Биохимические особенности антиоксидантных систем разнотолерантных к соли генотипов картофеля in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Киёмова, Зарафо Суфижоновна

• Киёмова, Зарафо Суфижоновна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Киёмова, Зарафо Суфижоновна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стресс и его воздействие на растения

1.2. Активные формы кислорода и пути их образования

1.3. Антиоксидантная система защиты растений

1.4. Ферменты антиоксидантной системы защиты растений

1.5. Влияние стрессорных факторов на фермент супероксиддисмутазу (СОД, КФ 1.15.1.1)

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Краткая характеристика объекта исследований

2.2. Оптимальные условия для произрастания картофеля

2.3. Материалы и методы исследований

2.3.1. Скрининг in vitro в условиях солевого стресса

2.3.2. Окислительный стресс

2.3.3. Определение содержания аскорбиновой кислоты

2.3.4. Определение количественного содержания

малонового диальдегида

2.3.5. Определение активности супероксиддисмутазы

2.3.6. Определение содержания активной формы кислорода

2.3.7. Определение относительного содержания воды

2.3.8. Определение водного дефицита

2.3.9. Определение содержания пролина

2.3.10. Выделение и очистка хлоропластов и митохондрий

2.3.11. Определение содержания перекиси водорода

2.3.12. Определение содержания НАДФ

2.3.13. Определение содержание хлорофилла

2.3.14. Полевые опыты

2.3.15. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отбор гибридов картофеля на устойчивость к №С1

3.2. Накопление активных форм кислорода и перекиси

водорода в разнотолерантных растениях картофеля

3.3. Содержание малонового диальдегида (МДА) у разнотолерантных к соли генотипов картофеля

3.4. Активность ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктазы (Фд-НАДФ-ОР, КФ: 1.6)

3.5. Роль пролина в проявлении устойчивости у растений картофеля

3.6. Содержание хлорофилла и каротиноидов у различных генотипов картофеля в условиях стресса

3.7. Активность СОД в органеллах клетки разнотолерантых

к соли генотипов картофеля

3.8. Равновесие системы прооксиданты-антиоксиданты

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВОДНОГО ДЕФИЦИТА РАЗНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К СТРЕСС У ГЕНОТИПОВ

КАРТОФЕЛЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЯ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

а- НУК - а-нафтилуксусную. кислоту; а-ТОФ - а токоферол; АОА - антиоксидантная активность; АОЗ - антиоксидантная защита; АФК - активные формы кислорода; ГП - глутатионпероксидаза; ИМК - индолил-3-масляная кислота КАТ- катал аза

МДА- малоновый диальдегид; МС - Мурасиге - Скуга;

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат; ПА - полиамин; ПО - пероксидаза;

ПОЛ - перекисное окисление липидов; СОД - супероксиддисмутаза;

Фд-НАДФ-ОР - ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктаза

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимические особенности антиоксидантных систем разнотолерантных к соли генотипов картофеля in vitro»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Картофель является важнейшей сельскохозяйственной культурой в Таджикистане. Для получения новых сортов используются как традиционные методы селекции, так и биотехнологические подходы, роль которых значительно возросла в последние годы. Биотехнологические методы способствуют получению новых сортов, обеспечивающих не только повышение урожайности, но и устойчивость к различным факторам окружающей среды, таким как засуха, засоление и повышение температуры. Влияние этих факторов особенно усилилось в последние годы в связи с глобальным изменением климата (Алиев, 2012).

Одним из факторов, лимитирующих продуктивность культурных растений, является засоление почвы. Подсчитано, что количество засоленных почв с каждым годом возрастает и через 25-30 лет достигнет угрожающего уровня. Примерно 40% пахотных земель будут непригодными для сельскохозяйственного возделывания растений (ФАО, 2010).

Для изучения токсического влияния соли и механизмов толерантности используются клеточные культуры (Бабаева и др., 1968; Кулаева и др., 1997). При изучении механизмов устойчивости у выделенных in vitro солеустойчивых клеточных линий показано, что у ряда клонов не нарушалась способность к проникновению ионов соли и вместе с тем поддерживался осмотический градиент, необходимый для функционирования клетки. Клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений, поэтому селекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получения устойчивых к засолению форм растений. Механизмы адаптации к условиям засоления могут быть разными и до конца не изучены.

Получение растений с целью придания им устойчивости к стрессорным факторам основано на манипулировании экспрессии и активности основных

ферментов антиоксидантной системы растений, которые напрямую связаны с защитой клетки от супероксид - радикалов (Мерзляк, 1989).

Поэтому, возможности регулирования молекулярного и биохимического адаптационного потенциала, заложенного в генотипе растения, можно использовать для повышения толерантности растений к стрессовым факторам среды, что имеет фундаментальное и прикладное значение. Цель и задачи работы. Целью работы являлось изучение молекулярно-биохимических особенностей разноустойчивых к засолению генотипов картофеля, а такж^ их прооксидантные и антиоксидантные системы в условиях in vitro.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность прооксидантов (Н2О2, 02) у

разночувствительных к соли генотипов картофеля;

2. Определить активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) у разночувствительных к соли генотипов картофеля;

3. Определить содержание малонового диальдегида (МДА) при воздействии засоления;

4. Изучить роль антиоксидантных систем в повышении солеустойчивости генотипов картофеля;

5. Изучить прооксидантные и антиоксидантные системы в различных компартментах клетки у разночувствительных гибридов картофеля.

Научная новизна работы. Изучена и проанализирована продукция активных форм кислорода (АФК), малонового диальдегида (МДА) и активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) у растений-регенерантов картофеля, различающихся по устойчивости к солевому стрессу. Показано, что растения, устойчивые к засолению имеют

более эффективно работающие антиоксидантные системы, и способны переносить длительный окислительный стресс.

Изучены антиоксидантные системы в различных компартментах клетки у разночувствительных гибридов картофеля. Впервые показана роль хлоропластных антиоксидантных систем, имеющих прямую зависимость от активации СОД и окисленности НАДФ у растений картофеля, способствующих сверх продукции АФК.

Использование антибиотика циклогексимида, специфически блокирующего трансляционный процесс на уровне цитоплазматической рибосомы показало существование предсинтезированного пула СОД и интенсификацию синтеза этого фермента De novo за счет экспрессии существующий мРНК у устойчивого к соли генотипа растений картофеля, что не было выявлено у чувствительных растений.

Практическая значимость. Полученные экспериментальные результаты расширяют представления о молекулярных механизмах устойчивости растений к экстремальным природным стрессорам и их адаптации.

Активность СОД, а также других антиоксидантов можно использовать как тест признак для селекции сельскохозяйственных растений, обладающих высоким адаптационным потенциалом.

Отобраны клон-гибриды картофеля, обладающие высоким уровнем устойчивости и урожайности в условиях засоления.

Апробация результатов исследования.

