Биологические основы моделирования процессов ЦНС и заболеваний мозга человека с использованием зебраданио (zebrafish, Danio rerio) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, доктор наук Калуев Алан Валерьевич

• Калуев Алан Валерьевич
• доктор наук
• 2020

Оглавление диссертации доктор наук Калуев Алан Валерьевич

Введение

Глава 1. Общий обзор методик исследования

Глава 2. Моделирование аффективных расстройств

у зебраданио: острый стресс

Глава 3. Моделирование аффективных расстройств

у зебраданио: хронический стресс

Глава 4. Эффекты судорожных препаратов на зебраданио

Глава 5. Взаимодействие памяти и стресса у зебраданио

Глава 6. Патогенез, связанный с депрессией

Глава 7. Действие основных классов психоактивных

препаратов на зебраданио

Заключение

Благодарности

Список основных работ по теме диссертации

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические основы моделирования процессов ЦНС и заболеваний мозга человека с использованием зебраданио (zebrafish, Danio rerio)»

Введение

Изучение механизмов работы мозга, а также развития патологического поведения и путей его лечения, является одной из основных фундаментальных задач биомедицины. Психические расстройства широко распространены в современном обществе, но при этом чрезвычайно сложны и мало изучены [1-4]. Современное исследование данных расстройств осложнено их полигенной природой, высоким уровнем коморбидности, а также отсутствием специфических биомаркеров и симптомов [5-11]. Низкий уровень понимания патогенеза ЦНС является также одной из причин малой эффективности их терапии и медленного внедрения инноваций в клиническую практику [12, 13].

Одним из трансляционных подходов в нейробиологии является расширение спектра используемых организмов, что может позволить определить эволюционно консервативную «центральную» часть патогенетического процесса и связанные с ней биомаркеры [14-16]. Подавляющее число работ в данной области используют модели ЦНС на грызунах. Однако в последние годы небольшая костная рыба зебраданио ^еЬга1^, Danio гепо) проявила себя как эффективная модель во многих сферах биомедицины, в том числе генетики, молекулярной биологии, биологии развития, фармакологии и

физиологии [17]. Использование зебраданио как модельного организма имеет множество преимуществ, включая удобство генетических манипуляций, наружное оплодотворение, ускоренное развитие, высокую фертильность, относительно маленький размер, низкую цену и простоту содержания [18]. Основные органы и их системы у зебраданио развиваются всего в течение 5 дней после оплодотворения, что наравне с ранней возможностью к репродукции (после 3 месяцев) указывает на высокую скорость развития. Наличие полового диморфизма (тело самки больше и округлее, чем тело самца) также удобно для работы с зебраданио [19, 20]. Эмбрионы и мальки зебраданио прозрачны, что позволяет проследить различные стадии развития под микроскопом, что особенно важно в оптогенетике и геномике [21]. Также существует линия каспер, мутантная по генам nacre и гоу, которая не имеет иридофоров и меланоцитов, и поэтому прозрачна даже во взрослом возрасте, крайне упрощая генетические, анатомические и физиологические манипуляции с данным организмом [22]. Одной из важных особенностей костных рыб является то, что они пережили дополнительный раунд дупликации генома [23]. Гены-дубликаты, полученные в результате данного процесса, могут оказаться как функциональны, так и нет, или нести в себе новые, не характерные для копируемого гена функции. Присутствие нескольких копий

одного и того же гена делает возможным нокауты генов, необходимых для поддержания жизни и развития организма, представленных у человека одной копией.

На данный момент генетика зебраданио изучена хорошо, известно 26,206 генов кодирующих белков, а также то, что 71.4% человеческих генов и 82% генов, ассоциирующихся с различными заболеваниями, имеют очевидные ортологи у зебраданио [24]. Фармакологические эффекты также оказались довольно консервативными у зебраданио и человека [25], чье генетическое сходство особенно выражено в активных сайтах энзимов, каналов и рецепторов (например, лиганд-связывающие участки глюкокортикоидныих рецепторов человека и зебраданио идентичны на 74%, а сами рецепторы - всего на 50% [26]). Зебраданио также имеет высокое сходство в физиологических системах метаболизма [27], кроветворение [28], сердечно-сосудистой [29] и нервных системах [30, 31]. Функционально и на молекулярном уровне, гематоэнцефалический барьер зебраданио также аналогичен другим позвоночным [32].

В целом, такое высокое физиологическое сходство позволяет использовать данную модель для широкого спектра прикладных задач. Например, они могут быть применены для скрининга различных препаратов, где многие малые молекулы, разработанные

как лекарства для людей, систематически исследуются на зебраданио, показывая похожие изменения физиологии и биомаркеров [33].

Нейрохимические системы позвоночных также эволюционно консервативны, и большая часть нейротрансмиттерных систем человека также содержатся у зебраданио. Более того, данные системы хорошо изучены как у мальков, так и у взрослых рыб, а особенно изученными являются глутамат-, ГАМК1-, холин-, дофамин, серотонин- и норадренергическая системы [34]. Несмотря на некоторые очевидные отличия в организации ЦНС (например, отсутствие неокортекса), зебраданио имеет функционально и биохимически подобные структуры структурам мозга человека [34, 35]. Зебраданио также активно используется в области физиологии ЦНС благодаря выраженному, хорошо определенному и одновременно сложному поведению как мальков, так и взрослых рыб [36]. Кроме того, зебраданио - животные с богатым социальным поведением и живут группами, поведение которых хорошо описано. Например, плотность построения косяка коррелирует с присутствием хищников, а организация косяка в период развития связана с активностью дофаминергических нейронов [37, 38].

1 Y-аминомасляная кислота (ГАМК)

Поведение зебраданио активно изучалось последние годы, что позволило создать множество надежных и эффективных моделей для изучения патогенеза ЦНС и их нейрональных и физиологических коррелятов и биомаркеров [31]. Были разработаны многие модели, связанные с патологией развития ЦНС и нейродегенерацией (аутизм, болезни Паркинсона или Альцгеймера), и изучены механизмы воздействия широкого спектра психоактивных препаратов [39][40]. На данный момент хорошо изучены парадигмы для изучения у зебраданио аффективных расстройств, агрессии и аддикции, а также появляются новые, такие как модели дефицита внимания и гиперактивности, обсессивно-компульсивное и посттравматическое стрессорное расстройства [40, 41].

Исследования лаборатории за последние 15 лет были направлены на изучение механизмов патогенеза ЦНС с использованием взрослых рыб [40, 41]. Нами были использованы поведенческие модели стресса на зебраданио, фармакологические манипуляции, анализ экспрессии мозговых генов, цитокинов, нейротрофинов, эндокринные и нейрохимические корреляты, отраженные в 110 работах в международной печати и трех монографиях. В течение последних лет нами также активно велось описание характерных черт поведения зебраданио, их детализация, каталогизация и стандартизация [36, 42, 43].

Глава 1.

Общий обзор методик исследования

Стресс является ведущим фактором патогенеза ЦНС, особенно депрессии, тревожных, панических, фобических и посттравматических расстройств [44-46]. Как острый, так и хронический стресс вызывает нарушения работы ЦНС [47-50], в том числе нейрохимические и нейроэндокринные дисфункции [51-56]. Вызванные острым стрессом состояния аффективного/тревожного спектра у зебраданио традиционно изучаются в тестах незнакомого аквариума (novel tank test) и темно-светлого аквариума (light-dark box test) и открытого поля-аквариума, которые концептуально аналогичны тестам открытого поля и темно-светлой камеры у грызунов [57, 58].

Поведенческие тесты.

В тесте незнакомого аквариума рыба помещается в новый аквариум, разделенный на 2 равные горизонтальные половины, где и ее поведение изучается в течение 5-30 мин [59, 60]. Изначально рыба проводит больше времени в нижней части аквариума, производит большое количество резких "эрратических" движений и фризинга, которые считаются признаками тревожного поведения, а затем (в процессе адаптации к новой среде) начинает все больше

исследовать верхнюю половину и совершать меньшее число эрратических движений и фризинга [43]. Другие популярные тесты для изучения поведения включают в себя тесты социального предпочтения (social preference) и построения косяка (shoaling) [61]. Поведенческое тестирование поведения проводили днем между 12:00 и 18:00 ч местного времени (в светлую фазу дня у животных). Все поведенческие тесты проводились в изолированном помещении с освещенностью, соответствующей освещению содержания. Поведение животных регистрировалось при помощи цифровой камеры или вручную (вслепую). Автоматическая обработка поведенческих данных производилась в программах EthoVision XT (Noldus IT, Netherlands) и CleverSys (CleverSys Inc., USA). Ручная обработка происходила с использованием программы RealTimer (Open Science, Krasnogorsk, Russia). Были проведены тесты открытого поля, темно-светлого аквариума, незнакомого аквариума, построения косяка и T-образный лабиринт. Были успешно отработаны и поставлены модели аносмии и обучение в крестообразном лабиринте зебраданио, протестированы многие нейротропные препараты.

Биохимические и морфологические методы. Зебраданио были эвтанизирован и их мозги извлечены с

w w п

последующей криконсервацией в жидком азоте. В день анализов,

мозги были растворены в 5 мкл 0.1 М раствора хлорной кислоты с 10 нг/мл 2,3-дигидроксибензойной кислоты (как внутренний стандарт) на мг ткани и обработаны ультразвуком на льду. Экстракты тканей были центрифугированы 15 мин на 12000 g при +4 °C профильтрованы через гидрофильную мембрану с порами (Merk Millipore, Germany). Определение дофамина, норадреналина, серотонина и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты в полных образцах мозга были выполнены при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим определением на хроматографической системе HTEC-510 на колонке C-18 CA-5ODS с обратной фазой (Eicom, USA), используя стандартные реагенты для хроматографии (Sigma-Aldrich, USA).

Непосредственно после экспериментальных манипуляций, зебраданио были эвтанизированы. Их тела были впоследствии гомогенизированы в 750 мкл ледяного 1 * натрий-фофатного буфера. Гомогенизирующее роторное лезвие было также промыто в 250 мкл ледяного 1 х натрий-фофатного буфера, а полученный раствор был собран в 2-мл пробирку, содержащую гомогенат. В течение данного процесса все образцы держались на льду. Образцы были перенесены в стеклянные пробирки для экстракции и кортизол был дважды экстрагирован с 5 мл диэтилового эфира (Fisher Scientific, USA). Для подсчета концентрации кортизола был

использован иммуноферментный анализ используя набор для исследования кортизола в слюне человека (Salimetrics LLC, PA). Иммуноферментные пластины были исследованы в VICTOR-WALLAC в программном обеспечении производителя. Общая концентрация кортизола определялась, используя логистическую регрессию, основанную на поглощающей способности стандартных концентраций в сравнении с образцами, и затем нормализована относительно веса каждого образца.

