Биокаталитическая технология этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот из вторичного рыбного сырья тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Пушкарев Михаил Алексеевич

• Пушкарев Михаил Алексеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Пушкарев Михаил Алексеевич

Введение

1 Аналитический обзор источников по теме работы

1.1 Отходы рыбопереработки

1.2 Значимость полиненасыщенных жирных кислот для здоровья человека

1.3 Методы концентрирования и очистки полиненасыщенных жирных кислот

1.4 Общие характеристики липаз

1.5 Методы очистки и выделения липаз

1.6 Выводы по разделу

2 Объекты, материалы и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.2 Выделение жиров из отходов рыбопереработки

2.3 Анализ физико-химических показателей липидного сырья

2.4 Тонкослойная хроматография жиров

2.5 Газохроматографический анализ

2.6 Ферментативный этанолиз липидного сырья

2.7 Дробное комплексообразование с мочевиной

2.8 Оценка влияние скорости охлаждения и соотношения компонентов

2.9 Изоляция термофильных продуцентов из компоста твердых коммунальных отходов

2.10 Родаминовый метод определения липолитической активности

2.11 Определение липолитической активности по образованию зон кальциевых солей

2.12 Идентификация культуры продуцентов липаз с помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии

2.13 Определение наиболее активного продуцента липаз

2.14 Определение концентрации белка методом Лоури

2.15 Определение липолитичекой активность по гидролизу 4-нитрофенилпальмитата

2.16 Методика скрининга продуцентов липаз

2.17 Определение липолитичекой активность по гидролизу Твин-80

2.18 Оптимизация состава питательных сред

2.19 Изучение динамики накопления липаз при глубинном культивировании

2.20 Метод осаждения фермента сульфатом аммония

2.21 Ионообменная хроматография белков

2.22 Эксклюзионная хроматография белков

2.23 Иммобилизация фермента на частицах хитозана

2.24 Методы определения кинетических констант выделенной липазы

2.25 Определение температурного оптимума липазы

2.26 Статистические методы обработки результатов

3 Технология получения концентрата этиловых эфиров ПНЖК с использованием коммерческих препаратов липаз

3.1 Выделение жира из отходов рыбопереработки

3.2 Характеристика липидного сырья

3.3 Выбор коммерческого препарата липаз для получения этиловых эфиров жирных кислот

3.4 Подбор температуры ферментативной процесса получения этиловых эфиров жирных кислот

3.5 Подбор соотношения компонентов реакции

3.6 Подбор количества фермента для реакции трансэтерификации

3.7 Определение влияния инертной атмосферы на процесс трансэтерификации

3.8 Распределение жирных кислот между твердой и жидкой фазами при дробном комплексообразовании с мочевиной

3.9 Влияние скорости охлаждения и соотношения компонентов на комплексообразование мочевиной

4 Получение препарата липаз

4.1 Выделение продуцентов липаз из ТКО

4.2 Скрининг коллекционных культур продуцентов липаз

4.3 Подбор состава питательных сред для продуцентов липаз

4.4 Динамика накопления липаз

4.5 Выделение липаз

4.6 Иммобилизация липаз

4.7 Характеристика полученных препаратов липаз

Заключение

Список литературы

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

Приложение Д

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биокаталитическая технология этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот из вторичного рыбного сырья»

Актуальность темы исследования

Добыча и переработка рыбного сырья является источником большого количества отходов. При разделке и переработке рыбы может образовываться до 50 % (от массы рыбы) отходов, богатых полноценным белком, незаменимыми полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), полным набором макро- и микроэлементов. Однако данные вторичные ресурсы не всегда находят применения в дальнейшей переработке, по причине того, что используемые технологии требуют комплексного подхода и, соответственно, значительных дополнительных инвестиций, а получаемые продукты имеют низкую рентабельность и не обладают высоким качеством. Так, например, наиболее распространенный способ утилизации отходов переработки рыбы в рыбокостную муку характеризуется высокой энергоемкостью, большим количеством загрязненных сточных вод, получаемые продукты - технический рыбий жир и рыбокостная мука, обладают низким качеством. Кроме того, рыбокостная мука, реализующаяся в качестве кормовой добавки, все больше вытесняется дешевыми микробными и растительными аналогами.

