Биологические сенсоры с использованием полимерных электронных и ионных проводников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Лукачева, Лилия Владимировна

• Лукачева, Лилия Владимировна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Лукачева, Лилия Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

В ВЕДЕНИЕ ^

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Общая характеристика электрохимических биосенсоров

1.1. Амперометрические биосенсоры

1.1.1. Амперометрические биосенсоры первого поколения

1.1.2. Амперометрические биосенсоры второго поколения

1.1.3. Амперометрические биосенсоры третьего поколения

1.2. Потенциометрические биосенсоры

1.2.1. Иоиоселективные электроды, применяемые для разработки потенциометриче-ских биосенсоров

1.2.2. Модифицированные электроды как потенциометрические трансдьюсеры

1.2.2. Потенциометрические биосенсоры

Глава 2. Проводящие полимеры: применение для разработки сенсоров

2.1. Модификация поверхности электродов проводящими полимерами

2.2. Ферментные электроды на основе электронпроводящих полимеров

2.3. Электрохимический синтез и свойства полианилина

2.3.1. Свойства электрохимически синтезированного гомополимера

2.3.2. С оп о л и мер иза ц ия анилина и замещенных анилинов

Глава 3. Химически синтезированный нолианилин и его растворение в органических рястворитслях

Глава 4. Иммобилизация ферментов для создания биосенсоров

4.1. Методы иммобилизации ферментов на поверхности модифицированных электродов47

4.2. Использование ионообменных полиэлектролитов для создания эле ктр ох и м и ч ее к и х сенсоров

4.3. Влияние органических растворителей на каталитическую активность и стабильность ферментов

Глава 5. Используемые материалы, оборудование и методы

5.1. Материалы

5.2. Оборудование

5.2.1. Электроды

5.2.2. Электрохимические измерения

5.2.3. Потенциометрические измерения

5.2.4. Прото ч но- ин жекционный анализ

5.2.5. Спектрофотометрические измерения

5.3. Методы

5.3.1. Получение электродов, модифицированных пленками ПАн, и исследование их свойств

5.3.2. Иммобилизация ГОД в мембраны Нафиона

5.3.3. Включение ферроценов в мембраны Нафиона

5.3.5. Приготовление потенциометрических глюкозных биосенсоров

5.3.6. Приготовление потенциомелгрического ферментного электрода для анализа пара-оксона

5.3.7. Приготовление потенциометрического ферментного электрода для анализа мочевины

5.3.8. Тестирование биосенсоров

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Иммобилизация глюкозооксидазы в мембраны Нафиона из сред с высоким содержанием этанола

6.1. Активность ГОД после инкубирования в смесях этанол - вода с низким содержанием воды

6.2. Оптимизация состава мембран Нафион - глюкозоокс-и даза

6.3. Исследование влияния иммобилизации ГОД на кинетические параметры реакции

окисления глюкозы

Глава 7. Безреагентный медиаторный амперометрический биосенсор на основе иммобилизованных в мембрану Нафиона глюкозооксидазы и 1,Г-диметплферроцена

7.1. Включение ферроцена и его производных в мембраны Нафиона

7. 2. Глюкозный амперометрический биосенсор на основе мембраны ДМФц - ГОД - Нафион

7.3. Проточно-инжекционный анализ глюкозы

Глава 8. Потенциометрические биосенсоры на основе сополимера анилина и мета-ниловой кислоты (самодопированного полианилина)...,

8.1. Электрохимическая сополимеризация анилина и метаниловой кислоты

8.2. Самодопированный полианилин как рН-трансдьюсер

8.3. Глюкозный потенциометрический биосенсор на основе са м о д оп ирова н но го ПАн

8.4. Улучшение стабильности потенциометрического глюкозного биосенсора путем использования разработанного метода иммобилизации

8.5. Потенциометрический биосенсор для анализа параоксона

Глава 9. Высокоэффективный рН-трансдьюсер на основе полианилина, допирован-ного камфорсульфоновой кислотой

9.1. Растворение ПАн в органических растворителях

9.2. Электроды, модифицированные ПАн, допированным КСК,

как высокочувствительные рН-сенсоры

9.2.1. pH-зависимость равновесного потенциала электродов, модифицированных химически синтезированного ПАн

9.2.2. Оптимизация аналитических характеристик рН-чувстви-тельных электродов на основе химически синтезированного ПАн

9.3. Разработка глюкозного потенциометрического биосенсора на основе полианилина, дотированного КСК

9.4. Биосенсор для анализа мочевины на основе ПАн

ВЫВОДЫ

Приложение. Список сокращений и структурных формул веществ, использованных в

работе

С ЛИС OK JIJJTJi^P.AT^nPbX •••••••••••••••••••••••••••••••«•««•••••в««**««*«««««**«*«»«*««**««««»«»*«««««****««««*««««****«« 14Т

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические сенсоры с использованием полимерных электронных и ионных проводников»

ВВЕДЕНИЕ

Биосенсорами называются устройства, в которых чувствительный биологический элемент связан с преобразователем его реакции на внешнее воздействие в сигнал, удобный для регистрации и обработки.

В последние десятилетия показано, что электрохимические биосенсоры представляют собой альтернативу традиционным методам анализа, особенно благодаря высокой селективности и простоте регистрирующих устройств. На первом месте по количеству разработок, в том числе внедренных в производство, стоят биосенсоры для анализа глюкозы в крови. Кроме клинической диагностики, не менее важным становится применение биосенсоров для серийных анализов при мониторинге окружающей среды и при контроле качества продуктов питания.

Анализ реальных объектов налагает свои требования на характеристики сенсоров, особенно на их чувствительность и селективность. В ряде случаев необходим непрерывный продолжительный мониторинг аналитического сигнала, в связи с чем важна операционная стабильность сенсора. Все эти требования диктуют необходимость создания новых биосенсоров с точки зрения как поиска новых путей сопряжения ферментативных и электрохимических реакций, так и новых методов иммобилизации ферментов на поверхности электрода.

Одним из перспективных направлений в разработке биосенсоров является применение электронпроводящих полимеров, таких как полипиррол, политиофен и полианилин (ПАн). Электрические и электрохимические свойства этих соединений чувствительны к целому ряду физических и химических воздействий, что обусловливает их применение в сенсорах. В биосенсорах электронпроводящие

полимеры могут применяться как электрохимические трансдьюсеры (преобразователи сигнала), а также в качестве матриц для иммобилизации ферментов.

Чувствительность и стабильность работы ферментного электрода во многом зависят от свойств биочувствительного слоя. Условия эксплуатации датчика, материал электрода и метод сопряжения электрохимической и ферментативной реакции накладывают определенные ограничения на используемые методы иммобилизации. Полиэлектролиты, обладающие ионной проводимостью, способны повышать селективность химических и биологических сенсоров. Наиболее широко для этих целей применяется катионообменный полиэлектролит Нафион. Представляет интерес его использование как матрицы для иммобилизации ферментов на поверхности электрохимических трансдьюсеров.

Данная работа посвящена созданию биосенсоров потенциометрического (!) и амперометрического (II) типов. Общие схемы разрабатываемых сенсоров приводятся ниже на примере глюкозных датчиков. Нафион в обоих случаях выступает в качестве матрицы для иммобилизации ферментов. Преобразование сигнала происходит в первом случае за счет изменения потенциала рН-чувствительного трансдьюсера - полианилина. Во втором случае амперометрический сигнал возникает вследствие переноса электронов от активного центра глюкозооксидазы к поверхности электрода с помощью медиатора ферроцена.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава L Общая характеристика электрохимических биосенсоров.

1.1. Амперометрические биосенсоры.

В основе действия амперометрических ферментных электродов лежит сопряжение специфического распознавания ферментом субстрата и электрохимического преобразования скорости реакции в электрический ток.

Концепция ферментных электродов была выдвинута Кларком и Лайонсом [1]. Они предложили использовать ферменты для придания электрохимическим сенсорам специфической чувствительности к определенным субстратам. Так, концентрацию глюкозы оказалось возможным измерять амперометрически по убыли концентрации кислорода, являющегося вторым субстратом реакции под действием глюкозооксидазы (ГОД). В первом электроде такого типа для анализа глюкозы раствор фермента удерживался между двумя мембранами. С другой стороны, мембрана защищала платиновый электрод от загрязнения белками и клетками крови, в которой определялось содержание глюкозы.

Первый ферментный электрод, в котором применили иммобилизацию ГОД на поверхности электрода в гелевой мембране, был предложен Апдайком и Хиксом в 1967 г. [2].

В 1969 г. началась разработка Кларком совместно с компанией Yellow Springs Instrument (США) специального анализатора для прямого определения глюкозы в цельной крови (объем пробы 25 мкл). В 1974 г. такой анализатор появился на рынке аналитических приборов клинической биохимии.

1.1.1. Амперометрические биосенсоры первого поколения

В основу электродов первого поколения положена природная фермента-

тивная реакция, например, окисление глюкозы в присутствии кислорода, катализируемое ГОД. В таких электродах используется амперометрическая детекция либо субстрата ферментативной реакции 02 по его восстановлению на катоде, либо продукта реакции Н202 по окислению на аноде:

глюкоза + 02 —> глюконолактон + Н2Ог (1.1)

Существенными недостатками биосенсоров этого типа являются следующие. При анализе по кислороду неизбежны большие погрешности определения и невоспроизводимость отклика, поскольку концентрация этого вещества в биологических жидкостях непостоянна. При проведении детекции по пероксиду водорода в нейтральных растворах необходимы высокие значения потенциала платинового электрода (+0,6 В) [3]. Однако в исследуемых жидкостях, например в крови, могут присутствовать легко окисляемые вещества (урат, аскорбат, парацетамол и др.), которые будут оказывать мешающее влияние при анализе.

В настоящее время предложен ряд подходов для решения этих проблем. Для усовершенствования биосенсоров первого поколения применяются диализные и ионселективные мембраны, наносимые на поверхность ферментного электрода, для уменьшения мешающего влияния восстановителей. Например, во многих работах указывается, что с помощью применения катионообменного полиэлектролита Нафиона удалось уменьшить и даже полностью исключить влияние урата [4-6], аскорбиновой кислоты [5,6], парацетамола [6] при их концентрациях, соответствующих физиологическому уровню. Для этих же целей применяются полиэлектролит Eastman AQ [7], комбинации из нескольких мембран, например, На-фион - ацетат целлюлозы [8], а также липидные бислои [9].

К настоящему времени разработаны ферментные электроды для анализа

целого ряда биологических метаболитов, органических и неорганических соединений. Как правило, они основаны на амперометрической детекции кислорода или перекиси водорода.

Важными для клинической диагностики метаболитами являются галактоза (улучшает гомеостатическую регуляцию глюкозы у недоношенных детей, однако превышение концентрации может оказывать токсическое действие), лактат (его повышенное содержание в плазме крови связано с заболеванием ацидозом), креатинин и креатин (определение их концентрации важно для диагностики заболеваний почек, щитовидной железы и мышц). Поскольку к настоящему времени выделены соответствующие оксидазы, то они используются в качестве биологического чувствительного элемента для создания биосенсоров первого поколения. Так, в случае анализа галактозы [10] и лактозы [11] используется галактозоокси-даза; для анализа лактата [12] - лактатоксидаза, иммобилизованные на поверхности электродов. При детекции креатинина используются три последовательные реакции, катализируемые иммобилизованными креатининамидогидролазой, креа-тинамидогидролазой и саркозиноксидазой. В случае анализа креатина на электрод наносятся только второй и третий из указанных ферментов [13].

Из сенсоров для анализа объектов окружающей среды упомянем биосенсоры на фенол на основе полифенолоксидазы [14] и для анализа пестицидов на основе ингибирования действия таких ферментов, как ацетилхолинэстеразы и холиноксидазы [15].

В настоящее время в США, Японии, Франции, Литве, Венгрии и некоторых других странах налажен промышленный выпуск анализаторов глюкозы, лактозы, сахарозы, лактата и др. [16].