Определение уровня иммунных биомаркеров.

Сразу после эвтаназии обезглавленные тела были собраны и проанализированы иммуноферментным анализом, на общий уровень биомаркеров, которые были выбраны основываясь на их известной и хорошо изученной роли в ЦНС [62-64]. Наборы для проведения иммуноферментного анализа были приобретены у Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China; IL-1p лот F20160528, IL-10 лот F20160529, IL-6 лот F20160915, мозговой фактор роста нервов (BDNF) лот F20160827), которые основаны на антителах тиляпии (с высокой генетической гомологией к зебраданио), специально созданных для работы с зебраданио [65]. Все собранные образы (n=9-14) были включены в анализ данных без исключения. Иммунноферментный протокол был выполнен в соответствии с инструкциями производителя. Тела были

гомогенизированы с ультразвуком и центрифугированы при температуре 4 °C в течение 20 мин при 10000 g, и супернатант был восстановлен в растворе. Иммунологический планшет с 96 лунками был инкубирован при комнатной температуре в течение 1ч. Колориметрический продукт реакции оценивался на 450 нм используя планшетный ридер (Dynatech MR 5000, PBI International, USA). Данные были выражены как нг/мл супернатанта.

Также был использован метод ПЦР с обратной транскрипцией (отПЦР) для анализа уровня гена BDNF (bdnf), генов двух BDNF рецепторов (p75, trkB), и гена глиального фибриллярного кислого белка (gfap). Так как BDNF сигнальный путь является критическим как для хронического стресса, так и для нейропластичности [66-69], экспрессия генов, связанных с BDNF, исследовалась как потенциальный «общий» биомаркер этих двух процессов [70]. GFAP был выбран как известный биомаркер астроцитарной активности в мозге [71]. Мозги зебраданио были лизированы добавлением тризола, экстракция РНК проведена по инструкциям производителя. Комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована из РНК, используя набор для обратной транскрипции Quantiscript (Promega Corporation, USA). 1 мкг РНК было использовано для синтеза первой нити кДНК, а все возможные геномные ДНК загрязнения в образцах РНК были удалены. Нуклеотидные последовательности (Таблица 8)

для праймеров были получены из базы данных по нуклеотидам NCBI's и PRIMER3 из Biology Workbench 3.2. После специфической валидации в NCBI-нуклеотид-BLAST, синтез праймеров был выполнен Sangon Biotech Co. (China). Реакция ПЦР была подготовлена, используя Quantitect SYBR Green master mix (Qiagen, Shanghai, China) и проведена, используя CFX Connect™ Real-Time system (Bio-Rad Laboratories, USA). Последовательности ПЦР состояли из начальной инкубации 15 мин при температуре 95°C для активации HotStarTaq DNA полимеразы, за которой следовали 94 °C в течение 15 сек (денатурация), 59 °C в течение 30 сек (отжиг), и 72 °C в течение 30 сек (элонгация). Уровни экспрессии генов были нормализованы по уровню РНК экспрессии гена контроля ß-актина (относительная количественная оценка) с aaCT коррекцией. В каждой группе, мозги были собраны у всех тестируемых животных и проанализированы отПЦР в 3 репликатах каждый. Данные, полученные с каждого образца, представляют собой среднее значение между 3 репликатами. Все анализируемые собранные образцы (n=13-14) были включены в заключительный анализ без исключения.

Нейроморфологический анализ.

Маркирование баллистическим красителем (Dil и DiO) было выполнено в соответствии со стандартными протоколами

разработанными Afraxis, Inc. (San Diego, CA, USA) для маркирования нейронов [72-75]. После фиксации в 10% формальдегиде образы теленцефалона зебраданио были промыты в 0.1 М фосфатном буфере в течение 15 мин. Лазерная конфокальная микроскопия (Olympus FV1000) была выполнена, используя 63* объектив (1.42 NA) для индивидуального сканирования нейронов на высоком (0.10 * 0.10 * 0.33 мкм воксель) резрешении. Для того, чтобы убедиться в отсутствии систематической предвзятости относительно групп и учитывая малый размер образцов теленцефалона, случайные регионы каждого индивидуала были проанализированы используя Afraxis Enhanced Spine Profiling (ESP) для высоконадежного и воспроизводимого изучения дендритных шипиков [72-75]. Целевые нейроны были определены по клеточной морфологии и изучены на предмет целостности дендритных мембран используя слепую деконволюцию (AutoQuant) примененную к трехмерным цифровым изображениям, которые впоследствии были проанализированы на плотность шипиков и их морфологию высоко обученными исследователями [73, 74]. Только один сегмент дендрита на нейрон был оценен, включая 8-12 дендритов на группу, собранную из 3-5 зебраданио. Индивидуальные шипики были оценены вручную на диаметр головки, длину и толщину шеи по фокус-стекинг (z-стекинг) изображениям, а каждый дендрит был параллельно

проанализирован тремя независимыми экспертами. Инндивидуально настроенная программа для автоматического распределения изображений Afraxis ESP (C++, Java) распределяла изображения между исследователями в случайном порядке и обеспечивала равномерное распределение дендритов из различных групп между аналитиками [72-75]. Статистический анализ межисследовательской вариации для каждого дендрита был проведен, используя протоколы ESP, в целях исключения дендритов, которые не соответствовали критериям воспроизводимости ESP -строгому критерию, а именно дендрит включался в дальнейший анализ только если все три оценки статистически значимо не отличались друг от друга [74]. Все дендриты, прошедшие данный критерий, были включены в дальнейший анализ. В соответствии со стандартными процедурами ESP [72-75], исследователи были слепыми ко всем экспериментальным условиям в течение сбора, исследования и интерпретации результатов.

Статистические операции и обработка данных.

Непараметрические поведенческие и физиологические биомаркеры исследовались, используя тест Крускала-Уоллиса, с последующим попарным пост-хок сравнением при помощи теста Данна или U-тестом Манна-Уитни с пост-хок коррекцией Бонферрони. Дисперсионный анализ (ANOVA) и t-критерий студента

использовались для анализа нормально распределенных показателей. Конкретные тесты, использованные для анализа уточнены в каждом конкретном разделе. Значения выражены как среднее значение по группе ± стандартная ошибка среднего. Размер групп определялся исходя из статистических мощностей прошлых исследований на зебраданио, значение р<0.05 признавалось статистически значимым отличием во всех данных тестах.

В цикле работ, составляющих диссертацию, автор самостоятельно определял выбор направления исследований, и принимал главное участие в разработке экспериментальных подходов, анализе, интерпретации и обобщении полученных результатов. Во всех исследованиях автор принимал непосредственное участие на всех этапах, включая постановку задач, проведение экспериментов, анализа, обсуждения и публикации полученных результатов, а также осуществлял координацию и общее руководство проектами.

Глава 2.

Моделирование аффективных расстройств у зебраданио:

острый стресс

Тесты незнакомого аквариума и открытого поля.

Новизна является одним из наиболее частых стрессоров у животных. В рамках данного исследования были изучены поминутные поведенческие отличия, возникающие у зебраданио в ответ на 6- и 30-мин тесты незнакомого аквариума [76] (Рис. 1). Также был изучен процесс адаптации (габитуации), происходящей вне теста - межсессионной, для чего рыбы помещались в 6-мин тест раз в день в течение 7 дней (Рис. 1). В данном тесте стандартно оценивались такие показатели, как латентный период выхода наверх, время наверху и частота заходов туда, а также количество эрратических движений и частота и длительность фризинга. Было обнаружено, что в 6-мин тесте незнакомого аквариума с течением времени увеличивается исследовательское поведение и снижается поведение связанное с фризингом. Также наблюдались статистически значимые временные эффекты в количестве переходов наверх, времени наверху, числе эрратических движений и длительности фризинга.

Рис. 1. Адаптационные поведенческие ответы зебраданио в тесте незнакомого аквариума. (А) 6-мин внутрисессионая габитуация (п=38) (В) 30-мин внутрисессионная адаптация (п=23) (С) Межсессионная габтитуация зебраданио в 6-мин тесте незнакомого аквариума в течение 7 дней (п=15). *Р<0.05, **Р<0.005, ***Р<0.001, #Р=0.05-0.1 (тренд) в сравнении с минутой 1. и-тест с поправкой Бонферрони.

В течение 30 мин данного теста наблюдались изменения с течением времени в количестве переходов наверх, времени наверху, числе эрратических движений и фризинга (а также его длительности). Анализ межсессионной габитуации показал, что с повторением теста у рыб изменяются количество переходов наверх, время там, число эрратических движений и число и длительность фризинга. Анксиогенные препараты (Рис. 2) кофеин, феромон тревоги и пентилентетразол и анксиолитические препараты (Рис. 3) этанол (в остром и хроническом воздействии), флуоксетин и морфин способны изменять характерные для данного теста процессы габитуации.

Поведенческие отличия различных линий.

Поведенческие отличия в реакции на новизну среды были также изучены на примере четырех различных генетических линий зебраданио - дикого типа, альбино, леопарда и длиннохвостых зебраданио [77] (Рис. 4) в тесте незнакомого аквариума.

Рис. 2. Эффекты анксиогенных препаратов на внутрисессионный адаптационный ответ в 6 минутных тестах незнакомого аквариума. (А) Феромон тревоги (7 мл х 15 мин). (В) Кофеин (100 мг/л х 10 мин). (С) Пентилентетразол (900 мг/л х 10 мин). *Р<0.05, **Р<0.005, #Р=0.05-0.1 (тренд) в сравнении с минутой 1, и-тест (п=15-16). Для поведенческих оценок достоверные различия показаны против первой минутой, для габитуации - против контроля. Все использованные анксиогенные препараты оказали статистически значимый тревожный эффект в сравнении с контрольной группой.

