарата (т.е. при с = 0), т.е.

где у(с) - концентрации вирусных антигенов в культуральном супернатанте при концентрации препарата, равной с. Индексом выживания при данной концентрации химиопрепарата с называется выраженное в процентах снижение концентрации жизнеспособных клеток по сравнению с контролем без химиопрепарата (с = 0) в инфицированной культуре, т.е.

где z (с) - концентрация жизнеспособных инфицированных клеток при концентрации химиопрепарата, равной с. Для характеристики действия химиопрепарата пользуются значением р% -уровневой эффективной ( ED ; от англ. - р% Effective Dose), которое определяется соотношениями:

Вычисление EDS0 осуществлялось с помощью линейно-логарифмической интерполяции [Reed L., 1938]. В качестве дополнительного контроля использовался чувствительный к AZT референс-штамм BH4-1BRU. Т.к. С 1(c) определяется в культуре неинфицированных клеток, то определить его значение на модели МПК пациента невозможно.

Определение анти-ВИЧ эффективности AZT на модели МПК пациента.

Для того, чтобы учесть индивидуальные особенности пациентов при определении эффективности AZT, помимо описанной выше модели Н9-(первичный изолят), использовалась и модель МПК самого ВИЧ-

VI(с) - • 100% , 2(0)

El(EDp) = р%,

•■ i,? ,.ч> ■":..• i ■ : ¿ :

• i'O-. Ж'

инфицированного пациента, которые культивировали с начальной концентрацией 1-Ю6 кл/мл в 25 см2-флаконах (Costar, США) в РС, содержащей 7.5 мкг/мл ФГА. После 24-часовой инкубации МПК в РС с ФГА при 37°С и 5% СОг, 5-104 клеток помещали в лунку 96-луночного планшета в 200 мкл РС с 1 % ИЛ-2 в присутствии различных концентраций (0, 10"4, 10"5, ..., 10"", ..., 10'" М) AZT. Через 4 дня определяли жизнеспособность клеток (МТТ-метод) и содержание вирусных антигенов в супернатанте. На основании этих данных, для каждой концентрации AZT определяли Е1{с) и VI(с).

Синтетические пептиды.

35 синтетических пептидов были синтезированы согласно методикам, описанным ранее [Zwart, 1993; Семилетов Ю.А., 1994; Мещерякова Д.В., 1995]. Аминокислотные последовательности пептидов приведены в табл.1.

Четырнадцать пептидов, а именно - р108-р115, р168-р170, pVI, pVII, pXII, pl838, pl839 и р1837 (выделенные в табл.1 полужирным шрифтом) - находят применение для серотипирования вариантов ВИЧ-1 (см., например, [Карамов Э.В., 1996; Ярославцева Н.Г., 1997; Щелканов М.Ю., 1998]).

Таблица 2. Аминокислотные последовательности использованных пептидов (фланкирующие цистеины образуют дисульфидную связь).

Код Описание пептида Последовательность пептида

р108 Консенсус У3-нетли др120 В-субтина ВИЧ-1 R К S I н I G Р G R А F Y T T G

р1837 Консенсус У3-петли Яр120 В-субтипа ВИЧ-1 С К S I н I G Р G R А F Y T T G С

р109 УЗ-пстля др120 амер.-свроп. варианта ВИЧ-1 R К S I N I G Р G R А F Y T T G

pllO УЗ-петля йр120 амер.-европ. варианта ВИЧ-1 R К S I Р I G Р G R А F Y T T G

pl 12 УЗ-петля gpl20 амер.-европ. варианта ВИЧ-1 S R G I R I G Р G R А I L A T E

pl 15 УЗ-петля др120 амер.-европ. варианта ВИЧ-1 R К R I Т м G Р G R V Y Y T T G

р168 УЗ-петля др120 африканского варианта ВИЧ-1 R К S V Н I G Р G Q А F Y A T G

р169 УЗ-петля gpl20 африканского варианта ВИЧ-1 R Е S V R I G Р G Q Т F Y A T G

р170 УЗ-петля gpl20 африканского варианта ВИЧ-1 R Q S т R I G Р G Q А L Y T N К

р1839 УЗ-петля gpl20 дикого варианта субтипа В ВИЧ-1 С к G I R I G Р G R А V Y A A E С

pVI УЗ-петля gpl20 варианта субтипа О ВИЧ-1 юга России к S I R I G Р G Q А F Y T T

pVII УЗ-петля gpl20 варианта субтипа О ВИЧ-1 юга России К S I N F G Р G Q А I Y T T

pXII УЗ-истля Яр120 варианта субтипа О ВИЧ-1 юга России I S L G Р G Q А F Y

р!838 УЗ-петля gpl20 дикого варианта субтипа Е ВИЧ-1 С т S I Т I G Р G Q V F Y T T G С

СП 00

со to

-ь - 51 о 51 <

Рис. 1. Иерархические отношения между аминокислотными последовательностями использованных пептидов и соответствующими фрагментами консенсусов некоторых таксонов ВИЧ-1 (обозначены заглавными буквами).

Из восьми 16-членных пептидов серотипической панели, пять (р108-р115) имитируют американо-европейские, и три (р168-р170) - африканские варианты верхушечной области (позиции 309-324) УЗ-петли диких изолятов ВИЧ-1. 14-членные pVI, pVII и 10-членный рХП соответствуют диким вариантам субтипа G из нозокомиального очага ВИЧ-1-инфекции на юге России [BobkovA., 1994]. Пептид р108 совпадает с соответствующим фрагментом консенсуса В-субтипа [Shchelkanov M.Yu., 1997; Myers G., 1996], a pXII наиболее часто встречается среди изолятов из нозокомиального очага юга России [BobkovA., 1994]. Последовательность кольцевого пептида р1837 совпадает с р108, за исключением концевых цистеинов, образующих дисульфидную связь. Два других кольцевых пептида - pi838 и р1839 - имитировали верхушечные

фрагменты УЗ-петли gpl20 субтипов Е и В, соответственно. На рис.1 представлены иерархические отношения между аминокислотными последовательностями использованных пептидов и соответствующими фрагментами консенсусов [8ЬсЬе1капоу М.Уи., 1997] (т.е. последовательностей, составленных из наиболее часто встречающихся символов в каждой позиции) 10 субтипов (А-1) группы М ВИЧ-1, а также группы и неклассифицируемых последовательностей.

ИФА на основе синтетических пептидов.

Концентрированные растворы пептидов (10 мг/мл) готовили в КБР. Пептиды в концентрации 1 мкг/мл сорбировали на 96-луночные планшеты в ФБР в течение 16-18 ч при комнатной температуре. Свободные участки твердой фазы блокировали ББР (1 ч; 37°С). Образцы сывороток инкубировали в разведении 1:100 в ББР (1ч; 37° С), а затем с коньюгатом и субстратом (раствором ортофенилендиамина). После каждой инкубации планшеты промывали ФСБТ. Обработка профилей иммунореактивности проводилась с помощью информационных технологий, разработанных в группе иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

ЧАСТЬ III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЦ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сахурия, Ирма Бухутиевна, 1999 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.

1. Абэлян A.B. Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - М.: НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, 1997.

2. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М., 1983.

3. Анджапаридзе О.Г., Богомолова H.H. Моделирование и исследование хронических форм вирусных инфекций в культурах клеток. - М., 1974.

4. ГрибковаН.В., Еремин В.Ф., Вотяков В.И., Щелканов М.Ю., Пашкова Т.А., Карамов Э.В. Подавление репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) цитокиноподобным антивирусным фактором//ЖМЭИ. - 1996. - N 5. -С. 27-29.

5. Ёлов A.A., Козлова A.B., Медников Б.М., Корнилаева Г.В., Папуашвили М.Н., Прокопенко В.Д., Карамов Э.В. Детекция ВИЧ в ДНК лимфоцитов. Мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне. Вопросы вирусологии.

