Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Евсеенко, Василий Александрович

• Евсеенко, Василий Александрович
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Евсеенко, Василий Александрович

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор Литературы.

1.1 История открытия вирусов гриппа.

1.2 Пандемии.

1.3 Структура вириона.

1.4 Химический состав вирусной частицы.

1.5 История возникновения вирусов гриппа птиц H5N1 -субтипа.

1.6 Филогенетический анализ.

1.7 Патогенность.

1.8 Молекулярные маркёры фенотипических свойств вирусов.

1.8.1 Молекулярные маркёры устойчивости к лекарственным препаратам (ремантадину, озельтамивиру).

1.9 Животные модели.

1.10 Заболевание человека.

1.10.1 Клиническая картина заболевания.

1.10.2 Диагностический алгоритм.

1.10.3 Этиотропная терапия птичьего гриппа.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1 Результаты молекулярно-генетического анализа.

3.2 Результаты филогенетического анализа.

3.3 Патогенность для мышей.

Список использовавшихся сокращений

ВГП - вирус гриппа птиц

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛД50 - 50% летальная доза

МЛД50 - 50% мышиная летальная доза

НК - натуральный киллер

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РДС (ARDS) - респираторный дистресс синдром

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТОРС - тяжёлый острый респираторный синдром

УФ - ультрафиолетовое излучение

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза

ЮАР - Южно Африканская Республика

IVPI - intra venous pathogenity index (индекс патогенности при внутривенном введении)

РА - полимеразный белок

РВ1 - полимеразный белок

РВ2 - полимеразный белок

НА - гемагглютинин

NA - нейраминидаза

NP - нуклеопротеин

NS - неструктурный белок

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические характеристики ряда штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах»

Актуальность работы

За последние десятилетия стало ясно, что битва с инфекционными болезнями никогда не будет выиграна. В этот период были выявлены новые инфекции, появились вирулентные штаммы давно идентифицированных возбудителей, и значительно расширилась географическая представленность ранее известных инфекционных агентов. Совокупность этих инфекций была объединена новым термином -«возникающие» заболевания (от англ. слова emerging - возникающий) (Morens D.M. et al. 2004). Появление возникающих и вновь возникающих инфекций обусловлено социально-экономическими факторами, изменяющими мировое устройство: рост темпов урбанизации, проникновение человека в новые экосистемы, расширение международных торгово-экономических связей, а вместе с этим увеличение объёма путешествий.

Вирусы гриппа А относят к одним из самых значимых для человечества возбудителей возникающих инфекционных болезней. Появление высокопатогенных субтипов вируса в популяции домашних птиц и увеличивающееся количество зарегистрированных случаев прямой передачи возбудителей птичьего гриппа человеку ставят проблему новой пандемии перед мировым здравоохранением. Основные эпидемии гриппа 20-го века были вызваны вирусами, произошедшими непосредственно от птичьих вирусов путем генетической реассортации между штаммами гриппа птиц и людей (пандемии 1957 и 1968 гг.) или адаптации птичьего штамма к человеку («испанка» 1918-1919 гг.) (Wright P.F.,Webster R.G., 2001). В последнее время всё большее значение приобретает прямая передача вирусов гриппа, циркулирующих среди птиц. Долгое время существовавшая концепция об ограниченности круга хозяев для возбудителей гриппа птиц рушится на глазах.

Доказательством тому служат два подтвержденных случая инфицирования вирусом A/H9N2 в Гонконге (Peiris М. et al., 1999), вспышка А/Н7Ш-инфекции в Нидерландах в 2003 году (Koopmans М. et al, 2004) и регистрирующиеся с 1997 года вспышки птичьего гриппа A H5N1-субтипа среди людей (WHO, 2007).

Особый интерес представляет возбудитель гриппа A H5N1-субтипа в связи с тем, что можно провести некоторые параллели между данным вирусом и вирусом «испанки» (подтип H1N1), явившемся причиной гибели до 40 миллионов людей во время пандемии 1918-1919 гг. Подобно вирусу «испанки», вирус гриппа A H5N1-субтипа может передаваться непосредственно от инфицированных птиц людям, обладает необычайно высокой патогенностью и способностью вызывать генерализованную инфекцию в отсутствии ранее сформировавшегося специфического иммунитета в человеческой популяции, по крайней мере, в определённых возрастных группах. Исследования циркулирующих изолятов возбудителя демонстрируют продолжающуюся эволюцию вируса и увеличение видового спектра организмов хозяев. Нужно отметить угрожающую динамику: каждый год происходит удвоение числа заболевших и погибших людей. Все эти обстоятельства заставляют рассматривать вирус A H5N1-субтипа в качестве наиболее вероятной причины будущих пандемий гриппа.