Диссертация подготовлена и обсуждена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан и на биологическом факультете Таджикского национального университета. Ее основные положения, выводы и рекомендации были доложены на конференциях и семинарах: на международном семинаре «Обеспечение улучшения продовольствия и

увеличение доходов в Юго-Западной и Центральной Азии (SWCA) через сорта картофеля с улучшенной устойчивостью к абиотическому стрессу» Индия (Гуджарат), 29-30 ноября 2010 г.; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва (Россия), 21-25 марта 2011 г.; на республиканской научной конференции посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане» Душанбе, 2011 г.; на международной научной конференции памяти академика Ю.С. Насырова «Фотосинтез и проблемы повышения продуктивности растений». Душанбе, 2012 г.; на республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов» Душанбе, 2012 г.; на V международной конференции «Экологические особенности биологического разнообразия» Худжанд, 2013 г.; на международном семинаре «Улучшение сортов картофеля и технологий управления водными ресурсами для улучшения эффективности водопользования, устойчивости к внешним воздействиям, рентабельность и производительность мелких земельных хозяйств, предрасположенных к стрессовым условиям Центральной Азии». Ташкент (Узбекистан) 3-5 сентября 2013 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста включающего в себя введение, 4 главы, заключение, списка использованной литературы и приложений. Работа также содержит 7 рисунков и 13 таблиц. Список цитируемой литературы включает 150 наименований, из которых 92 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Стресс и его воздействие на растения

Растительные клетки и организм в целом способны реагировать на воздействия факторов внешней среды соответствующим образом, что является необходимым для приспособления к условиям окружающей среды. Обмен веществ растений — это сложная система физиолого-биохимических процессов, связанных между собой и зависящих от внешних факторов окружающей среды (Пахомова, Чернов, 1996; Шакирова, 2001; Титов, Акимова, и др., 2006; Таланова, 2009). Очевидно, что негативные факторы способны воздействовать на четко организованную систему, подавляя метаболизм и даже разрушить нормальный (оптимальный) физиолого-биохимический процесс. Способность приспосабливаться к разнообразным стрессовым факторам внешней среды и сохранять свой жизненный потенциал является одним из условий существования растений и это зависит о защитных механизмов и возможности их реализации (Чиркова, 2002; Ипатова, 2005; Мелехов, 1985; Тарчевский, 2000; Dixon, Palva, 1996). Способность растения переносить экстремальные воздействия факторов окружающих среды и давать потомство называется устойчивостью или стресс-толерантностью. Способность растений адаптироваться в соответствии с изменяющимися условиями зависит от многих факторов. Однако длительность времени ответа определенного организма на неблагоприятные факторы, играет ключевую роль. Чем больше времени для ответа, тем более разнообразна способность адаптации к стрессорам (Веселовский и др., 2005). При неожиданном действии экстремальных факторов, ответ должен быть немедленным, и в соответствии с этим различают три способа адаптации: филогенетические адаптации - возникшие в ходе эволюционного процесса на основе генетических мутации и

передающиеся по наследству; фенотипические адаптации (акклимация) -происходят в течение жизни организма и не является наследственной, но осуществляется на основе тех возможностей, которые заложены в генотипе; срочная адаптация - это образование и функционирование шоковых защитных систем, обеспечивающих кратковременное выживание при неблагоприятных воздействиях окружающей среды. Срочная адаптация создает условия для формирования более надежных долговременных механизмов адаптации (Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006; Бабаджанова, Эсаналиева, Алиев, 2011; Ермакова, 2005).

Несмотря на множество путей адаптации растений их можно условно разделить на два различных типа: активная адаптация - индукция синтеза ферментов с новыми свойствами или новых белков, обеспечивающих защиту клетки и протекание метаболизма в ранее непригодных для жизни условиях, то есть формирование защитных механизмов, которые приводят к такой адаптации, что расширяет границы жизни растений.

Пассивная адаптация - в отличие от животных, растения не умеют прятаться от повреждающего действия стрессора, поэтому они должны сосуществовать или уметь уклоняться от воздействия экстремальных условий среды. К пассивным адаптациям относятся: способность растений изолировать тяжелые металлы в стареющих органах, тканях, или в вакуолях, переход в состояние покоя, то есть сосуществовать с ними. Сформировать семена до наступления неблагоприятных условий является настоящим «уходом» от действующего стрессора. Однако растения одновременно используют как активные, так и пассивные пути адаптации. Например, в ответ на повышение температуры воздуха растение понижая температуру тканей за счет транспирации «уходит» от действующего фактора, и одновременно синтезирует белки теплового шока, активно защищает клеточный метаболизм от высокой температуры, (Кузнецов Вл., 2005). Толерантность и избегание создают устойчивость к стрессу.

Для объяснений состояния организма возникшего в ответ на экстремальные воздействия окружающей среды использовали слово «Стресс», которое было предложено Гансом Селье в 1936 г. (от англ. stress — напряжение). Понятие стресс перенесено в физиологию растений из медицины и существует направление - стресс-физиология растений и комплекс метаболитических перестроек у растений во время стресса называют фитострессом (Генкель, 1982).

Внешние факторы, воздействующие на биологические системы и вызывающие стресс, называют стрессорами. Факторы, вызывающие стресс у растений делят на три группы (Полевой, 1989):

1. Физические

2. Химические

3. Биологические

К физическим стрессорам относят: механические воздействия, избыточная или недостаточная влажность, освещенность, температура, радиоактивные излучения. Химическими считаются соли, ксенобиотики, газы. К биологическим неблагоприятным факторам относят: цветение, созревание плодов, негативное влияние животных, голодание и возбудителей болезней.

Согласно концепции о стрессе, сформированной Г Селье, воздействие неблагоприятных факторов в организме индуцирует неспецифические реакции, сопровождающиеся перестройкой защитных систем во времени -генерализованный адаптационный синдром, в котором выделяются три стадии: стадия тревоги — первоначальная реакция, сопровождающаяся процессами катаболизма различных соединений (снижение активности синтетических процессов, деградация белоксинтезирующего аппарата, катаболизм биополимеров), которую называют по разному - стадией повреждения (Удовенко, 1977), реакцией защитного торможения метаболизма, первичной стрессовой реакцией, фазой физиологической депрессии (Пахомова, 1995), стадией активного состояния (Гордон, 1992),

индуктивной фазой (Пахомова, Чернов, 1996). В стадии адаптации происходит синтез стрессовых белков, повышение синтеза и активация гидролитических ферментов и так далее. В стадии истощения, в результате действия различных агентов разрушаются клеточные структуры. Наблюдается деструкция ядра, в хлоропластах происходит распад гран, в митохондриях уменьшается количество крист. Появляются дополнительные вакуоли, где обезвреживаются токсические вещества, образующуюся в результате изменений обмена в стрессовых условиях. Нарушение ультраструктуры основных энергетических генераторов - митохондрий и хлоропластов приводит к энергетическому истощению клетки, это влечет за собой сдвиги физико-химического состояния цитоплазмы. Эти сдвиги свидетельствуют о сильных, часто необратимых повреждениях клетки.

Теряется достигнутая адаптация, сопротивляемость падает ниже нормы, что, вероятно, связано с существованием порога приспособительной силы.

Метаболизм растений на клеточном уровне изменяется за счет реализации двух существующих одновременно (или последовательно) путей адаптации живых организмов к экстремальным факторам среды: 1) индукции синтеза отсутствующих ранее макромолекул с новыми свойствами, обеспечивающих "нормальное" протекание клеточного метаболизма при стрессе и 2) оптимизации внутриклеточной среды, функционирования ферментных систем за счет аккумуляции низкомолекулярных органических соединений, обладающих протекторными свойствами (Франко О., 2000, Narayanan et al., 1989; Freytag et al., 1990; Belowaly, Bouharmont, 1992; Долгих, 1994; Ларина, 1995; Bajji, Kinet, 1995).

Эти пути адаптации направлены на решение одних и тех же задач: на обеспечение организма энергией, восстановителями, предшественниками нуклеиновых кислот и белков, а также на поддержание функционирования клеточных регуляторных систем в условиях стресса (Кузнецов Вл., Шевякова, 1999; Кузнецов Вл., Дмитриева, 2006).