- 1994.-Т. 39.-N3.-C. 107-110.

6. Еремин В.Ф. Фенотипическая характеристика изолятов ВИЧ, выявленных на территории Республики Беларусь//Вопросы вирусологии. - 1998. - Т. 43. -N3.-С. 113-116.

7. Жданов В.М., Карамов Э.В., Аракелов С.А. и др. Иммуноферментный метод индикации антигена и антител к вирусу иммунодефицита человека и его использование для серологического обследования различных групп населения // Вопросы вирусологии. - 1989. -N 2. - С. 294-298.

8. Карамов Э.В., Лукашов В.В. Резистентность к азидотимидину при инфекции вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) // Молекулярная биология. - 1994.

- Т.28. - С. 7-20.

9. Карамов Э.В., Лукашов В.В., Тарусова Н.Б., Корнилаева Г.В., Родова М.А., Куханова М.К., Краевский A.A. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа в культуре клеток с помощью 3'-модифицированных нуклеозидов // Мол. Биол. - 1990. - Т. 24. - С. 1695-1701.

Ю.Карамов Э.В., Щелканов М.Ю., ЮдинА.Н., Горбачёва А.П., Бурунова В.В., Славский A.A., Лукашов В.В., Ярославцева Н.Г. Молекулярно-

эпидемиологические особенности вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди внутривенных наркоманов на территории бывшего СССР//ЖМЭИ. - 1999. -Принято в печать.

П.Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьёв A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. - С.-Петербург, 1992.

12. Козлов А.П., Емельянов A.B., Веревочкин C.B., Карамов Э.В. Закономерности ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД //Рус. Журн. «ВИЧ, СПИД и родственные проблемы». - 1997. - Т. 1. - С. 5-28.

13.Краевский A.A., Тарусова Н.Б., Кин-Ю Жу. Новые 5'-фосфонаты модифицированных по сахарному остатку нуклеозидов как ингибиторы продукции ВИЧ //Молекулярная биология - 1992. - Т.26. - С. 624-634.

14. Лимфоциты. Методы / Ред. Дж. Клаус. - М.: Мир, 1990. - 400 с.

15.М.Ю. Щелканов, А.Н. Юдин, В.В. Бурунова, А.П. Горбачёва, A.A. Славский, М.Н. Папуашвили, Н.Г. Ярославцева, И.Г. Сидорович, С. Османов, P.M. Хаитов, Э.В. Карамов. В популяции внутривенных наркоманов Твери циркулируют варианты ВИЧ-1 серотипа А/С // Иммунология. - 1998. - N 6.

16. М.Ю. Щелканов., Н.Г. Ярославцева, А.Н.Юдин, Ю.А. Мирсков, В.Ф. Ерёмин, Л.П. Титов, П.Г. Рытик, Э.В. Карамов. Анализ серологических свойств ВИЧ-1 из очага эпидемии в Гомельской области Белоруссии (1996 г.) // Вопросы вирусологии. - 1998. - N 5.

17.Мещерякова Д.В., Андреев С.М., Тарасова С.О., Сидорова М.В., Вафина М.Г., Папуашвили М.Н., Прокопенко В. Д., Хаитов P.M. Изучение иммунореактивности сывороток пациентов на различных стадиях ВИЧ-инфекции по отношению к синтетическим пептидам, имитирующим V3 область gpl20 ВИЧ-1 //Иммунология. - 1995. -N2. - С. 10-13.

18. Набатов A.A., Машарский А.Э., Емельянов A.B., Верёвочкин C.B., Ченцова Н.П., Круглов Ю.В., Кобыща Ю.В., Козлов А.П. Эпидемия ВИЧ-инфекции среди наркоманов на Украине: разные субтипы ВИЧ-1 в разных городах.

Русский журнал «ВИЧ, СПИД и родственные проблемы». - 1998. - Т. 1. - N. 1. - С. 130-131.

19.Носач В.В. Решение задач аппроксимации с помощью персональных компьютеров. - М., 1994.

20. Пашкова Т.А. Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - М.: НИИВ РАМН, 1996.

21. Пашкова Т.А., Ярославцева Н.Г., Щелканов М.Ю., Папуашвили М.Н., СахурияИ.Б., КорнилаеваГ.В., КарамовЭ.В. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 различных серотипов//Вопросы вирусологии. -1998.-N 5.

22.Пирс Э. Гистохимия. - М.: Мир, 1962. - 672 с.

23.Рубин Б.А., Воронков JT.A., Капустина Г.И. Биохимические изменения в инфицированной клетке //Биохимия. - 1968. - Т. 33. - Вып. 1. - С. 121-125.

24.Рытик П.Г., Ван-дер Гроен Г., Еремин В.Ф., Коломиец Н.Д., Попов С.А., Нис П., Вилемс В., Веркаутерен Г., Илькевич Ю.Г., Лемешко H.H. Биологические свойства ВИЧ, выделенного от вирусоносителя, проживающего в БССР // Вопросы вирусологии. - 1990. - Т. 5. - С. 389-390.

25.Сахурия И.Б., Щелканов М.Ю., Иванников Е.В., Юдин А.Н., Корнилаева Г.В., Горбачёва Э.С., Сойнов Л.А., Залунин В.В., Голиков В.А., Карамов Э.В. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 1997. -Т. 1. - N 1. -С. 141.

26.Семилетов Ю.А., Ржанинова A.A., Гараев М.М. Синтез и сравнительный анализ антигенной активности пептидов гипервариабельной области V3 поверхностного гликопротеида gpl20 вируса иммунодефицита человека типа 1 //Биоорган. Химия. - 1994. - Т. 20. - С. 1070-1079.

27. Соловьёв В.Д., Хесин Я.Е., Быковский А.Ф. Очерки по вирусной цитопатологии. - М.: Медицина, 1979. - 197 с.

28. Хаитов Р. М., Игнатьева Г. А. СПИД. - М.: Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей, 1992. - 352 с.

29.Хаустов А.И., Гагаркин Н.И. Эпидемия ВИЧ/СПИД в Николаевской области//Русский журнал «ВИЧ/СПИД и Родственные Проблемы». - 1997. -Т. 1. -N 1. - С. 127.

30.Хорлин A.A., Тарусова Н.Б., Краевский A.A. и др. Патент США N 5.043.438 Invention PCT/SU 88/00271, приоритет от 29.09.1987.

31.Шагинян В.Р., Круглов Ю.В. Анализ территориального распределения уровней заболеваемости гепатитом В и ВИЧ-инфекцией//Русский журнал «ВИЧ/СПИД и Родственные Проблемы». - 1997. - Т. 1. - N 1. - С. 127-128.

32.Щелканов М.Ю., Сахурия И.Б., Бурунова В.В., Пашкова Т.А., Абэлян Т.А., Павлова Т.В., Корнилаева Г.В., КарамовГ.В. Дегидрогеназная активность ВИЧ-инфицированных клеток при анализе результатов МТТ-теста // Иммунология. - 1998. - N 6.

33.Щелканов М.Ю., Сахурия И.Б., Полякова Е.Б., Бурунова В.В., Пашкова Т.А., Корнилаева Г.В., Карамов Э.В. Повышение качества МТТ-метода с помощью микродозаторных наконечников специальной конструкции // Иммунология. -1998. -N 4. - С. 57-59.

34.Щелканов М.Ю., Пашкова Т.А., Сахурия И.Б., Папуашвили М.Н., Карамов Э.В. Анализ биологических характеристик первичных изолятов ВИЧ-1 с помощью метода главных компонент//Вопросы вирусологии. - 1998. - N 3. -С. 117-121.

35.Щелканов М.Ю. Серологические свойства V3-петли gpl20 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории бывшего СССР // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - М.: НИИВ РАМН, 1999.