1.1.2. Амперометрические биосенсоры второго поколения

Перейдем к рассмотрению биоаналитических систем, называемых биосенсорами второго поколения. В них используется следующий принцип: фермент вступает в окислительно-восстановительную реакцию с субстратом, а затем вновь окисляется низкомолекулярным переносчиком электронов, медиатором. Последний, в свою очередь, окисляется на электроде, например:

глюкоза + ГОДок —> глюконолактон + ГОДвос (1.2)

ГОДок + М-> ГОДо* + М' + 2Н+, (1.3)

где ГОДвос и ГОДок - восстановленная и окисленная формы ГОД, что соответствует восстановленному и окисленному состоянию флавинадениндинуклеотида (ФДД) в активном центре фермента; М и М' - восстановленная и окисленная формы одноэлектронного медиатора.

Таким образом, можно заменить природный преносчик электронов, кислород. При этом медиатор может быть подобран таким образом, что отклик ферментного электрода будет полностью независим от парциального давления кислорода. Сформулировано несколько основных требований к медиаторам, применяемым для разработки биосенсоров [16]:

1) медиатор должен быстро реагировать с восстановленным ферментом;

2) гетерогенные реакции с участием медиатора должны быть обратимы;

3) перенапряжение процесса регенерации окисленного медиатора должно быть низким и не зависеть от рН;

4) медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в восстановленной форме;

5) восстановленный медиатор не должен реагировать с кислородом;

6) для многих приложений требуется, чтобы медиатор был нетоксичным.

Помимо этих условий, выбор медиатора определяется исходя из окислительно-восстановительных свойств активного центра фермента. В работах группы Станковича [17] были измерены окислительно-восстановительные потенциалы флавиновых реакций ГОД. Двухстадийное превращение ФАД в ФАДН2 происходит с участием одного электрона и одного протона на каждой стадии, суммарно:

Н

2ё

|ЧН 2Н+

ГТ4

Н о

ФАД ФАДН2 (1.4)

В щелочной среде (рН>8) присоединяется лишь один протон на второй стадии восстановления, т.е. продуктом реакции является ФАДН".

Потенциалы обоих переходов при рН 5,3 составляют приблизительно -0,065 В относительно насыщенного водородного электрода (н.в.э.). Поскольку в редокс-превращениях принимают участие протоны, то в щелочной среде редокс-потенциалы обоих стадий понижены и составляют соответственно -0,2 и -0,24 В (н.в.э.), рН 9,3.

Фундаментальные исследования реакционной способности ГОД с одно- и двухэлектронными акцепторами проведены Чаном и Бирксом [18]. Они выяснили, что перенос двух электронов с восстановленной ГОД на молекулы медиаторов происходит последовательно, причем лимитирующей стадией является перенос второго электрона. В то же время природный субстрат, кислород, окисляет восстановленный активный центр фермента с одновременным переносом двух элек-

тронов [19].

Анализ реакционной способности различных акцепторов электронов, проведенный в работах Ю Кулиса [19,20], показал, что наивысшие скорости окисления активного центра ГОД достигаются при использовании кислорода (константа скорости 2,32-106 М"1с'1) и соединений о-хиноидной структуры (величины констант скоростей того же порядка). Редокс-красители феназинового и фенотиазинового ряда реагируют примерно в сто раз менее эффективно. Феррицианид калия также обладает довольно низкой активностью в этой реакции, что обусловлено специфическим взаимодействием ионогенных групп в активном центре фермента с заряженными частицами.

По различию рН-оптимума ГОД при реакции с различными электрон-акцепторами последние разделены на 4 группы [21]. К первой относятся соединения, рН-зависимость скорости реакций которых имеет четко выраженную колоко-лообразную зависимость с максимумом при рН 5-6. Это хиноны и кислород. При использовании соединений второй группы рН-оптимум смещен в область рН 7,5. Это феноксазины, ферроцены, тетрацианохинодиметан, бензилвиологен и др. Электронакцепторы с высокой плотностью заряда имеют рН-оптимум в кислой среде (рН<4). Это феррицианид и трис(2,2'-бипиридин)кобальт (!!!) перхлорат, отнесенные к третьей группе. Представители четвертой группы (индофенолы) обладают низкой плотностью заряда; скорость их реакции с ГОД падает при увеличении рН, однако не так резко, как в случае представителей третьей группы.

Для создания медиаторных биосенсоров наиболее широко используются ферроцен (5-бис-(циклопентадиенил)железо) и его производные. На электроде ферроцен подвергается одноэлектронному окислению с образованием иона фер-рициния. Реакция происходит быстро и обратимо. Формальный окислительно-

восстановительный потенциал пары ферроцен/феррициний равен 0,165 В относительно насыщенного каломельного электрода (н.к.э.). Ионы феррициния менее стабильны, чем ферроцен, и подвержены медленному окислению кислородом в растворе. Однако сам ферроцен, т.е. восстановленная форма медиатора, не подвержен деструкции кислородом.

В ставшей классической совместной работе групп А.Хилла и Дж.Хиггинса [22] был проведен анализ реакционной способности различных ферроценов в реакции окисления активного центра ГОД, а также предложен новый медиаторный ферментный электрод на основе ГОД и 1,1 '-диметилферроцена, иммобилизованных на графите. Было показано, что реакциям между растворенными ГОД и различными ферроценами присущи высокие скорости. Исходя из наиболее низкого значения редокс-потенциала и наименьшей растворимости восстановленной формы в воде для разработки амперометрического биосенсора был выбран 1,1'-диметилферроцен. Ферментный электрод обладал откликом, линейно зависящим от концентрации глюкозы в диапазоне 2-30 мМ. Кроме того, кислород при его концентрациях, обычно присутствующих в венозной крови, практически не оказывал влияния на отклик электрода. При насыщении воздухом исследуемого раствора величина отклика понижалась лишь на 4%. Ферментный электрод был протестирован в цельной крови и в плазме. Коэффициент корреляции между обоими измерениями составил 0,99.

Данная разработка позволила фирме МесПЗепэе (Великобритания и США) начать в 1987 г. выпуск карманного прибора для измерения глюкозы в крови. Отмечено, что особую важность при заболевании сахарным диабетом приобретает постоянный контроль содержания глюкозы в крови. Поэтому необходимы приборы, позволяющие проводить многократный анализ в домашних условиях. Для

этого обычно применяют одноразовые (сменные) сенсорные элементы пленарного типа. Такие сенсорные полоски содержат рабочий электрод с иммобилизованными ГОД и ферроценовым медиатором, второй рабочий электрод, содержащий медиатор, и хлорсеребрянный электрод. Измерение разности токов откликов двух рабочих электродов позволяет избежать мешающего влияния примесей.

Одной из важнейших задач при разработке биосенсоров второго поколения является предотвращение вымывания медиатора в раствор. Например, в случае использования ферроценов их окисленная форма растворима в воде. Следовательно, необходимо обеспечить прочное удерживание медиатора на поверхности электрода. Реализация этого подхода находит отражение в концепции безреа-гентных амперометрических биосенсоров. Недавно Х.-Л. Шмидт и В.Шуман [23] сформулировали определение этих биосенсоров как амперометрических ферментных электродов, которые обеспечивают сигнал, пропорциональный концентрации субстрата и независимый от медиатора или кофермента. Однако такое определение не исключает присутствия этих реагентов поблизости от электрода. Таким образом, при разработке безреагентных амперометрических биосенсоров медиаторного типа возникает потребность в таких методах иммобилизации медиаторов, коферментов и ферментов, при которых не затрудняется их функционирование как эффективных переносчиков электронов между ферментом и электродом, а также сохранятся высокая скорость реакций переноса.

В упомянутом обзоре [23] перечислены такие методы, как:

1) ковалентное связывание медиатора с поверхностью электрода и адсорбция фермента;

2) модификация фермента медиатором или кофактором с последующей ко-валентной пришивкой к поверхности электрода;

3) включение фермента в проводящую полимерную пленку;

4) включение фермента в пленку редокс-полимера;

5) ковалентная пришивка фермента к поверхности электрода и последующее образование на его основе холофермента присоединением апофермента.

Наиболее развитым из этих направлений является предложенное А.Хеллером использование редокс-гидрогелей с включенными в них ферментами [24-27]. Термин, примененный для названия таких систем, можно перевести как "электрическое контактирование" медиатора и активного центра фермента. В трехмерную полимерную структуру на основе поливинилпиридина включают медиатор осмий(бипиридил)хлорид путем комплексообразования. Затем в полученный редокс-полимер иммобилизуют фермент.

В случае использования редокс гидрогелей оказалось возможным понизить потенциал рабочего электрода, что необходимо для уменьшения мешающего влияния восстановителей. Путем применения сополимера акриламида и винили-мидазола, удалось понизить потенциал детекции глюкозы и лактата до 0,2 В (отн. н.к.э.), в результате чего аскорбат, урат, ацетаминофен и 1_-цистеин, как сообщалось, не оказывали мешающего влияния при анализе [26].

Позднее был создан имплантируемый гибкий микросенсор для подкожного мониторинга глюкозы диаметром 0.29 мм [28]. Электрод изготовлялся на основе 0.09 мм золотой проволоки, изолированной полиимидом. Путем аккуратного вытягивания золотой проволоки из изоляторной трубки в образующийся с другого конца капилляр всасывались исходные растворы для формирования ферментного электрода. Золотая проволока служила впоследствии токоотводом. Имплантируемый биосенсор состоял из трех последовательных слоев: глюкозочувстви-тельного, ограничивающего активный транспорт и биосовместимого. При наложе-

нии потенциала 200 мВ (н.к.э.) ферментный электрод площадью 5-10~4 см2 обладал в модельных экспериментах чувствительностью 1 ^ 2.5 нА/мМ.

Имплантируемый биосенсор на основе редокс гидрогелей успешно прошел испытания в биологических системах, в частности., для исследования кинетики транспорта глюкозы в различные ткани крыс [29].

Поиск новых медиаторов, а также методов иммобилизации, обеспечивающих эффективное функционирование безреагентных сенсоров, продолжается. Наиболее успешными, вероятно, будут те разработки, которые позволят создать на основе одной общей концепции несколько датчиков на различные соединения. В то же время намечается тенденция создания мультианализаторов, включающих сразу несколько ферментов.

1.1.3. Амперометрические биосенсоры третьего поколения

В системах третьего поколения отсутствует диффузионно подвижный медиатор. Происходит прямой перенос электронов с активного центра фермента на электрод. Однако это определение трактуется двояко. Часть исследователей считает, что это означает перенос электронов на не модифицированный электроактивными веществами электрод. Другие исследователи говорят о такой модификации поверхности электрода, что становится возможным прямой перенос без участия диффузионно подвижных медиаторов. Как пример такой модификации приводят органические металлы.

Явление прямого биоэлектрокатализа было продемонстрировано в совместных работах Института электрохимии АН СССР и кафедры химической эн-зимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Для создания ферментного электрода была проведена иммобилизация фермента лакказы, или

голубой медьсодержащей полифенолоксидазы, в слой специально предобрабо-танной высокопористой сажи на поверхности золотого электрода. Предобработка заключалась в добавлении в сажу связующих и гидрофилизации поверхности выдерживанием электрода в растворе при потенциалах 0,4-0,6 В (ст.в.э.) [30].

В атмосфере кислорода под действием иммобилизованной лакказы происходило его восстановление до воды:

02 + 4Н* + 4е -> 2НгО (1.5)

При этом на электроде устанавливался потенциал, близкий к равновесному потенциалу кислорода (1,23 В). Ранее такое значение наблюдалось только на специально предобработанной платине [31]. При отсутствии фермента или его инактивации присходило снижение потенциала до 0,6-0,7 В. В специальной серии экспериментов было показано, что пероксид водорода не образуется в ходе реакции.

По аналогии с кислородным ферментным электродом был создан электрод для восстановления пероксид а водорода на основе иммобилизованной перокси-дазы. Важно отметить, что на циклических вольтамперограммах (ЦВА) ферментного электрода наблюдались пики, соответствующие окислению-восстановлению гема, входящего в состав активного центра фермента.

Детекцию пероксида водорода можно было проводить при отрицательных величинах потенциала (отн. н.к.э.), что практически предотвращало мешающее влияние восстановителей. Кроме того, дополнительная иммобилизация второго фермента - специфической оксидазы, продуктом каталитической реакции которой является пероксид водорода, позволила разработать несколько амперометриче-ских систем на основе пастовых электродов (перечислены в обзоре [32]). Таким образом были получены биосенсоры для анализа спиртов, альдегидов, 1_~

глютамата, I- и О-аминокислот.