Развития окислительного стресса можно считать наиболее опасным, поскольку в результаты повышение генерации активная форма кислорода (АФК) может произойти множество изменений и самое важное - нарушение работы физиолого-биохимической системы. Углеводы, липиды, белки, нуклеиновые кислоты, являются главными компонентами клетки подвергающимся действии АФК (Finkel, Holbrook, 2000; Колупаев, 2007; Мерзляк, 1989; Bouvier et al., 1998; Noctor, Foyer, 1998; Asada, 1999; Кулинский, 1999; Полесская, 2007).

В экстремальных условиях важнейшим механизмом устойчивости является активизация многоуровневой биохимической системы антиоксидантной защиты, в которую входит большое количество компонентов. Среди них особое место занимают низкомолекулярные матоболиты, проявляющие антиоксидантные свойства (аскорбиновая кислота, глутатион, пролин, каротиноиды, флавоноиды) и ферменты (СОД, каталаза, пероксидаза и др.) (Alonso et al., 2001; Грасоква, и др., 2004; Мутлу, 2005), конкурирующий с АФК в условиях стресса.

1.2. Активные формы кислорода и пути их образования

Кислород довольно медленно реагирует с органическими молекулами, так как сам имеет на внешних орбитах два неспаренных электрона с параллельными спинами, а органические молекулы, как правило, имеют на внешних орбитах пары электронов с антипараллельными спинами. Активация кислорода может происходить либо при поглощении энергии, необходимой для изменения спина одного из электронов кислорода, либо в ходе реакций восстановления. В первом случае, образуется химически активный синглетный кислород. Во втором случае, образуются различные АФК, являющиеся промежуточными продуктами восстановления кислорода до воды в электрон-транспортных цепях:

02 + е" -> 02- + е" + 2Н+ -> Н202 + е~ + Н+ - Н20 -+ ОН* + е" + Н+ -*

2н2О

Наименьшей стабильностью среди АФК отличаются супероксидный анион-радикал (0~2), образующуюся при передаче кислороду одного электрона (Млзга, РпсктсИ, 1972) и гидроксильный радикал (ОН"), которые интенсивно вступают в химические реакции. Супероксидный анион-радикал генерируется, в основном, за счёт «паразитных» химических реакций, происходящих в начале и середине цепи дыхательных ферментов митохондрий. При этом донорами электронов служат ионы РеЗ+, Си2+, семихиноны и некоторые другие продукты дыхания (Кулинский, 1999). Этот радикал непосредственно не является тем агентом, который обуславливает окислительные процессы в биологических мембранах, поэтому инициирование свободнорадикальных процессов связывают с другими АФК (Мерзляк, 1989). В отличие от кислорода, для передвижения которого мембраны не представляют преграды, супероксидный анион-радикал, обладая зарядом, окружен молекулями воды, что не дает ему возможности преодолеть гидрофобный мембранный барьер. Кроме того, время полужизни радикала составляет несколько микросекунд, поэтому он быстро становится источником других АФК, дисмутируя до пероксида водорода. Протонированной формой О 2 (при слабокислых значениях рН) является гидропероксильный радикал (НОг). Он способен пересекать биологические мембраны и свободно диффундировать между компартментами клетки и реагировать с ненасыщенными жирными кислотами, некоторыми аминокислотами, такими как гистидин, метионин и триптофан (Ба1 е1 а1., 2000).

Пероксид водорода (Н202) образуется при последующем получении супероксидным анион-радикалом (или его протонированной формы -гидропероксильным радикалом) ещё одного электрона и представляет собой более стабильное соединение (Мерзляк, 1989). Это соединение не является свободным радикалом, но участвует в качестве окислителя средней силы во многих реакциях. В отличие от супероксида, Н2Ог способен диффундировать через мембраны. Пероксид может инактивировать некоторые ферменты,

окисляя их тиоловые группы. Так, Cu/Zn-супероксиддисмутаза и Fe-супероксиддисмутаза инактивируются Н202 (Charles, Halliwell, 1980). В присутствии металлов переменной валентности (в виде солей или в составе белков), пероксид водорода вступает в реакцию Фентона, приводящую к образованию наиболее опасного свободного радикала - гидроксильного радикала (ОН-). Fe2+ + Н202 = Fe3+ + ОН" + ОН'

Это очень сильный окислитель, не способный к внутриклеточной миграции и быстро вступающий в реакцию с биомолекулами.

В некоторых случаях супероксидный анион-радикал образуется в реакциях с озоном, который появляется как результат фотодиссоциации молекулярного кислорода под влиянием солнечной энергии: 03 + 02 -> 202 + 02'~

АФК возникают в различных компартментах клетки. Образование синглетного кислорода связано с хлоропластами. Поглощая квант света, пигмент - фотосенсибилизатор (хлорофилл) переходит в синглетное или триплетное возбужденное состояние. Молекулы пигмента, сталкиваясь с молекулой кислорода, передают ему энергию, что меняет спин электронов в его молекуле и приводит к образованию химически активного синглетного кислорода. Стимулятором образования синглетного кислорода может быть присутствие большого количества НАДФ-Н. Такая ситуация создаётся в случае замедленного окисления НАДФ-Н в цикле Кальвина по сравнению с его образованием. Основным источником АФК в хлоропластах является комплекс цитохромов b/f (Мерзляк, 1999; Asada, 1999; Чиркова, 2002; Foyer, Noctor, 2003). В митохондриях кислород является акцептором электронов, поступающих из электрон-транспортные цепы (ЭТЦ). На него передаются 4 электрона при помощи комплекса пиридиновых, флавиновых ферментов и цитохромоксидазной системы или альтернативной оксидазы.

1.3. Антиоксидантная система защиты растений

Считается, что в ходе жизнедеятельности организма образуются свободные радикалы - промежуточные продукты обмена, которые благодаря наличию неспаренного электрона обладают чрезвычайно высокой реакционной способностью и могут вносить «хаос и беспорядок» в тонко налаженную «биохимическую машину». Так, например, перекисное окисление липидов (ПОЛ) может привести к нарушению нормальной упаковки мембранного бислоя, что может, в свою очередь, вызвать повреждение мембраносвязанных белков (Richter et al.1987); ПОЛ может приводить к инактивации мембранных рецепторов и некоторых ферментов, принимающих непосредственное участие в поддержании ионного гомеостаза клетки (Болдырев, 2001).

В норме в системе оксиданты-антиоксиданты сохраняется равновесие. Нарушение этого баланса в пользу оксидантов приводит к развитию, так называемого, оксидативного стресса. Он выражается в избыточной продукции АФК и недостаточности антиоксидантной защиты. Неконтролируемая генерация АФК и их производные вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот, ферментов, биомембран и приводит к развитию патологических состояний (Suzuki et al., 1996; Rahman et al., 1996). Свободные радикалы и АФК в основном образуются при последовательном присоединении электронов к кислороду и в процессе свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Основной внутренний источник опасности для гомеостаза анаэробных организмов - это интермедиаты, участвующие в передаче кислорода, и продукты, образованные в результате метаболизма кислорода. Анаэробные организмы в процессе эволюции выработали хорошо отрегулированные механизмы для нейтрализации окислительных эффектов кислорода и его активных метаболитов.

Обычный и основной путь метаболизма молекулярного кислорода - это его полное восстановление до молекулы воды (Н20) путем принятия четырех

электронов. Однако, при восстановлении одним электроном могут образовываться свободные радикалы и перекись водорода (Н202), как показано ниже:

О 2 +*1 *0е - = О 2 (супероксидный радикал)

О 2 + Н20 = Н02.+0Н (гидропероксидный радикал) Н02+ *1*0е- + Н = Н202 (перекись водорода) Н202+*1*0е- = .ОН + ОН - (гидроксильный радикал) Реакционная способность является следствием нестабильной электронной конфигурации радикалов; они с готовностью принимают электроны от других молекул, и те, в свою очередь, становятся свободными радикалами, способными реагировать. Таким образом, происходит цепная реакция в органелле растений.