36.Щелканов М.Ю., СойновЛ.А., ЗалунинВ.В., Славский A.A., Сахурия И.Б., Бурунова В.В., Ярославцева Н.Г., Карамов Э.В., Хаитов P.M. Определение дистантности спектров иммунореактивности при серотипировании ВИЧ // Иммунология. - 1998. - N 6.

37.Щелканов М.Ю., ЮдинА.Н., Бурунова В.В., Горбачёва А.П., Славский A.A., Папуашвили М.Н., Ярославцева Н.Г., Сидорович И.Г., Османов С.,

Хаитов P.M., Карамов Э.В. В популяции внутривенных наркоманов Твери циркулируют варианты ВИЧ-1 серотипа А/С // Иммунология. - 1998. - N 6.

38.Щелканов М.Ю., ЮдинА.Н., Ерёмин В.Ф., Гадынская Н.И., ЯроелавцеваН.Г., Карамов Э.В. Увеличение серотипической гетерогенности ВИЧ-1 в Светлогорском очаге (1996) через год после начала вспышки эпидемии // Вопросы вирусологии. - Принято в печать.

39.Щелканов М.Ю., ЯроелавцеваН.Г., Емельянов A.B., СахурияИ.Б., Абэлян A.B., Верёвочкин C.B., Козлов А.П., Карамов Э.В. Модель функционирования верхушечного эпитопа УЗ-петли gp 120 ВИЧ-1 в составе комплекса с антителами // Молекулярная биология. - 1998. - N 6.

40.Щелканов М.Ю., ЯроелавцеваН.Г., Набатов A.A., Машарский А.Э., ЮдинА.Н., МирсковЮ.А., ЧенцоваН.П., КобыщаЮ.В., Козлов А.П., Карамов Э.В. Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на юге\юго-востоке Украины // Вопросы вирусологии. - 1998. - N 4.

41. Щелканов М.Ю., Ярославцева Н.Г., Юдин А.Н., Бурунова В.В., Горбачёва А.П., Славский A.A., Ольшанский А.Я., Голиков В.А., Карамов Э.В. Серотипический профиль эпидемии ВИЧ-1 в Москве // Вопросы вирусологии. - Принято в печать.

42. Щелканов М.Ю., ЯроелавцеваН.Г., ЮдинА.Н., Ерёмин В.Ф., Пыжова Н. С., Семилетов Ю.А., Абэлян A.B., Титов Л.П., Карамов Э.В. Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1: I. «Аргинин-глутаминовый триггер» в четвёртой позиции верхушечного тетрапептида УЗ-петли gpl20 // Молекулярная биология. - 1998. - N4. - С. 717-728.

43. Щелканов М.Ю., ЯроелавцеваН.Г., ЮдинА.Н., Ерёмин В.Ф., Пыжова Н. С., Семилетов Ю.А., Абэлян A.B., Титов Л.П., Карамов Э.В. Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1: II. Влияние свойств аминокислотных остатков, фланкирующих С-конец верхушечного тетрапептида УЗ-петли gp 120//Молекулярная биология. - 1998. - N4. -С. 729-734.

44.Щелканов М.Ю., Ярославцева Н.Г., Юдин А.Н., Мирсков Ю.А., Ерёмин В.Ф., Титов Л.П., Рытик П.Г., Карамов Э.В. Анализ серологических свойств ВИЧ-1 из очага эпидемии в Гомельской области Белоруссии (1996 г.) // Вопросы вирусологии. - 1998. - N 6.

45.Ярославцева Н.Г., Лукашов В.В., Папуашвили М.Н., Прокопенко В.Д., Хаитов P.M., Карамов Э.В. УЗ-серотипы ВИЧ-1, представленные на территории России. Иммунология. - 1996. - N 3. - С. 17-21.

46.Ярославцева Н.Г., Щелканов М.Ю., Юдин А.Н., Наврузбеков Г.А., Семилетов Ю.А., Карамов Э.В. Влияние аминокислотных замен в последовательности УЗ-петли GP120 на серологическую кросс-реактивность между различными субтипами ВИЧ-1//Молекулярная биология. - 1997. -Т. 31.-N2.-С. 350-355.

47. Alkhatib G. et al. СС CKR5: a RANTES, MIP-la, MIP-ip receptor as a fusion cofaktor for macrophage-tropic HIV-1 // Science. - 1996. - V. 272. - P. 1955-1958.

48. Almond N.M., Heeney J.L. AIDS vaccine development in primate model // AIDS. -1998. - V. 12. - Suppl. A. - P. S133-140.

49. Apetrei C., Necula A., Holm-Hansen C., Loussert-Ajaka I., Pandrea I., Cozmei C., Streinu-Cercel A., Pascu F.R., Negut E., Molnar G., Duca M., Pecec M., Brun-Vezinet F., Simon F. HIV-1 diversity in Romania//AIDS. - 1998. - V. 12. -P. 1079-1085.

50. Arthos J., Deen K., Chaikin M.A. // Cell. - 1989. - V. 57. - P. 469-481.

51.Asjo A., Albert J., Karlsson A., Morfeldt-Manson L., Biberfeldt G., Fenyo E.M. Replicative properties of human immunodeficiency virus from patients with varying severity of HIV infection // Lancet. - 1986. - ii. - P. 660-662.

52.Bachmann M.F., Zinkernagel R.M. The influence of virus structore on antibody responses and serotype formation// Imm. Today. - 1996. - V. 17. - N 12. - P. 553558.

53.Back N.K.T., Thiriart C., Delers A., Ramautarsing C., Bruck C., Goudsmit J. // J. Med. Virol. - 1995. - V. 31. - P. 200-208.

54.Baldassarre F., Mallardo M., Mezza E., Scala G., Quinto I. Regulation of NF-kappa В through the nuclear processing of pi05 (NF-kappa Bl) in Epstein-Barr

virus-immortalized B cell lines // J. Biol. Chem. - 1995. - V. 270. - P. 3124431248.

55. Baldwin A., K.P. LeClair, H. Singh, P.A. Sharp. A large protein containing zing finger domains to related sequence elements in the enhancers of the class 1 major histocompatibility complex and kappa immunoglobulin genes // Mol. Cell. Biol. -1994. -V. 10. - P. 1406-1414.

56.Baltimore D. Viruses, polimerases and cancer// Science. - 1976. - V. 162. - P. 632636.

57.Balzarini J., Karlson A., Perez-Perez M.-J. et al. HIV-1 specific reverse transcriptase inhibitors show differential activity against HIV-1 mutant strains containing different amino acid substitutions in the reverse transcriptase // Virology. - 1993. - V. 192. - P. 246-253.

58.Barin F., Lahbabi Y., Buzelay L., Lejeune B., Baillou-Beaufils A., Denis P., Mathiot C., M'Boup S., Vithayasai V., Dietrich U., Goudeau A. Diversity of antibody binding to V3 peptides representing consensus sequences of HIV type 1 genotypes A to E: an approach for HIV type 1 serological subtyping // AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1996. - V. 12. - P. 1279-1289.

59.Barre-Sinoussi F., Chermann J.C., Rey F. and Monagnier L. Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for aquired immune deficiency syndrome (AIDS) // Science. - 1983. - V. 220. - P. 868-871.

60.Bastiani L., Laal S., Zolla-Pazner S., KimM. Host cell-dependent alterations in envelope components of HIV-1 virions // J. Virol. - 1997. - V. 71. - P. 3444-3450.

61.Bates P.A., McGregor M.J., Islam S.A. et al. // Protein Engng. - 1989. - V. 3. -P. 13-21.

62.Beckmann H., Kadesch T. The leucine zipper of TFE3 dictates helix-loop-helix dimerization specificity. // Genes Dev. - 1991. -V. 5 P. 1057-1066.