Важнейшими задачами для предприятий рыбной отрасли является эффективное использование всех добываемых биоресурсов, сокращение энерго- и ресурсоемкости процессов, применение малоотходных и безотходных технологий. В связи с этим актуальным является поиск новых подходов и совершенствование классических методов переработки рыбных отходов, особенно липидсодержащих, так как липиды морских гидробионтов являются основным источником незаменимых ПНЖК, в частности омега-3, имеющие большое физиологическое значение для человека.

Степень разработанности темы.

Существенный вклад в развитие технологий переработки вторичных ресурсов рыбной отрасли, в том числе в вопросах извлечения и переработки липидов из отходов добычи и обработки рыбы, и получения продуктов

медицинского, пищевого и технического назначения, внесли такие отечественные и зарубежные ученые, как Албулов А.И., Андреев М.П., Артемова А.Г., Боева Н. П., Бредихина О. В., Дацун В.М., Дубровин С. Ю., Землякова Е.С., Ишевский А.Л., Куприна Е.Э., Лебская Т. К., Мукатова М. Д., Новиков В.Ю., Петров Б. Ф., Подкорытова А.В., Ржавская Ф. М., Эпштейн Л.М., Ярочкин А.П., Haraldsson G.G., Linder M., Ramakrishnan V.V., See S.F., Wasswa J. и др. Тем не менее, эти технологии разработаны главным образом на базе классической химической технологии, которая в отличии от биокатализа, является источником опасных отходов и не позволяет в желаемой степени обеспечивать сохранность биологически активных компонентов. Это обуславливает необходимость проведения данной работы.

Целью работы является разработка биокаталитической технологии получения концентратов этиловых эфиров полиненасыщенных жирных из липидов вторичного рыбного сырья.

Задачи:

1 Характеристика липидов вторичного рыбного сырья.

2 Выбор биокатализатора и подбор условий получения этиловых эфиров жирных кислот из жиров вторичного рыбного сырья.

3 Изучение процесса фракционирования этиловых эфиров жирных кислот различной степени ненасыщенности комплексообразованием с мочевиной.

4 Скрининг микроорганизмов продуцентов липаз среди коллекционных культур и выделение термофильных культур продуцентов липаз из техногенных экологических ниш (компост ТКО).

5 Исследование влияния компонентов питательной среды на продукцию липаз и подбор состава питательной среды для культивирования продуцентов липаз.

6 Получение иммобилизованного препарата липазы.

7 Разработка лабораторных технологических процессов получения и иммобилизации липаз, биокаталитической трансэтерификации рыбных жиров и выделения фракции полиненасыщенных жирных кислот.

Научная новизна.

Изучен процесс ферментативной трансэтерификации рыбных жиров с этанолом с использованием коммерческого ферментного препарата Novozym 435. Получены зависимости выхода этиловых эфиров жирных кислот от основных условий (температура, соотношение спирт:масло, количество фермента) проведения процесса, подобраны условия реакции. Установлены зависимости распределения жирных кислот различной степени ненасыщенности по фракциям при дробном комплексообразовании с мочевиной. Проведен двухэтапный скрининг продуцентов липаз среди музейных культур кафедры ТМС СПбГТИ(ТУ), выявлено 32 культуры продуцента внеклеточных липаз. Из образцов компоста ТКО изолированы и идентифицированы 15 штаммов термофильных продуцентов внеклеточных липаз. Из наиболее активного продуцента липазы - Bacillus licheniformis, получена и охарактеризована внеклеточная термостабильная липаза, получена ее иммобилизованная на хитозане форма. Изучена зависимость продукции липаз культурами Rhodococcus equi, Bacillus thuringiensis и Bacillus licheniformis от концентрации ключевых компонентов питательной среды. Определена продолжительность культивирования B. licheniformis для максимальной продукции липазы.