Главный биологический процесс, ведущий к образованию супероксидного радикала - это электронный транспорт, связанный с митохондриальными мембранами (МсСогё, РпсЬуюЬ, 1970). Обычно, восстановительное превращение кислорода в воду (Н20) с участием оксидаз требует последовательного переноса электронов, что сопровождается образованием свободных радикалов.

Вещества, обеспечивающие защиту от повреждающего действия свободных радикалов, обычно объединяют в, так называемую, антиоксидантную систему защиты. Эта система включает много веществ, которые обычно называются антиоксидантными ферментами, утилизаторами свободных радикалов, терминаторами цепи или восстановителями. К таким веществам относятся: супероксиддисмутаза (СОД), катал аз а (КАТ), а также различные виды пероксидаз, среди которых выделяют аскорбат-, глутатион-и гваяколпероксидазы. Гваяколпероксидаза связана с фенольным обменом в клетках растений и способствует функционированию таких процессов как например, лигнификация клеточной стенки, кроме того, гвояколпероксидазы связаны с ростовыми процессами. Аскорбат- и глутатион- пероксидазы

входят в состав антиоксидантных систем клеток и играют важную роль в разрушении Н202.

Антиоксидантная система, отвечающая за защиту клетки против окислительного стресса, также разнообразна, как и сами радикалы. Для обеспечения наиболее эффективной защиты эти ферменты-утилизаторы компартментализованы в отдельные субклеточные органеллы. Например, супероксиддисмутаза (СОД), КАТ и глутатионпероксидаза (GSH-PX) содержатся не только в цитоплазме, но и в других органеллах клетки (митохондриях, хлоропластах), где образуется большинство внутриклеточных свободных радикалов (Lawrence, Burke, 1976). Хотя был достигнут значительный прогресс в понимании функционирования индивидуальных ферментов и компонентов антиоксидантной защиты, сложная внутриклеточная сеть различных антиоксидантов затрудняет понимание в целом работы защитных систем (эл. источн.: medbiol.ru; Machlin, Bendich, 1987).

Davies (1988) была предложена схема сравнительной классификации антиоксидантных систем защиты.

Первичная система антиоксидантной защиты включает:

1. Антиоксиданты витамины - витамин Е, витамин А и витамин С, глутатион и мочевая кислота.

2. Утилизирующие ферменты, такие как супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы.

Вторичная система антиоксидантной защиты по ее классификации включает ферменты расщепления жиров - фосфолипазы, протеолитические ферменты - протеазы, пептидазы, ферменты репарации ДНК, эндонуклеазы, экзонуклеазы и лигазы. Эта схема наиболее гибкая и удобная; некоторые ее компоненты требуют детального описания и пояснения.

В литературе известно большое количество работ, посвященных проблеме окислительного стресса у животных объектов. Это связано с тем, что АФК в клетках животных участвуют в таких процессах как фагоцитоз,

бактерицидные эффекты, различные виды патогенеза при ишемической болезни сердца, лучевом поражении, катаракте, воспалительных процессах и многих других болезнях. Известно, что АФК, образующиеся в период реоксигенации, принимают участие в механизмах программируемой смерти клетки у животных, растений и микроорганизмов (Levine et al., 1996). У растений же этой проблеме до недавнего времени уделялось недостаточное внимание, хотя роль АФК в их мембранных структурах очень велика (Мерзляк, 1989).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Киёмова, Зарафо Суфижоновна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно засоление является одним из неблагоприятных факторов окружающей среды, которое приводит к снижению продуктивности культурных растений, особенно в регионах с засушливым и частично засушливым климатом. Таджикистан является интраконтинентальной страной с характерным засушливым климатом и частично, высоким содержанием солей в почве. Высокие концентрации солей приводят к ингибированию ростовых процессов, подавлению физиологических и биохимических функций клетки и даже к гибели растений.

Торможение ряда физиологических и биохимических процессов в условиях засоления сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК) и развитием окислительного стресса.

Постоянное присутствие АФК в клетках делает необходимым непрерывное функционирование систем антиоксидантной защиты растений.

В наших экспериментах солевой стресс по-разному оказывал влияние на активность антиоксидантных ферментов в разных органеллах клетки (хлоропласты, митохондрий и цитоплазмами). Особенно наблюдалось усиление активации СОД при высоких концентрациях ЫаС1 в среде культивирования растений. Но, у солеустойчивого генотипа при низких концентрациях ЫаС1 активация СОД несколько замедляется при одновременном уменьшении продуктов ПОЛ, а у чувствительного генотипа, наоборот, усиливается активация прооксидантов (О 2> Н202). Это, видимо, связанно с ограниченным пулом НАДФ в клетках чувствительных к стрессорным факторам генотипов картофеля. В наших опытах сверхэкспрессия НАДФ-оксидоредуктазы приводила к дефициту НАДФ у солечувствительного генотипа картофеля, о чем указывает соотношение НАДФ/НАДФН. Это дает основание высказывать мысль о том, что электроны направляются по другим путям, способствующим образованию АФК.

Такое явление происходит тогда, когда акцепторная сторона ФС1 полностью восстановлена при накоплении НАДФ-Н, что может вызывать переход Р700 в триплетное состояние, в таком состоянии хлорофилл может взаимодействовать с кислородом (Ог) с образованием токсичного синглетного кислорода, вызывающего повреждение мембран хлоропластов при стрессовых воздействиях (засоление, засухе и др), что особенно усиливается у чувствительных к стрессу растений, по сравнению с устойчивыми генотипами картофеля.

Судьба электронов, исходящих из ФС I при стрессе может быть следующей: электроны из ФС I акцептируются ферредоксином с помощью фермента Фд-НАДФ-оксидоредуктазы. При ограничении НАДФ освобожденные электроны, образуют АФК, а накопление НАДФ-Н может вызвать переход Р700 в триплетное состояние, который взаимодействуя с кислородом (О2) образовывает токсичный синглетный кислород, вызывающий повреждение клеточных мембран.

В «гашении» АФК особую роль играет пролин и другие низкомолекулярные соединения. Пролин обладает «антистрессорными» свойствами и активно синтезируется в клетках растений в ответ на действие различных стрессоров (засуха, засоление, тепло, холод и др.). Пролин обладает уникальными свойствами в растворенном виде, даже в высоких концентрациях не нарушать структуру белков и других макромолекул в клетках, поэтому пролин является уникальным природным осмопротектором. Количество пролина в растениях определяется балансом его синтеза и распада, поэтому увеличение его содержания в растениях или усиление его синтеза повышает стрессустойчивость растений. Возможно, у чувствительных генотипов преобладает распад пролина в результате активации пролиндегидрогеназы, а у стрессустойчивых генотипов, наоборот синтез преобладает над его распадом, что указывает на повышенную адаптационную устойчивость растений к стрессорным природным факторам без потери продуктивности.

Пластиды, как составные части окислительной системы клетки могут определять активность антиоксидантных ферментов. Нами было показано, что при воздействии солевого стресса содержание фотосинтетических пигментов у разнотолерантных генотипов достоверно отличалось.

Содержание хлорофилла снижалось в условиях солевого стресса у обоих генотипов, независимо от степени устойчивости к NaCl, но степень повреждения у устойчивого генотипа была меньше, чем у генотипа, не обладающего устойчивостью к солевому стрессу. При воздействии солевого стресса содержание хлорофилла а снижалось в меньшей степени, чем хлорофилла Ъ. Что касается содержания каротиноидов, то у устойчивого генотипа в условиях стресса оно было выше, чем у неустойчивого. Таким образом нами были подтверждены многочисленные данные об участии каротиноидов в «гашении» АФК.