В 2005 году в с. Суздалка был зафиксирован падёж домашней птицы, который был вызван вирусом H5N1-субтипа. В кратчайшее время вирусы распространились по территории Западной Сибири, а в последствии в Центральных регионах и Юго-запада России. В результате распространения погибло и было забито более 1 млн. голов домашней птицы (Онищенко Г.Г., 2006). Происходил контакт населения и больной птицы, который мог привести к заболеванию и гибели людей. Поскольку это были первые случаи выявления вирусов высокопатогенного гриппа птиц H5N1 -субтипа на территории России, актуальным являлось получение данных о фенотипических особенностях - иатогенности для птиц и млекопитающих, филогенетическом положении, серологических свойствах. Также было необходимо разработать животные модели гриппа птиц H5N1 -субтипа для использования их при разработке вакцин и лекарственных препаратов. Решению этих проблем была посвящена данная работа.

Цель

Целью работы является изучение разнообразия фенотипических, молекулярно-генетических, филогенетических и серологических свойств 7 штаммов вируса гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2006 годах. Задачи

1. Определить нуклеотидную последовательность геномов следующих штаммов вирусов гриппа A: A/turkey/Suzdalka/12/05, A/chicken/Suzdalka/06/05, А/goose/Suzdalka/10/05, A/chicken/Krasnodar/123/06 A/chicken/Reshoty/02/06. A/duck/Tuva/01 /06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

2. Провести анализ функционально значимых районов генома.

3. Определить филогенетические отношения изучаемых штаммов и их положение среди вирусов гриппа A H5N1-субтипа.

4. Определить патогенность изучаемых вирусов для модельных животных (кур, мышей линии BALB/c, беспородных хорьков).

5. Определить серологическую кросс-реактивность антигенов изучаемых штаммов с поликлональными референс сыворотками, полученными на вирусы гриппа птиц H5N1-субтипа, выделенных в период с 1997 по 2004 годы.

6. Определить динамику изменения системной продукции IFN-gamma, TNF-alpha, IL-lbeta, IL-6, IL-10, IL-18 при экспериментальной инфекции BALB/c мышей.

Научная новизна и практическая значимость

В данной работе проведено комплексное изучение молекулярно-генетических, филогенетических, серологических и фенотипических свойств семи штаммов вирусов гриппа A H5N1 -субтипа, выделенных на территории России в 2005 и 2006 годах.

Впервые в мире было показано теоретически и подтверждено экспериментами на животных моделях, что вирусы, принадлежащие кладе 2 субкладе 2, обладают различной патогенностью для млекопитающих.

Впервые в мире описано развитие геморрагического синдрома при экспериментальном заражении штаммом гриппа A H5Nl-cy6rana A/duck/Tuva/01/06 BALB/c мышей.

Впервые в России описаны характеристики экспериментальной инфекции у мышей линии BALB/c и беспородных хорьков.

Были получены данные о серологической кросс-реактивности антигенов вирусов, принадлежащих кладе 2 субкладе 2 с сыворотками, полученными против вирусов, принадлежащих кладе 1.

Фактически были разработаны модели гриппа птиц H5N1-субтипа, которые могут быть использованы для определения алгоритмов лечения, проверки эффективности существующих и новых противогриппозных препаратов. Также эти модели могут быть использованы для проверки иммуногенных и протективных свойств вакцин гриппа птиц H5N1-субтипа.

Апробация работы

Список публикаций по теме работы:

1. Бвсеенко В.А, Зайковская А.В, Терновой В.А, Дурыманов А.Г, Золотых С.И, Рассадкин Ю.Н, Липатов А.С, Webster R.G, Шестопалов А.М, член. корр. РАН Нетесов С.В. Изучение разнообразия высоко патогенных вирусов гриппа H5N1, вызвавших эпизоотии среди птиц на территории Западной Сибири в 2005 году // Доклады АН 2007,414:226-30.