63.Benn S. et al. Genomic heterogeneity of AIDS retroviral isolates from Noth America and Zaire // Science. - 1985. - V. 230. - P. 949-956.

64. Berger E.A. Chemokine receptors and HIV entry//AIDS. - 1997. - V. 11. -Suppl. A. - P. S5-S16.

65. Berkhout B., Jeang K.-T. Functional roles for the TATA promoter and enhancers in basal and Tat-induced expression of the HIV-1 long terminal repeat // J. Virol. -1992. - V. 66. - P. 139-149.

66.Bhattacharyya D. et al. Postioning of positively chared residues in the V3 loop correlates with HIV type 1 Syncitium-indusing phenotype. A Mc Knight A. et al. Change in tropism upon immune escape by human immunodeficiency virus // J. Virol. - 1995. - V. 69. - P. 3167-3170.

67.Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Garaev M., Rzhaninova A., Kaleebu P., Beddows S., Bachmann M.H., Mullins J.I., Louwagie J., Janssens W., van der Groen G., McCutchan F., Weber J. Identification of an env G subtype and heterogeneity of HIV-1 strains in the Russian Federation and Belarus//AIDS. -1994.-V. 8.-P. 1649-1655.

68.Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L., Ladnaya N., Kazennova E., Kravchenko A., Fedotov E., Saukhat S., Zverev S., Pokrovsky V., Weber J. An HIV type 1 epidemic among injecting grug users in the former Soviet Union caused by homogeneous subtype A strain//AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1997. -V. 13.-P. 1195-1201

69. Boucher C.A., O 5, 0Sullivan E., Mulder J.W. et al. Ordered appearanceof zidovudine (AZT) resistance mutations during treatment of 18 human immunodeficiency virus-positive subjects. // J. Infec. Dis. - 1992. - V. 165. P. 105110.

70. Boucher C.A., van Leeuwen R., Kellam P. et al. Effects of discontinution of zidovudine treatment on zidovudine sensitivity of human immunodeficiency virus type 1 isolates. //Antimicrob. Agents Chemother. - 1993. - V. 37. - P. 15251530.

71. Boucher C.A.B., Tersmette M., Lange J.M.A. et al. // Lancet. - 1990. - V.336. - P. 585-590.

72.Bou-Habib D.C., Roderiquez G., Oravecz T., Berman P.W., Lusso P., Norcross M.A. // J. Virol. - 1994. - V. 68. - P. 6006-6013.

73.Brenneman D.E., Westbrook G.L., Fitzgerald S.P. Neuronal cell killing by the envelope protein of HIV and its prevention by vasoactive intestinal peptide //Nature. - 1988. - Vol. 335. - P. 639-642.

74. Bukrinsky M.I., Syrsev V.A., Popov S.A., Barsov E.V., Chaplinskas S.A. and Karamov E.V. False-positive sera do not react with human immunodeficency virus (HIV) gag-encoded recombinant antigen//J. Med. Virol. - 1989. - V. 7. -P. 72-75.

75.Burunova V.V., Shchelkanov M.Yu., YudinA.N., Gorbacheva A.P., Slavsky A.A., Abelian A.V., Olshansky A.Ya., GolikovV.A., YaroslavtsevaN.G., Karamov E.V. HIV-1 serotypes in Moscow//In: Abstract Book of 6-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", 1998, May 18-22, St.-Petersburg, Russia. -St.-Petersburg, 1998. - P. 91.

76. Camerini D., Seed B. // Cell. - 1990. - V. 60. - P. 747-754.

77. Cameroon D.W., Japour A., Mellors J. Antiretroviral safety and durability of ritonavir (RIT)-saquinavir in protease inhibitor-naive patients in year two of follow-up // 5th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. -Chicago. - February, 1997. - Abstract 388.

78. Carpenter C.C.J., Fischl M.A., Hammer S.M. Antiretroviral therapy for HIV infection in 1997: updated recomendations of the International AIDS Society-USA panel. - JAMA. - 1997. - V. 77. - P. 1962-1969.

79.CavertW., Notermans D.W., Staskus K. Kinetics of response in lymphoid tissues to antiretroviral therapy of HIV-1 infection// Science. - 1997. - V. 276. - P. 960964.

80. CDC. Pneumocystis pneumonia. Kaposi's sarcoma and Pneumocystis pneumonia among homosexual men // MMWR. - 1981. - V. 30. - P. 250-252, 305-308.

81.Cho M.W., Lee M.K., Carney M.C., BersonJ.F., Doms R.W., Martin M.A. Identification of detrminants on a dualtropic human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein that confer usage of CXCR4//J. Virol. - 1988. - V. 72. -P. 2509-2515.

82. Clair M.H., Martin J.L., Tudor-Williams G. et al. Resistance to ddland sensitivity to AZT induced by a mutation in HIV-1 reverse transcriptase // Science. - 1991. -V. 253.-P. 1557-1559.

83.Clavel F., Guetard D., BrunVezinet F. Isolation of a new human retrovirus of West-African patients with AIDS // Science. - 1986. - V. 233. - P. 343-346.

84. Coney A.J., Tsai S.Y., O'Malley B. W., Tsai M.-J. Chiken ovalbumin upstream promoter transcription factor binds to a negative regulatory region in the HIV-1 long terminal repeat // J. Virol. - 1991. - V. 65. - P. 2853-2860.

85.Couto-Fernandez J.C., Janssens W., Heyndrickx L., Motte J., Fransen K., Peeters M., Delaporte E., Galvao-Castro B., Piot P., van der Groen G. Genetic and antigenic variability of HIV type 1 in Brazil // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1994. -V. 10. - P. 1157-1163.

86.Cravcik S., Sahai J., KerrB. Nelfinavir mesylate (NFV) increases saquinavir-soft gel capsule exposure in HIV+ patients // 4th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. - Washington. - January, 1997. - Abstract 371.

87.Dalgleish A.G. et al. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus //Nature. - 1984. - V. 312. - P. 763-767.

88. De Clercq E. Strategy of anti-HIV therapy // Antiviral. Res. - 1989. - Vol.12. -P. 1-20.

89.DeGruttola V., Hughes M., Gilbert P., Phillips A. Trial design in the era of highly effective antiviral drug combinations for HIV infection//AIDS. - 1998. - V. 12. -Suppl. A.-P. S149-S156.

90. Dietrich U. et al. The epidemiology of HIV in India // Trends Microbiol. - 1995. -V. 3. - P. 17-21.

91.Dittmar M.T., McKnight A., Simmons G., Clapham P.R., Weiss R.A., Simmonds P. Co-receptors for HIV-into-cell entry // Nature. - 1997. - Vol. 385. - P. 495-496.

92.Diviacco S., Norio P, Zentilin L., et al. // Gene - 1992. - V. 122. - P. 313-320.

93.DomsR.W., PeipertS.C. Unwelcomed guests with master keys: how HIV uses chemokine receptors for cellular entry // Virology. - 1977. - V. 235. - P. 179-190.

94.Doranz B,J. et al. A dual-tropic primary HIV-1 isolate that users fusin and the beta-chemokine CKR-5, CKR-3, and CKR-2b as fusin cofactors // Cell. - 1996. - V. 85. -P. 1149-1158.

95.Dragic T. et al., HIV-1 entry into CD4(+) cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5 //Nature. - 1996. - V. 381. - P. 661-666.

96.Dynan W.S., Chervitz S.A. Characterization of a minimal simian virus 40 late promoter: enhancer elements in the 72-base-pair repeat not required // J. Virol. -1989. -V. 63. - P. 1420-1427.

97.Endres M.J. et al. CD4-independent infection by HIV-2 is mediated by Fusin/CXCR4 // Cell. - 1996. - V. 87. - P. 745-756.