Теоретическая и практическая значимость работы

Подобранные условия ферментативной переработки липидного сырья из отходов рыбопереработки позволяют получать этиловые эфиры жирных кислот с высоким (97%) выходом. Возможность осуществлять трансэтерификацию при температурах 25 °С позволяет проводить процесс без использования искусственного обогрева. Разработан лабораторный регламент ферментативного получения этиловых эфиров жирных кислот из рыбьего жира. Полученные диаграммы распределения этиловых эфиров жирных

кислот по фракциям при дробном комплексообразовании являются основой для технологических расчетов. Подобраны условия разделения смеси этиловых эфиров жирных кислот рыбного происхождения на концентрат ПНЖК и смесь этиловых эфиров насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот (биодизель). Разработан лабораторный регламент получения концентрата ПНЖК и биодизеля из смеси этиловых эфиров жирных кислот рыбного происхождения. На основе коллекционных и вновь выделенных культур создан музей продуцентов липаз с проверенной активностью, которые могут найти применение в производстве липаз для пищевой промышленности. Отработана технология получения, очистки и иммобилизации липазы В. 11скеп1/отт18. Разработан лабораторный регламент производства иммобилизованного препарата липазы В. Нскет/огт1$.

Положения, выносимые на защиту

1 Биокаталитическая технология получения концентратов этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот из липидов вторичного рыбного сырья, обоснование рациональных параметров процессов переработки.

2 Скрининг коллекционных культур микроорганизмов и выделенных из компоста ТКО продуцентов липаз.

3 Математическая модель влияния компонентов питательной среды на продукцию липаз при глубинном культивировании Як.едш, В. 1Ьиг[щ1ет18 и В. Нскет/огт15.

4 Регламент получения иммобилизованной на хитозане липазы В. 11скет/огт15.

Степень достоверности результатов. Достоверность научных положений подтверждается полнотой теоретических и практических исследований, их положительной оценкой на научных конгрессах и конференциях, научными публикациями и актами о внедрении, использованием статистических методов, результатами практической проверки.

Апробация работы. Результаты работы доложены на следующих конференциях и конгрессах: VI Moscow International Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Москва, Россия, 21-25 марта, 2011), Научно-технической конференции молодых ученых «Неделя науки -2011» (СПб, Россия, 30 марта - 1 апреля, 2011), International Conference «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine» (СПб, Россия, 21-24 июня, 2011), Научно-технической конференции молодых ученых «Неделя науки - 2012» (СПб, Россия, 28 - 30 марта, 2012), Научной конференции, посвящённой 185-й годовщине образования Санкт-Петербургского государственного технологического института (СПб, Россия, 27 ноября, 2013), 5й международный форум «Продовольственная безопасность» (СПб, 27 ноября - 2 декабря 2013), IV научно-технической конференции молодых учёных «Неделя науки-2014» (СПб, Россия, 31марта -1 апреля, 2014), Научно-практической конференции "Биотехнология: реальность и перспективы" (Саратов, Россия, 2-3 декабря, 2014), Научной конференции, посвященной 186-й годовщине образования СПбГТИ(ТУ) (СПб, Россия, 2-3 декабря 2014), 1st and 3rd North and East European Congress on Food, (СПб, 22-24 апреля 2012, Брашов, Румыния, 20-23 мая, 2015), IX международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 20-22 февраля, 2017) 1st International Congress Food Quality & Safety, Health & Nutrition / Nutricon 2017 (Скопье, Македония, 5-7 Октября 2017).

Связь с проектами. Полученные результаты были достигнуты в рамках НИР «Разработка технологии ферментативной переработки липидного сырья морских гидробионтов в концентрат омега-3 полиненасыщенных жирных кислот и биодизель», заказчик - ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере», №3574ГУ1/2014, №9755ГУ2/2015.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рецензируемых ВАК, и 1 статья в изданиях, входящих в базы данных Scopus.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы и пяти приложений. Основная часть работы изложена на 139 страницах машинописного текста, включает 32 рисунка и 26 таблиц. Библиографический список включает 328 наименований.