2. Evseenko VA, Bukin ЕК, Zaykovskaya AV, Sharshov KA, Ternovoi VA, Ignatyev GM, Shestopalov AM. Experimental infection of H5N1 HPAI in BALB/c mice.// Virol J. 2007 Jul 27;4(1):77

3. Aleksandr S. Lipatov*, Vasily A. Evseenko*, Hui-Ling Yen, Anna V. Zaykovskaya, Alexander G. Durimanov, Sergey I. Zolotykh, Sergey V. Netesov, Ilya G. Drozdov, Gennadiy G. Onishchenko, Robert G. Webster and Alexander M. Shestopalov. Influenza (H5N1) Viruses in Poultry, Russian Federation, 2005-2006. // Emerg Infect Dis 2007, Vol 13, No 4. April p. 539-546. Эквивалентный вклад в выполненную работу

4. Г.Г. Онищенко, A.M. Шестопалов, В.А. Терновой, В.А. Евсеенко, А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, А.В. Зайковская, СМ. Золотых, А.К. Юрлов, В.Н. Михеев, С.В.Нетесов, И.Г. Дроздов. Изучение высокопатогенного H5N1 вируса гриппа, выделенного от больных и погибших птиц в Западной Сибири. // Журн. Микробиол., 2006 №5, с. 47-54

5. Shestopalov AM, Durimanov AG, Evseenko VA, Ternovoi VA, Rassadkin YN, Razumova YV, et al. H5N1 Influenza virus from domestic birds, Western Siberia, Russia. // Emerging infection diseases (EID), 2006, 2006 Jul; 12(7):1167-9.

6. Evseenko V.A, Zaikovskaya A.V, Lipatov A.S, Shestopalov A.M. Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005 // International Journal of Infectious Diseases (IJID) supplemental edition, 2006, June.

7. Г.Г. Онищенко, A.M. Шестопалов, В.А. Терновой, В.А. Евсеенко, А.Г. Дурыманов, Ю.Н. Рассадкин, Ю.В. Разумова, А.В. Зайковская, С.И. Золотых, С.В. Нетесов, JI.C. Сандахчиев. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов гриппа, генетически родственных вирусам, циркулирующим в Юго-Восточной Азии в 20032005 гг. // Доклады АН, 2006, №2, стр. 63-65. Тезисы докладов

8. Evseenko V.A., Zaykovskaya A.V., Ignatyev G.M., Shestopalov A.M., Drozdov I.G. Lethal mouse model based on strain A/Grebe/Tuva/01/06. 2006 Keystone Symposia Conference E7: Respiratory Viruses of Animals Causing Disease in Humans. Poster presentation.

9. Evseenko V.A., Zaykovskaya A.Y., Ignatyev G.M., Shestopalov A.M. Lethal mouse model of H5N1 HPAI based on a novel strain of 2006. 4th Vaccines: All Things Considered November 16-17, 2006, Washington D.C. Poster presentation.

10. Evseenko V.A, Zaikovskaya A.V, Lipatov A.S, Shestopalov A.M. Investigation of HPAI viruses caused epizooty in Russia in 2005. 12 International Congress on Infectious Diseases, Lisbon June 15-19, Portugal 2006. Oral presentation.

11. Shestopalov A.M., Evseenko V.A., Ternovoy V.A., Durimanov A.G., Zolotykh Z.I., Urlov A.K., Netesov S.V. The study of genetic variety of influenza A viruses of highly pathogenic H5N1 subtype that were isolated during the epizooty in period from 2005 to 2006 in Russian Federation. First international Conference on Avian Influenza in Humans, Institut Pasteur, Paris-France, June 29-30, 2006. Постер.

12. Шестопалов A.M., Евсеенко B.A., Терновой B.A., Дурыманов А.Г., Золотых С.И., Юрлов А.К., Нетесов С.В. Дроздов И.Г. Изучение генетического разнообразия вирусов высоко патогенного гриппа А подтипа H5N1, выделенный в ходе эпизоотии 2005-2006 гг. в России. III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006. Доклад. Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием. Новосибирск 27- 29 сентября 2006. Новосибирск: Цэрис. 2006, с. 244- 245.

13. Шестопалова J1.B., Шаркова Т.В., Евсеенко В.А., Зайковская А.В., Юшков Ю.Г., Шестопалов A.M. Изучение морфологических изменений тканей птиц при экспериментальном заражении высокопатогенными вирусом гриппа H5N1. III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006. Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием. Новосибирск 27- 29 сентября 2006. Новосибирск: Цэрис. 2006, с. 244- 245.