Рис. 3. Эффекты анксиолитических препаратов на внутрисессионный адаптационный ответ (габитуацию) в 6-мин тесте незнакомого аквариума. (А) Острый эффект этанола (0.3% х 5 мин). (В) Хронический эффект этанола (0.2% объема х 2 недели). (С) Флуоксетин (селективный ингибитор обратного захвата серотонинаб СИОЗС; 100 мкг/л х 2 недели). (D) Морфин (2.0 мг/л х 15 мин). *P<0.05, **P<0.005, #P=0.05-0.1 (тренд) в сравнении с минутой 1, U-тест (n=15-16). Для поведенческих оценок достоверные различия показаны против первой минутой, для габитуации - против контроля. Все использованные анксиогенные препараты оказали статистически значимый тревожный эффект в сравнении с контрольной группой).

Рис. 4. Различия в поведении различных линий зебраданио (А) в тесте незнакомого аквариума. (В)

Паттерны поведения в течение 3 мин. (С) Другие поведенческие показатели, проанализированные программой CleverSys. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005 против дикой линии, U-тест.

Были обнаружены такие поведенческие отличия, как тенденция к снижению латенции выхода наверх у трех линий относительно дикого типа (леопардовая линия статистически значимо снизила данный показатель). Линия дикого типа также проявила тенденцию к увеличенному числу заходов наверх. Время там выявило наиболее сильные отличия, т.к. леопардовая и альбино линии провели меньшее времени наверху по сравнению с диким типом.

Поведенческие реакции домашней базы.

Одной из форм поведения, ассоциирующегося с исследовательской активностью и когнитивными способностями, является поведение домашней базы - тенденция животного устанавливать для себя «безопасное» домашнее пространство, к которому оно регулярно возвращается в процессе исследования окружающего пространства [78]. Такое поведение часто наблюдается у грызунов, которые используют домашнюю базу как точку отсчета для организации своего исследования окружающего пространства [78-80]. Для исследования наличия и специфики поведения домашней базы у зебраданио был поставлен следующий эксперимент [81] (Рис. 5). В данном эксперименте рыбы были помещены в различные аквариумы для теста открытого поля. Аквариум 1 представлял собой большой прямоугольный

пластиковый непрозрачный аквариум 12.3 см в высоту на 38.7 см в ширину и 47.3 см в длину, поделенный на 9 зон.

Рис. 5. Поведение домашней базы продемонстрированное тремя различными 30-мин тестами открытого поля (OFT1-3). OFT1 был большой прямоугольной ареной, OFT2 был большой круглой, а OFT3 - маленькой квадратной ареной (А) Пути сгенерированные программой Ethovision XT7. Следует отметить выраженные пространственные предпочтения зебраданио в OFT. (В) Карта плотности, сгенерированная для трех различных рыб (тех же, что на панели А), сгенерированная Ethovision XT7. (С) Итоговая топография домашней базы для всех протестированных рыб (n=20 для каждого OFT). Каждая домашняя база показана черной точкой.

Аквариум 2 представлял собой белый пластиковый цилиндр 23.6 см в высоту и диаметром в 22.8 см, поделенный на 8 зон. Аквариум 3 представлял собой белый прямоугольный аквариум с текстурированной поверхностью и закругленными углами 14 см в высоту, 29 см в ширину и 37 см в длину, поделенный на 9 зон. В рамках тестирования рыбы помещались в середину аквариума, и их поведение записывалось в течение 30 мин. Для выявления домашней базы использовался следующий алгоритм (Рис. 6). Сначала по построенной карте передвижения зебраданио определялась активность рыбы в каждой зоне, присваивая ей от 0 (нет активности) до 3 (очень высокая баллов. Зона, которая может потенциально являться домашней базой определялась, как имеющая минимум 2 балла. Затем для каждой зоны были подсчитаны пройденная в данной зоне дистанция, количество посещений данной зоны и время, проведенное рыбой в данной зоне в процентном соотношении от общего показателя данного параметра. Три максимальных процентных значения зон в дальнейшем считались как потенциальная домашняя база. Все 4 критерия были наложены друг на друга для определения пересекающихся зон, как конечный определитель домашней зоны.

Рис. 6. Методология идентификации домашней базы на примере трех рыб в трех различных 30-мин тестах открытого поля (OFT). (А) Алгоритм, использованный в данном исследовании для определения домашних баз. Вкратце, пути были сгенерированы Ethovision XT7 и оценены вручную двумя опытными наблюдателями, используя оценочную систему от 0 до 3. Время в зоне, пройденная дистанция и число посещений зон было подсчитано в Ethovision XT7 для каждой зоны OFT и выраженно как % от общего числа. Потенциальные домашние базы были идентифицированы и картрированы основываясь на трех максимальных процентных показателях для зон. Карты плотности были использованы как дополнительный инструмент для визуальзации и подтверждения наличия в данных локациях домашней базы (отмечены белыми стрелками). (В) Подтверждение домашних баз (определенных по методу описанному выше) основанное на подсчете среднего времени проведенного в базе и пройденной дистанции в ней (в % от общей оценки OFT для каждого показателя) домашнего сектора в сравнении с другуми (недомашними) секторами (***P<0.00001, U-тест).

В результате эксперимента было обнаружено установление всеми рыбами домашних баз (обычно 1 (60-80% рыб) или 2 (20-40%) зоны вблизи стен). Таким образом, впервые выявлено наличие у зебраданио поведения домашней базы, подтверждая тем самым то, что зебраданио, как и грызуны, используют домашнюю базу при исследовательской активности, демонстрируя эволюционную консервативность данного поведения в неизвестной среде.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Калуев Алан Валерьевич, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Fears, S.C., et al., Multisystem component phenotypes of bipolar disorder for genetic investigations of extended pedigrees. JAMA Psychiatry, 2014. 71(4): p. 375-87.

2. Meyer-Lindenberg, A. and D.R. Weinberger, Intermediate phenotypes and genetic mechanisms of psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci, 2006. 7(10): p. 818-27.

3. Nestler, E.J. and S.E. Hyman, Animal models of neuropsychiatry disorders. Nat Neurosci, 2010. 13(10): p. 1161-9.

4. Tsankova, N., et al., Epigenetic regulation in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci, 2007. 8(5): p. 355-67.

5. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics, C., Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature, 2014. 511(7510): p. 421-7.

6. Ikeda, M., et al., Evidence for shared genetic risk between methamphetamine-induced psychosis and schizophrenia. Neuropsychopharmacology, 2013. 38(10): p. 1864-70.

7. Murphy, D.L., et al., Experimental gene interaction studies with SERT mutant mice as models for human polygenic and epistatic traits and disorders. Genes Brain Behav, 2003. 2(6): p. 350-64.

8. Uddin, M., et al., Brain-expressed exons under purifying selection are enrichedfor de novo mutations in autism spectrum disorder. Nat Genet, 2014. 46(7): p. 742-7.

9. Gaugler, T., et al., Most genetic risk for autism resides with common variation. Nat Genet, 2014. 46(8): p. 881-5.

10. Ivleva, E.I., et al., Genetics and intermediate phenotypes of the schizophrenia--bipolar disorder boundary. Neurosci Biobehav Rev, 2010. 34(6): p. 897-921.

11. Cross-Disorder Group of the Psychiatric Genomics, C., et al., Genetic relationship between five psychiatric disorders estimated from genome-wide SNPs. Nat Genet, 2013. 45(9): p. 984-94.

12. Griebel, G. and A. Holmes, 50 years of hurdles and hope in anxiolytic drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2013. 12(9): p. 667-87.

13. McMahon, F.J. and T.R. Insel, Pharmacogenomics and personalized medicine in neuropsychiatry. Neuron, 2012. 74(5): p. 773-6.

14. Crawley, J.N., What's wrong with my mouse?: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2007: John Wiley & Sons.

15. Kalueff, A.V., M. Wheaton, and D.L. Murphy, What's wrong with my mouse model? Advances and strategies in animal modeling of anxiety and depression. Behav Brain Res, 2007. 179(1): p. 1-18.

16. Ma, L., et al., Animal inflammation-based models of depression and their application to drug discovery. Expert Opin Drug Discov, 2017. 12(10): p. 995-1009.

17. Grunwald, D.J. and J.S. Eisen, Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet, 2002. 3(9): p. 717-24.

18. Stewart, A.M., et al., Building Zebrafish Neurobehavioral Phenomics: Effects of Common Environmental Factors on Anxiety and Locomotor Activity. Zebrafish, 2015. 12(5): p. 339-48.

19. Singleman, C. and N.G. Holtzman, Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: a staging tool for teaching and research. Zebrafish, 2014. 11(4): p. 396-406.

20. Chu, J. and K.C. Sadler, New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology, 2009. 50(5): p. 1656-63.

21. MacRae, C.A. and R.T. Peterson, Zebrafish-based small molecule discovery. Chem Biol, 2003. 10(10): p. 901-8.

22. White, R.M., et al., Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell, 2008. 2(2): p. 183-9.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41.

42

43

44.

45.

Glasauer, S.M. and S.C. Neuhauss, Whole-genome duplication in teleost fishes and its evolutionary consequences. Mol Genet Genomics, 2014. 289(6): p. 1045-60. Howe, K., et al., The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature, 2013. 496(7446): p. 498-503.

Milan, D.J., et al., Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation, 2003. 107(10): p. 1355-8.

Schaaf, M.J., et al., Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish. Endocrinology, 2008. 149(4): p. 1591-9.

Tiso, N., E. Moro, and F. Argenton, Zebrafish pancreas development. Mol Cell Endocrinol, 2009. 312(1-2): p. 24-30.

Jagannathan-Bogdan, M. and L.I. Zon, Hematopoiesis. Development, 2013. 140(12): p. 2463-7.

Vornanen, M. and M. Hassinen, Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels (Austin), 2016. 10(2): p. 101-10.

Karnik, I. and R. Gerlai, Can zebrafish learn spatial tasks? An empirical analysis of place and single CS-US associative learning. Behav Brain Res, 2012. 233(2): p. 41521.

Orger, M.B. and G.G. de Polavieja, Zebrafish Behavior: Opportunities and Challenges. Annu Rev Neurosci, 2017. 40: p. 125-147.

Jeong, J.Y., et al., Functional and developmental analysis of the blood-brain barrier in zebrafish. Brain Res Bull, 2008. 75(5): p. 619-28.

Asnani, A. and R.T. Peterson, The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Dis Model Mech, 2014. 7(7): p. 763-7. Panula, P., et al., The comparative neuroanatomy andneurochemistry of zebrafish CNS systems of relevance to human neuropsychiatric diseases. Neurobiol Dis, 2010. 40(1): p. 46-57.