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1.1 Отходы рыбопереработки

О масштабах проблемы. Причины отходов. Текущее состояние

Сегодня рыба и рыбопродукция заняли в мировой торговле важнейшее место. В 2016 году доля произведенной в мире рыбы (пищевой и непищевой), в разных формах попавшей на международные товарные рынки, составила 35% [1].

Рыба является важным источником белка и основных микроэлементов. В 2009 году на долю рыбы приходилось 16,6 % мирового потребления животного белка и 6,5 % всего белка, доступного в мире. Доступность такого ценного ресурса возможна благодаря рыболовству и аквакультуре. За последние 50 лет наблюдается устойчивый рост производства рыбы, средний темп роста составляет 3,2 % в год, что выше, чем темпы роста населения мира (1,7%). Таким образом, производство рыбы на душу населения увеличилось на 17,5 % за 10-летний период [2].

Общее производство рыбы в 2016 году достигло рекордного объема -171 млн тонн [1]. По количеству производимых ресурсов рыболовство составляет более 50% от общего мирового производства рыбы. В 2016 году мировое производство рыболовства составило 90,9 млн тонн, а аквакультура -80 млн тонн.

Россия входит в десятку ведущих стран по добыче рыбы в мире (Таблица 1). Основной источник рыбного сырья — это рыболовство. Традиционно основные объемы вылова водных биоресурсов российскими рыбаками приходится на рыболовство, осуществляемое в исключительной экономической зоне Российской Федерации, континентальном шельфе и открытой части Мирового океана [3]. Аквакультура в России развита слабо, и Россия пока не входит в список лидеров в области аквакультуры [1,3].

Главный лимитирующий фактор развития аквакультуры и в России, и в мире - нехватка недорогих, эффективных, экологичных кормов. Главный

лимитирующий фактор развития производства кормов для аквакультуры -дефицит, дороговизна и низкая экологичность традиционного сырья - рыбной муки.[4]

Таблица 1 - Объемы продукции морского промышленного рыболовства в 25

основных странах [1]

Страна Производство, тыс. тонн

Средний вылов за 2005-2014 годы 2015 год 2016 год

Китай 13189 15314 15246

Индонезия 5075 6217 6110

Соединенные Штаты Америки 4757 5019 4897

Российская Федерация 3601 4172 4467

Перу 6439 4787 3775

Индия 3218 3497 3600

Япония 3992 3423 3168

Вьетнам 2082 2607 2678

Норвегия 2348 2293 2034

Филиппины 2156 1948 1865

Малайзия 1388 1486 1574

Чили 3158 1786 1500

Марокко 1074 1350 1432

Республика Корея 1747 1641 1377

Таиланд 1830 1317 1343

Мексика 1401 1316 1311

Мьянма 1160 1107 1186

Исландия 1282 1319 1067

Испания 939 967 906

Канада 914 823 832

Китайская провинция Тайвань 960 989 750

Аргентина 880 795 736

Эквадор 494 643 715

Соединенное Королевство 631 705 702

Дания 736 869 670

Около 88 % от общего объема произведенной в 2016 году рыбы (151 млн тонн) составила рыба, предназначенная непосредственно для употребления в пищу. Достижение таких показателей стало возможно благодаря стабильности вылова в промышленном рыболовстве, сокращению отходов и продолжающемуся росту аквакультуры. На фоне такого производства потребление рыбы на душу населения в 2016 году тоже вышло на рекордное значение - 20,3 кг в год [1].

Несмотря на то, что живая, свежая или охлажденная рыба часто дороже, потребители отдают ей предпочтение - так в 2016 году на подобную продукцию пришлось 45% рыбы, употребленной в пищу, а доля мороженой рыбы составила 31% [1]. Оставшаяся часть продукции, предназначенной для пищевых целей, реализовывалась в различном обработанном виде: в вяленом, соленом, копченом, в консервированном виде или ином переработанном виде

[5].

Оставшаяся часть 12% выловленной рыбы была использована на непищевые цели (около 20 млн тонн): 76 процентов на производство рыбной муки и рыбьего жира, а остаток - на реализацию в различных целях, в том числе в качестве сырья для непосредственного скармливания в аквакультуре. Использование рыбных субпродуктов все в большей степени превращается в важную промышленную отрасль, где растущее внимание уделяется вопросам их контролируемой, безопасной и гигиеничной переработки [5].