14. Евсеенко В.А., Зайковская А.В., Терновой В.А., Дурыманов А.Г., Золотых С.И., Рассадкин Ю.Н., Шестопалов A.M., Нетесов С.В., Дроздов И.Г. Изучение разнообразия Высокопатогенных вирусов гриппа H5N1, вызвавших эпизоотию в Западной Сибири. III российская конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, 2006. Тезисы докладов III Российской научной конференции с международным участием. Новосибирск 27- 29 сентября 2006. Новосибирск: Цэрис. 2006, с. 232- 233.

15. Евсеенко В.А., Терновой В.А., Зайковкая А.В., Золотых С.И., Дурыманов А.Г., Рассадкин Ю.Н., Кононова Ю.В., Юшков Ю.Г., Нетесов С.В., Шестопалов A.M. Генотипичекое разнообразие вирусов гриппа А типа H5N1, выделенных от домашних птиц во время летней и осенней эпизоотии 2005 года в нескольких районах новосибирской области. Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения военной медицины. Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006 г. Доклад. Материалы Российской научно- практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно- медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с. 102- 103.

16. Зайковская А.В, Евсеенко В.А., Шестопалов A.M. Изучение патогенных свойств вирусов гриппа H5N1, выделенных в новосибирской области в 2005 году. Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения военной медицины. Санкт

Петербург, 22-24 марта 2006 г. Доклад. Материалы Российской научно- практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с. 122-123.

17. Яцышина С.Б., Подколзин А.Т., Терновой В.А., Евсеенко В.А., Шестопалов A.M., Краснова Т.В., Обухов И.Л., Нетесов С.В., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Апробация ПЦР-Тест-Систем для выявления вируса гриппа птиц. Генодиагностика инфекционных болезней. НСО 25-27 октября 2005. Доклад. Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 110- летию кафедры инфекционных болезней Военно- медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт- Перербург, 22- 24 марта 2006 года, с. 174- 177.

18. Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M., Цэреноров Д., Золотых С.И., Раумова Ю.В., Кононова Ю.В., Славский А.А., Петренко М.С., Галкина И.В., Евсеенко В.А., Епанчинцева А.В., Абмед Д., Аристова В.А., Морозова Т.Н., Альховский С.В., Юрлов А.К., Терновой В.А., Локтев В.Б., Громашевский В.Л., Нетесов С.В., Львов Д.К. Комплексное вирусологическое обследование птиц западносибирского пролётного пути: результаты исследований по Гранту РФФИ-03-04-49158. Генодиагностика инфекционных болезней. НСО 25-27 октября 2005. Доклад. Материалы Российской научно- практической конференции. Новосибирск: Цэрис. 2005, с. 170- 173. Награды

За изучение вирусов высокопатогенного гриппа птиц H5N1-субтипа автор удостоен премии "Novartis Vaccine Award for Epidemiology of Infectious Diseases" общества по изучению инфекционных заболеваний (International Society for Infectious Diseases, 2006)

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Евсеенко, Василий Александрович

Выводы

1. Впервые определены полноразмерные нуклеотидные последовательности геномов следующих штаммов вирусов гриппа A/chicken/Reshoty/02/06, A/chicken/Krasnodar/123/06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/chicken/Suzdalka/06/05, A/goose/Suzdalka/10/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/duck/Tuva/01/06. На основании филогенетического анализа последовательностей всех генов вышеуказанных штаммов было показано, что все исследованные штаммы принадлежат кладе 2 субклады 2, или так называемым «Цинхай» - подобным штаммам вируса гриппа А подтипа H5N1-субтипа.

2. Анализ районов «петля 130», «петля 220», «спираль 190» показал, что все изученные штаммы имеют структуру рецептор-связывающего домена, характерную для вирусов, циркулирующих в популяциях птиц. Аминокислотных замен в антигенно значимых районах геммагглютинина у данных штаммов вируса не обнаружено. В РТГА с референс сыворотками к вирусу гриппа A H5N1 -субтипа также была подтверждена серологическая однородность изученных штаммов. Было показано отсутствие замен, характерных для лекарственно устойчивых (ремантадин и озелтамивир) штаммов вируса гриппа А.