Du, Y., et al., Spatial and Temporal Distribution of Dopaminergic Neurons during Development in Zebrafish. Front Neuroanat, 2016. 10: p. 115.

Kalueff, A.V., et al., Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish, 2013. 10(1): p. 70-86.

Engeszer, R.E., et al., Timing and plasticity of shoaling behaviour in the zebrafish, Danio rerio. Anim Behav, 2007. 74(5): p. 1269-1275.

Buske, C. and R. Gerlai, Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Dev Psychobiol, 2012. 54(1): p. 28-35.

Kalueff, A.V., A.M. Stewart, and R. Gerlai, Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends Pharmacol Sci, 2014. 35(2): p. 63-75. Meshalkina, D.A., et al., Adult zebrafish in CNS disease modeling: a tank that's half-full, not half-empty, and still filling. Lab Anim (NY), 2017. 46(10): p. 378-387. Stewart, A.M., et al., Developing zebrafish models relevant to PTSD and other trauma-andstressor-relateddisorders. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2014. 55: p. 67-79.

Kalueff, A.V., Illustrated Zebrafish Neurobehavioral Glossary, in The rights and wrongs of zebrafish: Behavioral phenotyping of zebrafish, A.V. Kalueff, Editor. 2017, Springer International Publishing: Cham. p. 291-317.

Cachat, J., et al., Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc, 2010. 5(11): p. 1786-99.

McEwen, B.S. and E. Stellar, Stress and the individual: mechanisms leading to disease. Archives of internal medicine, 1993. 153(18): p. 2093-2101. Cohen, S. and G.M. Williamson, Stress and infectious disease in humans. Psychological bulletin, 1991. 109(1): p. 5.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54

55

56

57

58

59.

60

61.

62

63

64

65

66

67

Cohen, S., D. Janicki-Deverts, and G.E. Miller, Psychological stress and disease. Jama, 2007. 298(14): p. 1685-1687.

Carlson, E.B. and R. Rosser-Hogan, Trauma experiences, posttraumatic stress, dissociation, and depression in Cambodian refugees. The American journal of psychiatry, 1991. 148(11): p. 1548.

Resnick, S.G., G.R. Bond, and K.T. Mueser, Trauma and posttraumatic stress disorder in people with schizophrenia. Journal of abnormal psychology, 2003. 112(3): p. 415. Johansson, L., et al., Midlife psychological stress and risk of dementia: a 35-year longitudinal population study. Brain, 2010. 133(8): p. 2217-2224. Lee, S.P., et al., The effect of emotional stress and depression on the prevalence of digestive diseases. Journal of neurogastroenterology and motility, 2015. 21(2): p. 273. Conrad, C.D., Chronic stress-induced hippocampal vulnerability: the glucocorticoid vulnerability hypothesis. Reviews in the Neurosciences, 2008. 19(6): p. 395-412. McGonigle, P., Animal models of CNS disorders. Biochemical pharmacology, 2014. 87(1): p. 140-149.

Joels, M. and T.Z. Baram, The neuro-symphony of stress. Nature reviews neuroscience, 2009. 10(6): p. 459.

McEwen, B.S., Neurobiological and Systemic Effects of Chronic Stress. Chronic stress (Thousand Oaks, Calif.), 2017. 1: p. 10.1177/2470547017692328. Bisht, K., K. Sharma, and M.-E. Tremblay, Chronic stress as a risk factor for Alzheimer's disease: Roles of microglia-mediated synaptic remodeling, inflammation, and oxidative stress. Neurobiology of Stress, 2018. 9: p. 9-21.

Zaletel, I., D. Filipovic, and N. Puskas, Chronic stress, hippocampus and parvalbumin-positive interneurons: what do we know so far? Reviews in the Neurosciences, 2016. 27(4): p. 397-409.

Stewart, A., et al., The developing utility of zebrafish in modeling neurobehavioral disorders. International Journal of Comparative Psychology, 2010. 23(1). Maximino, C., et al., Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nat Protoc, 2010. 5(2): p. 209-16.

Levin, E.D., Z. Bencan, and D.T. Cerutti, Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiol Behav, 2007. 90(1): p. 54-8.

Grossman, L., et al., Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behav Brain Res, 2010. 214(2): p. 277-84.

Stewart, A., et al., Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology, 2012. 62(1): p. 135-43.

Goshen, I., et al., Brain interleukin-1 mediates chronic stress-induced depression in mice via adrenocortical activation and hippocampal neurogenesis suppression. Mol Psychiatry, 2008. 13(7): p. 717-28.

Wong, M.-L., et al., Interleukin (IL) 1ft, IL-1 receptor antagonist, IL-10, andIL-13 gene expression in the central nervous system and anterior pituitary during systemic inflammation: pathophysiological implications. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1997. 94(1): p. 227-232.

Wajant, H., K. Pfizenmaier, and P. Scheurich, Tumor necrosis factor signaling. Cell death and differentiation, 2003. 10(1): p. 45.

Yang, Y., et al., Biological response of zebrafish embryos after short-term exposure to thifluzamide. Scientific reports, 2016. 6: p. 38485.

Berton, O., et al., Essential role of BDNF in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science, 2006. 311(5762): p. 864-8.

Calabrese, F., et al., Brain-derived neurotrophic factor: a bridge between inflammation andneuroplasticity. Frontiers in cellular neuroscience, 2014. 8: p. 430.

68

69

70

71

72

73

74

75

76.

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88.

89

Kalueff, A.V., et al., BDNF in anxiety and depression. Science, 2006. 312(5780): p. 1598-1599.

Mendez-David, I., et al., Nrf2-signaling and BDNF: A new target for the antidepressant-like activity of chronic fluoxetine treatment in a mouse model of anxiety/depression. Neuroscience letters, 2015. 597: p. 121-126. Pavlidis, M., A. Theodoridi, and A. Tsalafouta, Neuroendocrine regulation of the stress response in adult zebrafish, Danio rerio. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2015. 60: p. 121-31.

Eng, L.F., R.S. Ghirnikar, and Y.L. Lee, Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochemical research, 2000. 25(9-10): p. 1439-1451. Burgdorf, J., et al., The long-lasting antidepressant effects of rapastinel (GLYX-13) are associated with a metaplasticity process in the medial prefrontal cortex and hippocampus. Neuroscience, 2015. 308: p. 202-211.

Chen, Y., et al., Correlated memory defects and hippocampal dendritic spine loss after acute stress involve corticotropin-releasing hormone signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010. 107(29): p. 13123-13128. Ota, K.T., et al., REDD1 is essential for stress-induced synaptic loss and depressive behavior. Nature medicine, 2014. 20(5): p. 531.

Waworuntu, R.V., et al., Early life diet containing prebiotics and bioactive whey protein fractions increased dendritic spine density of rat hippocampal neurons. International Journal of Developmental Neuroscience, 2016. 55: p. 28-33. Wong, K., et al., Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res, 2010. 208(2): p. 450-7.

Egan, R.J., et al., Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav Brain Res, 2009. 205(1): p. 38-44.

Eilam, D. and I. Golani, Home base behavior of rats (Rattus norvegicus) exploring a novel environment. Behav Brain Res, 1989. 34(3): p. 199-211.

Golani, I., Y. Benjamini, and D. Eilam, Stopping behavior: constraints on exploration in rats (Rattus norvegicus). Behav Brain Res, 1993. 53(1-2): p. 21-33. Tchernichovski, O., Y. Benjamini, and I. Golani, Constraints and the emergence offree'exploratory behavior in rat ontogeny. Behaviour, 1996. 133(7): p. 519-539. Stewart, A., et al., Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behav Processes, 2010. 85(2): p. 198-203.

Eilam, D., M. Dank, and R. Maurer, Voles scale locomotion to the size of the open-field by adjusting the distance between stops: a possible link to path integration. Behav Brain Res, 2003. 141(1): p. 73-81.

Fonio, E., Y. Benjamini, and I. Golani, Freedom of movement and the stability of its unfolding in free exploration of mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(50): p. 21335-40.

Kalueff, A.V., et al., Temporal stability of novelty exploration in mice exposed to

different open field tests. Behav Processes, 2006. 72(1): p. 104-12.

Eilam, D. and I. Golani, Home base behavior in amphetamine-treated tame wild rats

(Rattus norvegicus). Behav Brain Res, 1990. 36(1-2): p. 161-70.

Tchernichovski, O. and I. Golani, A phase plane representation of rat exploratory

behavior. J Neurosci Methods, 1995. 62(1-2): p. 21-7.

Blaser, R. and R. Gerlai, Behavioral phenotyping in zebrafish: comparison of three behavioral quantification methods. Behav Res Methods, 2006. 38(3): p. 456-69. Cachat, J., et al., Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS One, 2011. 6(3): p. e17597.

Champagne, D.L., et al., Translating rodent behavioral repertoire to zebrafish (Danio rerio): relevance for stress research. Behav Brain Res, 2010. 214(2): p. 332-42.

90. Rosemberg, D.B., et al., Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One, 2011. 6(5): p. e19397.

91. Stewart, A.M., et al., Understanding spatio-temporal strategies of adult zebrafish exploration in the open field test. Brain Res, 2012. 1451: p. 44-52.

92. Clepce, M., et al., Olfactory abnormalities in anxiety disorders. Neurosci Lett, 2012. 511(1): p. 43-6.

93. Albers, M.W., M.H. Tabert, and D.P. Devanand, Olfactory dysfunction as a predictor of neurodegenerative disease. Curr Neurol Neurosci Rep, 2006. 6(5): p. 379-86.

94. Atanasova, B., et al., Olfaction: a potential cognitive marker ofpsychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev, 2008. 32(7): p. 1315-25.

95. Abreu, M.S., et al., The smell of "anxiety": Behavioral modulation by experimental anosmia in zebrafish. Physiol Behav, 2016. 157: p. 67-71.

96. Hussain, A., et al., High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor cadaverine. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(48): p. 19579-84.

97. Cachat, J., et al., Modeling withdrawal syndrome in zebrafish. Behav Brain Res, 2010. 208(2): p. 371-6.

98. v. Frisch, K., Über einen Schreckstoff der Fischhaut und seine biologische Bedeutung. Zeitschrift für vergleichende Physiologie, 1942. 29(1): p. 46-145.

99. Speedie, N. and R. Gerlai, Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res, 2008. 188(1): p. 168-77.

100. Rehnberg, B.G. and R.J.F. Smith, The influence of alarm substance and shoal size on the behaviour of zebra danios, Brachydanio rerio (Cyprinidae). Journal of Fish Biology, 1988. 33(1): p. 155-163.