Согласно [1,6], результаты расчетов показывают, что доля продовольственных потерь и отходов в мировом рыбном хозяйстве достигает 35 процентов от вылова.

Причем не менее 8 % потерь приходится на выбросы рыбы за борт до выгрузки, большей частью при траловом лове [1,5]. Также часть улова не используется, и при переработке выбрасывается за борт [7].

Помимо промысловых видов, при донном тралении также попадаются другие виды рыб и морских организмов. Этот случайный вылов называется приловом, а в случае, если его не выгружают, а выбрасывают за борт -выбросом. При этом количество такого прилова может превышать в несколько раз вылов промысловых видов. Нередко значительную часть прилова составляет мелкая и малоценная рыба, причем значительная его часть выбрасывается за борт и поэтому не используется [5].

Ранее ФАО уже провела две оценки прилова и выбросов в рыболовстве в глобальном масштабе. Согласно первому исследованию (1994 год), среднегодовая оценка выбросов в глобальном масштабе составила 27 млн

тонн. Спустя десятилетие показатель среднегодового выброса составил 7,3 млн тонн [5].

Во всем мире основное количество потерь рыбы приходится на послепромысловую стадию. характерны для большинства цепочек реализации рыбной продукции. Согласно оценкам, 27 % выгруженной рыбы утрачивается из-за потерь или порчи на этапе между выгрузкой и потреблением. Послепромысловые потери характерны для большинства цепочек реализации рыбы [1, 5].

В Европе, например, доля побочных продуктов рыбопереработки относительно высока - 54 % [1,8].

Проведенные ФАО исследования [9,10] позволили установить, что 65 % послепромысловых потерь и отходов рыбы обусловлены недостатками технического, технологического и/или инфраструктурного характера, проявляющимися на фоне неадекватного уровня знаний и опыта в части послепромысловой переработки. Остальные 35 % потерь и отходов связаны с социально-культурными аспектами уязвимости, а также с вопросами управления, регулирования и правоприменения [1].

Рыболовство испытывает периоды перенасыщения и дефицита, в свою очередь перерабатывающие предприятия не имеют возможности создавать запасы рыбы для переработки. Скопление необработанного сырья вызывает проблемы неприятного запаха и невозможности хранения; кроме того, испорченное сырье трудно переработать, и оно дает более низкий выход. Пока не найден дешевый и безопасный метод консервации рыбного сырья. Охлаждение является не экономичным, а известные химические методы консервации имеют некоторые неудобства [11].

Отходы производства, т.е. остатки сырья и материалов, которые образуются при получении основной продукции, не полностью лишенные потребительской стоимости сырья, могут быть использованы как вторичная продукция или при получении новой продукции. К подобным отходам причисляют отходы, которые остаются после разделки гидробионтов,

например, внутренности, головы, плавники. Продукты, которые не относятся к главной цели технологического производства, но образуются при физико-химической обработке сырья вместе с основной продукцией, которые при этом нельзя использовать без дальнейшей обработки в качестве готовой продукции, называются побочными продуктами [12].

Рыбоперерабатывающая промышленность генерирует большое количество твердых отходов. Кроме того, переработка рыбы требует больших объемов воды, что приводит к значительному количеству сточных вод. Твердые отходы составляют 20-60% от массы исходного сырья и представлены различными остатками: рыба целиком, головы рыб, внутренние органы, кожа, кости, кровь, гонады, кишки, мышечные ткани и т.д.) [13]. В некоторых странах эти отходы не утилизируются, а сбрасывается в океаны и моря, вызывая экологические проблемы [14,15].

Аэробные бактерии, присутствующие в воде, диссимилируют органическое вещество, что приводит к значительному уменьшению содержания кислорода в воде, а также к повышению концентраций соединений фосфора и азота, что в свою очередь приводит к изменению рН и повышению мутности воды. Анаэробные условия в воде стимулируют процессы брожения и гниения, что приводит к образованию сероводорода, аммиака, органических кислот, диоксида углерода и метана [2].