3. Установлено наличие реассортации генов у штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05. Гены NP и NS вероятнее всего происходят от вирусов, подобных штаммам A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/goose/Suzdalka/10/05 (Кластер 5 по гену гемагглютинина). Гены НА, NA, М, PA, РВ1, РВ2 происходят от вирусов, филогенетически принадлежащих к кластеру 4 по гемагглютинину.

4. Определена патогенность изученных штаммов для модельных животных - кур, мышей линии BALB/c, и беспородных хорьков. Было показано, что все изученные штаммы высоко патогенны для кур (индекс патогенности от 2,6 до 3), но делятся на две группы по патогенности для млекопитающих - мышей и хорьков: штаммы A/chicken/Suzdalka/06/05, A/turkey/Suzdalka/12/05, A/goose/Suzdalka/10/05 низкопатогенны, а штаммы A/goose/krasnoozerskoye/627/05, A/duck/Tuva/01/06 A/chicken/Krasnodar/123/06 и A/chicken/Reshoty/02/06 - высокопатогенны для данных животных.

5. У низкопатогенных для мышей линии BALB/c и беспородных хорьков штаммов A/chicken/Suzdalka/06/05, A/goose/Suzdalka/10/05, A/turkey/Suzdalka/12/05 в 627 позиции белка РВ2 находится гистидин (Н), в то время как у высокопатогенных A/chicken/Reshoty/02/06, A/chicken/Krasnodar/123/06, A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, A/duck/Tuva/01/06 находится лизин (К). Что может говорить о связанности данных генетического и фенотипического признаков.

6. Нами впервые было показано, что цитокины IFN-gamma, IL-lbeta, IL-6 играют очень важную, если не ключевую, роль в патогенезе гриппа птиц H5N1-субтипа у мышей. Показано увеличение уровней IFN-gamma, IL-lbeta, IL-6 в сыворотке крови в 8, 3 и 4 раза, соответственно, к моменту гибели мышей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Евсеенко, Василий Александрович, 2007 год

1. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Изд. 2. - Л., 1962.

2. Львов Д.К. Вирусы гриппа и грипп. Москва, Медицина 1978.

3. Онищенко Г.Г. Грипп птиц в Сибири. Новосибирск, «ЦЭРИС» 2006.

4. Юрлов А.К., Чернышов В.М., Яновский А.П. // Материалы к распространению птиц на Урале, в Приуралье и Западной Сибири. Екатеринбург, 1998. С. 189-192.

5. Юрлов А.К., Чернышов В.М., Яновский А.П. Новые сведения о путях пролета и районах зимовки некоторых видов птиц из южной части Западной Сибири. // Материалы к распространению птиц на Урале, в Приуралье и Западной Сибири. Екатеринбург, 1998. С. 189-192.

6. Apisarnthanarak A. et al. Atypical avian influenza (H5N1) // Emerg. Infect. Dis. 10, 1321-4 (2004).

7. Garcia M., Suarez D.L., Crawford J.M., Latimer J.W., Slemons R.D., Evolution of H5 subtype avian influenza A viruses in North America // Journal Virus Res. 51 (2), 115-124 (1997)

8. Apisarnthanarak A. et al. Atypical avian influenza (H5N1) // Emerg. Infect. Dis. 10, 1321-4 (2004).

9. Chotpitayasunondh Т. et al. Human disease from influenza A (H5N1), Thailand, 2004 // Emerg. Infect. Dis. 11, 201-9 (2005).

10. Beigel J. H. et al. Avian influenza A (H5N1) infection in humans // N. Engl. J. Med. 353, 1374-85 (2005).

11. Beare A. S., Webster R. G. Replication of avian influenza viruses in humans // Arch. Virol. 119, 37-42(1991).

12. Bone R.C. 1992. Toward an epidemiology and natural history of SIRS (systemic inflammatory response syndrome) // Jama 268:3452-5.

13. Brown E.G. Influenza virus genetics // Biomed. Pharmacother. 2000 May; 54(4): 196-209. Review.

14. Li M.L., Ramirez B.C., Krug R.M. RNA-dependent activation of primer RNA production by influenza virus polymerase: different regions of the same protein subunit constitute the two required RNA-binding sites //EMBO J. 1998 Oct 1; 17(19):5844-52.