Еще одним ферментом, для которого было доказано явление прямого био-электрокатализа на углеродистых электродах, является гидрогеназа. Этот фермент катализирует окисление молекулярного водорода, а также выделение водорода из воды. На ферментном электроде с иммобилизованной гидрогеназой был впервые достигнут равновесный потенциал пары 2Н+/Н2. Была выдвинута гипотеза об участии железосерного кластера в активном центре гидрогеназы как внутримолекулярного вспомогательного редокс-центра. Возможно, происходит комплексование координационно ненасыщенного атома железа с поверхностными лигандами углеродистого электрода, что образует цепь переноса электронов с активного центра фермента на электрод [33].

Известна структурная концепция для объяснения переноса электрона между активным центром белка и электродом. Грей с сотр. [34] на основании данных теоретических расчетов туннельного переноса электронов получили эмпирическое уравнение, выражающее зависимость между скоростью внешнесферного переноса электрона и глубиной залегания активного центра фермента. Критическое расстояние туннельного переноса было оценено как 1,24 нм при скорости

О 1

переноса 10 с . Другие исследователи приводят величины критических расстояний 1,2-1,6 нм [35]. Анализ экспериментальных данных, проведенный в работе Кулиса и Разумаса [19], позволил им заключить, что те белки, которые являются активными в процессе прямого биоэлектрокатализа, обладают близко расположенным к поверхности белковой глобулы (менее 1 нм) активным центром. Например, для гидрогеназы глубина залегания активного центра составляет 0,2 нм, для цитохрома с - 0,32 нм [19]. Для этих белков изучено явление биоэлектрокатализа. В то же время для ГОД флавиновый активный центр углублен более чем на

1 нм и находится в гидрофобном окружении, поэтому прямой перенос электронов на него не наблюдается. Таким образом, удалось объяснить экспериментально полученные данные, накопленные в области биоэлектрокатализа.

Перейдем к рассмотрению ферментных электродов на основе проводящих органических солей ("органических металлов"). Примером может служить соль, образованная катионом Ы-метилфеназиния (НМП) и анионом тетрациан -п-хинодиметана (ТЦХМ). Электроды, модифицированные этим комплексом, послужили эффективными трансдьюсерами для создания ферментных глюкозных электродов [36,37]. Однако имеются разногласия относительно механизма электрохимической реакции между проводящей солью и активным центром фермента. Эл-бери и Кноулес [36] утверждают, что соль прочно удерживается на поверхности электрода. Кроме того, ее положительные и отрицательные заряды взаимодействуют с соответствующими разноименными зарядами фермента. Кулис с сотр. [19,37] в ряде работ указывает на то, что анион или катион соли, хоть и в небольшой степени, но растворимы в буферном растворе. Таким образом, происходит перенос электронов с помощью подвижного медиатора, находящегося в приэлек-тродном слое.

Несмотря на несколько удачных разработок, к настоящему времени существует лишь небольшое число биосенсоров третьего поколения. Это связано ограниченным кругом ферментов, для которых возможно точное доказательство механизма прямого биоэлектрокатализа.

1.2. Потенциометрические биосенсоры.

1.2.1. Ионоселективные электроды, применяемые для разработки потенциометрических биосенсоров

Потенциометрические ферментные электроды представляют собой комбинацию ионоселективного электрода (ИСЭ) с иммобилизованным вблизи него ферментом. Ионы, принимающие участие или получаемые в ходе ферментативной реакции, детектируются ИСЭ. Достоинствами потенциометрических сенсоров являются простота детектирующего оборудования, низкая стоимость, доступность большого числа электродов, чувствительных к ионам Н+, Ыа+, К+, Мд2+, Са2+, Сб2+, Си2+, Б2", Г, Вг", !М03' и др., совмещенные с чувствительностью и селективностью ферментативных методов анализа.

В зависимости от мембран, применяемых в ИСЭ, последние можно разделить на:

1) Стеклянные электроды, примером которого является рН-электрод. Мембрана представляет собой тонкое стекло, обладающее селективностью по отношению к определенным катионам.

2) Электроды, в которых чувствительным элементом является ионпроводя-щий моно- или поликристалл либо осадок. Этот чувствительный к определенным ионам компонент может быть диспергирован в инертном полимерном носителе. Некоторые примеры таких ИСЭ, называемых твердотельными, приведены в табл. 1.1. Ионит может находиться также в жидком состоянии и удерживаться на электроде инертной мембраной.

Остановимся подробнее на формировании потенциометрического отклика ИСЭ. Чувствительным элементом здесь является мембрана с избирательной проницаемостью, которая объясняется тем, что на границе раздела фаз раствор -

Таблица 1.1. Некоторые виды твердотельных ионоселективных электродов

Определяемый ион Носитель Полимерная матрица Литература

Н+ - ЫНз-ПВХ 1 [38]

СОз2' трифторо-п-бутилбензол поливинилхлорид (ПВХ) [39]

ын/ нонактин ЫН2-ПВХ 1 [39]

БОМ" Мп(1И)-порфирин ПВХ [40]

К+ валиномицин силанизированная резина [41]

1 ЫНг-ПВХ - ПВХ с атомами С1, частично замещенными на ЫН2-(СН2)п^Н2.

мембрана понижен энергетический барьер для транспорта определенных (анализируемых) ионов, тогда как для всех остальных он остается высоким. В результате транспорта ионов без противоионов изменяется потенциал границы раздела фаз, Дфр.„. Постепенно система приходит к равновесному состоянию, которое характеризуется равенством электрохимических потенциалов иона / в растворе и мембране, то есть

и,Р = С-6)

Электрохимический потенциал иона / по определению равен

//,. =//, + (1-7)

где г,- - заряд иона, Р - постоянная Фарадея, - потенциал фазы, в которой существуют ионы /. Химический потенциал ионов / равен

= КПп(а1) + (1.8)

где Я - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура, -стандартный химический потенциал и а, - активность иона /'. Подстановкой выра-

жений (1.7) и (1.8) для иона / в растворе и в мембране в уравнение (1.6) получим уравнение Нернста для взаимосвязи потенциала границы раздела фаз и активности иона в растворе (активность иона в мембране считается большой и постоянной величиной и учитывается в Е°:

Е = фр,_т =Е°- (КГ / гР)1п(а,) (1.9)

Запишем это уравнение для стационарного потенциала рН-чувствительного электрода с учетом констант и при г = 1, Т= 298 К:

Е = Е°- 0,059рН (1.10)

Важный вывод, который можно сделать из проведенного анализа уравнений, состоит в том, что чувствительность рН-сенсоров на основе ионоселективных мембран не должна превышать 59 мВ/рН. Например, для стеклянных рН-электродов эта величина составляет 55-58 мВ/рН. Вопрос о том, как можно увеличить чувствительность ИСЭ, будет рассмотрен в следующих главах.

Принципиально новым подходом к разработке потенциометрических ионоселективных датчиков явилось использование полевых транзисторов (ПТ). Впервые чувствительный к ионам водорода ПТ описан Бергвельдом в 1970 г. [42]. Селективным слоем был диоксид кремния, нанесенный на диэлектрический затвор ПТ. При современном развитии технологии не составляет трудности нанести ионоселективную мембрану на диэлектрический затвор ПТ, получив тем самым ионоселективный полевой транзистор (ИСПТ). Кроме того, оказалось, что сам диэлектрик (например, диоксид кремния или нитрид кремния) сам по себе является рН-чувствительной матрицей. Чувствительность к изменению кислотности среды для ИСПТ составляет 45-54 мВ/рН [43]. Преимущества ИСПТ по сравнению с обычными ионоселективными электродами заключаются, прежде всего, в воз-

можности миниатюризации датчиков (их размеры не превышают нескольких миллиметров) и создания условий для их массового производства. В микроэлектронике разработаны многие конфигурации ПТ для усиления сигнала и уменьшения влияния помех. Кроме того, можно объединить несколько ПТ, чувствительных к различным ионам, в многофункциональную систему. Наконец, ИСПТ чаще всего представляют собой полностью твердотельные сенсоры, что значительно облегчает их применение по сравнению с ИСЭ с внутренним стандартным буфером или раствором ионита.

Все эти преимущества открыли путь к использованию ПТ в аналитике и биоаналитике.

1.2.2. Модифицированные электроды как лотенциометрические трансдьюсеры

Химическая или электрохимическая модификация поверхности электрода позволяет придать системе принципиально новые свойства. В частности, этот метод применим для получения электродов, потенциал которых будет зависеть от концентрации в исследуемом растворе определенных веществ или ионов.

Предложено использование для анализа модифицированных электродов, обладающих рН-зависимым потенциалом в различных средах. Принципиальным преимуществом применения модифицированных электродов является то, что при их использовании в качестве рН-сенсоров достижимы отклики, превышающие нернстовскую величину - 59 мВ/рН. Если на модифицированной матрице происходит окислительно-восстановительная реакция типа (1.11) с участием протонов, то уравнение Нернста принимает вид (1.12):

Яей —> Ох л- тН [ + пе (1.11)

,0,059 т/0х] пт

Е = Е°+--lg~........--.......0,059.....~рН (1.12)

п ¡Redi п

Таким образом, если число переносимых электронов меньше числа принимающих участие в реакции протонов, то изменение потенциала превысит -59 мВ/рН.

Наиболее хорошо изучены рН-электроды на основе оксидов металлов. Для некоторых из них, таких как оксиды иридия [44,45], вольфрама [46] и алюминия

[47], сообщается об рН-отклике, равном и даже превышающем нернстовскую величину. Так, для электрода, модифицированного оксидом иридия, полученного анодным окислением базового иридиевого электрода в кислой среде [44] получен максимальный отклик 81 ± 0,1 мВ/рН.

Электрохимические способы получения модифицированных электродов позволяют получать матрицы с заданными и хорошо определенными свойствами. Поэтому не случайно, что рН-сенсоры на основе 1г02 уже выпускаются промышленностью. Так, сенсор, производимый фирмой Toa Electronics (Япония) в работе

[48] сравнивали с другими рН-сенсорами (стеклянным, Si3N4-nCnT и Та205-ИСПТ). Измерения проводились в неводных средах с целью создать систему титрования пикриновой кислоты. Результаты исследований показали, что рН-сенсор на основе Ir02 обладает стабильным в течение более года тестирований откликом, а также удовлетворительным временем отклика.

На основе модифицированного оксидом иридия (IV) электрода был создан биосенсор для анализа фосфороорганических соединений. Его рабочие характеристики приведены в следующем разделе (см. табл. 1.2, [49]).

В качестве трансдьюсеров в потенциометрических биосенсорах применяются также электроды, модифицированные проводящими полимерами (например,

полипирролом и полианилином). Природа формирования их отклика будет рассмотрена отдельно.

1.2.2. Потенциометрические биосенсоры

При использовании потенциометрического биосенсора, то есть комбинации ИСЭ с иммобилизованным ферментом, измеряется зависимость разности потенциалов между рабочим электродом и электродом сравнения, от концентрации вводимого в исследуемый раствор определяемого вещества. Впервые такой электрод для определения мочевины был предложен Гильбо и Монталво в 1969 г. [50]. Для изгототовления биосенсора на чувствительный к ионам аммония ИСЭ наносили найлоновую или дакроновую мембрану с уреазой, иммобилизованной в полиакриламидном геле. При добавлении мочевины в анализируемый раствор на электроде происходила реакция, катализируемая уреазой:

(МН2)2СО + 2Н20 21МН4+ + С032" (1.13)

Ферментный электрод обладал откликом, линейно зависящим от логарифма

<у с

концентрации мочевины в диапазоне 10" - 5-10 М Время отклика составляло 1-2 минуты.

Разработке потенциометрических биосенсоров для анализа мочевины, являющейся важным диагностическим показателем функции почек, посвящена значительная часть исследований и в наши дни. Для анализа этого вещества можно применять не только чувствительные к ионам аммония ИСЭ. Другими базовыми электродами могут быть газочувствительный аммиачный или углекислотный сенсоры. Аммиак и углекислый газ образуются при подщелачивании и подкислении анализируемого раствора соответственно. Созданы также ферментные электроды на основе чувствительных к ионам аммония и карбонат-ионам мембран [39].