Обычно после обработки гидробионтов на отходы производства приходится около 60%. Доля пищевых отходов составляет 40-45% сырья, которое поступило на обработку. Эта цифра существенна. Хотя эти отходы являются ценным источником полезных продуктов с биологической активностью, таких как ферменты, нуклеотиды и стерины, сейчас в основном эти отходы используются в дальнейшем при получении рыбной кормовой муки и жира, могут являться источником. Непищевыми отходами являются органы ЖКТ, чешуя, кости, кровь, слизь. Доля слизи от общей массы тела некоторых рыб может составлять 15-20%. Содержание сухих веществ в рыбной слизи составляет 10-12%, в состав которых входят различные

аминокислоты, в том числе незаменимые аминокислоты. Их получение возможно при утилизации слизи [12].

Количество отходов образующихся при переработке определяется видом рыбы и глубиной переработки рыбы.

Методы обработки разнятся от простого потрошения, обезглавливания или нарезки до более совершенных методов, добавляющих стоимость -панировка, тепловая обработка и индивидуальная шок-заморозка, в зависимости от продукта и рыночной стоимости [5].

Можно выделить следующие этапы в переработке рыбы: размораживание, сортировка по виду и размеру, удаление слизи, удаление чешуи, промывку, удаление голов, потрошение, срезание плавников, нарезку на стейки, филетирование, отделение костей, упаковку, маркировку и сбыт [2].

Характеристика отходов.

Состав рыбы варьируется в зависимости от вида, пола, возраста, источников питания, времени года и состояния здоровья. Большинство рыб содержит 15-30% белка, 0-25% жира и 50-80% влаги [16,17]. Так, например [18], среди таких видов как, сом, треска, камбала, скумбрия и лосось, самое высокое содержание жира у скумбрии (11,7 %), а самый низкий у трески (0,1 %). Высокое содержание белка (23,5 %) у лосося, а в составе камбалы меньше всего количество белка (14 %). Содержание воды среди данных пяти видов рыб варьировалось от 69 % до 84,6 %, но зольность всех видов одинакова. Основные твердые рыбные отходы, образующиеся при переработке рыбы, это головы, хвосты, кожа, внутренности, плавники и скелет. Такие отходы также содержат белки (58 %), липиды и жиры (19 %) и минералы (Таблица 2). Очевидно, что такие вторичные продукты рыбной промышленности могут быть источником полезных продуктов с добавленной стоимостью, таких как белки и аминокислоты, коллаген и желатин, масло и ферменты [2,19,20].

Таблица 2 - Состав рыбных отходов [2]

Компонент Удельное количество (на сухой вес)

Сырой протеин (%) 57,92 ± 5,26

Жир (%) 19,10 ± 6,06

Клетчатка (%) 1,19 ± 1,21

Зола (%) 21,79 ± 3,52

Кальций (%) 5,80 ± 1,35

Фосфор (%) 2,04 ± 0,64

Калий (%) 0,68 ± 0,11

Натрий (%) 0,61 ± 0,08

Магний (%) 0,17 ± 0,04

Железо (мг/кг) 100,00 ± 42,00

Цинк (мг/кг) 62,00 ± 12,00

Марганец (мг/кг) 6,00 ± 7,00

Медь (мг/кг) 1,00 ± 1,00

Рыбные белковые концентраты (РБК) и изоляты (РБИ). США, Япония, Германия, Норвегия и Польша являются крупнейшими производителями РБК и РБИ. К этому привели высокая пищевая ценность рыбных белковых концентратов и изолятов и перемены в сырьевой базе рыбной промышленности. В уловах увеличились проценты содержания мелких рыб и рыб пониженной товарной ценности. Содержание азотистых веществ от общей массы рыбы составляет 16-22%. Количество миофибриллярных белков, которые обладают структурообразующими свойствами, может составлять у рыб до 76% от общего белка [12].