15. Capua I., Mutinelli F. A color atlas and text on avian influenza. Papi Editore, Bologna, Italy, 2001.

16. Chan P.K. Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997 // Clin. Infect. Dis. 34 Suppl. 2, S58-64 (2002).

17. Chan P.K. Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997 // Clin Infect Dis. 34 Suppl. 2, S58-64 (2002).

18. Cheung C.Y. et al. Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A (H5N1) viruses: a mechanism for the unusual severity of human disease? // Lancet 360, 1831-7 (2002).

19. Cheng V.C., Tang, B.S., Wu, A. K„ Chu, C.M., Yuen, K.Y. Medical treatment of viral pneumonia including SARS in immunocompetent adult // J Infect 49, 262-73 (2004).

20. Esmon, C.T. 2005. The interactions between inflammation and coagulation // Br. J. Haematol. 131:417-30.

21. Fields Virology (eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M.) (Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, 2001).

22. Fitch W.M. Rate of change of concomitantly variable codons // J. Mol. Evol. 1971; l(l):84-96.

23. Gately, M.K., A.G. Wolitzky, P.M. Quinn, R. Chizzonite. 1992. Regulation of human cytolytic lymphocyte responses by interleukin-12 // Cell. Immunol. 143:127-42.

24. Moore, K.W., R. de Waal Malefyt, R.L. Coffraan, A. O'Garra. 2001. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor// Annu. Rev. Immunol. 19:683-765.

25. Govorkova, E.A., Leneva, I.A., Goloubeva, O.G., Bush, K, Webster, R.G. Comparison of efficacies of RWJ-270201, zanamivir, and oseltamivir against H5N1, H9N2, and other avian influenza viruses // Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2723-32 (2001).

26. Guan Y, Poon L.L., Cheung C.Y., Ellis T.M., Lim W., Lipatov A.S., et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:8156-61.

27. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 May 25;101(21):8156-61.

28. Gubareva L.V., McCullers J.A., Bethell R.C., Webster, R.G. Characterization of influenza A/HongKong/156/97 (H5N1) virus in a mouse model and protective effect of zanamivir on H5N1 infection in mice // J. Infect. Dis. 178, 1592-6 (1998).

29. Hirst G.K. Antigenic variation among influenza viruses // Bull NY Acad. Med. 1952 Nov; 28(11):769.

30. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y., Hobom G., Webster R.G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2000 May 23;97(11):6108-13.

31. Hoffmann E., Lipatov A.S., Webby R.J., Govorkova E.A., Webster R.G. Role of specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 influenza virus vaccines // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2005 Sep 6; 102(36): 12915-20

32. Hulse-Post D.J., Sturm-Ramirez K.M., Humberd J. Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 Jul 26; 102(30): 10682-7.

33. Ilyushina N.A., Govorkova E.A., Webster R.G. Detection of amantadine-resistant variants among avian influenza viruses isolated in North America and Asia // Virology. 2005; 341:102-6

34. Katz J.M., Lu X., Frace A.M., Morken Т., Zaki S.R., Tumpey T.M. Pathogenesis of and immunity to avian influenza A H5 viruses // Biomed. Pharmacother. 2000 May; 54(4): 178-87.

35. Kiso, M. et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study // Lancet 364, 759-65 (2004).

36. Kida, H. et al. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs // J. Gen. Virol. 75 (Pt 9), 2183-8 (1994).

37. Koopmans M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands // Lancet 363, 587-93 (2004).

38. Kuiken Т., Rimmelzwaan G., van Riel D., van Amerongen G., Baars M., Fouchier R., Osterhaus A // Science. 2004 Oct 8; 306(5694):241.

39. Kuiken Т., Rimmelzwaan G.F., Van Amerongen G., Osterhaus A.D. Pathology of human influenza A (H5N1) virus infection in cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) // Vet. Pathol. 2003 May; 40(3):304-10.

40. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Brief Bioinform. 2004 Jun; 5(2):150-63.

41. Le Q.M., Kiso M., Someya K., Sakai Y.T., Nguyen Т.Н., Nguyen K.H., et al. Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus // Nature. 2005; 437:1108.

42. Li K.S. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature 430, 209-13 (2004)

43. Lipatov A.S., Krauss S., Guan Y., Peiris M„ Rehg J.E., Perez D.R., Webster R.G. Neurovirulence in mice of H5N1 influenza virus genotypes isolated from Hong Kong poultry in2001 //J. Virol. 2003 Mar; 77(6):3816-23.