Изучение активности СОД в разных органеллах клетки у разнотолерантных генотипов картофеля показало, что активность СОД в хлоропластах резко усиливалась у чувствительных растений по сравнению с устойчивыми. Активность СОД цитоплазмы была значительно ниже, по сравнению с активностью СОД в хлоропластах и митохондриях. Это говорит о том, что хлоропласты толерантных растений характеризовались меньшей степенью окисленности, чем хлоропласты чувствительных растений.

Одним из важных объяснений высокой активности СОД у толерантных к солевому стрессу генотипов по сравнению с чувствительными генотипами, может быть связанно с наличием пула фермента в клетке или с моментальной экспрессией генов в условиях стресса.

Действие циклогексимида -ингибитора трансляции на уровне 80S рибосом не одинаково оказывает влияние на активность СОД в хлоропластах и митохондриях. Наши исследование показали, что при длительном выдерживании растений с циклогексимидом у толерантного генотипа падение активности СОД наблюдается на позднем периоде блокады

трансляции, а у чувствительного генотипа на начальном этапе. Это указывает на существование предсинтезированных форм СОД у устойчивых генотипов.

Эти результаты наводят на мысль о том, что у толерантных растений существует определенное депо СОД, способствующее обезвреживанию АФК на срок воздействия стресса, а далее подключается активация генов этого фермента, локализованных в ядре. По-видимому, чувствительные растения имеют незначительный пул предсинтезрованных СОД, которые не в полной мере обеспечивают обезвреживание АФК, даже на первом этапе воздействия стресса, что является причиной преждевременного запуска цепи реакций перекисного окисления липидов.

выводы

1. Установлено, что при солевом стрессе происходит накопление активных форм кислорода, приводящее к увеличению содержания малонового диальдегида в зависимости от генотипа. Стрессорные воздействия существенно влияют на равновесие ПОЛ и СОД в хлоропластах, вызывая активацию ПОЛ и СОД в противоположном направлении.

2. Показано что, у солеустойчивого генотипа равновесие прооксиданты-антиоксиданты в хлоропластах картофеля смещается в сторону антиоксидантов, а у солечувствительного генотипа в сторону прооксидантов.

3. Установлено, что уровень активации ПОЛ связан с устойчивостью генотипа к солевому стрессу и засухе. Так как, наблюдалась прямая зависимость активации ПОЛ от концентрации хлористого натрия и полиэтиленгликоля (ПЭГ) in vitro. Активность СОД, участвующего в «гашении» АФК, препятствует активации ПОЛ в условиях стресса у солечувствительного генотипа в меньшей степени, чем у солеустойчивого.

4. Установлено, что при длительном выдерживании растений в среде, содержащей циклогексимид снижение активности СОД у устойчивого генотипа наблюдается на позднем периоде блокады трансляции синтеза белков на цитоплазматических рибосомах, а у чувствительного генотипа уже в первые часы воздействия, так как, солеустойчивый генотип имеет достаточное количество предсинтезированной формы СОД и происходит усиленный синтез этого фермента de novo.

5. Показано, что в условиях солевого стресса, содержание хлорофилла а снижалось в меньшей степени, чем хлорофилла Ь, независимо от генотипа. Содержание каротиноидов у устойчивого клон-гибрида было выше, чем у неустойчивого, что свидетельствует об участии каротиноидов в «гашение» АФК.

6. Показано, что адаптация к солевому стрессу на уровне целого растения осуществляется путём значительного накопления пролина и НАДФ, регулирующих активацию АФК и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в результате чего, образуется Н2О2 которые очевидно провоцируют активацию альтернативных путей «гашения» окислительного стресса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Киёмова, Зарафо Суфижоновна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алиев К. Биотехнология растений: клеточно-молекулярные основы. Из-во «Ирфон», Душанбе, 2012, 185 с.

2. Алиев К. Молекулярные механизмы биогенеза хлоропластов//докт. дисс., Минск, 1985, 339 с.

3. Бабаджанова М.А., Эсаналиева Ш.А., Алиев К.А. Влияние внешних факторов на рибулозобисфосфаткарбоксилазную активность свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина в листьях различных генотипов хлопчатника. - Материалы научной конференции. «Физиология растений и проблемы развития растениеводства в Таджикистане»: посвященной 60-летию образования Академии наук Республики Таджикистан. Тез. Докл. - Душанбе, 2011, с.31-33.

4. Бабаева Ж.А., Бутенко Р.Г., Строганов Б.П. Влияние засоления на питательной среды на рост изолированных тканей моркови //Физиология растений. 1968.-Т.15. - ВЫП.1. -С.93-109.

5. Бараненко В.В. Супероксиддисмутаза в клетках растений/ЛДитология. 2006. Т. 48. №6. С. 465-474.

6. Болдырев А.А., Юнева М.О., Сорокина Е.В., Крамаренко Г.Г., Федорова Т.Н., Коновалова Г.Г., Ланкин В.З. Антиоксидантные системы в тканях мышей с ускоренным темпом старения (SAM, Sciences Accelerated Мюе)//Биохимия, 2001. Т. 66. С. 1157-1163.

7. Вей Чи - Физиология растений, 2006, т. 53, с. 364-370.

8. Веселов А.П., Гормональная и антиоксидантная системы при ответе растения на тепловой шок//Автореф. дис. док-pa биол. наук. М.: ИФР. 2001.40 с.

9. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернявский Д.С. Стресс растения. 1993.

10. Власов Н.Ф., Зятчина Г.П. О сортовой специфичности изоферментов супероксиддисмутазы кормовых белков//Сельскохозяйственная биология. 2000. №5. С. 93-96.

11. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М.: Наука, 1982, 280 с.

12. Гордон JI.X. Функциональная характеристика адаптивного старения отсеченных корней пщеницы. // Физиол. И биох. Культ., раст. 1992. Т. 24. №2. С. 128-133.

13. Граскова H.A., Боровский Г.Б., Колесниченко A.B., Войников В.К. Пероксидаза как компонент сигнальной системы клеток картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Физиология растений. 2004. - Т. 51. - № 5. -С. 692-697.

14. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б. Селекция на осмоустойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений регенерантов// Физиол. раст., 1994. Т.41. №1. - С. 114-117.

15. Ермаков, И.П. Физиология растений: учебник для студ. вузов / И.П. Ермаков.- М.: «Академия», 2005. 640с.

16. Зауралов O.A., Лукаткин Ф.С. Последствие пониженных температур на дыхание теплолюбивых растений//Физиология растений. 1997. Т. 44. №5. С. 736-741.

17. Ипатова В.И. Адаптация водных растений к стрессовым факторам среды. - М.: Изд-во «Графикон-принт», 2005. - 224 е.;

18. Калашников Ю.Е., Балахнина Т.И., Закржевский Д.А. Действие почвенной гипоксии на активацию кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях и листьях ячменя//Физиол. раст. 41 (4). 1994. С. 583—588.

19. Кириллова Н.В. Изменение активности супероксиддисмутазы в каллусной культуре Rauwolfia serpentine Benth., выращенной в

стандартных условиях и при температурном шоке // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 1. С. 89-93.

20. Колупаев Ю.Е. активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции// Вестник Харьковского нацимолнального аграрного университета. Сер. Биология. 2007. - Вып. 3(12).-с. 6-26.

21. Кузнецов Вл. В. Физиология растений: Учеб. для вузов /Вл.В. Кузнецов, Г.А. Дмитриева: М.: Высш. шк., 2005. - 736 е.: ил.

22. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений//Изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 2006. 742 с.

23. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция //Физиол. Растений - 1999, т.46, вып. 2 с. 305-320.

24. Кулаева О. Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу.//Статьи Соровского образовательного журнала. Биология, 1997

25. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и окислительные модификации макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. 1999. №1. С.56-63.

26. Курганова JI.H., Веселов А.П., Гончарова Т.А., Синицына Ю.В. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система защиты хлоропластов гороха при тепловом шоке//Физиол. раст. 44 (5) 1997. С. 725—730.

27. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. 343 с.

28. Ланкин В.З., Тихадзе А.К., Беленков Ю.Н. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et соп1ха//Кардиология, 2004. №2. С.72-81.

29. Ланкин В.З., Тихадзе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы//Кардиология. 2000. Том 40. №7. С.48-61.

80

30. Панкин В.З., Тихадзе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях (Пособие для врачей). Издание 2, исправленное и дополненное//М: РКНПК МЗ РФ 2001. 78 с.

31. Ларина С.Н. Клеточные линии и растения-регенеранты как модель для изучения солеустойчивости. Автор, канд. дис., 1995, 24с.

32. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. - Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1986.- 145 с.

33. Мелехов Е.И. Принцип регуляции скорости процесса повреждения клетки и реакция защитного торможения метаболизма (РЗТМ). Журнал общей биол. - 1985, № 46, 174-189 е.;

34. Мерзляк М. Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительных клеток//Итоги науки и техники. Сер Физиология растений. - М: ВИНИТИ, 1989, т.6, 168 с.

35. Мутлу Ф. Влияние засоления на содержание полиаминов и некоторых других соединений в различающихся по солеустойчивости вастениях подсолнечника. / Ф. Мутлу, С. Бозкук // Физиология растений.-2005.-Т.52.-№1.-С.36-42

36. Нецветаев В.П. Теоретические основы использования белкового полиморфизма для оптимизации селекционного процесса: Автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук: /Санкт-Петербург, 2000. - 40 с.

37. Осадчая O.E. Антиоксиданты и их роль в питании человека при неблагоприятных экологических условиях. - М.: ВНИИТ-ЭИагропром, 1998. 44 с.

38. Парамонова Н.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Ультраструктурные особенности ферритина в листьях Mesembryanthemum crystallinum при стрессе // Физиология растений. 2007. Т.54.С.275-289

39. Пахомова В.М., Чернов И.А. Некоторые особенности индуктивной фазы неспецифического адаптационного синдрома растений.//Докл. РАН. Сер. биол. №6: 1996. с. 705-715.

40. Полевой В.В. Физиология растений. - М.: Высшая школа, 1989. - 464 с.

41. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. - М.: КДУ, 2007. - 140 с.

42. Сыркин A.JL, Добровольский A.B. Антиишемические препараты метаболического действия//Соп8Шшп Medicum. 2002. Том 4. №11. С.572-575.

43. Таланова В.В. Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Автореф. ... дисс. докт. биол. наук, Петрозаводск, 2009. 45 с.

44. Тарчевский, И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. Физиол. растений - 2000, № 47, с. 321-331.

45. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Топчиева Л.В. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука, 2006. 143 с.

46. Трач В.В. Супероксиддисмутаза как показатель состояния и устойчивости растений при карбонатном хлорозе: Автореф. дис...канд. биол. наук. - Киев: ИФР, 1987. - 23 с.

47. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. Л., 1977., 216 с.

48. Франко О. Л. Осмопротекторы: ответ растений на осмотический стресс /О. Л. Франко, Ф. Р. Мело //Физиология растений. -2000. т.47. №1. С. 152-159.

49. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода//свободные радикалы в биологии. М: Мир. 1979. Т. 1. С. 272314

50. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений//СПб: Изд-во СпбГУ. 2002. 240 с.

51. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гилем, 2001. - 160 с.

52. Шевякова Н.И., Бакулина У.А., Кузнецов Вл.В. - Физиология растений, 2009, т.56, с.736-742.

53. Электронный источник: http://medbiol.ru/medbiol/antioks/0000322e.htm

54. Яаска В. Изоферменты СОД в проростках фасолевых (фасоли и вигны)// Изв. Ан. ЭССР. Биология. - 1984,- Т.ЗЗ.- №1.- С. 42-48.

55. Alonso R., Elvira S., Castillo F.J., Gimeno B.S. (2001) Interactive effects of ozone and drought stress on pigments and activities of antioxidative enzymes in Pinus halepensis. Plant Cell Environ., 24, 905-916.

56. Alscher R.G., Erturk N., Heath L.S. Role of Superoxide Dismutase in Controlling Oxidative Stress in Plants//! Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 13311342.

57. Aruoma О. I. Free radicals, oxidants and antioxidants: trend towards the year 2000 and beyond//In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. - Aruoma O. and Halliwell B. (Eds.). - Oica International, Saint Lucia, London. 1998. P. 1-28.

58. Asada K. Radical production and scavenging in the chloroplasts. In: Photosynthesis and the environment. Netherlands: Kluwer Acad. Publ., Dordrecht. 1966. P. 123-150.

59. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: Scavenging of active oxygen and dissipation excess photons//Amnu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 601-679.

60. Azevedo Neto A.D., Prisco J.T., Eneas-Filho J., Braga de Abreu C.E., Gomes-Filho E. Effect of Salt Stress on Antioxidative Enzymes and Lipid Peroxidation in Laves and Roots of Salt Tolerant and Salt Sensitive Maize Genotypes//Environ. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 87-94.

61. Babithaa M.P., Bhath S.G., Prakasha H.S., Shettya H.S. Different induction of superoxide dismutase in downy mildew-resistant and -susceptible genotypes of pearl millet. Plant Pat-hol. 2002. P. 480—486.

62. Babithaa M.P., Bhath S.G., Prakasha H.S., Shettya H.S. Different induction of superoxide dismutase in downy mildew-resistant and -susceptible genotypes of pearl millet. Plant Pat-hol. 2002. P. 480—486.

63. Bajji M., Kinet J.M., Bouharmont J. Characterization of progenies issued from drought tolerant plants of durum wheat selected in vitro. Proc. Intern. Congr. " Integrated study on drought tolerance of higher plants". Montpellier. France. 1995.VII2.

64. Bannister W. N. From haemocuprein to copper- zinc superoxide dismutase: a history on the fiftieth anniversary of thediscovery of haemocuprein and twentieth anniversary of the discovery of superoxide dismutase // Free Rad. Res. Comms. 1988 . -V.5. - №1. - p. 35-42.

65. Barrs H.D., Weatherley P.E. A Re-Examination of the Retentive Turgidity Technique for Estimating water deficit in leaves//Aust. j. Biol. Sci. 1962. v. 15, p. 413-428.

66. Bates L.E., Waldren R.P., Teare J.D. determination of free proline for water stress studies//Plant Soil, 1973, v.39, p. 205-207.

67. Beauchamp C.O., Fridovich I. Isozymes of superoxide dismutase from wheat germ. Biochim. biophys. acta. 1973. P. 50-64.

68. Belowaly N., Bouharmont J. NaCl tolerant plants of Poncirus trifoliata regenerated from tolerant cell lines 11 Theor. Appl. Enet. 1992. V. 83. P. 509514.

69. Biemelt S., Keetman U., Aibrecht G. Re-aeration following hypoxia or anoxia leads to activation of the antioxidative defense system in roots of wheat seedlings//Plant. Physiol. 1998. V. 116. P.651-658.

70. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, Oxidative Damage and Oxygen Deprivation Stress: A Review//Ann. Bot. 2003. V. 91. P. 179194.