98.Federsppiel B. et al. Molecular cloning of the cDNA and chromosomal localization of the gene for a putative seven-transmembrane segment (7-TMS) receptor isolated from human spleen // Genomics. - 1993. - V. 16. - P. 707-712.

99.Feinberg M. Hidden dangers of incompletely suppressive antiretroviral therapy // Lancet. - 1997. - V. 349. - P. 1408-1409.

100. Fenyo E.M. Biological phenotype - in vitro // In: Abstract Book of Conference on AIDS. - 1996. - Berlin, Gemany - V. 1. - P. 1-7.

101. Fenyo E.M., Morfeld-Mansson L., Chiodi F., Lind B., von Gegerfelt A., Albert J., Olausson E., Asjo B. Distinct replicative and cytopathic characteristics of human immunodeficiency virus isolates // J. Virol. - 1988. - V. 62. - P. 4414-4419.

102. Fiore J.R., Calabro M.L., Angarano G. HIV-1 variability and progression to AIDS: a longitudinal study // J. Med. Virol. - 1990. - V. 32. - N 4. - P. 252-256.

103. Fitzgibbon J.E., Biron K.K., Keen M et al. Human immunodeficiency virus type 1 pol gene mutations which cause decreased susceptibility to 2',3'-dideoxycytidine // Antimicrob. Agents Chemother. - 1992. - V. 36. - P. 153-157.

104. Florino P.M. et al. Lymphadenopathy Assotiated virus infection of a blood donor-recipient pair with acquired immunodeficiency syndrom // Science. - 1985. -V. 225.- P. 69-72.

105. Foley G.M., Lazarus H., Farber S., Uzman B.G., Boone B.A., McCarthy R.E. Continuous culture of human lymphoblasts from peripheral blood of a child with acute leukemia // Cancer .- 1965. - V. 18. - P. 522-529.

106. Furman P.A., Fyfe J.A., St. Clair M.H., Weinhold K., Rideout J.L., Freeman G.A., Nusinoff-Lehrman S., Bolognesi D.P., Broder S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1986. - Vol. 83. - P. 8333-8337.

107. Gallo R.C. and Montanier L. The chronology of AIDS research// Nature. -1987.-V. 326.-P. 435-436.

108. Gallo R.C. et al. Isolation of Human T-cell Leucemia virus in acquired immunodeficiency syndrom // Science. - 1983. - V. 220. - P. 865-868.

109. Gamier L., BowzardB., Wills J.W. Recent advances and remaining problems in HIV assembly // AIDS. - 1998. - V. 12. - Suppl. A. - P. S5-S16.

110. Ghiara J.B., Stura E.A., Stanfield R.L., Profy A.T., Wilson I.A. Crystal structure of the principal neutralization site of HIV-1 // Science. - 1994. - V. 264. -P. 82-85.

111. Gorbacheva A.P., Shchelkanov M.Yu., YudinA.N., Burunova V.V., SlavskyA.A., Papuashvili M.N., Yaroslavtseva N.G., KaramovE.V. HIV-1 serotyping in the IDU population of Tver (Russia) // In: Abstract Book of 6-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", 1998, May 18-22, St.-Petersburg, Russia. - St.-Petersburg, 1998. - P. 85.

112. Gregor P.D., Sawadogo M., Roeder R.G. The adenovirus major late transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimer // Genes Dev. - 1990. - V. 4. - P. 17301740.

113. GulickR.M., Mellors J.W., HavlirD. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less// New Engl. J. Med. - 1997. -V. 337.-P. 734-739.

114. Hamers F.F., Downs A.M., InfusoA., Brunei J.-B. Diversity of HIV/AIDS epidemic in Europe // AIDS. - 1998. - V. 12. - Suppl. A. - P. S63-S70.

115. Hammer S.M., Yeni P. Antiretroviral therapy: where are we ? // AIDS. - 1998. -V. 12.-Suppl. A. - P. S181-S188.

116. Harous J.M. et al. Inhibition of entry of HIV-1 in neural cell lines by antibodies against galactosyl ceramide // Science. - 1991. - V. 253. - P. 320-323.

117. Harrich D., Ulich C., Garcia-Martinez L.F., Gaynor R.B.Tat is required for efficient HIV-1 reverse transcription // EMBO J. - 1997. - V. 16. - P. 1224-1235.

118. Haseltine W.A. Molecular biology of the AIDS virus: ten years of discovery -hope for the future // In: Science Challenging AIDS. Basel: Karger, 1992. - P. 71106.

119. HauberJ., Perkins A., Heimer E.P. Gullen E.P. // Proc. Natl. Acad. Sei. US. - 1987. - Vol. 284. - P. 6364-6386.

120. Havlir D.V., Lange J.M.A. New antiretrovirals and new combinations // AIDS.

- 1998. - V. 12. - Suppl. A. - P. S165-S174.

121. HerzongH. et al. Molecular cloning, characterization, and localization of the human homologe to the reported bovine NPY Y3 receptor: lack of NP // Genomics.

- 1993. -V. 16. - P. 700-706.

122. Hoelscher M., Hanker S., Barin F., Cheingsong-Popov R., Dietrich U., Jordan-Harder B., Olaleye D., Nagele E., Markuzzi A., Mwakagile D., Minja F., Weber J., Gurtler L., Von Sonnenburg F. HIV type 1 V3 serotyping of Tanzanian samples: probable reasons for mismatching with genetic sub typing // AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1998. - V. 14 - P. 139-149.

123. Hogervorst E., De Jong J., Van Mijk A., Bakker M., Valk M., Nara P., Goudsmit J. //J. Virol. - 1995. - V. 69. - P. 6342-6351.

124. Hoggard P.G., Kewn S., Barry M.G., Khoo S.H., Back D.J. Effects of drugs on 2',3 '-dideoxy2',3 '-didehydrothymidinephosphorylation in vitro // Antimicrob. Agents Chemother. - 1997. - V. 41. - V. 1231-1236.

125. Hu Y., Kazenwadel J., James R. Isolation and characterization of the murine homeobox gene Cdx-1. Regulation of expression in intestinal epithelial cells // J. Biol. Chem. - 1993. - V. 268. - P. 214-225.

126. Human retroviruses and AIDS: compilation and analyses of nucleic and amino acid sequences / Ed. G. Myers. Theoretical Biology and Biophysics Group. Los Alamos National laboratory. - New Mexico: Los Alamos, 1996.

127. Irwin K.L., Pau C.P., Lupo D., Pienazek D., Luo C.C., Olivo N., Rayfield M., Hu D.J., Weber J.T., Respess R.A., Janssen R., Minor P., Ernst J. Presence of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 subtype A infection in a New York

community with high HIV prevalence: a sentinel site for monitoring HIV genetic diversity in North America. Centers for Disease Control and Prevention-Bronx Lebanon HIV Serosurvey Team // J. Infect. Dis. - 1997. - V. 176. - P. 1629-1633.

128. Ivanoff L.A., Looney D.J., McDonal C. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -

1991.-V. 7.-P. 595-603.

129. Jankowski J.M., Dixon G.H. The GC box as a silencer // Biosci. Rep. - 1987. -V. 7.-P. 955-963.

130. Javaherian K., Langlois A.J., LaRosa G.J., Profy A.T., Bolognesi D.P., Herlihy W.C., Putney S.D., Mattews T.J. // Science. - 1990. - V. 250. - P. 1590-1593.

131. Jazin E.E. et al. A proposed bovine neuropeptide Y (NPY) receptor cDNA clone or its human homologue, confers neithe NPY binding sites nor NPY responsivention transfected cells // Regul. Pept. - 1993. - V. 47. - P. 247-258.

132. Jones K.A., Kadonaga J.T., Luciw P.A., Tjian R. Activation of the AIDS retrovirus promoter by the cellular transcription factor, Spl // Science. - 1986. - V. 232.-P. 755-759.