Часто для создания потенциометрических биосенсоров используют выпус-

каемые промышленностью рН-электроды. Для иммобилизации фермента используют либо мембрану из геля, либо физическое удерживание раствора фермента между целлофановыми мембранами. В работе [51] сообщалось о разработке глю-козного, мочевинного и пенициллинового биосенсоров на основе рН-электрода. Отклик на глюкозу был линеен в интервале от 0,1 до 1 мМ, а при увеличении концентрации глюкозы в 10 раз значение рН изменялось на 0,85. Однако применение стеклянных рН-электродов не всегда практично по причине их хрупкости.

Применение ИСПТ для разработки потенциометрических биосенсоров приобретает в последнее время все большее распространение. Впервые ферментный ПТ для анализа пенициллина был предложен в работе Караса и Джанаты [52]. Эти же авторы разработали глюкозный биосенсор [43]. Фермент ГОД иммобилизовали на поверхности нитрида кремния в полиакриламидный гель. Диапазон измеряемых концентраций составил 0,1-10 мМ глюкозы. На величину отклика биосенсора, а также на ширину диапазона линейности отклика влияла концентрация второго субстрата ферментативной реакции, кислорода: при увеличении его концентрации оба этих параметра также возрастали.

Известно множество ферментативных реакций, в ходе которых изменяется кислотность среды. Поэтому рН-чувствительные ИСЭ и ИСПТ применяются для анализа широкого круга веществ. Некоторые примеры приведены в табл. 1.2. Существенным недостатком потенциометрических сенсоров является зависимость их отклика от буферной емкости исследуемого раствора. Вероятно, поэтому по-тенциометрические биосенсоры не получили столь широкого распространения, как амперометрические сенсоры. Известны лишь единичные примеры промышленного производства подобных сенсоров для анализа мочевины и аминокислот.

Таблица 1.2. Потенциометрические биосенсоры на основе рН-чувствительных электродов и полевых транзисторов

Анализируемое вещество Фермент Ферментативная реакция Диапазон измеряемых концентраций (чувствительность1) Время отклика Стабильность Литература

глюкоза ГОД глюкоза глюконовая кислота до 10 мМ 2 мин [43]

а *>•> глюкозодегидро-геназа глюкоза + ИАВ+ глюконовая кислота + НАБН 1-40 мМ 5 мин нет данных [53]

мочевина уреаза (ШзЬСО + 2Н20 2Ш3 + СОГ + 2Н 0,05-10 мМ (0.8 рН/рС) 7-10 мин 21 день [51]

¿ь ?? СС 1-500 мМ 20 с 30 дней [54]

СС 0,1-100 мМ (1.5 рН/рС) 2-5 мин > 1 мес [55]

ацетилхолин ацстилхолинэстсраза ацетилхолин + Н20 -» холин + СНзСООН 0,2 -2 мМ 10 с 12 дней [56]

2 параоксон бутирилхолинэстераза М-бутирилхолин + Н20 —> холин + С3Н7СОН до 0,05 мМ 8-10 мин несколько дней [49]

Ь-аспарагин Ь-аспарагиназа Ь-аспарагин - > Ь-аспартат 0,1-2 мМ < 2 мин нет данных [57]

- за чувствительность принят тангенс угла наклона лависимоети отклика (АЕ или ДрН) от логарифма концентрации вещества в области линейности отклика

- биосенсор на основе обратимого ингибирования ферментативной реакции

Глава 2. Проводящие полимеры: применение для разработки сенсоров 2.1. Модификация поверхности электродов проводящими полимерами

Проводящие полимеры - высокомолекулярные соединения, обладающие электропроводностью. В растворах им присущи два типа проводимости - ионная и электронная. Первые эксперименты с проводящим полиацетиленом относятся к 70-м г.г [58]. С тех пор были синтезированы многие полимеры на основе алифатических, ароматических и гетероциклических соединений. Наиболее полно изучены свойства полипиррола, политиофена и полианилина.

В последнее десятилетие проводящие полимеры рассматриваются как наиболее перспективные материалы для модификации поверхности электродов. Как указывает в своем обзоре А. Макдиармид [59], большой прогресс в области проводящих полимеров связан с возможностью воспроизводимо синтезировать чистые полимеры в известном окислительно-восстановительном состоянии, с известной молекулярной массой и известной степенью допирования.

Целый ряд химических превращений: ионный обмен, комплексообразова-ние, осаждение, ферментативные реакции - могут быть проведены на поверхности и/или внутри полимерной пленки. При этом изменяется окислительно-восстановительное состояние проводящего полимера. Это, в свою очередь, проявляется в изменении таких параметров, как сопротивление, потенциал или ток. Таким образом, формируется электрохимический сигнал в ответ на определенное химическое воздействие.

Электрохимическая полимеризация с целью получения пленки проводящего полимера на поверхности электрода (золотого, платинового, стеклоугле-

родного) обычно проводится при анодном окислении мономеров из их растворов в электролитах. Рост пленок проводится в гальваностатическом, потен-циостатическом или потенциодинамическом режиме [60]. Объемная морфология полимера, и, следовательно, многие физические характеристики зависят от таких параметров, как материал электрода, скорость осаждения, значение рН. Например, полипиррол получают из нейтральных водных растворов в одном из указанных режимов осаждения пленки [61]. Однако для получения других полимеров такие мягкие условия неприменимы, например, для электросинтеза политиофена нужна органическая среда, а для полианилина - растворы кислот.

В результате полимеризации обычно получают окисленный полимер, обладающий положительным зарядом, и содержащий противоионы, захваченные из раствора. В таком состоянии полимеры являются обычно полупроводниками, однако известны случаи металлической проводимости ( до ~105 Ом"1- см"1 для полиацетилена [62]). В нейтральном, восстановленном состоянии проводящие полимеры являются полупроводниками (10"7-10"11 Ом"1- см"1) [62].

Реакция (2.1) - пример процесса допирования. Термин "допирование" перенесен из физики полупроводников. Электронпроводящие полимеры в нейтральном состоянии являются полупроводниками с заполненной валентной зоной и незаполненной зоной проводимости. Эти вакантные для электронов зоны разделены запрещенной зоной. Допирование полимера приводит к образованию новых вакантных уровней в области запрещенной зоны. Это облегчает выход электронов из валентной зоны и достижение зоны проводимости, что в свою очередь, приводит к увеличению собственной проводимости полимера.

где 5 - уровень допирования, А" - противоион.

Окислительное допирование считается аналогом появления дырочной проводимости, или р-допирования. Восстановительное допирование проводящих полимеров можно отнести к электронному, или л-допированию. Для каждого полимера характерно оба типа допирования, поскольку в полностью окисленном и полностью восстановленном состояниях их проводимость достаточно низка. Для характеристики области потенциалов, в которой полимерные полупроводники обладают высокой проводимостью в работе [63] был применен термин "окна проводимости".

Различные функциональные группы могут быть включены в полимерную матрицу как во время синтеза, так и в процессе допирования. Впоследствии может быть осуществлен обмен анионами со средой, так называемое передопирование. Эти три процесса открывают широкие возможности для создания чувствительных поверхностей на электродах.

Наиболее ярко преимущества использования проводящих полимеров для разработки сенсоров демонстрируют работы последних 10-15 лет, посвященные полипирролу. Как уже было упомянуто, этот полимер часто получают электрополимеризацией из нейтрального водного раствора мономера. По разнообразию противоионов, которые могут быть включены в полимерную матрицу в ходе синтеза, полипиррол намного превосходит все остальные полимеры. Полимер, допированный в ходе электросинтеза определенными анионами,

часто приобретает чувствительность к этим ионам. Например, разработаны потенциометрические датчики на хлорид- [64] и хлорат-ионы на основе модифицированных полипирролом электродов. Наклон зависимости потенциала электрода от концентрации хлорид-ионов составил 58-60 мВ/рСа- в диапазоне концентраций 10"1 - 10 "4 М [64]. Однако селективность подобных сенсоров невелика, так как "распознавание" матрицей ионов по сути является избирательным включением подходящих по размерам частиц.

Как и в случае других проводящих полимеров, протонирование-депротонирование полипиррола приводит к увеличению или уменьшению проводимости соответственно. При этом происходит изменение потенциала разомкнутой цепи модифицированного электрода. Для полипиррола зависимость потенциала от рН можно охарактеризовать следующим образом. В сильно кислых и сильно щелочных средах тангенс угла наклона этой зависимости составляет 45 мВ/рН [65]. В интервале рН 4-8 потенциал практически не изменяется. Как видно, это значительно затрудняет использование полипиррола в качестве рН-чувствительного трансдьюсера. Решение этой проблемы состоит в использовании новых подходов для синтеза полимера. Например, было предложено синтезировать полипиррол из щелочного раствора, с получением электронейтральной пленки [66]. Такие пленки проявляли отклик на изменение кислотности среды, составивший около 50 мВ/рН, в широком диапазоне (рН 2-10).

Интересным применением проводящих полимеров является анализ катионов металлов (серебра, ртути, меди) с помощью полипиррола, модифицированного путем допирования анионами, способными образовывать с анализируемыми катионами устойчивые комплексы или осадки. Например, в случае

ионов серебра в качестве включаемых в полипиррол противоионов используют перхлорат, хлорид, бромид, ЭДТА, а в случае анализа ионов меди - динитро-карбамат [67]. Таким образом, происходит преконцентрирование ионов металлов на поверхности электрода, что облегчает их анализ.

2.2. Ферментные электроды на основе электронпроводящих полимеров Одна из первых работ по иммобилизации фермента в полипиррол была проведена в 1986 г. Фоулдсом и Лоу [68]. По сути, это явилось открытием нового метода иммобилизации ферментов. Для создания на поверхности платинового электрода полипиррольной пленки, содержащей глюкозооксидазу, полимеризацию проводили при анодном потенциале 0,8 В (отн. х.с.э.) из раствора, содержащего до 0,2 М пиррола и 0,13 мкМ ГОД, рН 7, в анаэробных условиях. Значение изоэлектрической точки для этого фермента равно 4,2 [21]. Поэтому в нейтральных растворах он заряжен отрицательно. Вследствие этого ГОД включалась в пленку полипиррола в качестве противоиона. Полученный ферментный электрод использовался в качестве амперометрического биосенсора. Для анализа глюкозы использовалась детекция продукта ферментативной реакции, пероксида водорода, при потенциале 0,7 В (отн. х.с.э.). Помимо успешной и воспроизводимой иммобилизации фермента, в этой работе обращают на себя внимание еще два важных результата. При обработке кинетических данных, полученных амперометрическими методами, была получена Км,на6л = 31 мМ. Эта величина практически совпадает с найденной для реакции окисления глюкозы под действием ГОД в насыщенном воздухом растворе (33 мМ) [69], Таким образом, можно сделать вывод, что связывание субстратов с ферментом в полимерной матрице не затруднено. Наконец, последним важным ре-

зультатом работы [68] является хорошая стабильность ферментного электрода при его хранении в буферном растворе. Так, на 21 день отклик электрода составил около 67% от исходного.

В том же 1986 г. появилась и другая работа описывающая иммобилизацию ГОД в полипиррол в ходе электросинтеза полимера [70]. Для амперометриче-ского анализа глюкозы при 0-0,2 В использовалось окисление пероксида водорода иодом в присутствии Мо (VI). Однако стабильность ферментного электрода была невысока: через неделю после приготовления отклик понизился в 10 раз. Объяснение этого факта авторы статьи видят в постепенном вымывании ГОД из пор полипиррола при хранении в буферном растворе.

На основе этих двух работ появился целый ряд новых исследований. Они касались как усовершенствования ферментных электродов первого поколения на основе пленок полипиррол - ГОД, так и разработки систем с включенным медиатором. Например, была проведена ковалентная модификация поверхности полипиррола замещенным ферроценом и показано, что этот метод намного эффективнее, чем физическая адсорбция медиатора [71].

Другие примеры ферментных электродов на основе проводящих пленок представлены в табл. 2.1. Как видно, в основном для создания биосенсоров испотзуется полипиррол, что связано с условиями его электрохимического синтеза. Однако обращает на себя внимание тот факт, что в большинстве случаев проводящие полимеры используются как инертные матрицы. Например, несмотря на достаточно широкое их применение для потенциометрических химических сенсоров, практически нет примеров потенциометрических биосенсоров.