44. Lipatov A.S., Webby R.J., Govorkova E.A., Krauss S., Webster R.G. Efficacy of H5 influenza vaccines produced by reverse genetics in a lethal mouse model // J. Infect. Dis. 2005 Apr 15;191(8):1216-20.

45. Lipatov A.C., Smirnov Iu.A, Kaverin N.V, Webster R.G. Evolution of avian influenza viruses H5N1 (1997-2004) in southern and south-eastern Asia // Vopr. Virusol. 2005 Jul-Aug; 51(4): 11-7.

46. Lu X.H., Cho D„ Hall H„ Rowe Т., Mo I.P., Sung H.W., Kim W.J., Kang C., Cox N„ Klimov A., Katz J.M. Pathogenesis of and immunity to a new influenza A (H5N1) virus isolated from duck meat // Avian Dis. 2003; 47(3 Suppl): 1135-40.

47. Macken C., Lu H., Goodman J., Boykin L., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Options for the Control of Influenza IVII Elsevier Science, 2001, 103106.

48. Maines T.R., Lu X.H., Erb S.M., Edwards L., Guarner J., Greer P.W., et al. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals//J. Virol. 2005; 79:17888-800.

49. Morens D. M., Folkers G.K., Fauci A.S. The challenge of emerging and re-emerging infectious diseases //Nature 430, 242-9 (2004).

50. Obenauer J.C., Denson J., Mehta P.K., Su X., Mukatira S., Finkelstein D.B., et al. Large-scale sequence analysis of avian influenza isolates // Science. 2006; 311:1576-80

51. Peiris J.S. et al. Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease // Lancet 363, 617-9 (2004).

52. Peiris M. et al. Human infection with influenza H9N2 // Lancet 354, 916-7 (1999).

53. Peiris J.S., de Jong M.D., Guan Y. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health // Clin. Microbiol. Rev. 2007 Apr; 20(2):243-67.

54. Peiris M. Pathogenesis of avian flu H5N1 and SARS. Novartis Found Symp 279, 56-60; discussion 60-5, 216-9 (2006).

55. Rimmelzwaan G.F., Kuiken Т., van Amerongen G., Bestebroer T.M., Fouchier R.A., Osterhaus A.D. A primate model to study the pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection.

56. Rimmelzwaan G.F., Kuiken Т., van Amerongen G., Bestebroer T.M., Fouchier R.A., Osterhaus A.D. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model // J. Virol. 2001 Jul; 75(14):6687-91.

57. Ron A.M. Foucher, Thijs Kuiken, Guus F. Rimmelzwaan, Albert D.M.E. Osterhaus. Materials of Respiratory of Animals causing disease in Humans, p.27

58. Rowe T. et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays // J Clin Microbiol 37, 937-43 (1999).

59. Seo S. H., R.G. Webster. 2002. Tumor necrosis factor alpha exerts powerful anti-influenza virus effects in lung epithelial cells // J. Virol. 76:1071-6.

60. Seo S. H., E. Hoffmann, R. G. Webster. 2002. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses // Nat. Med. 8:950-4.

61. Shestopalov A.M., Durimanov A.G., Evseenko V.A., Ternovoi V.A., Rassadkin Y.N., Razumova Y.V., Zaykovskaya A.V., Zolotykh S.I., Netesov S.V. H5N1 Influenza Virus, Domestic Birds, Western Siberia, Russia// Emerg. Infect. Dis. 2006 Jul; 12(7): 1167-9.

62. Shortridge K.F., Peiris J.S., Guan Y. The next influenza pandemic: lessons from Hong Kong. // J. Appl. Microbiol. 2003; 94 Suppl:70S-79S.

63. Slemons R.D., Condobery P.K., Swayne D.E. Assessing pathogenicity potential of waterfowl-origin type A influenza viruses in chickens // Avian Dis. 1991 Jan-Mar; 35(1):210-5.

64. Stevens J., Blixt O., Tumpey T.M. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus // Science, 2006, v. 312, 404-410

65. Swayne D.E., Perdue M,L., Garcia M., Rivera-Cruz, E., Brugh M., Pathogenicity and diagnosis of H5N2 Mexican avian influenza viruses in chickens // Avian Dis. -1997, -41(2), -p. 35-46.