133. Jones K.A., Tjian R. Spl binds to promoter sequences and activates herpes simplex virus 'immediate-early' gene transcription in vitro // Nature. - 1985. - V. 317.-P. 179-182.

134. Jong De J.J., De Ronde A., Keulen W., Tersmette M., Goudsmit J. // J. Virol. -

1992.-V. 66.-P. 6777-6780.

135. KalathoorS., Sinclair J., AndronL., SensionM.G., Highbarger H.C. Combination therapy with stavudine and didanosine // 4th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. - Washington, January 1997. - Abstract 552.

136. Kalyanaraman V.S. A new subtype of human T-cell Leukemia virus (HTLV-II) associated with a T-cell variant of hairy cell leukemia // Science. - 1982. - V. 218. -P. 571-573.

137. Kan N.C., Franchini G. and Wong-Staal F. Identification of HIV sor gene product and detection of antibodies in human sera// Science. - 1986. - V. 231. -P.1553-1555.

138. Kanter A.S., Spencer D.C., Steinberg M.H. Development of an HIV clinical and research database for South Africa//Methods Inf. Med. - 1997. - V. 36. -P. 144-148.

139. Karamov E.V., Yaroslavtseva N.G., Shchelkanov M.Yu., Martovitski D.V., Lukashov V.V., Kozlov A.P., Papuashvili M.N., Goudsmit J., Khaitov R.M. Antigenic and genetic relations between different HIV-I sybtypes in Russia // Immunology and Infectious Diseases. - 1996. - V. 6. - P. 15-24.

140. Kellam P., Larder B.A., Boucher C.A. Fifth mutation in human immunodeficiency virus (HIV) type 1 reverse transcriptase contributes to the development of high-level resistance to zidovudine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

- 1992. -V. 89. - P. 1934-1938.

141. Kellog S.E., Sninsky J.J., and Kwok S. // Analyt. Biochem. - 1990. - V.189, p. 202-208.

142. Koot M., Vos A.H., Keet R.P., De Goede R.E., Dercksen M.W., Terpstra F.G., Coutinho R.A., Miedema F., Tersmette M. // AIDS. - 1992. - V. 6. - P. 49-54.

143. Krayevsky A.A., Watanabe K.A. Modified nucleosides as anti-AIDS drugs: current status and perspectives. - Moscow, 1993.

144. Lacey S.F., Larder B.A. A novel mutation (V75T) in the HIV-1 reverse transcriptase confers resistance to 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine (D4T) in cell culture // Antimicrob. Agents Chemother. - 1994. - V. 38. - P. 14281432.

145. Larder B. AZT resistance predicted by direct detection of mutation in DNA from HIV-infected lymphocytes // AIDS - 1991. - V.5. - P. 137-144.

146. Larder B.A. 3'- Azido-3'-deoxythymidine resistance suppressed by a mutation conferring human immunodeficiency virus type 1 resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor // Antimicrob. Agents Chemother. - 1992.

- V. 36. - P. 2664-2669.

147. Larder B.A., Darby G., Richmann D.D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine isolated during prolonged therapy // Science. - 1989. - V. 243. - P. 1731-1734.

148. Letovsky J., Dynan W.S. Measurement of the binding of transcription factor

Spl to a single GC box recognition sequence // Nucleic Acids Res. - 1989. - V. 17. - P. 2639-2653.

149. Levy J.A. Pathogenesis of HIV infection // Microbiol. Rev. - 1993. - V. 57. - P. 233-235.

150. Lifson J.D, Engelman E.G. // Immunol. Rev. - 1989. - V. 109. - P. 93-117.

151. Lillie R.D. Histopathologic technic and practical histochemistry. -NY: McGraw-Hill Company, 1965. - 439 p.

152. Loetsher M. et al. Cloning of all human seven-transmembrane domaine receptor, LESTR, that is highly expressed in leucocytes // J. Biol. Chem.. - 1994. -V. 269. - P. 232-237.

153. LoriF., MalykhA., Cara A. Hydroxyurea as an inhibitor of human immunodeficiency virus-type 1 replication // Science. - 1994. - V. 266. - P. 801805.

154. Lukashov V.V., Cornelissen M.T.E., Goudsmit J., Papuashvilli M.N., Rytik P.G., Khaitov R.M., Karamov E.V. and De Wolf F. Simultaneous introduction of distinct HIV-1 subtypes into differebt risk groups in Russia, Byelorussia and Lithuania // AIDS. -1995. - V. 9. - P. 435-439.

155. Lukashov V.V., Karamov E.V., Eremin V.F., Titov L.P., Goudsmit J. Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus// AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1998. - V. 14. - P. 12991303.

156. Lukashov V.V., Kuiken C.L., Vlahov D., Coutinho R.A., Goudsmit J. Evidence for HIV type 1 strains of U.S. intravenous drug users as founders of AIDS epidemic among intravenous drug users in northern Europe // AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1996. -V. 12. - P. 1179-1183.

157. Mallardo M., Dragonetti E., Baldassarre F., Ambrosino C., Scala G., Quinto 1. An NF-kappaB site in the 5'-untranslated leader region of the human immunodeficiency virus type 1 enhances the viral expression in response to NF-kappaB-activating stimuli // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - P. 20820-20827.

158. Mann D.L., O'Brein S.J., Gilbert D.A., Reid Y., Popovic M., Read-Connole E„ Gallo R., Gazdar A. Origin of the HIV-susceptible human CD4+ cell line//AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1989. - V. 5. - P. 253-255.

159. McCaffrey P.G., Luo C„ Kerppola T.K., Jain J., Badalian T.M., Ho A.M., Burgeon E., Lane W.S., Lambert J.N., Curran T. Isolation of the cyclosporin-sensitive T cell transcription factor NFATp // Science. - 1993.- V. 262. - P. 750754.

160. McKnight A. Change in tropism upon immune escape by human immunodeficiency virus // J. Virol. - 1995. - V. 69. - P. 3167-3170.

161. Mellors J.W., Aticken A., Stapleton J.T. et al. A single conservative amino acid substitution in the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 confers resistance to (+)-(5S)-4,5,6,7-tetrahydro-5-methyl-6-(3-methyl-2-butenyl)imidazo [4,5,1-jk][ 1,4] benzodiazepin-2 (lH)-thione TIBO, R82150)// Mol. Pharmacol. - 1993. - V. 43. - P. 11-16.

162. Merrill D.P., Manion D.J. Chou T.C., Hirsch M.S. Antagonism between human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitors indinavir and saquinavir in vitro // J. Infect. Dis. - 1997. - V. 176. - P. 265-268.

163. Millhouse S., Krebs F.C., Yao J., McAllister J.J., Conner J., Ross H., Wigdahl B. Spl and related factors fail to interact with the NF-kappaB-proximal G/C box in the LTR of a replication competent, brain-derived strain of HIV-1 (YU-2) // J. Neurovirol. - 1998. - V. 4. - P. 312-323.

164. Mizukami T. Binding region for HIV and epitopes for HIV-sitedirected mutagenesis // PNAS US. - 1988. - V. 85. - P. 9273-9277.

165. Mohri H., Ching W.T.W., Chang H.E. HIV-1 variants with reduced sensitivity to AZT // In: VI International Conference on AIDS, San Francisco, USA - 1990. -V. 3. -Th.S.B.81.-P. 116.

166. Moore J.P., McKeating J.A., Huang Y.X., Ashkenazi A., Ho D.D. // J. Virol. -1992.-V. 66. - P. 235-243.

167. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assay//J. Immunol. Methods. - 1983. -V. 65. - P. 55-63.

168. Murphy R., GagnierP., LamsonM., DusekA., JuW., Hsu A. Effect of nevirapine (NVP) on pharmacokinetics (PK) of indinavir (IDV) and ritonavir (RTV) in HIV-1 patients//4th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Washington, January 1997. - Abstract 374.