Таблица 2.1. Ферментные электроды на основе проводящих полимеров

Анализируемое вещество Полимер Фермент Метод иммобилизации Литера тура

Амперометри чсские

сульфит полипиррол сульфитоксидаза включение фермента в полимер в ходе электросинтеза [72]

лактат полипиррол + поли-(о-фе- нилендиамин) лактатоксидаза включение фермента в поли-(о~ фен и лен д нами н) в ходе электросинтеза [73]

креатинин полипиррол крсатининаза+кре-атиназа+саркозин- оксидаза включение всех трех ферментов в полипиррол в ходе электросинтеза [74]

фруктоза и ?? фруктозодегидроге на за включение фермента и медиатора - феррицианида - в ходе электросинтеза [75]

глютамат 1) полипиррол 2) поли-(о-фе-нилендиамин) глютаматоксидаза включение фермента в один из полимеров в ходе электросинтеза [76]

глюкоза политиофен глюкозооксидаза включение фермента в ходе электросинтеза в двухфазной системе (микроэмульсии) [77]

полииндол включение фермента в ходе электросинтеза [78]

полианилин включение фермента, передопированием после электросинтеза полимера [79]

саркозин саркозиноксидаза [80]

галактоза а м галактозооксидаза 181]

аскорбат аскорбатоксидаза включение фермента в ходе электросинтеза [82]

пероксид водорода пероксидаза СС [83]

полианилин + поливи- нилсульфонат ■а ?? включение фермента в ходе электросинтеза [84]

Потенциометрические

глюкоза полипиррол глюкозооксидаза включение фермента в ходе электросинтеза [85]

мочевина уреаза ковалентная пришивка фермента к элсктросинтезированному полимеру [86]

2.3. Электрохимический синтез и свойства полианилина 2.3.1. Свойства электрохимически синтезированного гомополимера

Полианилин (ПАн), как и другие представители класса проводящих полимеров, обладает целым рядом уникальных физико-химических свойств. Однако ему также присущи некоторые особенности, на которых хотелось бы остановиться подробнее.

В восстановленном состоянии ПАн, как было показано многочисленными исследованиями, является поли-л-фениленаминимином. Это подтверждено данными ИК, КР, ЯМР-13С -спектроскопии [88]. Структурную формулу полимера можно представить как

Полимер может быть получен химической или электрохимической поликонденсацией. В последнем случае окисление мономера наблюдается при 0,45 - 0,65 В (отн. н.к.э.) в среде 0.1 - 2 М серной кислоты на платиновом электроде. Для электросинтеза используются растворы других кислот - хлорной, плавиковой, трихлоруксусной, а также безводная эвтектика ЬЖ3 - НР [89]. В ходе полимеризации наблюдается небольшой индукционный период, а затем приращение интенсивности процесса пропорционально количеству электричества, прошедшего через раствор, т.е. наблюдается автокатализ.

Скорость роста пленки полимера в потенциодинамическом режиме и ее пористость зависят от выбранной кислоты [90]. Так, при синтезе в серной, азотной и соляной кислоте наблюдается более быстрое приращение толщины пленки (характеризующееся приращением количества электричества в каждом

следующем цикле), чем в хлорной и трихлоруксусной. В первом случае пленка характеризуется гранулярной и пористой структурой, а во втором она получается более плотная, с отсутствием пор.

На скорость роста влияет также и анодный предел циклирования: при увеличении его значения рост пленки ускоряется, однако происходит частичная деструкция полимера, о чем будет подробно сказано ниже.

На циклической вольтамперограмме (ЦВА) электрода, покрытого пленкой ПАн, обычно наблюдается три пары пиков (рис.2.1). Две из них - первая и третья - связаны с окислительно-восстановительными превращениями полимера. Еще одну пару пиков относят к превращениям дефектов в линейной структуре полимера, так как в случае ПАн линейной структуры, выращенного при ограничении анодного потенциала циклирования, этот пик не проявляется [91].

Первая пара пиков соответствует переходу от наиболее восстановленного состояния ПАн, называемого лейкоэмеральдином (ЛЭ), к эмеральдину (Э), и в кислой среде (1 <рН < 4) этот переход может быть записан как (2.2):

Вторая окислительно-восстановительная реакция ПАн - переход от эме-ральдина к пернигранилину (ПНА), уравнение (2.3):

Рис. 2.1. Циклическая вольтамперограмма (ЦВА) полианилина.

■ 0,2 М Н2304, скорость развертки потенциала 50 мВ/с.

Следует отметить, что положение пиков на ЦВА зависит от рН среды, то есть редокс потенциалы реакций ПАн являются рН-зависимыми [92,93]. При значении рН > 4 редокс активность ПАн наблюдать не удается. Редокс потенциал обратимого окисления ЛЭ при 1< рН < 4 не зависит от изменения кислотности среды, но при рН < 0 тангенс угла наклона рН-зависимости составляет -60 мВ/рН. Переход (2.3) характеризуется рН-зависимостью редокс-потенциала с тангенсом угла наклона около -120 мВ/рН, что соответствует переносу двух протонов на один электрон.

Электрохимические превращения ПАн приводят к изменению его электро-

максимальным значением 1-10 Ом"1 см"1 [63]). Таким образом, проводимость

этого полимера зависит не только от его окислительно-восстановительного состояния, но и от степени кислотного допирования. Возникает возможность кислотного допирования ПАн, то есть придания ему высокой электронной проводимости путем протонирования без изменения окислительного состояния:

N——N— Н \—/ Н

основание эмеральдина

(2.4)

соль эмеральдина

Благодаря сопряжению ^-связей полимерной цепи возможно существование нескольких резонансных форм соли эмеральдина. В результате все атомы азота становятся идентичными, неся заряд --+0,5. Все С6Н4-группы находятся в состоянии, промежуточном между хиноидной и бензеноидной [93]:

♦ 0.5 у-—N. * 0.5

♦ 0.5 /—х »0.5 Н ( А* ) Н Н ( А" ) Н

« ( А" ) Н ♦0.5 Ч^^/ ♦ 0.

Первое сообщение о зависимости равновесного потенциала ПАн от рН появилось в работе [94]. Сообщалось о высокой чувствительности равновесного потенциала к изменению рН, равной -115 мВ/рН.

Применению ПАн в потенциометрических биосенсорах долгое время пре-

пятствовал тот факт, что электросинтез полимера может быть проведен лишь в таких средах, где фермент быстро инактивируются. Кроме того, в слабокислых, нейтральных и слабощелочных водных растворах, где обычно активны ферменты, ПАн становится непроводящим. Поэтому первоначально этот полимер использовался лишь в качестве инертной матрицы для иммобилизации ферментов при создании амперометрических биосенсоров (см. табл. 2.1). Сообщалось также о биоэлектрохимическом окислении глюкозы по механизму прямого переноса электронов с фермента на ПАн [95]. Однако биосенсор был разработан на основе платинового электрода, а измерения окисления глюкозы проводились при потенциале +0,6 В (отн. х.с.э.), так что другим объяснением наблюдаемого отклика видится детектирование образующегося в ходе ферментативной реакции пероксида водорода на платине.

Об использовании ПАн в качестве трансдьюсера в кондуктометрическом глюкозном биосенсоре сообщили авторы работ [96,97]. Изменение проводимости происходило за счет изменения рН в ходе последовательных ферментативных реакций окисления глюкозы под действием ГОД и последующего превращения глюконолактона в глюконовую кислоту под действием глюконолакто-назы [97].

Разработан модельный потенциометрический биосенсор на основе пленки ПАн [98]. В этой работе было показано, что потенциометрический отклик ПАн на изменение рН составляет 65-70 мВ/рН. Включение фермента трипсина было проведено путем сорбции в пленку ПАн. Высокая рН-чувствительность пленки в сочетании с возможностью иммобилизации фермента низкой молекулярной массы обеспечили повышенный и стабильный отклик электрода на субстрат -

этиловый эфир М-бензоил-Ь-аргинина. Максимальный тангенс угла наклона калибровочной кривой в полулогарифмических координатах составил 180

МВ/рСсубстрата-

2.3.2. Сополимеризация анилина и замещенных анилинов.

Применению ПАн в качестве рН-чувствительного трансдьюсера, как уже было отмечено, препятствует то, что в нейтральных водных растворах этот полимер теряет электронпроводящие свойства.

Для синтеза полианилина, обладающего проводимостью в нейтральных растворах, в работе [99] была проведена химическая полимеризация анилина в дымящей серной кислоте. Как сообщалось, полученный полимер имел сульфо-замещенные фрагменты в цепи, благодаря чему сдвигалось локальное значение рН вблизи атомов азота и проводимость сохранялась до рН 7. Полученный полимер назывался "самодопированным", то есть имеющим собственные до-пирующие кислотные остатки.

Для проведения электрохимического синтеза самодопированных полианилинов в нашей лаборатории были выбраны производные анилина, содержащие карбоксильные и сульфо-группы [100]. Поскольку пара-положение анилина используется при полимеризации, то использовались мета- и орто-замещенные кислоты. Таким образом, использовались о-аминобензойная (антраниловая), м-аминобензойная и м-аминобензосульфоновая (метаниловая)кислоты.

Была проведена электрохимическая сополимеризация анилина с каждой из кислот при соотношениях мономеров от 3 : 1 до 1 : 3 в потенциодинами-ческом режиме. Показано, что скорость полимеризации уменьшается при уве-

юс&яАекд«

41 ^СУДД^СТВЕННА

-■^бЛйОТ'ШД-

личении доли кислоты в смеси мономеров. При анализе ЦВА полученных пле-

/

нок, записанных при различных значениях рН, оказалось, что наиболее высокой редокс-активностью в нейтральных и щелочных растворах (вплоть до рН 10) обладает сополимер анилина и метаниловой кислоты. Кроме того, для проявления этих свойств достаточно соотношения мономеров 1:1. Повидимому, это связано с тем, что даже в полностью протонированном ПАн степень прото-нирования атомов азота составляет 50% [93]. Общим результатом работы можно назвать синтез сополимеров анилина с его производными, сохраняющих редокс-активность в слабокислых, нейтральных и слабощелочных растворах. Следовательно, эти сополимеры могут быть применены в целях разработки биосенсоров.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Лукачева, Лилия Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод иммобилизации фермента глюкозооксидазы в мембрану водонераотворимого полиэлектролита Нафион из водно-органических смесей с высоким содержанием органического растворителя. Ферментсодер-жащие мембраны, полученные из смесей в 90% этаноле, обладали повышенной активностью и стабильностью.

2. С использованием предложенного метода иммобилизации создан безреагентный медиаторный биосенсор на основе мембран Нафион - глюкозо-оксидаза -1,1 '-диметилферроцен.

3. Для адаптации полианилина в нейтральных и щелочных средах был синтезирован сополимер анилина и метаниловой кислоты (самодопированный ПАн), обладающий электроактивностью вплоть до рН 12.

4. Предложено создание потенциометрических биосенсоров на основе полианилина. Преимущества применения этого полимера показаны на примере биосенсоров для анализа глюкозы и эфиров фосфорной кислоты.

5. Для повышения технологичности потенциометрических биосенсоров был использован химически синтезированный ПАн, допированный камфор-сульфоновой кислотой для придания растеоримости в органических растворителях. Показано, что электроды, модифицированные этим полимером, являются высокоэффективными рН-трансдьюсерами. В физиологической диапазоне рН (3 < рН < 9) отклик сенсора был полностью обратими чувствительность достигала рекордной величины - 90 мВ/рН.

6. На основе высокоэффективного рН-трансдьюсера созданы потенцио-метрические биосенсоры для анализа глюкозы и мочевины. Они обладали высокой чувствительностью, пригодной для анализа реальных объектов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Лукачева, Лилия Владимировна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Clark, L. С.; Lyons, С. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann.NY Acad. Sci., 1962,102, 29-45.

2. Updike. S. J.; Hiks, J. P. The enzyme electrode. Nature, 1967, 214, 986-988.

3. Guilbault, G. G.; Lubrano, G. J. An enzyme electrode for amperometric determination of glucose. Anal. Chim. Acta, 1973, 64 (3), 439-455.