101. Song, C., et al., Modeling consequences of prolonged strong unpredictable stress in zebrafish: Complex effects on behavior and physiology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2018. 81: p. 384-394.

102. Wong, K., et al., Modeling seizure-related behavioral and endocrine phenotypes in adult zebrafish. Brain Res, 2010. 1348: p. 209-15.

103. Goldberg, D.J., et al., RDX intoxication causing seizures and a widespread petechial rash mimicking meningococcaemia. J R Soc Med, 1992. 85(3): p. 181.

104. Kasuske, L., J.M. Schofer, and K. Hasegawa, Two marines with generalized seizure activity. J Emerg Nurs, 2009. 35(6): p. 542-3.

105. Kucukardali, Y., et al., Accidental oral poisoning caused by RDX (cyclonite): a report of 5 cases. J Intensive Care Med, 2003. 18(1): p. 42-6.

106. Woody, R.C., et al., The neurotoxicity of cyclotrimethylenetrinitramine (RDX) in a child: a clinical and pharmacokinetic evaluation. J Toxicol Clin Toxicol, 1986. 24(4): p. 305-19.

107. Davies, J.O., et al., Oral C-4plastic explosive in humans - a case series. Clin Toxicol (Phila), 2007. 45(5): p. 454-7.

108. Harrell-Bruder, B. and K.L. Hutchins, Seizures caused by ingestion of composition C-4. Ann Emerg Med, 1995. 26(6): p. 746-8.

109. Hett, D A. and K. Fichtner, A plastic explosive by mouth. J R Soc Med, 2002. 95(5): p. 251-2.

110. Stone, W.J., et al., Toxic effects following ingestion of C-4plastic explosive. Arch Intern Med, 1969. 124(6): p. 726-30.

111. Burdette, L.J., L.L. Cook, and R.S. Dyer, Convulsant properties of cyclotrimethylenetrinitramine (RDX): spontaneous audiogenic, and amygdaloid kindled seizure activity. Toxicol Appl Pharmacol, 1988. 92(3): p. 436-44.

112.

113.

114.

115

116

117.

118

119.

120.

121

122.

123.

124.

125

126.

127.

128.

129.

130

131

Meyer, S.A., et al., Up-and-down procedure (UDP) determinations of acute oral toxicity of nitroso degradation products of hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX). J Appl Toxicol, 2005. 25(5): p. 427-34.

Schneider, N.R., S.L. Bradley, and M.E. Andersen, The distribution and metabolism of cyclotrimethylenetrinitramine (RDX) in the rat after subchronic administration. Toxicol Appl Pharmacol, 1978. 46(1): p. 163-71.

Smith, J.N., et al., Age dependent acute oral toxicity of hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX) and two anaerobic N-nitroso metabolites in deer mice (Peromyscus maniculatus). Chemosphere, 2007. 67(11): p. 2267-73.

Williams, L.R., et al., RDX binds to the GABA(A) receptor-convulsant site and blocks GABA(A) receptor-mediated currents in the amygdala: a mechanism for RDX-induced seizures. Environ Health Perspect, 2011. 119(3): p. 357-63.

Williams, L.R., et al., Behavioral and physiological effects of RDX on adult zebrafish.

Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2012. 155(1): p. 33-8.

Von Oettingen, W.F., D.D. Donahue, and et al., Toxicity and potential dangers of

cyclotrimethyl-enetrinitramine. J Ind Hyg Toxicol, 1949. 31(1): p. 21-31.

Coulter, D.A., J.R. Huguenard, and D.A. Prince, Differential effects of petit mal

anticonvulsants and convulsants on thalamic neurones: GABA current blockade. Br J

Pharmacol, 1990. 100(4): p. 807-13.

Kalueff, A.V., Mapping convulsants' binding to the GABA-A receptor chloride ionophore: a proposed model for channel binding sites. Neurochem Int, 2007. 50(1): p. 61-8.

Kaluev, A.V., G.E. Samonina, and I.P. Ashmarin, [Behavioral effects of penicillin in experimental anxiety in rats]. Biull Eksp Biol Med, 1995. 120(10): p. 352-4. Rodgers, R.J., et al., Ethopharmacological analysis of the effects of putative 'anxiogenic'agents in the mouse elevatedplus-maze. Pharmacol Biochem Behav, 1995. 52(4): p. 805-13.

Carmody, S. and L. Brennan, Effects of pentylenetetrazole-induced seizures on metabolomic profiles of rat brain. Neurochem Int, 2010. 56(2): p. 340-4. Prigol, M., et al., m-Trifluoromethyl-diphenyldiselenide attenuatespentylenetetrazole-induced seizures in mice by inhibiting GABA uptake in cerebral cortex slices. Pharmacol Rep, 2009. 61(6): p. 1127-33.

Baraban, S.C., et al., Pentylenetetrazol induced changes in zebrafish behavior, neural activity andc-fos expression. Neuroscience, 2005. 131(3): p. 759-68. Gaikwad, S., et al., Acute stress disrupts performance of zebrafish in the cued and spatial memory tests: the utility of fish models to study stress-memory interplay. Behav Processes, 2011. 87(2): p. 224-30.

Grossman, L., et al., Effects of piracetam on behavior and memory in adult zebrafish. Brain Res Bull, 2011. 85(1-2): p. 58-63.

Hausler, A., et al., Adrenalectomy, corticosteroid replacement and their importance for drug-induced memory-enhancement in mice. J Steroid Biochem Mol Biol, 1992. 41(3-8): p. 785-9.

File, S.E. and J.R. Hyde, Piracetam--a non-sedative anxiolytic drug? [proceedings]. Br J Pharmacol, 1978. 62(3): p. 425P-426P.

Mondadori, C. and A. Hausler, Aldosterone receptors are involved in the mediation of the memory-enhancing effects of piracetam. Brain Res, 1990. 524(2): p. 203-7. Demin, K.A., et al., Acute effects of amitriptyline on adult zebrafish: Potential relevance to antidepressant drug screening and modeling human toxidromes. Neurotoxicol Teratol, 2017. 62: p. 27-33.

Meshalkina, D.A., et al., The Effects of Chronic Amitriptyline on Zebrafish Behavior and Monoamine Neurochemistry. Neurochem Res, 2018.

132.

133.

134.

135.

136.

137.

138.

139.

140.

141

142.

143.

144.

145

146.

147.

148

149.

150.

151

Leucht, C., M. Huhn, and S. Leucht, Amitriptyline versus placebo for major depressive disorder. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2012(12).

Dulawa, S.C., et al., Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression. Neuropsychopharmacology, 2004. 29(7): p. 1321-30. Norcross, M., et al., Effects of adolescent fluoxetine treatment on fear-, anxiety- or stress-related behaviors in C57BL/6J or BALB/cJ mice. Psychopharmacology (Berl), 2008. 200(3): p. 413-24.

Lowry, C.A., et al., Fluoxetine inhibits corticotropin-releasing factor (CRF)-induced behavioural responses in rats. Stress, 2009. 12(3): p. 225-39.

Szymanska, M., et al., The effect of antidepressant drugs on the HPA axis activity, glucocorticoid receptor level and FKBP51 concentration in prenatally stressed rats. Psychoneuroendocrinology, 2009. 34(6): p. 822-32.

Kyzar, E., et al., Behavioral effects of bidirectional modulators of brain monoamines reserpine andd-amphetamine in zebrafish. Brain Res, 2013. 1527: p. 108-16. Angrini, M., J.C. Leslie, and R.A. Shephard, Effects of propranolol, buspirone, pCPA, reserpine, and chlordiazepoxide on open-field behavior. Pharmacol Biochem Behav, 1998. 59(2): p. 387-97.

Pirch, J.H. and R.H. Rech, Behavioral recovery in rats during chronic reserpine treatment. Psychopharmacologia, 1968. 12(2): p. 115-22.

Carvalho, R.C., et al., Effects of reserpine on the plus-maze discriminative avoidance task: dissociation between memory and motor impairments. Brain Res, 2006. 1122(1): p. 179-83.

Duty, S. and P. Jenner, Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. Br J Pharmacol, 2011. 164(4): p. 135791.

Freis, E.D., Mental depression in hypertensive patients treated for long periods with large doses of reserpine. N Engl J Med, 1954. 251(25): p. 1006-8. Quetsch, R.M., et al., Depressive reactions in hypertensive patients; a comparison of those treated with Rauwolfia and those receiving no specific antihypertensive treatment. Circulation, 1959. 19(3): p. 366-75.

Biala, G. and M. Kruk, Amphetamine-induced anxiety-related behavior in animal models. Pharmacol Rep, 2007. 59(6): p. 636-44.

Lapin, I.P., Anxiogenic effect of phenylethylamine and amphetamine in the elevated plus-maze in mice and its attenuation by ethanol. Pharmacol Biochem Behav, 1993. 44(1): p. 241-3.

Markham, C.M., et al., Effects of D-amphetamine on defensive behaviors related to fear and anxiety. Pharmacol Biochem Behav, 2006. 83(4): p. 490-9.

Rotllant, D., et al., The brain pattern of c-fos induction by two doses of amphetamine suggests different brain processing pathways and minor contribution of behavioural traits. Neuroscience, 2010. 168(3): p. 691-705.

Janowsky, D.S., Depression and dysphoria effects on the interpersonal perception of negative and positive moods and caring relationships: effects of antidepressants, amphetamine, andmethylphenidate. Curr Psychiatry Rep, 2003. 5(6): p. 451-9. Sulzer, D., et al., Amphetamine redistributes dopamine from synaptic vesicles to the cytosol and promotes reverse transport. J Neurosci, 1995. 15(5 Pt 2): p. 4102-8. Stewart, A., et al., Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2011. 35(6): p. 1421-31.

Irons, T.D., et al., Acute neuroactive drug exposures alter locomotor activity in larval zebrafish. Neurotoxicol Teratol, 2010. 32(1): p. 84-90.

152.

153.

154.

155

156.

157.

158

159.

160.

161

162.

163.

164.

165.

166.

167.

168.

169.

170.

Stewart, A.M. and A.V. Kalueff, The behavioral effects of acute Delta(9)-tetrahydrocannabinol and heroin (diacetylmorphine) exposure in adult zebrafish. Brain Res, 2014. 1543: p. 109-19.