71. Bor M., Özdemir F., Türkan I. The Effect of Salt Stress on Lipid Peroxidation and Antioxidants in Leaves of Sugar Beet Beta vulgaris L. and Wild Beet Beta maritime L.//Plant Sei. 2003. V. 164. P. 77-84.

72. Bouchereau A., Aziz A., Larher F., Martin-Tanguy J. Polyamines and Environmental Challenges: Recent Development//Plant Sei. 1999. V. 140. P. 103-125.

73. Bouvier F., Backhaus R.A., Camara B. Induction and Control of Choroplast-Speeific Carotenoid Genes by Oxidative Stress // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. -P. 30651-30659

74. Capaldi D. J., Taylor K.E. A new peroxides color reaction: Oxidative coupling of 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazones (MBTH) with its formaldehyde azine application to glucose and chlorine oxidases// anal. Biochem. 1983.v. 129. P. 329-336.

75. Capuldi D.J., Taylor K.E. Anal. Biochem, 1983 v. 129., pp. 329-336.

76. Cardinaels C., Put C., Van Assche F., Clijster H. The superoxide dismutase as Biochemical Indicator Discriminating between Zinc and Cadmium Toxicity// Arch. Int. Physiol. Biochem. 1984 -V.92. - P. 27-28.

77. Casano L. M., Gomes L. D., Lascano H. R., Gonzales C. A., Trippi V. S. Inactivation and degradation of CuZn-SOD by active oxygen species in wheat chloroplasts exposed to photooxidative stress//Plant Cell Physiol. 38/ 1997. P. 433-440.

78. Charles S.A., Halliwell B. Effect of hydrogen peroxide on spinach (Spinacia oleracea) Chloroplast fructose bisphosphatase. // Biochem J. -1980. -V. 189. -P.373-376.

79. Chiries G. and Rossignel L. Environmental effect on potato plants in vzW/lournal of plant Physiology. 1992. №139. P. 708-713.

80. Dajic Z. Salt stress // Physiology and Molecular Biology of stress Tolerance in Plant / Eds. Madhava Rao K.Y., Radhavendza A.S., Janazdhan Reddy K. Dozdzecht: springez-vezlag, 2006, p.41-10.

81. Dat J., Vandenabeele S., Vranova E., Van Montagu M., Inze D., Van Breusegem F. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses // Cellular and Molecular Life Sciences. 2000. - V. 57. - P. 779795.

82. Davis H.V. Sugar Metabolism in stolon Tibs of potato during Earlu Tuberization//z. Pflanzen physiol. 1984. Bd.113. S.377-381.

83. Del Rio L.A., Sandalio L.M., Altomare D., Zilinskas B. Mitochondria and peroxisomal manganese superoxide dismutase: different expression during leaf senescence. J. Exp. Bot. 2003. P. 923-933.

84. Dionisio-Sese M.L., Tobita S. Antioxidant Responses of Rice Seedlings to Salinity Stress//Plant Sci. 1998. V. 135. P. 1-9.

85. Dixon R.A., Palva NL. - Striss-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell. 1996, v. 7, p.p. 1085-1097.

86. Doke N ., Miura Y ., Lesndro M.S., Kawakita K. Causes of Photooxidative Stress and Amelioration of Defense Systems in Plants/ Ed. C.N. Foyer., P. M. Mullineaux Boca Radon: CRC Press. 1994. - P. 177-197.

87. Doke N. Involvement of superoxide generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible Rose of phytophthoza intestines and Hyphul wall components // Plant physiol. Pathol. 1983. V.23, pp. 345-357.

88. Edreva A., Yordanov I., Kardjieva R., Gesheva E. Heat shock responses of bean plants: involvement of free radicals. Anti-oxidants and free radical/active oxygen scavenging systems//Biol. Plant. 1998. P. 185—191.

89. Finkel T., Holbrook N.J. Oxidants, oxidative stress and the biology of aging // Nature. 2000. - V. 408. - P. 239-247.

90. Foyer C.H., Noctor G. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signaling//New physiol. 2000.V. 146. P. 359-388;

91. Foyer C.H., Noctor G. Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria // Physiol. Plant. 2003.V. 119, P. 355-364.

92. Freytag A.H., Wrather J.A., Erichsen A.W. Salt tolerant sugarbeet progeny from tissue cultures challenged with multiple salts // Plant Cell Reports. 1990. V. 8. № 11. P. 647-650.

93. Fridovich I. Superoxide dismutases// Advances in Enzymology. 1986. - V.58. -. - P. 61-97.

94. Getzoff E. D., Tainer J. A., Weiner P. K., Kolman P. A., Richardson D. S. Electrostatic recognition between superoxide and copper zinc superoxide dismutase // Nature. 1983 - V.306. - P. 287-290.

95. Giannopolitis C.N., Ries S.K. Superoxide Dismutase. II. Purification and quantitative relationship with water-soluble protein in seedlings//Plant Physiol. 1997. V. 59. №2. P. 315-318.

96. Givan C.V. Metabolic detoxification of ammonia in tissue of higher Plants//Phytochemistry. 1979. V. 18. P. 375-382.

97. Gomez J., Jimenez A., Olmos E., Sevilla F. Location and effects of long-term NaCl stress on superoxide dismutase and ascorbate peroxidase isoenzymes of pea (Pisum sativum, cv. Puget) chloroplasts//J. Exp. Bot. 2003/4. P. 119-130.

98. Hallivell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. -Oxford: Claredon Press, 1986. - 346 p.

99. Halliwell B. Lignin Synthesis: The Generation of Hydrogen Peroxide and Superoxide by Horseradish Peroxidase and It's Stimulation by Manganese (II) and Phenols//Planta. 1978. V. 140. P. 81-88.

100. Halliwell, B., Gutteridge, J. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transitions metals and disease. - 1984, Biochem. J. 219,1 -21.

101. Heath R.L., Pusker L. Photoperoxidation in isolated Chloroplast 1. Kinetic and Stoichiometry of fatty acid peroxidation//Arch. Biochem. Bioplys. 1968. V. 25. P. 189-198.

102. Hernandez J.A., Campillo A., Jimenes A, Alarcon J.J., Sevilla F. Response of antioxidant systems and leaf water relations to NaCi stress in pea//New Phytologist., 1999. P. 241-251.

103. Hodges D. M., Delong J.M, Forney C.F., Prange R.K. Improving The Thiobarbituric Acid-Reactive- substances Assay for estimating Lipid peroxidation in plant tissues Containing anthocyanin and other interfering compound// Planta, 1999. V. 207. P. 604-611

104. Hurst A., Grams T., Ratajczak R. Effects of salinity, high irradiance, ozone, and ethylene on mode ofphotosynthesis, oxidati-ve stress and oxidative damage in the C3/CAM intermediate plant Mesembryanthemum crystallinum L. Plant//Cell Envir., 2002. P. 187-197.

105. Hurst A., Grams T., Ratajczak R. Effects of salinity, high irradiance, ozone, and ethylene on mode ofphotosynthesis, oxidati-ve stress and oxidative damage in the C3/CAM intermediate plant Mesembryanthemum crystallinum L. Plant//Cell Envir, 2002. P. 187-197.

106. Ishikawa Y. Purfication and immunological characterization of superoxide dismutase of the onion maggot, Delia antiqua// Archives of Insect Biochem. and Physiol. 1995,- V.28.- P. 387-396.

107. Iturbe-Ormaetxe I, Escuredo P, Arrese-Igor C, Becana M. Oxidative damage in pea plants exposed to water deficit or paraquat//Plant Physiol. 1998. P. 173-181.