4. Chen, C. Y.; Gotoh, M ; Makino, H.; Su, Y. C.; Tamiya, E.; Karube, I. Amperometric needle-type glucose sensor based on a modified platinum electrode with diminished response to interfering materials. Anal. Chim. Acta, 1992, 265 (1), 5-14.

5. Yao, T. Enzyme electrode for the successive detection of hypoxanthine and iosine. Anal. Chim. Acta, 1993, 281 (2), 323-326.

6. Wang, J. Selectivity coefficients for amperometric sensors. Talanta, 1994, 41, (6), 857-863.

7. Fan, Z., Harrison, D.J. Permeability of glucose and other neutral species through recast perfluorosulphonated ionomer films. Anal. Chem., 1992, 64, 13041311.

8. Yao, Т., Satomura, M., Nakahara, T. Simultaneous assays of glucose, urate and cholesterol in blood serum by flow-injection analysis. Electroanalysis, 1995, 7 (2), 143-146.

9. Amine, A., Kauffman J.-M., Patriarche G.J., and Guilbault, G.G. Electrochemical behaviour of a lipid modified enzyme electrode. Anal. Lett., 1989, 22, 2403-2411.

10. Manowitz, P., Stoecker, P.W., Yacynych, A.M. Galactose biosensors using composite polymers to prevent interferences. Biosens. Bioelectron., 1995, 10, 359370.

11. Taylor, P. J.; Kmetec, E.; Johnson, J. M. Design, construction and applications of a galactose selective electrode. Anal. Chem., 1977, 49, 789-794.

12. Mascini, M.; Moscone, D.; Palleschi, G. A lactate electrode with lactate oxidase immobilized on nylon net for blood serum samples in flow systems. Anal. Chim. Acta, 1984,157, 45-51.

13. Madaras, M. В., Buck, R.P. Miniaturized biosensors employing electropolymerized permselective films and their use for creatinine assays in human blood. Anal. Chem., 1996, 68 (21), 3832-3839.

14. Saini, S., Sarareungchal, W., Turner, A.P.F. Preliminary invesrigation of a bioelectrochemical sensor for the detection of phenol vapours. Biosens. Bioelectron., 1995,10(9), 945-957.

15. Marty, J.-L.; Sode, K.; Karube, I. Biosensor for detection of organophosphate and carbamate insecticides. Electroanalysis, 1992, 4, 249-252.

16. Тернер, Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения; "Мир", М , 1992; 614 с.

17. Stankovich, М. Т.; Schopfer, L. М.; Massey, V. Determination of glucose oxidase oxidation-reduction potentials and oxygen reactivity of fully reduced and semiquinoid forms. J. Biol. Chem., 1978, 253, 4971-4979.

18. Chan, T. W.; Bruice, Т. C. One and two electron transfer reactions of glucose oxidase. J. Am. Chem. Soc., 1977, 99 (7), 2387-2389.

19. Кулис, Разумас И.Й. Биокатализ в электрохимии органических соединений; "Москлас",Вильнюс, 1983; 168 с.

20. Kulys, J. J.; Cenas, N. К. Oxidation of glucose oxidase from Pennicillium vitale by one-and two-electron acceptors. BBA, 1983, 744, 57-63.

21. Wilson. R.; Turner, A. P. F. Glucose oxidase: an ideal enzyme. Biosens. Bioelectron., 1992, 7, 165-185.

22. Cass, A. E. G.; Davis, G.; Francis, G. D.; Hill, H. A. O.; Aston, W. G.; Higgins, I. J., Plotkin, E. V.; Scott, L. D. L.; Turner, A. P. F. Ferrocene-Mediated Enzyme Electrode for Amperometric Detection of Glucose. Anal. Chem., 1984, 56, 667-671.

23. Schmidt, H.-L., Schuhmann, W. Reagentless oxidoreductase sensors. Biosens. Bioelectron., 1996,11 (1/2), 127-135.

24. Schuhmann, W., Ohara, T. J.; Schmidt, H.-L.; Heller, A. Electron transfer between glucose oxidase and electrodes via redox mediators bound with flexible chains to the enzyme surface. J. Am. Chem. Soc., 1991,113,1394-1397.

25. Ohara, T. J.; Rajagopalan, R.; Heller, A. Glucose electrodes based on cross-linked [Os(bpy)2]+/2+ complexed poly(L-vinilimidazole) films. Anal. Chem., 1993, 65 (23), 3512-3517.

26. Ohara, T. J.; Rajagopalan, R., Heller, A. "Wired" Enzyme Electrodes for Amperometric Determination of Glucose or Lactate in the Presence of Interfering Substances. Anal. Chem., 1994, 66 (15), 2451-2457.

27. Kenausis, G., Chen Q., Heller A. Electrochemical Glucose and Lactate Sensors based on "wired" thermostable soybean peroxidase operating continuously

and stably at 37 C. Anal. Chem., 1997, 69, 1054-1060.

28. Csoregi, E.; Schmidtke, D. W.; Heller, A. Design and optimization of a selective subcutaneously implantable glucose electrode based on wired glucose oxidase. Anal. Chem., 1995, 67 (7), 1240-1244.

29. Quinn, C. P.; Pishko, M. V.; Schmidtke, D. W.; Ishikawa, M.; Wagner, J. G.; Raskin, P., Hubbeii, J. A.; Heller, A. Kinetics of glucose delivery to subcutaneous tissue in rats measured with 0.3 mm amperometric microsensors. Amer. J. Physiol.-Endocrinol., Metabolism, 1995, 32 (1), E155-E161.

30. Березин, И. В , Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Д., Ярополов А. И. Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы. Докл. АН СССР, 1978, 240, 615-618.

31. Добош Д. Электрохимические константы. "Мир", Москва, 1980, 365 с.

32. Gorton, L. Carbon paste electrodes modified with enzymes, tissues and cells. Electroanalysis, 1995, 7 (1), 23-45.

33. Yaropolov, A. I.; Karyakin, A. A.; Varfolomeyev, S. D.; Berezin, I. V. Mechanism of H2-electrooxidation with immobilized hydrogenase. Bioelectrochem. Bioenerg., 1984,12, 267-277.

34. Mauk, A. G., Scott R.A., Gray H.B. Distances of electron transfer to and from metalloprotein redox sites in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1980, 102(13), 4360-4363.

35. Григоров, Л. H., Чернавский Д.С. Квантово-механистическая модель переноса электрона от цитохрома к хлорофиллу в фотосинтезе. Биофизика, 1972, 17(2), 195-202.

36. Albery, W. J., Knowles J R. Energetic of enzyme catalysis. Isotropic experiments, enzyme convertion and oversaturation. J. Theoret. Biol., 1987, 124, 137-171.

37. Cenas, N. K.; Kulys, J. J. Biocatalytic oxidation of glucose on the conductive charge transfer complexes. Bioelectrochem. Bioenerg., 1981, 8, 103-113.

38. Ma, S. C., Meyerhoff т.е. Potentiometric pH-response of membranes prepared with various aminated-poly(vinyl chloride) products. Microchim. Acta, 1990, 1, 197-202.

39. Yim, H.-S., Kibbey C.e., Ma S.-C., Kliza D M., Liu D., Park S.-B., Epadas Tore C., Meyerhoff M.E. Polymer membrane-based ion-, gas- and bioselective potentiometric sensors. Biosens. Bioelectron., 1993, 8, 1-38.

40. Brown, D. V., Chaniotakis N A., Lee I.H., Ma S C. et al. Mn(lll)-porphyrin-based thiocyanate-selective membrane: characterization and application in flow

injection determination of thiocyanate in saliva. Electroanalysis, 1989,1, 477.

41. Pick, J., Toth K,, Pungor E , Vasak M., Simon W. Potassium-selectrive silicone-rubber membrane electrode based on a neutral carrier. Anal. Chim. Acta, 1973, 64 447-480.

42. Bergveld P. Development of an ion-selective solid-state device for neuro-physiological measurements. IEEE Trans. Biomed. Eng., 1970, BME-17, 70-71.

43. Caras, S. D.; Janata, J.; Saupe, D.; Schmitt, К. pH-based enzyme Potentiometrie sensors. Part 1. Theory. Anal. Chem., 1985, 57, 1917-1920.

44. Hitchman, M. L., Ramanathan S. Evaluation of iridium oxide electrodes formed by potential cycling as pH probes. Analyst, 1988,113 (1), 35-39.

45. Trapp, Т., Kotter С., Cammann К. Reactive sputtering of iridium oxide on polymer films - an electrochemical investigation.; Proc. Eurosensors XII, 1998, Southampton, UK,1, 55-58.

46. Shuk, P.; Ramanujachary, К. V.; Greenblatt, M. New Metal-Oxide-Type Ph Sensors. Solid State Ionics, 1996, 86-8 (pt.2), 1115-1120.

47. Zhou, T. A.; Ottova, A.; Tien, H. T. Alkaline-Pretreated Aluminum Electrodes As Ph Sensors. J. Electrochem. Soc., 1994, 141 (5), 1142-1146.

48. Izutsu, K.; Yamamoto, H. Response Of an Iridium Oxide Ph-Sensor In Nonaqueous Solutions : Comparison With Other Ph-Sensors. Analyt. Sei., 1996, 12 (6), 905-909.

49. Trojanowicz, M., Hitchman M L. Simple disposible Potentiometrie biosensor for pesticides. Chem. Anal. (Warsaw), 1995, 40 (4), 609-617.

50. Guilbault, G. G.; Montalvo, J. A urea-specific enzyme electrode. J. Am. Chem. Soc., 1969, 91, 2164-2165.

51. Nilsson, H.; Akerlund, A.; Mosbach, К. Determination of glucose, urea and penicillin using enzyme pH electrodes. BBA, 1973, 320, 529-534.

52. Caras, S., Janata, J. Field-effect transistor sensitive to penicillin. Anal. Chem., 1980, 52 (12), 1935-1937.

53. Vering, Т., Schuhmann W., Schmidt H.-L., Mikolajick Т., Falter Т., Ryssel H., Janata J. Field-effect transistors as transdusers in biosensors for substrates of dehydrogenases. Electroanalysis, 1994, 6 (11-12), 953-956.

54. Zuern, A., Rabolt В., Graefe M., Mueller H. Advanced in photolithograp-hically fabricated ENFET membranes. Fresenius' J. Anal. Chem., 1994, 349 (8-9), 666-669.

55. Walcerz, I., Koncki R., Leszczynska E., Glab S. Enzyme biosensor for urea

determination based on an ionophore free pH-electrode. Anal. Chim. Acta, 1995, 315 (3), 289-296.

56. Kumaran, S., Meyer H., Danna A.M., Tran-Minh C. Immobilization of thin enzyme membranes to construct glass enzyme electrodes. Anal. Chem., 1991, 63 (18), 1914-1918.

57. Stein, K., Shi R , Schwedt, G. Determination of L-asparagine using flow-injection systems with spectrophotometry and potentiometric detection. Anal. Chim. Acta, 1996, 336(1-3), 113-122.

58. Ivaska, A. Analytical applications of conducting polymers, (plenary lecture). Electroanalysis, 1991, 3, 247-254.

59. MacDiarmid, A. G. Polyaniline and polypyrrole: where are we headed? Synth. Metals, 1997, 84, 27-34.

60. Imisides, M., John R., Riley P.J., Wallace J.J. The use of electropolymerization to produce new sensing surfaces: a review emphasing electrodeposition of heteroaromatic compounds. Electroanalysis, 1991, 3, 879-889.

61. Diaz, A. F.; Kanazawa, K. K.; Gardini, G. P. Electrochemical polymerization of pyrrole. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1979, 635-638.

62. Bidan, G. Electroconducting conjugated polymers: new sensitive martixes to build up chemical or electrochemical sensors. Sensors and Actuators B, 1992, 6, 45-56.

63. Ofer, D.; Crooks, R. M.; Wringhton, M. S. Potential dependence of the conductivity of highly oxidised polythiophenes, polypyrroles and polyaniline: finite windows of high conductivity. J. Am. Chem. Soc., 1990,112, 7869-7879.

64. Dong, S , Che G. An electrochemical microsensor for chloride. Talanta, 1991, 38, 111-114.

65. Josowicz, M. Application of conducting polymers in potentiometric sensors. Analyst, 1995,120, 1019-1024.

66. Osaka, T., Fukuda T., Kanagawa H., Momma T., Yamauchi S. Application of electroinactive polypyrrole film to the pH sensor electrode. Sensors and Actuators B, 1993,13(1-3), 205-208.