169. Nara P.L. Neutralization of HIV-1: a paradox of humoral proporions // FASEB J. - 1991. - V. 5. - N 10. - P. 2437-2455.

170. Nara P.L., Fischinger P.J. Quantitative infectivity assay for HIV-1 and HIV-2 //Nature. -1988. - V. 322. - P. 469-470.

171. Nara P.L., Hatch W.C., Dunlop N.M., Robey W.G., Fischinger P.J. Simple, rapid quantitative, syncytium-forming microassay for the detection of human immunodeficiency virus neutralizing antibody // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1987. -V. 3. - P. 283-302.

172. Niederman T.M., Garcia J.V., Hastings W.R., Luria S., Ratner L. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits NF-kappa B induction in human T cells // J. Virol. - 1992. - V. 66. - P. 6213-6219.

173. Nomura H. Molecular cloning cDNAs encoding a LD78 receptor and putative leukocyte chemotactic peptide receptors // Int. Immunol. - 1993. - V. 5. - P. 12391249.

174. Nunberg J.H. Viral resistance to human immunodeficiency virus type 1-specific pyridinone reverse transcriptase inhibitor // J. Virol. - 1991. - V. 65. - P. 48874892.

175. Otto M.J., Jacobsen H., Dano K. et al. In vitro isolation and identification of human immunodeficiency virus (HIV) variants with reduced sensetivity to C-2 symmetrical inhibitors of HIV-1 protease// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. -V. 90. - P. 7543-7547.

176. Ovod V., Lagerstedt A., Ranki A. Immunological variation of immunohistochemical localization of HIV-1 Nef demonstrated with monoclonal antibodies // AIDS. - 1992. - V. 6. - P. 25-34.

177. Pantaleo G., PerrinL. Can HIV be eradicated? II AIDS. - 1998. - V. 12. -Suppl. A. - P. S175-S180.

178. PauC.P., Lee-Thomas S., Auwanit W., George J.R., Ou C.Y., Parekh B.S., Granade T.C., Holloman D.L., Phillips S., Schochetman G. Highly specific V3 peptide enzyme immunoassay for serotyping HIV-1 specimens from Thailand //AIDS. - 1993. - V. 7. - P. 337-340.

179. Pedneult L., ElionR., AdlerM. Stavudine (d4T), didanosine (ddl), and nelfinavircombination therapy in HIV-infected subjects: antiviral effectand safety in an ongoing pilot study // 4th International Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. - Washington. - January, 1997. - Abstract 241.

180. Picchio G.R., Gulizia R.J., Wehrly K., ChesebroB., MosierD.E. The cell tropism of human immunodeficiency virus type 1 determines the kinetic of plasma viremia in SCID mice reconstituted with human peripheral blood leukocytes // J. Virol. - 1998. - V. 72. - P. 2002-2009.

181. Poiesz A.P. T-cell lines established from human T-lymphocytic neoplasias by direct response to T-cell growth factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980. -V. 77.-P. 6815-6819.

182. Pollard R., Peterson D., Hardy D. Stavudine (d4T) and didanosine (ddl) combination therapy in HIV-infected subjects: final analysis of antiviral effect and safety in a randomized double-blind study // XI International Conference on AIDS. - Vancouver. - July, 1996.

183. Popovic M., Read-Connole E., Gallo R. T4 positive human neoplastic cell lines susceptible to and permissive for HTLV-III // Lancet - 1984. - V. ii. - P. 14721473.

184. Popovic M., Sarngadharan M.G., Read E., Gallo R. Detection, isolation, and continuos prodaction of cytopatic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS // Science. - 1984. - V. 224. - P. 497-500.

185. Preston B.D., Poiesz B.J., Loeb L.A. Fidelity of HIV-1 reverse transcriptase// Science. - 1988. -V. 242. - P. 1168-1171.

186. Reed L., Muench H.//Amer. J. Hygiene. - 1938. -V.27, P. 493-497.

187. Reed L., Muench H. A simple method of estimating 50% endpoints // Amer. J. Hygiene. - 1938. - V. 27. - P. 493-497.

188. Richman D.D. // Antimicrob. Agents Chemot. - 1993. - Vol. 37. - 1207-1213.

189. Rini J.M., Stanfield R.L., Stura E.A., Salinas P.A., Profy A.T., Wilson I.A. Crystal structure of a human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibody, 50.1, in complex with its V3 loop peptide antigen//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1993. -V. 90. - P. 6325-6329.

190. Roberts J.D., Katarzyna B., Thomas A.K. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1 // Science. - 1988. - V. 242. - P. 63-65.

191. Roberts N.A., Jonson V., Merrill D. et al. Rationel design of peptide-based HIV proteinase inhibitors // Science - 1990. - V. 248. - P. 358-361.

192. Robertson D.L., Sharp P.M., McCutchan F.E., Hahn B.H. Recombination in HIV-1 // Nature. - 1995. - V. 374. - P. 124-126.

193. Saag M.S. Extensive variation of HIV-1 in vivo //Nature. - 1988. - V. 334. - P. 440-444.

194. Sadaie M.R., Benter T., Wong-Staal F. Site-directed mutagenesis of two trans-regulatorygenes (tat III, trs) of HIV-1 // Science. - 1988. - V. 239. - P. 910-913.

195. Satten tau O.J., Arthos J., Deen K. et al.// J. exp. Med. - 1989. - V. 170. -P. 1319-1334.

196. Shaw J.P., Utz P.J., Durand D.B., Toole J.J., Emmel E.A., Crabtree G.R. Identification of a putative regulator of early T cell activation genes // Science. -1988. - V. 241.-P. 202-205.

197. Shchelkanov M.Yu., Pashkova T.A., Lukashov V.V., Kornilayeva G.V., Karamov E.V. Verification of the MTT-assay model for the detection anti-HIV compaunds. // Abstract Book of 2-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St.-Petersburg,Russia / Ed. A.P. Kozlov. - St.-Petersburg: 1993.-P. 37.

198. Shchelkanov M.Yu., Yudin A.N., Sakhuria I.B., Polyakova E.B., Pashkova T.A., Karamov E.V. // Abstract Book of 3-nd International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems". - 1995. - St.-Petersburg, Russia, May 22-26. -P. 74.

199. Shchelkanov M.Yu., StarikovN.S., Yaroslavtcev I.V., YudinA.N., AntonovA.V., Novak I.L., VedenovA.A., KaramovE.V. Variability Analysis of HIV-1 gpl20 V3 Region: III. Distinctions between various sets of peptide fragments derived from the sequences belonging to different HIV-1 taxons//J. Biomol. Struct. Dyn. - 1998. - V. 15. - N 3. - P. 537-546.

200. Shchelkanov M.Yu., YudinA.N., AntonovA.V., SoinovL.A., Zalunin V.V., VedenovA.A., KaramovE.V. Variability Analysis of HIV-1 gpl20 V3 Region: II. Hierarchy of taxons// J. Biomol. Struct. Dyn. - 1997. - V. 15. - N2. - P. 231241.

201. Shchelkanov M.Yu., Yudin A.N., Antonov A.V., Starikov N.S., Vedenov A.A., Karamov E.V. Variability Analysis of HIV-1 gpl20 V3 Region: I. Point Estimators for the Amino Acid Distribution Characteristics // J. Biomol. Struct. Dyn. - 1997. -V. 15. -N 2. - P. 217-229.

202. Shimizu N.S. et al. Isolation and characterization of human immunodeficiency virus type 1 variant infections to brain-derived cells: detection of common point mutations in the 3 region of the env gene of the variants // J. Virol. - 1994. - V. 68. -P. 6130-6135.