108. Kamminska-Rozek E, Pukacki P. Effect of water deficit on oxidative stress and degradation of cell membranes in needles of Norway spruce (Picea abies)//Acta physiol. plant. 2004. P. 431-442.

109. Kang H.M, Saltveit M. Activity of enzymatic antioxi-dant defense systems in chilled and heat shocked cucumber seedling radicles//Physiol. Plant. 2001. P. 548-556.

110. Kato T, Bezger S.J, Carter J.A, Lowry O.H, - Anal. Biochem, 1973, v. 53, p. 86-97

111. Kaur-Sawhney R, Flores H. E, Galston A.W. Polyamine Oxidase in Oat Leaves: A Cell Wall-Localized Enzyme//Plant Physiol. 1981. V. 68. P. 494498.

112. Keele B.B, McCord J.M, Fridovich I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme//J. Biol. Chem. 1970. P. 6176-6181.

113. Kim S.M, Han D, Park M.N, Rhee J.S. Screening for superoxide dismutase - like compounds and it's activators in extracts of fruits and vegetables // Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 1994. V. 58. №12. P. 2263-2265.

114. Koca H, Özdemir F, Türkan I. Effect of Salt Stress on Lipid Peroxidase Activities of Lycopersicon esculentum and L. pennellii//Biol. Plant. 2006. V. 50. P. 745-748.

115. Kuk Y.I, Shin J.S, Burgos N, Hwang T„ Han O, Cho B. H, Jung S, Guh J. O. Antioxidative enzymes offer protection from chilling damage in rice plants// Crop Sei. 2003. P. 2109-2117.

116. Kuzniak E, Sklodowska M. The effect of Botrytis cine-rea infection on the antioxidant profile of mitochondria from tomato leave// J. Exp. Bot. 2004. P. 605-612.

117. Lawrence R.A, Burke R.F. Glutathione peroxidase activity in selenium deficient rat liver//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. P. 952-958.

118. Lee D. H, Kim Y. S, Lee C. B. The inductive responses of the antioxidant enzymes by salt stress in the rice (Oryza sativa L.)//J. Plant Physiol. 2001. P. 737-745.

119. Levine A, Penned R. I, Alvarez M. E, Palmer R, Lamb C. Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response//II Curr. Biol. 1996. V. 6. P.427-437.

120. Machlin L, Bendich A. Free radical tissue damage: protective role of antioxidant nutrients//FASEB J.l. 1987. P. 441-445.

89

121. Mann T., Keilin D. Hemocuprein and hepatocuprein copper-protein compounds of blood and liver in mammals. Proc. R. Soc. Lond. B. 1938. P. 303-315.

122. McCord J.M. & Fridovich I. The utility of superoxide dismutase in studying free radical reactions. II. The mechanism of the mediation of cytochrome c reduction by a variety of electron carriers//.!. Biol. Chem. 245. 1970. P. 13741377.

123. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein)//J. Biol. Chem. 1969. P. 6056-6063.

124. Misra H.P., Fridovich I. The generation of superoxide radical during the autooxidation of hemoglobin. // J. Biol. Chem. -1972. -V.247. -P.69609 6962.

125. Mitteler R. Oxidative Stress, Antioxidants, and Stress Tolerance//Trends Sci. 2002. V. 7. P. 405-409.

126. Mittova V., Tal M., Volokita M., Guy M. Up-regulation of the leaf motochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt-induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii. Plant//Cell Envir. 2003. P. 845-856.

127. Moller I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species//Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. P. 561-591.

128. Monk L. S., Fagerstedt K. V., Crawford R. M. M. Superoxide dismutase as an anaerobic polypeptide. A key factor in recovery from oxygen deprivation in Iris pseudacorus//II Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1016.

129. Moran J. F., James E. K., Rubio M. C., Robert G. S., Klucas V., Becana M. Functional characterization and expression of a cytosolic iron-superoxide dismutase from cowpea root nodules//Plant Physiol. 2003. P. 773-782.

130. Murashige T., Skoog F. A revised medium bor rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures//Physiol. Plant, 1962. VIS, P.473-497.

131. Narayanan K.K, Kangasamy S.R. Inheritance of salt tolerance in progenies of tissue culture selected variants of rice // Curr. Sci. 1989. №21. P. 1204-1205.

132. Navari-Izzo F, Quartacci M.F, Pinzino C, Vecchia F.D, Sgherri C.L. Thylakoid-bound and stromal antioxidative enzymes in wheat treated with excess copper//Physiol. Plant. 1998. P.630-638.

133.Necchi A, Pogna N.E, Mapelli S. Early and Late Heat Shock Proteins in Wheats and Other Cereal Species//Plant Physiol. 1987. V. 84. P. 1378-1384.

134. Neil S, Desikan R, Yancock J. Hydrogen Peroxide Signaling//Curr. Opin. Plant Biol. 2002. V. 5. P. 388-395.

135. Noctor G, Foyer C.H. Asorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. - V. 49. - P. 249279.

136. Nyman P.O. A modified method for the purification of erytrocuprein// Buochim. biophys. acta. 1960. P. 387-389.

137. Ogawa K, Kanematsu S, Asada K. Generation of superoxide anion and localuzation of Cu/Zn-superoxide dismutase in vascular tissue of spinach hypocotyls: their association with lignifications//Plant Cell Physiol. 1997. P. 1118-1126.

138. Palma J.M, Huertas E.L, Corpas F.J, Sandalio L.M, Gomez M, Del Rio L.A. Peroxisomal manganese superoxide dismutase: purification and properties of the isozyme from pea leaves//Physiol. Plant. 1998. P. 720-726.

139. Parker M.W, Schinina M.E, Bossa F, Bannister J.V. Chemical aspects of the structure, function and evolution of superoxide dismutases// Inorg. Chim. Acta. 1984.- V.91.- P.307-317.

140. Prasad T.K, Anderson M.D, Martin B.A, Stewart C.R. Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide // Plant Cell, 1994. V.6. - P. 65-74.

141. Rahman I, Morrison D, Donaldson K, MacNee W. Systemic oxidative stress in asthma, COPD, and smokers. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154 (4 Pt 1): 1055-60.

142. Raymond M.J. Boggess S.F., Sewart C.R. Effect of water on proline syntusis from radioactive precursors // Plant physiol. 1976. V. 58. P. 398-401.

143. Raymond M.J., Smirnoff N. Proline metabolism in maize seedling at low water potential// Ann. Bot. 2002.V.89. P.813-823;

144. Richter C. Biophysical consequence of lipid peroxidation in membranes//Chem. Phys. Lipids. , 1987, V. 44, P. 175-189.

145. Samato A., Okumura T., Kaminuka H., Sumi K., Tanaba K. Structure and differential response to abscisic acid of two promoters for cytosolic copper/zing-superoxiddismutase genes, SOD Ccl and SOD Cc2, in rice protoplasts/ Febs Lett. 1995. V. 258. P. 62-66.

146. Scandalios J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases /J. G. Scandalios // Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 7-12.

147. Suzuki YJ, Forman HJ, Sevanian A. Free Radical Biol Med 1996; 22 (1/2): 269-85.

148. Van Toai T., Bolles C. S. Post-anoxic injury in soybean (Glycine max) seedlings//II Plant Physiol. 1991. V. 97. P.588-592.

149. Wettstein D. - Experimental cell research, 1957, v. 12, N3, p.427.

150. Yost F., Fridovich I. An iron-containing superoxide dismutase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1973. P. 4905-4908.

151.Yoyce G.F., Jhon L.H. Responses of superoxide dismutase and glutation reductase activities in cotton leaf tissue exposed to an atmosphere Enriched in oxygen// Plant Physiol.- 1980. - V.66. - №5. - P. 482-487.