67. Adeloju, S. B., Wallace G.G. Conducting polymers and the bioanalytical sciences: new tools for biomolecular communications. Analyst, 1996,121, 699-703.

68. Foulds, N. C.; Lowe, C. R. Enzyme entrapment in electrically conducting polymers. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 1986, 82, 1259-1264.

69. Swoboda, B. E. P., Masset V. Purification and properties of the clucose

oxidase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem., 1965, 240 (5), 2209-2215.

70. Umana, M.; Waller, J. Protein-modified electrodes. The glucose oxidase/polypyrrole system. Anal. Chem., 1986, 58, 2979-2983.

71. Dicks, J. M., Hattori S., Karube I., Turner A.P.F., Yokozawa T. Ferrocene modified polypirrole with immobilized glucose oxidase and its application in amperometric glucose microbiosensors. Ann. Biol. Clin., 1989, 47 607-619.

72. Adeloju, S. B., Barisci, J.N., Wallace G.G. Electroimmobilization of sulfite oxidase into a polypyrrole film and its utilization for flow amperometric detection of sulfite. Anal. Chim. Acta, 1996, 332 (2-3), 145-153.

73. Palmisano, F., Guerrieri A., Quinto M., Zambonin P.G. Electrosynthesized bilayer of polymeric membrane for effective elimination of interferent in amperometric biosensors. Anal. Chem., 1995, 67 (5), 1005-1009.

74. Yamato, H., Ohwa M., Wernet W. A polypyrrole - three enzyme electrode for creatinine detection. Anal. Chem., 1995, 67 (17), 2776-2780.

75. Khan, G. F., Shinohara HL, Ikariyama Y., Aizawa M. Amperometric biosensor for fructose using a PQQ (pyroloquinoline quinone) enzyme. Sensors and Actuators B„ 1993, 14(1-3), 673-674.

76. Cooper, J. M.; Foreman, P. L.; Glidle, A.; Ling, T. W.; Pritchard, D. J. Glutamate oxidase enzyme electrodes: microsensors for neurotransmitter determination using electrochemically polymerized permselective films. J. Electroanal. Chem., 1995, 388, 143-149.

77. Chan, H. S. O., Gan, L.M., Chi H., Toh C.S. A renweable glucose sensor fabricated from microemulsion polymerization of thiophene in a flow cell with application in a HPLC system. J. Electroanal. Chem., 1994, 379 (1-2), 293-300.

78. Pandey, P. C. New conducting polymer-coated glucose sensor. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 1988, 84 (7), 2259-2265.

79. Mu, S. L.; Xue, H. G. Bioelectrochemical Characteristics Of Glucose-Oxidase Immobilized In a Polyaniline Film. Sensors and Actuators B, 1996, 31 (3), 155-160.

80. Yang, Y. F.; Mu, S. L. The Bioelectrochemical Response Of the Polyaniline Sarcosine Oxidase Electrode. J. Electroanal. Chem., 1996, 415 (1-2), 71-77.

81. Mu, S. L. Bioelectrochemical response of the polyaniline galactose oxidase electrode. J. Electroanal. Chem., 1994, 370 (1-2), 135-139.

82. Wang, H., Mu S.J. Bioelectrochemical response of the polyaniline ascorbate oxidase electrode. Electroanal. Chem., 1997, 436 (1-2), 43-48.

83. Yang, Y. F.. Mu, S. L. Bioelectrochemical Responses Of the Polyaniline Horseradish-Peroxidase Electrodes. J. Eiectroanal. Chem., 1997, 432 (1-2), 71-78.

84. Iwuoha, E. I., De Villaverde D.S., Garcia N.P., Smyth M R., Pingarron J.M. Reactivities of organic phase biosensors. 2. The amperometric behavior of horseradish peroxidase immobilized on a platinum electrode modified with an electrosynthetic polyaniline film. Biosens. Bioelectron., 1997,12 (8), 749-761.

85. Trojanowizs, M., Hitchman H.L. A potentiometric polyoyrrol-based glucose biosensor. Eiectroanalysis, 1996, 8 (3), 263-266.

86. Hernandez, E. C., Witkowski A., Daunert S., Bachas L.G. Potentiometric enzyme electrode for urea based on electrochemically prepared polypyrrole membrane. Mikrochim. Acta, 1995,121 (1-4), 63-72.

87. Letheby, H. J. Chem. Soc., 1862,15,161.

88. Menardo, C.; Nechtschein, M.; Rousseau, A.; Travers, J. P. Inversigation on the structure of polyaniline: 13C N.M.R. and titration studies. Synth. Metals, 1988, 25, 311-322.

89. Электрохимия полимеров; под ред. Тарасевич, M. Р., Хрущевой Е.И. "Наука": М., 1990; 237 с.

90. Zotti, G.; Cattarin, S.; Comisso, N. Cyclic potential sweep electropolymerisation of aniline. The role of anions in the polymerisation mechanism. J. Eiectroanal. Chem., 1988, 239, 387-396.

91. Lapkowski, M. Electrochemical synthesis of linear polyaniline in aqueous solutions. Synth. Metals, 1990, 35,169-182.

92. Focke, W. W.; Wnek, G. E.; Wei, Y. Influence of oxidation state, pH and counterion on the conductivity of polyaniline. J. Phys. Chem., 1987, 91, 5813-5818.

93. Huang, W.; Humphrey, B. D.; MacDiarmid, A. G. Polyaniline, a novel conducting polymer. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 1986, 82, 2385-2400.

94. Rubinstein, I. Voltammetnc pH Measurements with Surface-Modified Electrode and a Voltammetric Internal Reference. Anal. Chem., 1984, 56, 11351137.

95. Shaolin, M.; Huaiguo, X ; Bidong, Q. Bioelectrochemical responses of the polyaniline glucose oxidase electrode. J. Eiectroanal. Chem., 1991, 304, 7-16.

96. Hoa, D. T.; Kumar, T. N. S.; Punekar, N. S.; Srinivasa, R. S ; Lai, R.; Contractor, A. Q. Biosensor based on conducting polymers. Anal. Chem., 1992, 64, 2645-2646.

97. Miwa, Y., Nishizawa, M., Matsue T., Uchida I. Conductometric glucose

sensor based on a twin-microband electrode coated with polyaniline thin film. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1994, 67 (10), 2864-2866.

98. Karyakina, E. E.; Shkurko, 0. A.; Varfoiomeyev, S. D.; Karyakin, A. A. Potentiometric biosensor based on polyaniline semiconductor film. B c6. Modern enzymology: problems and trends; Kurganov, B. I.; Kochetkov, S. N.; Tishkov, V. I. Eds.; Nova Science publishers: New York, 1994; 809-813.

99. Yue, J.; Epstein, A. J.; MacDiarmid, A. G. Sulfonic acid ring-substituted polyaniline, a self-doped conducting polymer. Mol. Cryst. Liq. Cryst, 1990, 189, 255261.

100. Karyakin, A. A.; Strakhova, A. K.; Yatsimirsky, A. K. Self-doped polyanilines electrochemically active in neutral and basic aqueous solutions. Electropolymerisation of substituted anilines. J. Electroanal. Chem., 1994, 371, 259265.

101. MacDiarmid, A. G.; Epstein, A. J. Polyanilines: a novel class of conducting polymers. Faraday Disc. Chem. Soc., 1989, 88, 317-332.

102. Mattozo, L. H. C., MacDiarmid A G., Epstein A.J. Controlled synthesis of high molecular weight polyaniline and poly(o-methoxyaniline). Synth. Metals, 1994, 68, 1-11.

103. Angelopoulos, M., Asturias, G.E., Ermer S.P., Ray A., Scherr E.M., MacDiarmid A.J., Akhtar M., Kiss Z , Epstein A.J. Mol. Cryst. Liq. Cryst., 1988, 160, 151.

104. Bobaska, J., Lindfors, T., McCarrick M., Ivaska A., Lewenstam A. Single-piece all-solid-state ion-selective electrode. Anal. Chem., 1995, 67 (20), 3819-3823.

105. Cao, Y.; Qiu, J. J.; Smith, P. Effect Of Solvents and Cosolvents On the Processibility or Polyaniline .1. Solubility and Conductivity Studies. Synth.Metals, 1995, 69 (1-3), 187-190.

106. Han, C. C., Schaklette L.W., Elsenbaumer R.L. ; Meet, of Materials Research Society, Symposium on Electrical, Optical and Magnetic Properties of Organic Solid State Materials, 1991, Boston, MA, USA448.

107. Cao, Y.; Smith, P.; Heeger, A. J. Counter-ion induced processibility of conducting polyaniline and of conducting polyblends of polyaniline. Synth. Metals, 1993, 57, 3514-3519.

108. Cao, Y.; Smith, P.; Heeger, A. J. Counter-ion induced processibility of conducting polyaniline and of conducting polyblends of polyaniline in bulk polymers. Synth. Metals, 1992, 48, 91-97.

109. Cao, Y., Smith, P. Effect Of Solvents and Cosolvents On the Processibility

Of Polyaniline. 2. Spectroscopic and Diffraction Studies. Synth. Metals, 1995, 69, (13), 191-192.

110. Gettinger, C. L., Heeger A.J., Pine D.J... Cao Y. Solution characterization of surfactant solubilized polyaniline. Synth. Metals, 1995, 74, 81-88.

111. Yang, C. Y.. Cao, Y.; Smith, P., Heeger, A. J. Morphology Of Polyaniline In Solution Processed Blends With Poly(Methyl Methacrylate). Abst. Papers Am. Chem. Soc., 1993, 205 (pt.2), 443-POLY.

112. Grummt, U. W.; Pron, A.; Zagorska, M.; Lefrant, S. Polyaniline Based Optical Ph Sensor. Anal. Chim. Acta, 1997, 357 (3), 253-259.

113. Атанасов, П., Богдановская В.А., Иллиев И., Тарасевич М.Р., Воробьев В. Г. Окислительно-восстановительные реакции глюкозооксидазы на углеродистых материалах. Электрохимия, 1989, 25 (11), 1480-1486.

114. Palleschi, G., Rathore H.S., Mascini М. Amperometric probe for 3-hydroxybutyrate with immobilized 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. Anal. Chim. Acta, 1988, 209 (1-2), 223-230.

115. Cooper, J. M., McNeil C.J., Spoors J.A. Amperometric enzyme electrode for the determination of aspartate minotransferase and alanine aminotransferase in serum. Anal. Chim. Acta, 1991, 245 (1), 57-62.

116. Lisdat, F., Wollenberger U., Paeschke M,, Scheller F.W. Bioelectrocatalytic recycling system for miniaturised sensors of catecholamines.: Proc. Eurosensors XI, 1997, Warsaw, Poland, 2, 2A1-2.

117. Nikolelis, D. P., Krull U.J. Bilayer lipid membranes for electrochemical sensing. Electroanalysis, 1993, 5 (7), 539-545.

118. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты; под ред. Березина, И. В., Мартинека К. Изд-во МГУ: М., 1982; 383 с.

119. Nikolelis, D. Construction of an immobilized asparaginase sensor and determination of asparagine in blood serum. Anal. Chim. Acta, 1984,161, 343-348.

120. Magner, R. Trends in electrochemical biosensors. Analyst, 1998, 123 1967-1970.

121. Smolander, M., Marko-Varga, G , Gorton, L. Aldose dehydrogenase-modified carbon paste electrodes as amperometric aldose sensors. Anal. Chim. Acta, 1995, 302 (2-3), 233-240.

122. Sasso, S V.; Pierce, R. J.; Walla, R.; Yacynych, A. M. Electropolymerized 1,2-diaminobenzene as a means to prevent interferences and fouling and to stabilize immobilized enzymes in electrochemical biosensors. Anal. Chem., 1990, 62, 1111-

123. Koncki, R., Glab S. Kinetic model of pH-based potentiometric enzymic sensors. Part 4. Enzyme loading and lifetime factors. Analyst, 1995,120, 489-493.

124. Wang, J. Modified electrodes for electrochemical sensors. Electroanalysis, 1991, 3, 255-259.

125. Hikuma, M., Matsuoka H., Takeda M., Tonooka Y. Use of enzyme electrodes at a low temperature and its effect on stability. Anal. Lett., 1993, 26 (2), 209-221.