Onaivi, E.S., M.R. Green, and B.R. Martin, Pharmacological characterization of cannabinoids in the elevated plus maze. J Pharmacol Exp Ther, 1990. 253(3): p. 10029.

Berrendero, F. and R. Maldonado, Involvement of the opioid system in the anxiolytic-like effects induced by Delta(9)-tetrahydrocannabinol. Psychopharmacology (Berl), 2002. 163(1): p. 111-7.

Valjent, E., et al., Behavioural and biochemical evidence for interactions between Delta 9-tetrahydrocannabinol and nicotine. Br J Pharmacol, 2002. 135(2): p. 564-78. Green, B., D. Kavanagh, and R. Young, Being stoned: a review of self-reported cannabis effects. Drug Alcohol Rev, 2003. 22(4): p. 453-60.

D'Souza, D.C., et al., The psychotomimetic effects of intravenous delta-9-tetrahydrocannabinol in healthy individuals: implications for psychosis. Neuropsychopharmacology, 2004. 29(8): p. 1558-72.

Braida, D., et al., 5-HT1A receptors are involved in the anxiolytic effect of Delta9-tetrahydrocannabinol and AM 404, the anandamide transport inhibitor, in Sprague-Dawley rats. Eur J Pharmacol, 2007. 555(2-3): p. 156-63.

Rubino, T., et al., Cellular mechanisms underlying the anxiolytic effect of low doses of peripheral Delta9-tetrahydrocannabinol in rats. Neuropsychopharmacology, 2007. 32(9): p. 2036-45.

Long, L.E., et al., A behavioural comparison of acute and chronic Delta9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol in C57BL/6JArc mice. Int J Neuropsychopharmacol, 2010. 13(7): p. 861-76.

Buadze, A., et al., Patient's perceptions of the cannabis-psychosis link--a systematic review. Curr Pharm Des, 2012. 18(32): p. 5105-12.

Torres, G. and F. Fiestas, [Effects of marijuana on cognition: a review form the neurobiologicalperspective]. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 2012. 29(1): p. 12734.

Gonzalez, S.C., V.K. Matsudo, and E.A. Carlini, Effects of marihuana compounds on the fighting behavior of Siamese fighting fish (Betta splendens). Pharmacology, 1971. 6(3): p. 186-909.

Akhtar, M.T., et al., Developmental effects of cannabinoids on zebrafish larvae. Zebrafish, 2013. 10(3): p. 283-93.

Moreira, F.A. and C.T. Wotjak, Cannabinoids and anxiety. Curr Top Behav Neurosci, 2010. 2: p. 429-50.

Harte-Hargrove, L.C. and D.L. Dow-Edwards, Withdrawal from THC during adolescence: sex differences in locomotor activity and anxiety. Behav Brain Res, 2012. 231(1): p. 48-59.

Tambaro, S. and M. Bortolato, Cannabinoid-related agents in the treatment of anxiety disorders: current knowledge and future perspectives. Recent Pat CNS Drug Discov, 2012. 7(1): p. 25-40.

Schlussman, S.D., et al., Heroin-induced locomotor activity and conditioned place preference in C57BL/6Jand 129P3/Jmice. Neurosci Lett, 2008. 440(3): p. 284-8. Andersen, J.M., et al., Increased locomotor activity induced by heroin in mice: pharmacokinetic demonstration of heroin acting as a prodrug for the mediator 6-monoacetylmorphine in vivo. J Pharmacol Exp Ther, 2009. 331(1): p. 153-61. Solecki, W., et al., Motivational effects of opiates in conditioned place preference and aversion paradigm--a study in three inbred strains of mice. Psychopharmacology (Berl), 2009. 207(2): p. 245-55.

171. Bailey, A., et al., Mouse strain differences in locomotor, sensitisation and rewarding effect of heroin; association with alterations in MOP-r activation and dopamine transporter binding. Eur J Neurosci, 2010. 31(4): p. 742-53.

172. Stewart, A., et al., Behavioral effects of MDMA ('ecstasy') on adult zebrafish. Behav Pharmacol, 2011. 22(3): p. 275-80.

173. Childs, E., et al., Association between ADORA2A and DRD2 polymorphisms and caffeine-induced anxiety. Neuropsychopharmacology, 2008. 33(12): p. 2791-800.

174. El Yacoubi, M., et al., The anxiogenic-like effect of caffeine in two experimental procedures measuring anxiety in the mouse is not shared by selective A(2A) adenosine receptor antagonists. Psychopharmacology (Berl), 2000. 148(2): p. 153-63.

175. Sudakov, S.K., et al., Effect of short-term and chronic caffeine intake on rats with various anxiety level. Bull Exp Biol Med, 2001. 132(6): p. 1177-9.

176. Houchi, H., et al., Involvement of A2A receptors in anxiolytic, locomotor and motivational properties of ethanol in mice. Genes Brain Behav, 2008. 7(8): p. 887-98.

177. Stewart, A.M., et al., Anxiogenic-like effects of chronic nicotine exposure in zebrafish. Pharmacol Biochem Behav, 2015. 139 Pt B: p. 112-20.

178. Abramson, H.A., et al., Effect of lysergic acid diethylamide on the surfacing behaviour of large carp. Nature, 1962. 193: p. 320-1.

179. Abramson, H.A., et al., Lysergic Acid Diethylamide (Lsd-25). 34. Comparison with Effect of Psilocybin on the Siamese Fighting Fish. J Psychol, 1963. 56: p. 363-74.

180. Gettner, H.H., A. Rolo, and H.A. Abramson, Lysergic Acid Diethylamide (Lsd-25). Xxxv. Comparison of Effect on Siamese Fighting Fish and Goldfish. J Psychol, 1964. 58: p. 57-63.

181. Chessick, R.D., J. Kronholm, and G. Maier, Effect of Lysergic Acid Diethylamide (Lsd-25)and Other Drugs on Tropical Fish. J Nerv Ment Dis, 1963. 137: p. 389-94.

182. Backstrom, J.R., et al., Agonist-directed signaling of serotonin 5-HT2C receptors: differences between serotonin and lysergic acid diethylamide (LSD). Neuropsychopharmacology, 1999. 21(2 Suppl): p. 77S-81S.

183. Gresch, P.J., L.V. Strickland, and E. Sanders-Bush, Lysergic aciddiethylamide-induced Fos expression in rat brain: role of serotonin-2A receptors. Neuroscience, 2002. 114(3): p. 707-13.

184. Krebs-Thomson, K. and M.A. Geyer, The role of 5-HT(1A) receptors in the locomotor-suppressant effects of LSD: WAY-100635 studies of 8-OH-DPAT, DOI and LSD in rats. Behav Pharmacol, 1996. 7(6): p. 551-559.

185. Geyer, M.A., et al., A characteristic effect of hallucinogens on investigatory responding in rats. Psychopharmacology (Berl), 1979. 65(1): p. 35-40.

186. Braida, D., et al., Hallucinatory and rewarding effect of salvinorin A in zebrafish: kappa-opioid and CB1-cannabinoid receptor involvement. Psychopharmacology (Berl), 2007. 190(4): p. 441-8.

187. Riehl, R., et al., Behavioral and physiological effects of acute ketamine exposure in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol, 2011. 33(6): p. 658-67.

188. Zakhary, S.M., et al., A behavioral and molecular analysis of ketamine in zebrafish. Synapse, 2011. 65(2): p. 160-7.

189. Swain, H.A., C. Sigstad, and F.M. Scalzo, Effects of dizocilpine (MK-801) on circling behavior, swimming activity, and place preference in zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicol Teratol, 2004. 26(6): p. 725-9.

190. de Mello, C.F., et al., Intrastriatal methylmalonic acid administration induces rotational behavior and convulsions through glutamatergic mechanisms. Brain Res, 1996. 721(1-2): p. 120-5.

191. Canever, L., et al., A rodent model of schizophrenia reveals increase in creatine kinase activity with associated behavior changes. Oxid Med Cell Longev, 2010. 3(6): p. 4217.

192. Wilson, C., et al., Effects of age and sex on ketamine-induced hyperactivity in rats. Physiol Behav, 2007. 91(2-3): p. 202-7.

193. Cachat, J., et al., Unique and potent effects of acute ibogaine on zebrafish: the developing utility of novel aquatic models for hallucinogenic drug research. Behav Brain Res, 2013. 236(1): p. 258-69.

194. Kalueff, A.V., A. Kaluyeva, and E.L. Maillet, Anxiolytic-like effects of noribogaine in zebrafish. Behav Brain Res, 2017. 330: p. 63-67.

195. Kyzar, E.J., et al., Effects of hallucinogenic agents mescaline and phencyclidine on zebrafish behavior and physiology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2012. 37(1): p. 194-202.

196. Lush, I.E., A comparison of the effect of mescaline on activity and emotional defaecation in seven strains of mice. Br J Pharmacol, 1975. 55(1): p. 133-9.

197. Abramson, H.A., et al., The intracranial injection of drug in goldfish. I: Hallucinogens and their antagonism to smooth muscle activity. J Asthma Res, 1979. 16(2): p. 55-61.

198. Gorelick, D.A. and W.H. Bridger, Does increasing stress change the behavioral action of mescaline from disruption to facilitation? Psychopharmacologia, 1975. 44(3): p. 307-9.

199. McLean, S.L., M.L. Woolley, and J.C. Neill, Effects of subchronic phencyclidine on behaviour offemale rats on the elevated plus maze and open field. J Psychopharmacol, 2010. 24(5): p. 787-90.

200. Turgeon, S.M., et al., The effects of phencyclidine (PCP) on anxiety-like behavior in the elevated plus maze and the light-dark exploration test are age dependent, sexually dimorphic, and task dependent. Pharmacol Biochem Behav, 2011. 100(1): p. 191-8.

201. Robinson, K.S., et al., Psychopharmacological effects of acute exposure to kynurenic acid (KYNA) in zebrafish. Pharmacol Biochem Behav, 2013. 108: p. 54-60.

202. Lapin, I.P., Antagonism of kynurenic acid to anxiogens in mice. Life Sci, 1998. 63(15): p. PL231-6.

203. Lapin, I.P., et al., [Changes in the burrowing reflex of mice and rats under the influence of kynurenines]. Fiziol Zh SSSR Im I M Sechenova, 1990. 76(7): p. 849-54.

204. Schmitt, M.L., F.G. Graeff, and A.P. Carobrez, Anxiolytic effect of kynurenic acid microinjected into the dorsal periaqueductal gray matter of rats placed in the elevated plus-maze test. Braz J Med Biol Res, 1990. 23(8): p. 677-9.