203. Simmons G. et al. Primary, syncytium-inducing human immunodeficiency virus type 1 isolates are dual-tropic most can use either LESTR or CCR5 as coreceptors for virus entry // J. Virol. - 1996. - V. 70. - P. 8355-8360.

204. Skoog K.L., Nordenskjold Bo.A., Bjursell K.G. // Eur. J. Biochem. - 1973. -Vol. 33.-P. 428-432.

205. Smith S.D., Shatsky M., Cohen P.S., Warnke R., Link M.P., Glader B.E. Monoclonal antibody and enzymatic profiles of human malignant T-lymphoid cell and derived cell lines // Cancer Res. - 1984. - V. 44. - P. 5657-5660.

206. Smith S.D., Shatsky M., Cohen P.S., Warnke R., Link M.P., Glader B.E. Monoclonal antibody and enzymatic profiles of human malignant T-lymphoid cell and derived cell lines. Cancer Res. - 1984. - Vol. 44. - P. 5657-5660.

207. Steinman R.M., Germain R.N. Antigen presentation and related immunological aspects of HIV-1 vaccines//AIDS. - 1998. - V. 12. - Suppl. A. - P. S97-S112.

208. Stoff J., Shui-LokH. Vaccines and immunology//AIDS. - 1998. - V. 12. -Suppl. A. - P. S95-S96.

209. Strebel K., Klimkait T. and Martin M.A. A novel gene of HIV-1, vpu, and its 16-kilodaltonproduct// Science. - 1988. - V. 241. - P. 1221-1223.

210. Subert P.D., Larrick G.W. // Nature. - 1992. - V. 359. - P. 557-558.

211. TakahashiH., Nakagawa Y., Pendleton C.D., Houghten R.A., Yokomuro K., Germain R.N., Berzofsky J.A. // Science. - 1992. - V. 225. - P. 333-336.

212. Temin H. The DNA provirus hypothesis: the establishment and implications of RNA-directed DNA synttheses // Science. - 1976. - V. 192. - P. 1075-1080.

213. Tersmette M., de Goede R.E.Y., AI B.J.M., Winkel I.N., Gruters R.A., Guypers H.T., Huisman H.G., Miedema F. Differential syncytium-inducing capacity of human immunodeficiency virus isolates: Frequent detection of syncytium-inducing isolates in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related complex // J. Virol. - 1988. - V. 62. - P. 2026-2032.

214. Tersmette M., Gruters R.A., De Wolf F., De Goede R.E., Lange J.M., Schellekens P.T., Goudsmit J., Huisman H.G., Miedema F. // J. Virology. - 1989. -V. 63.-P. 2118-2125.

215. Tersmette M., Koot M., de Gouede R.E.Y., Kootstra N., Schuitemaker H. / HIV: a practical approach // J. Karn. - Oxford, 1995.

216. Vella S., Mildvan D. Clinical treatment // AIDS. - 1998. - V. 12. - Suppl. 12. -P. S147-S148.

217. Virologische praxis / Herausgegeben von G. Starke. - Jena: Veb Gustav Fischer Verlag, 1968. - 352 p.

218. Vistica D.T., Scehan P., Scudiero D., et al. Tetrazolium-based assay for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. // Cancer Res. - 1991. - V. 51. - P. 2515-2520.

219. Vogt G.M. Retroviral virions and genomes // In: Retroviruses / Ed. Coffin J.M., Hughes S.H., Varmus H. - NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1997. - P. 27-70.

220. Vrang L., Basin H., Remaund G. eta al. // Antivir. Res. - 1987. - V. 7. - P. 139149.

221. Wei X., Ghosh S.K., Taylor M.E., Johnson V.A., Amini E.A., Deutch P., Lifson J.D., Bonhoeffer S. , Nowak M.A., Hahn B.H., Saag M.S., Shaw G.M. // Nature. - 1995. - Vol. 373. - P. 117-122.

222. Wilks D., Walker L., O'Brien J. et al.// Immunology. - 1990. - V. 71. - P. 1015.

223. Wyatt R., Thali M., Tilley S., Pinter A., Posner M., Ho D., Robertson J., Sodroski J. // J. Virol. -1992. - V. 66. - P. 6997-7004.

224. Yarchoan R., Mitsuya H., Myers C.E., Broder S. // New England J. Med. -1989.-Vol. 321.-P. 726-738.

225. Yaroslavtseva N.G., Shchelkanov M.Yu., YudinA.N., Papuashvili M.N., Verevochkin S.V., Emeljanov A.V., KozlovA.P., EreminV.Ph., RytikP.G., Titov L.P., Gorbacheva E.S., Golikov B.A., Chaplinskas S.A., Karamov E.V. Atlas of immunoreactivity profiles of HIV-positive sera from the territory of the former USSR//In: Abstract Book of 5-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", 1997, May 25-30, St.-Petersburg, Russia. - St.-Petersburg, 1997. - P. 257-258.

226. Yaroslavtseva N.G., Shchelkanov M.Yu., YudinA.N., Papuashvili M.N., Nabatov A.N., KozlovA.P., EreminV.Ph., Titov L.P., RytikP.G., Olshansky A.Ya., Golikov V.A., Chaplinskas S.A., Karamov E.V. Atlas of immunoreactivity profiles of HIV-positive sera collected in the territory of former USSR: the update on 1998//In: Abstract Book of 6-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", 1998, May 18-22, St.-Petersburg, Russia. -St.-Petersburg, 1998.-P. 109.

227. Yaroslavtseva N.G., Shchelkanov M.Yu., YudinA.N., Sakhurial.B., EreminV.Ph., Gadynskaya N.I., Titov L.P., RytikP.G., Karamov E.V. Molecular history of HIV-1 epidemic in (Gomel region, Byelorus) //In: Abstract Book of 6th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", 1998, May 1822, St.-Petersburg, Russia. - St.-Petersburg, 1998. - P. 91.

228. Yolov A.A., Kozlova A.V., Yaroslavtseva N.G., Mednikov B.M., Karamov E.V. Quantitative PCR as a way to the gene-level monitoring of retroviral infection//Virus genes. - 1995.-V. 10. - N 1. - P. 45-51.

229. Yudin A.N., Shchelkanov M.Yu., Yaroslavtseva N.G., Eremin V.Ph., Semiletov Yu.A. and Karamov E.V. Serotype heterogeneity analysis of HIV-1-positive sera from the territory of Byelorussia//In: Abstract Book of 4-nd International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", May 21-25, 1996, St.-Petersburg, Russia / Ed. A.P. Kozlov. - St.-Petersburg, 1996. - P. 105.

230. Yudin A.N., Shchelkanov M.Yu., Yaroslavtseva N.G., SlavskyA.A., DenisovM.V., Karamov E.V. 3D-analysis of HIV-1 gpl20 V3 tip functioning within its complex with antibody//In: Abstract Book of 6-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", 1998, May 18-22, St.-Petersburg, Russia. - St.-Petersburg, 1998. - P. 83.

231. Zwart G., Wolfs T.F.W., Bookelman R., Hartman S., Bakker M., Boucher C.A.B., Kuiken C., Goudsmit J. Greater diversity of the HIV-1 V3 neutralization domain in Tanzania compared with The Netherlands: serological and genetic analysis // AIDS. - 1993. - V. 7. - P. 467-474.

Благодарности

Автор пользуется случаем выразить искреннюю благодарность своим научным руководителям с.н.с. Эдуарду Владимировичу Карамову и академику РАМН, профессору Сергею Миновичу Клименко за помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы, ценные советы и рекомендации, а также с.н.с., к.б.н. Галине Владимировне Корнилаевой за консультативную и практическую помощь.

Особую благодарность автор выражает Михаилу Юрьевичу Щелканову за ценное научное сотрудничество, полезные дискуссии и всестороннюю поддержку.

Выражаю искреннюю признательность соавторам и всем сотрудникам группы иммунохимии НИИ вирусологии.