126. Deng, Q., Li В., Dong S. Self-gelatinizable copolymer immobilized glucose biosensor based on Prussian Blue modified graphite electrode. Analyst, 1998, 123, 1995-1999.

127. Liu, H., Qian J., Liu Y., Yu Т., Deng J. Immobilization of glucose oxidase in the composite membrane of regenerated silk fibroin and poly(vynil alcohol): application to an amperometric glucose sensor. Bioelectrochem. Bioenerg., 1996, 39, 303-308.

128. Stein, K., Schwedt G. Comparison of immobilization methods for the development of an acetylcholinesterase biosensor. Anal. Chim. Acta, 1993, 272 (1), 73-81.

129. Triantafyllou, A. 0., Wang D., Wehtje E., Adlercreutz P. Polyacrylamides as immobilization supports for use of hydrolytic enzymes in organic media. Biocatal. Biotransform, 1997, 15 (3), 185-203.

130. Gorshkov, D. V., Soldatkin A.P., Maupas H., Martelet, C., Jaffrezic-Renault N. Correlation between the electrical charge properties of polymeric membranes and the characteristics of ISFET or penicillinase based ENFET. Anal. Chim. Acta, 1996, 331 217-223.

131. Hart, J. P., Wring S.A. Recent developments in the design ans application of screen-printed electrochemical sensors for biomedical, enviromental and industrial analysis. Trends Anal. Chem., 1997,16 (2), 89-102.

132. Silber, A., Brauchle C., Hampp N. Dehydrogenase-based thick-film biosensors for lactate and malate. Sensors and Actuators B, 1994, 18-19, 235-239.

133. Вудворд, Д. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы; "Мир", М., 1988; 215 с.

134. Moses, P. R., Weir L., Murrey R.W. Chemically modified tin oxide electrodes. Anal. Chem., 1975, 47, 1882-1886.

135. Bain, C. D., Biebuych H A., Whitesides G.M. Comparison of self-assembled monolayers on gold. Coadsorption of thiols and disulphides. Langmuir,

1989, 5, 723-727.

136. Mizutani, F., Sato Y., Yabuki S., Hi rata Y. Enzyme uitra-thin layer electrode prepared by the co-adsorption of poly-L-lysine and glucose oxidase on to a mercaptopropionic acid-modified gold surface. Chem. Lett., 1996, 4, 251-252.

137. Parker, M.-C., Patel N.. Davies M., Roberts C.J., Tendler S.J.B. A novel organic solvent based coupling method for the preparation of covalently immobilized proteins. Protein Sci., 1996, 5, 2329-2332.

138. Tatsuma, Т., Tani K., Oyama N.. Yeoh H. Linamarin sensors: interference-based sensing of linamarin using linamarase and peroxidase. Anal. Chem., 1996, 68, (17), 2946-2950.

139. Koncki, R., Walcerz I., Ruckruh F , Glab S. Bienzymic potentiometric electrodes for creatinine and L-arginine determination. Anal. Chim. Acta, 1996, 333, (3), 215-222.

140. Березин, И. В., Антонов В К., Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы.; Изд-во МГУ: М., 1976; т.1; 296

с.

141. Mikkelsen, S. R., Rechnitz G.A. Conductometric transducers for enzyme-based biosensors. Anal. Chem., 1989, 61 (15), 1737-1742.

142. Przybyt, M., Sugier H. Enzyme electrode for glucose assay. Chem. Anal, 1989, 34 (1). 63-71.

143. Nagata, R., Clark C.A., Yokoyama K., Tamiya E., Karube I. Amperometric glucose biosensor manufactured by a printing technique. Anal. Chim. Acta, 1995, 304 (2), 157-164.

144. Schmidt, H.-L., Gutberlet, F.; Schuhmann, W. New principles of amperometric enzyme electrodes and of reagentless oxidoreductase biosensors. Sensors and Actuators, 1993,13-14, 366-371.

145. Ho, M. H., Guilbault G.G., Rietz B. Portable piezoelectric crystal detector for field monitoring of environmental pollutants. Anal. Chem., 1983, 55 (11), 18301832.

146. Karyakin, A. A., Karyakina, E. E.; Gorton, L. Prussian Blue based amperometric biosensors in flow-injection analysis. Talanta, 1996, 43, 1597-1606.

147. Wang, J., Dempsey, E., Ozsoz M., Smyth, M,R. Amperometric enzyme electrode for theophylline. Analyst, 1991, 116 (10), 997-999.

148. Rubinstein, I.; Bard, A. J. Polymer Films on Electrodes. 4. Nafion-Coated Electrodes and Electrogenerated Chemiluminiscense of Surface-Attached

Ru(bpy)32+. J. Am. Chem. Soc1980,102, 6641-6642.

149. Rubinstein, I.; Bard, A. J. Polymer Films on Electrodes. 5. Electrochemistry and chemiluminiscense of Nafion-Coated Electrodes. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 5007-5013.

150. Wen, Z H., Lju, D.X., Ye B.X., Zhou X.Y. Development of disposable electrochemical sensor with replaceable glucose oxidase tip. Anal. Commun., 1997, 34(1), 27-30.

151. Liu, H. Y., Ying, T.L., Sun, K, Qi, D.Y. A reagentless biosensor highly sensitive to hydrogen peroxide based on new methylene blue N dispersed in Nafion gel as the electron shuttle. J. Electroanal. Chem., 1996, 417 (1-2), 59-64.

152. Motonaka, J , Faulkner, L.R. Determination of cholesterol an dcholesterol ester with novel enzyme micro-sensor. Anal. Chem., 1993, 65 (22), 3258-3261.

153. Harkness, J. K.; Murphy, O. J.; Hitchens, G. D. Enzyme electrodes based on ionomer films coated on electrodes. J. Electroanal. Chem., 1993, 357 (1-2), 261272.

154. Brown, R. S.; Luong, J. H. A reagentable pseudo-reagentless glucose biosensor based on Nafion polymer and 1,1 -dimethylferricinium mediator. Anal. Chim. Acta, 1995, 310, 419-427.

155. Fortier, G.; Vaillancourt, M.; Belanger, D. Evaluation of Nafion as media for glucose oxidase immobilization for the development of an amperometric glucose biosensor. Electroanalysis, 1992, 4 (3), 275-283.

156. Rishpon, J.; Gottesfeld, S.. Campbell, C.; Davey, J.; Zawodzinski, T. A. J. Amperometric glucose sensors based on glucose oxidase immobilized in Nafion. Electroanalysis, 1994, 6 (1), 17-21.

157. Wang, J., Wu H. Highly selective biosensing of glucose utilising a glucose oxidase + rhodium + Nafion biocatalytic-electrocatalytic-premselective surface microstructure. J. Electroanal. Chem., 1995, 395 (1-2), 287-291.

158. Wang, J., Chen Q. Highly sensitive biosensing of phenolic compounds using bioaccumulation-chronoamperometry at a tyrosinase electrode. Electroanalysis, 1995, 7 (8), 746-749.

159. Karyakin, A. A ; Karyakina, E. E.; Schuhmann, W.; Schmidt, H.-L.; Varfolomeyev, S. D. New amperometric dehydrogenase electrodes based on electrocatalytic NADH-oxidation at poly(Methylene Blue) modified electrodes. Electroanalysis, 1994, 6, 821-829.

160. Saini, S., Turner, A.P.F. Multi-phase bioelectrochemical sensors. Trends Anal. Chem., 1995,14(7), 304-310.

161. Harrison, D. J., Turner R.F.B., Baltes HP. Characterization of perfluorosuiphonic acid polymer coated enzyme electrodes and a miniaturized integrated potentiostat for glucose analysis in whole blood. Anal. С hem., 1988, 60 (19), 2002-2007.

162. Wang, J., Naser N., Lopez D. Organic-phase biosensing of secondary alcohols а Та. brockii alcohol dehydrogenase electrode. Biosens. Bioelectron., 1994,9(3), 225-230.

163. Wang, J., Lin Y., Chen Q. Organic-phase biosensors based on the entrapment of enzymes within poly(ester - sulfonic acid) coatings. Electroanalysis, 1993,5(1), 23-27.

164. Adeyoju, O., Iwuoha E.I., Smyth M.R. Kinetic characterization of the effects of organic solvents on the performance of a peroxidase-modified electrode in detecting peroxides, thiourea and ethylenethiourea. Electroanalysis, 1995, 7 (10), 924-929.

165. Fortier, G., Beliveau, R., Leblond, E., Belanger, D. Development of biosensors based on immobilization of enzymes in Eastman AQ polymers coated with a layer of Nafion. Anal. Lett., 1990, 23 (9), 1607-1619.

166. Рапли, Д., Янг П., Толлин Г. . В сб. Вода в полимерах; под ред. Ро-уленда С. "Мир", М., 1984; 114-136.

167. Lee, С. S., Ru М.Т., Нааке М , Dordick J.S., Reimer J.A., Clark D.S. Multinuclear NMR study of enzyme hydration in an organic solvent. Biotechnol. Bioeng., 1998, 57 (6), 686-693.

168. Simon, L. M., Laszlo K., Vertesi A., Bagi K., Szajani B. Stability of hydrolytic enzymes in water-organic solvent system. J. Mol. Catal. B: Enzym., 1998, 4(1-2), 41-45.

169. Khmelnitsky, Y. L.; Mozhaev, V. V.; Belova, А. В.; Sergeeva, M. V.; Martinek, K. Denaturation capacity: a new criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. Eur. J. Biochem., 1991,198, 31-41.

170. Zaks, A.; Klibanov, A. M. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263 (7), 3194-3201.

171. Griebenow, К , Klibanov A.M. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvent. J. Amer. Chem. Soc., 1996, 118 (47), 11695-11700.

172. Гладилин, А. К., Левашов А.В. Катализ надмолекулярными фермент-полиэлектролитными комплексами (ассоциатами) в органических средах. Усп. биол. хим., 1996, 36 141-161.

173. Gladilin, А. К.; Kudryashova, E. V.; Vakurov, A. V.; Izumrudov, V. A.; Mozhaev, V. V.; Levashov, A. V. Enzyme-polyelectrolyte noncovaleni complexes as catalysts for reactions in binary mixtures of polar organic solvents with water. Biotechnol. Lett., 1995,17 (12), 1329-1334.

174. Otamiri, M., Adlercreutz P., Mattiasson B. Complex formation between chymotrypsin and polymers as a means to improve exposure of the enzyme to organic solvent. В сб. Biocatalysis in non-conventional media; Tramper, J. Ed.; Elsevier Science Publishers, 1992; 363-369.

175. Matsushima, A., Kodera Y., Hiroto M., Nishimura H., Inada Y. Bioconjugates of proteins and polyethylene glycol: potential tools in biotechnological processes. J. Mol. Catal. B: Enzym., 1996, 2 1-17.

176. Гордон, А., Форд P. "Спутник химика"; "Мир", M., 1976; 541 с.

177. Досон, Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика; "Мир", М., 1991; 543 с.

178. Gibson, Q., Swoboda B E.P., Masset V. Kinetics and mechanism of action of glucose oxidase. J. Biol. Chem., 1964, 239 (11), 3927-3934.

179. Потехин, А. А. Свойства органических соединений; "Химия": П., 1984.

180. Bacon, J.; Adams, R. N. Anodic oxidation of aromatic amines. III. Substituted anilines in aqueous media. J. Am. Chem. Soc., 1968, 90 (24), 65966599.

181. Caras, S. D., Petelenz D., Janata J. pH-based enzyme potentiometric sensors. Part 2. Glucose-sensitive Field-effect transistor. Anal. Chem., 1985, 57, 1920-1923.

182. Garcia-Pinto, C., Perez-Pavon J L, Moreno-Cordero B. Cloud point preconcentration and high-performance liquid-chromatographic determination of organophosphorus pesticides with dual electrochemical detection. Anal. Chem., 1995, 67(15), 2606-2612.

183. Yang, C. Y.; Cao, Y.; Smith, P.; Heeger, A. J. Morphology Of Conductive, Solution-Processed Blends Of Polyaniline and Poly(Methyl Methacrylate). Synth. Metals, 1993, 53 (3), 293-301.