205. Kolesnikova, T.O., et al., Effects of a non-competitive N-methyl-d-aspartate (NMDA) antagonist, tiletamine, in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol, 2017. 59: p. 62-67.

206. Canavello, P.R., et al., Measuring endocrine (cortisol) responses of zebrafish to stress, in Zebrafish neurobehavioralprotocols. 2011, Springer. p. 135-142.

SAINT PETERSBURG STATE UNIVERSITY

Manuscript

Alan V. Kaluev

Biological bases of experimental modeling of CNS processes and human brain diusorders using zebrafish (Danio rerio)

Specialty 03.03.01 - PHYSIOLOGY

A DISSERTATION SUBMITTED FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF BIOLOGICAL SCIENCES

Saint Petersburg - 2020

Content

Introduction.........................................................................................142

Chapter 1. General overview of methodological approaches............146

Chapter 2. Modeling affective disorders in zebrafish:

acute stress.....................................................................153

Chapter 3. Modeling affective disorders in zebrafish:

Chronic stress.................................................................179

Chapter 4. Effects of proconvulsant agents in zebrafish...................186

Chapter 5. Memory-stress interplay in zebrafish models..................190

Chapter 6. Depression-related pathogenesis....................................197

Chapter 7. Activity of major classes of neuroactive drugs

in zebrafish........................................................................206

Conclusions ........................................................................................ 237

Acknowledgements............................................................................243

List of key publications........................................................................244

References..........................................................................................249

Introduction

Studying normal and pathological brain mechanisms, as well as their therapy, is a fundamental task of modern biomedicine. Mental disorders are widespread clinically, yet are extremely complex and poorly understood [1-4]. Studying these disorders is complicated by their polygenic nature, a high level of comorbidity, as well as by the absence of specific biomarkers and disorder-specific symptoms [5-11]. Our poor understanding of CNS pathogenesis is also one of the reasons for the low efficiency of their therapy and the slow pace of innovations in clinical practice [12, 13]. One of translational approaches in neurobiology is the expansion of the spectrum of model organisms, which may allow us to determine the evolutionarily conservative, "core" part of the pathogenetic process and the associated biomarkers [14-16]. The vast majority of works in this area use CNS models in rodents.

However, in recent years, a small teleost fish, zebrafish (Danio rerio) has become a powerful effective model in genetics, molecular biology, developmental biology, pharmacology and physiology [17]. The use of zebrafish as a model organism has many advantages, including the convenience of genetic manipulation, external fertilization, accelerated development, high fertility, relatively small size, low cost and easy

maintenance [18]. The main organs and their systems in zebrafish develop only within 5 days after fertilization, which, along with the early possibility of reproduction (after 3 months), indicates their rapid development. The presence of sexual dimorphism (the body of the female is larger and rounder than the body of the male) is also convenient for working with zebrafish [19, 20]. Zebrafish embryos and fry are also transparent, enabling tracing various developmental stages under a microscope, which is especially useful in optogenetics and genomics [21]. There is also a Casper strain, mutant for the nacre and roy genes, lacking iridophores and melanocytes, and therefore transparent in adulthood, greatly simplifying their genetic, anatomical and physiological manipulations [22]. An important feature of teleost fishes is that they underwent an additional round of genome duplication [23]. Such duplicate genes may be either functional or not, also carrying new functions that are not characteristic of the copied gene. The presence of several copies of the same gene enables knocking out 'vital' genes necessary to maintain the life and development, represented in humans by one copy.

The zebrafish genetics is presently well studied, with 26.206 genes encoding proteins known, where 71.4% of human genes and 82% of disease-associated genes have orthologs in zebrafish [24]. The pharmacological effects are also quite conserved evolutionarily in zebrafish and humans [25], whose genetic similarity is especially

pronounced in the active sites of enzymes, channels and receptors. For example, the ligand-binding sites of human and zebrafish glucocorticoid receptors are 74% identical, and the receptors themselves only 50% [26].

Zebrafish also have a high physiological similarity in metabolic [27], hematopoitic [28], cardiovascular [29] systems and CNS [30, 31]. Functionally and at the molecular level, the blood-brain barrier of zebrafish is similar to other vertebrates [32]. Such high physiological homology allows the use of this model for a wide range of applied problems. For example, zebrafish are widely used for screening various drugs, as many small molecules designed as drugs for humans are systematically tested in zebrafish, showing similar changes in biomarkers [33].

The neurochemical systems of vertebrates are also evolutionarily conserved, and major human neurotransmitters are also found in zebrafish. Moreover, these systems are well studied both in larval and adult fish, whose central glutamatergic, GABAergic2, cholinergic, dopaminergic, serotonergic, and noardrenergic systems are especially well-studied [34]. Despite some differences in CNS organization, zebrafish have functionally and biochemically similar structures to those in the human brain [34, 35]. Zebrafish are also actively used in the field of CNS physiology due to the pronounced, well-defined and complex behaviors in both larval and adult fish [36]. Zebrafish have rich social

2 Y-aminobutyric acid (GABA)

behaviors and live in groups (shoals) whose behavior is well described. For example, shoal cohesion correlates with the presence of predators and the activity of dopaminergic neurons [37, 38].

Zebrafish behavior has been actively studied in recent years, yielding numerous effective methods for modeling neuronal and physiological correlates and biomarkers of human brain disorders [31]. Many models have been developed for neurodevelopmental and neurodegenerative disorders, such as autism and Parkinson's or Alzheimer's diseases, and testing psychoactive drugs and addiction [39, 40]. Presently, paradigms for studying affective and anxiety disorders, aggression and addiction in zebrafish are well studied and described, and new ones appear, such as attention deficit hyperactivity-, obsessive-compulsive and post-traumatic stress disorders [40, 41]. Studies of my laboratory over the past 15 years have focused on mechanisms of CNS pathogenesis in adult zebrafish [40, 41]. We used behavioral stress models, pharmacological manipulations, analysis of the expression of brain genes, cytokines, neurotrophins, physiological (endocrine) markers, as well as neurochemical correlates, reflected in 110 publications in the international press and three monographs. Over the past years, we have also actively described known behaviors of zebrafish, providing their detailed cataloging and standardization [36, 42, 43].

Chapter 1.

General overview of research methods

Stress is a leading factor of CNS pathogenesis, especially depression, anxiety, panic, phobic and post-traumatic stress disorders [44-46]. Both acute and chronic stress cause neurobehavioral [47-50], neurochemical and neuroendocrine dysfunctions [51-56]. Zebrafish affective-like syndromes can be induced by various acute stressors, and are traditionally studied in novelty-based tests, such as the novel tank test and the dark-light box test, which are conceptually similar to the rodent open field and dark-light box tests [57, 58].

Behavioral approaches.

In the novel tank test, the fish is placed individually into a novel tank virtually divided into 2 equal horizontal halves (top and bottom), and its behavior is studied for 5-30 min [59, 60]. Initially, the fish dives and spends more time in the 'protective' bottom part, with multiple erratic movements and freezing, which are considered as 'anxiety/fear-like' behaviors. Subsequently, in the process of adapting to new environment, the fish begins to more actively explore the upper half (top) of the tank, producing fewer erratic and freezing behaviors [43]. Other popular tests for studying behavior include the open field test, the social preference test, shoaling test, mirror stimulation test and T- or plus-maze test [61]. Behavioral

testing of behavior was performed in the afternoon between 12:00 and 18:00 local time (in the light phase of the day in animals). All behavioral tests were conducted in an isolated room with illumination corresponding to the illumination of the content. Animal behavior was recorded using a digital camera or manually (blindly). Behavioral data were automatically processed using the programs Noldus EthoVision XT (Noldus IT, Netherlands), CleverSys (CleverSys Inc., USA) and idTracker. Manual processing was performed using the RealTimer program (Open Science, Ltd., Russia).

Biochemical and morphological methods.

Whenever necessary, zebrafish were euthanized after behavioral testing and their brains extracted on ice, followed by cryopreservation in liquid nitrogen. On the day of analysis, the brains were dissolved in 5 ^l of a 0.1 M perchloric acid solution with 10 ng/ ml of 2,3-dihydroxybenzoic acid (as an internal standard) per mg of tissue and sonicated (sonication) on ice. The tissue extracts were next centrifuged for 15 min at 12,000 g at + 4 ° C and filtered through a hydrophilic pore membrane (Merk Millipore, Germany). The detection of norepinephrine, serotonin and its 5-hydroxyindoleacetic acid metabolite in complete brain samples was performed using high performance liquid chromatography with electrochemical determination on an HTEC-510 chromatographic system on a reverse phase C-18 CA-5ODS column (Eicom, San Diego, USA )

using standard chromatographic reagents (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

Immediately after experimental manipulations, zebrafish were euthanized, and their bodies homogenized in 750 |jl of ice-cold 1 * sodium phosphate buffer. The homogenizing rotor blade was also washed in 250 jl of ice-cold 1 x sodium phosphate buffer, and the resulting solution was collected in a 2-ml tube containing homogenate. Samples were next transferred on ice to glass extraction tubes and cortisol was extracted twice with 5 ml of diethyl ether (Fisher Scientific, USA). After evaporation, cortisol was reduced in 1 ml of 1 * sodium phosphate buffer. An enzyme-linked immunosorbent assay was used to calculate cortisol concentration using a human saliva cortisol assay kit (Salimetrics LLC, PA). Enzyme-linked immunosorbent plates were assayed using VICTOR-WALLAC in manufacturer software. The total concentration of cortisol was determined using logistic regression based on the absorption capacity of standard concentrations compared to the samples, and then normalized to the weight of each sample.

Neuro-immune biomarkers.

Following the euthanasia, the decapitated fish bodies were collected and analyzed by enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay for the overall level of biomarkers, which were selected based on their well-known and well-studied role in the CNS [62-64]. Enzyme immunoassay

kits were purchased from the Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China; IL-1 p lot F20160528, IL-10 lot F20160529, IL-6 lot F20160915, BDNF lot F20160827), which are based on tilapia antibodies (with high genetic homology to zebrafish) for zerbafish assays [65]. All collected images (n=9-14) were included in the data analysis, without exception. The bodies were homogenized in 1 * sodium phosphate buffer and centrifuged at 4 ° C for 20 min at 10,000 g, and the supernatant was recovered. A 96 well immunological plate was incubated at room temperature for 1 h. The colorimetric reaction product was evaluated at 450 nm using a plate reader (Dynatech MR 5000, PBI International, USA). Data were expressed as ng/ml supernatant.