66. Swayne D.E., Beck J.R. Mickle T.R., Efficacy of recombinant fowl poxvirus vaccine in protecting chickens against a highly pathogenic Mexican-origin H5N2 avian influenza virus // Avian Dis. -1997, -41(4), -p. 10-22.

67. Swayne D.E., Pantin-Jackwood M. Pathogenicity of avian influenza viruses in poultry // DevBiol (Basel). 2006; 124:61-7.

68. Subbarao K., Klimov A., Katz J., Regnery H., Lim W., Hall H., et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness // Science. 1998;279:393-6

69. Tanaka H., Park C.H., Ninomiya A., Ozaki H., Takada A., Umemura Т., Kida H. Neurotropism of the 1997 Hong Kong H5N1 influenza virus in mice // Vet. Microbiol. 2003 Aug 29; 95(1-2):1-13.

70. Tam J.S. Influenza A (H5N1) in Hong Kong: an overview // Vaccine 20 Suppl 2, S77-81 (2002).

71. Tran Т.Н. et al. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam // N. Engl. J. Med. 350, 1179-88 (2004).

72. Tamura K, Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 Jul 27; 101 (30): 11030-5.

73. Taubenberger J.K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus // Proc. Am. Philos. Soc. 2006 Mar; 150(1):86-112.

74. To K.F. et al. Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A H5N1 virus // J. Med. Virol. 63, 242-6 (2001).

75. Webby R.J., Webster R.G. Are we ready for pandemic influenza? // Science. 2003 Nov 28; 302(5650): 1519-22.

76. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance.

77. Wong S.S., Yuen K.Y. Avian influenza virus infections in humans // Chest 129, 156-68 (2006).

78. World Health Organization. H5N1 avian influenza: Timeline of major events. Situation Update, 20 April 2007. http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/timeline20070420.pdf.

79. Wright P.F., Webster R.G. in Fields Virology (eds. Knipe, D. M. & Howley, P. M.) (Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, 2001).

80. Xu Т., J. Qiao, L. Zhao, G. Wang, G. He, K. Li, Y. Tian, M. Gao, J. Wang, H. Wang, and C. Dong. 2006. Acute Respiratory Distress Syndrome Induced by Avian Influenza A (H5N1) Vims in Mice // Am. J. Respir. Crit. Care Med.

81. Yen H.L., Hoffmann E., Taylor G., Scholtissek C., Monto A.S., Webster R.G., Govorkova E.A. Importance of neuraminidase active-site residues to the neuraminidase inhibitor resistance of influenza viruses // J. Virol. 2006 Sep; 80(17):8787-95.

82. Yen H.L., Monto A.S., Webster R.G., Govorkova E.A. Virulence may determine the necessary duration and dosage of oseltamivir treatment for highly pathogenic A/Vietnam/1203/04 influenza virus in mice // J. Infec. Dis. 192, 665-72 (2005).

83. Yuen K.Y. et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus // Lancet 351, 467-71 (1998).

84. EF205209 EF205208 EF205207 EF205206

85. EF205201 EF205200 EF205199 EF205198

86. EF205193 EF205192 EF205191 EF205190

87. EF205185 EF205184 EF205183 EF205182

88. EF205177 EF205176 EF205175 EF205174

89. EF205169 EF205168 EF205167 EF205166

90. EF205161 EF205160 EF205159 EF205158

91. DQ676836 DQ861295 DQ861294 DQ861293

92. DQ231241 DQ231240 DQ676839 DQ676842

93. DQ676835 DQ676834 DQ676833 DQ676832

94. АВ076705 АВ076704 АВ076703 АВ076702

95. АВ076697 АВ076696 АВ076695 АВ076694

96. АВ076689 АВ076688 АВ076687 АВ076686

97. АВ076681 АВ076680 АВ076679 АВ076678

98. АВ076673 АВ076672 АВ076671 АВ076670

99. АВ076665 АВ076664 АВ076663 АВ076662

100. АВ076657 АВ076656 АВ076655 АВ076654

101. АВ076649 АВ076648 АВ076647 АВ076646

102. АВ076641 АВ076640 АВ076639 АВ076638

103. ABI23980 АВ123979 АВВ22776 АВВ22775

104. ABG20479 ABG20478 ABG20476 ABG204751. ABG20469 ABG20468