The reverse transcription PCR (PCR) was used to analyze the brain expression of the BDNF gene (bdnf), the genes of two BDNF receptors (p75, trkB), and the glial fibrillar acid protein (gfap) gene. Since the BDNF signaling pathway is critical for both chronic stress and neuroplasticity [66-69], the expression of genes associated with BDNF was studied here as a potential "common" biomarker of these two processes [70]. GFAP was chosen as the well-known biomarker of astrocytic activity in the brain [71]. Zebrafish brains were lysed by the addition of trizole, RNA extraction was carried out according to the manufacturer's instructions. Complementary DNA (cDNA) was synthesized from RNA using the Quantiscript reverse transcription kit (Promega Corporation, USA). 1 ^g

of RNA was used to synthesize the first cDNA strand, and all possible genomic DNA contamination in the RNA samples were removed. The nucleotide sequences (Table 8) for the primers were obtained from the NCBI's and PRIMER3 nucleotide database from Biology Workbench 3.2. The synthesis of primers was performed by Sangon Biotech Co. (China). A PCR reaction was prepared using the Quantitect SYBR Green master mix (Qiagen, Shanghai, China) and carried out using the CFX Connect ™ Real-Time system (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA). The PCR sequences consisted of an initial incubation of 15 min at 95 ° C to activate HotStarTaq DNA polymerase, followed by 94° C for 15 s (denaturation), 59 ° C for 30 sec (annealing), and 72 ° C for 30 s (elongation). Gene expression levels were normalized by RNA level of p-actin control gene expression (relative quantification) with △△ CT correction. In each group, brains were collected from all tested animals and analyzed by PCR in 3 replicates. Data from each sample is the average of 3 replicates. All analyzed collected samples (n=13-14) were included in the final analysis without exception.

Neuromorphological analyses.

Ballistic dye staining (DiI and DiO) was performed in accordance with standard protocols developed by Afraxis, Inc. (San Diego, CA, USA) for labeling neurons [72-75]. After fixation in 10% formaldehyde, the images of zebrafish telencephalon were washed in 0.1 M phosphate

buffer for 15 min. Laser confocal microscopy (Olympus FV1000) was performed using a 63 * lens (1.42 NA) for individual scanning of neurons at high (0.10 * 0.10 * 0.33 |jm voxel) resolution. To ensure that there was no systematic bias, and given the small size of the telencephalon samples, random regions of each individual fish were analyzed using Afraxis Enhanced Spine Profiling (ESP) for a highly reliable and reproducible study of dendritic spines [72-75]. Target neurons were determined by cell morphology and studied for the integrity of dendritic membranes using blind deconvolution (AutoQuant) applied to raw three-dimensional digital images, which were subsequently analyzed for spike density and morphology [73, 74]. Only one segment of dendrite per neuron was evaluated, the analysis included 8-12 dendrites per group, collected from 3-5 zebrafish. Individual spines were manually evaluated for head diameter, neck length and thickness by focus-stacking (z-stacking) images, and each dendrite was simultaneously analyzed by three independent experts. A custom-made program for automatic image distribution Afraxis ESP distributed images randomly and ensured uniform distribution of dendrites from various groups between analysts [72-75]. Statistical analyses of the inter-research variation for each dendrite was carried out using ESP protocols to exclude dendrites that did not meet the ESP reproducibility criteria, namely, the dendrite was included in the further analysis only if all three estimates were not statistically different

from each other [74]. All dendrites that met this criterion were included in further analysis. In accordance with standard ESP procedures [72-75], the raters were blinded to all experimental conditions during the data collection, analyses and interpretation of the results.

Statistical analyses and data handling.

Nonparametric behavioral and physiological biomarkers were analyzed using the Kruskal-Wallis test, followed by a pairwise post-hock comparisons using Dunn's or the Mann-Whitney U-test with Bonferroni correction. Analysis of variance (ANOVA) and Student's t-test were used to analyze normally distributed data. Data are expressed as mean ± mean standard error. The group size was determined based on the statistical power of past zebrafish studies; a value of p<0.05 was recognized as a statistically significant difference in all tests. In the presented experiments, the author determined the choice of the direction of research, took a major part in the development of experimental approaches, analysis, interpretation and generalization of the results. In all these studies, the author was directly involved at all stages, including setting goals, conducting experiments, analyzing, discussing, formatting and publishing the results, as well as managing and leading the project.

Chapter 2.

Modeling affective disorders in zebrafish: acute stress

The novel tank and the open field tests.

Novelty is one of the commonest stressors in animals. Here, we analyze minute-by-minute behavioral differences that occur in zebrafish in response to 6- and 30-min novel tank test [76] (Fig. 1). We also studied the adaptation (habituation) process that occurs in daily 6-min testing for 7 days (Fig. 1). Overall, in a 6-min novel tank test, zebrafish exploration increases over time and anxiety-like freezing-related behavior decreases. Statistically significant temporary effects were observed for the number of entries to top, time in top, the number of erratic movements and the duration of freezing. In the 30-min test, changes were observed over time for the number of top entries, time in top, the number of erratic movements and freezing and freezing duration. Analyses of intersession habituation show altered number of top entries, time in top, the number of erratic movements, and the number and duration of freezing. Anxiogenic agents (Fig. 2) caffeine, anxiety pheromone and pentylenetetrazole and anxiolytic drugs (Fig. 3) ethanol (acute and chronic exposure), fluoxetine and morphine all alter zebrafish habituation in this test.

Fig. 1. Zebrafish adaptive behavioral responses in the novel tank test (A) 6-min intrasession habituation (n=38) (B) 30-min intra-session habituation (n=23) (C) Intersession habituation to 6-min daily testing (7 days, n=15). *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001, #P=0.05-0.1 (trend) vs. minute 1, U-test with Bonferroni correction.

Behavioral strain differences.

Behavioral differences in novelty stress compared four different strains of zebrafish - the short-fin outbred wild type, albino, leopard, and long-tail fish [77] (Fig. 4) in the novel tank test. Behavioral differences were found in the trend towards lower latency to enter top in the three strains vs. the wild type, whereas the leopard strain significantly reduced this latency. The wild-type strain also tended to increase the number of entries to top. Time spent in top revealed the strongest differences, where the leopard and albino fish spent less time in top compared to the wild type zebrafish (Fig. 4).

Home base behavior.

One of the forms of exploratory behavior and cognitive indices in animals is their home base behavior - the tendency to establish a "safe" home space for itself, to which it regularly returns in the process of exploring the surrounding environment [78]. Such behavior is often observed in rodents, establishing the home base as a reference point for organizing their exploration [78-80]. Here, we examined whether the home base behavior exists in zebrafish [81] (Fig. 5).

Fig. 2. Effects of anxiogenic drugs on the intra-session habituation in 6-min novel tank test. (A) Alarm pheromone (7 ml x 15 min). (B) Caffeine (100 mg/L x 10 min). (C) Pentylenetetrazole (900 mg/L x 10 min). *P<0.05, **P<0.005, #P=0.05-0.1 (trend) vs. minute 1, U-test (n=15-16). For behavioral assessments, a statistically significant difference is shown vs. minute 1. For adaptive assessments, a statistically significant difference is shown vs. control. All used anxiogenic drugs had statistically significant effects vs. controls.

Fig. 3. Effects of anxiolytic drugs on intra-session habituation in the 6-min novel tank test. (A) Acute effect of ethanol (0.3% x 5 min). (B) Chronic effect of ethanol (0.2% x 2 weeks). (C) Fluoxetine (100 jg/L x 2 weeks). (D) Morphine (2.0 mg/L x 15 min). *P<0.05, **P<0.005, #P=0.05-0.1 (trend) vs. minute 1, U-test (n=15-16 in each group). For behavioral assessments, significant difference is shown vs. minute 1. For adaptive assessments, significant difference is shown vs. control.

■2

Fig. 4. Behavioral strain differences in zebrafish in the novel tank test. (A) Strains used in thius study. (B) Patterns of exploration for 3 min. (C) Other behaviors tested analyzed by video tracking (CleverSys, Inc.). *P<0.05, **P<0.01,

***P<0.005 vs. the wild type, U-test.

In this experiment, fish were placed in various open field test tanks of varying shapes and sizes. Tank 1 was a large rectangular plastic opaque aquarium 12.3 cm tall 38.7 cm wide and 47.3 cm long, divided into 9 zones. Tank 2 was a white plastic cylinder 23.6 cm high and 22.8 cm in diameter, divided into 8 zones.

Fig. 5. Zebrafish home base behaviors demonstrated by three different 30-min open field tests (OFT1-3). OFT1 was a large rectangular arena, OFT2 was a large circular arena and OFT3 was a small square arena (A) Paths generated by the Ethovision XT7 program for 3 different zebrafish. (B) Density map generated for three different fish (the same ones on panel A) generated by Ethovision XT7. (C) The total topography of the home base for all fish tested (n=20 for each OFT). Each home base is denoted by a black dot.

Tank 3 was a white rectangle with a textured surface and rounded corners 14 cm high, 29 cm wide and 37 cm long, divided into 9 zones. As part of the test, fish were placed individually in the middle of the tank, and their behavior was recorded for 30 min. To identify the home base, the following algorithm was used (Fig. 6). First, the fish activity in each zone was determined from the generated movement map, ranked from 0 (no activity) to 3 (very high). An area that could potentially be a home base was defined as having at least 2 points. Then, for each zone we calculated the distance traveled in this zone, the number of visits to it and the time spent there as a percentage of the total for each parameter. The three maximum percentage values of the zones were further calculated as potential home base. Finally, all 4 criteria were superimposed to identify the overlapping zones as the ultimate determinant of the home base (Fig. 6).

Overall, all fish tested had establish home bases (usually 1, 60-80% of fish, or 2, 20-40%), near the walls of all tanks. Thus, it was confirmed that zebrafish have a robust home base behavior and, like rodents, use these home bases for their exploration of novelty, thus demonstrating the evolutionarily conserved nature of their novelty behavioral strategies.

(B)

60

20

% Time spent

% Distance traveled

% Visits

30

■ Mofruttts« OOlher

■ Hcmebase OOthet

Ifeli: Jlii ifcli

■ »tomobase OOtfw*

OFT1

OFT2

OFT3

OfTl

OFT2

OfT3