Костные ткани, отделяемые от туловища рыбы при филетировании, содержат значительное количество мышечных белков. Такие белки обладают высокой питательной ценностью, значительно превосходя по этому показателю растительные белки и имеют лучшее соотношение незаменимых жирных кислот по сравнению с другими источниками животного белка [21,22]. Поэтому белки из этой части рыбных отходов могут быть гидролизованы и экстрагированы, а не выброшены как отходы [23]. Однако мышечные белки рыб более чувствительны к теплу, чем белки мышцы млекопитающих [24]. Более восприимчивы к температурной денатурации

белки рыб обитающих в холодных водах нежели обитающих в тропических водах. Значения показателя Т-50 (температура, требуемая для 50% денатурации мышечных белко рыбы) зависят от рН и находятся в диапазоне 29-35 °С при рН 7,0 и снижается к диапазону 11-27 °С при рН 5,5 [25]. В мускулатуре рыб различают два вида мышечных волокон: светлые (белые) и темные (красные). Туловищная мускулатура большинства костистых рыб представлена в основном светлыми мышцами, которые содержать около 1823% белков. Наибольшая доля светлых мышц в белой рыбе, такой как треска и пикша, у которых темные мышцы располагаются лишь тонкой полоской под кожей по обеим сторонам тела. Большая доля темных мышц у жирных сортов рыб, таких как сельдь и скумбрия. Такие мышцы содержат больше витаминов и жиров [16]. Около 70-80% мышечных белков рыбы состоят из миофибриллярных белков - миозин и актин [26]. Они характеризуются полной биологической полноценностью. На водорастворимые саркоплазматические белки приходится 20-30%. В основном это ферменты, которые катализируют нежелательные биохимические процессы при хранении рыбы. Около 2-3% мышечных белков это нерастворимые белки сарколеммы и соединительной ткани, которые представлены коллагеном и эластином [2].

Белки, экстрагированные из рыбной мускулатуры, содержат ряд пептидов, которые обладают многими биологическими активностями, такими как антигипертензивные, антитромботические, иммуномодулирующие и антиокислительные свойства [27].

Коллагеносодержащие отходы, такие как плавники, кожа, головы, образуются при глубокой разделке рыбы на филе и фарш и применяются в кормовых целях [12].

Отделяемая при разделки рыбы кожа являются богатым источником коллагена и желатина, которые в настоящее время используются в пищевой, косметической и биомедицинской промышленностях. Коллаген и желатин представляют собой две различные формы одной и той же макромолекулы. Желатин — это частично гидролизованный коллаген. Эти белки не являются

полноценными, т.к. не содержат триптофан. Более чем 80% аминокислотного состава приходится на неполярные аминокислоты такие как глицин, аланин, валин и пролин [28]. При тепловой денатурации коллаген легко переходит в желатин. У коллагена и желатина из рыбных источников значимое преимущество по сравнению с белками крупного рогатого скота - они не несут риска возникновения заболевания губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота [2].

Аминокислотный состав значительно зависит от вида рыбы, их половой принадлежности, периода онтогенеза, питания и экологических факторов [29]. Вцелом белки рыбного происхождения имеют сбалансированный аминокислотный состав.

Так, например, в аминокислотном составе белков скумбрии и терпуга содержатся все незаменимые аминокислоты, на долю которых приходится около половины от общего количества аминокислот [30].

Соединительная, хрящевая и костно-хрящевая ткани гидробионтов характеризуются высоким содержанием гексозаминов (глюкоз- и галактозаминов) [31].

Кожа рыб является высококперспективным источником для выделения гиалуроновой кислоты (ГК), основного компонента внеклеточной структуры тканей, который состоит из повторяющихся дисахаридов N ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты [32].

Рыбные кости содержат 60-70 % минералов, включая кальций, фосфор и гидроксиапатит [33].

К основной массе липидных отходов относятся триглицериды и фосфолипиды, а также липиды непищевого назначения (алкоксидиглицериды, воска, углеводороды), фосфолипиды, свободные жирные кислоты, ди- и моноглицериды. Преобладающими жирными кислотами в составе рыбных жиров являются жирные кислоты с числом атомов углерода С14 - С22 [12].

Липидсодержащие отходы от разделки рыбы являются ценным источником полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), в особенности

эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой кислот (ДГК), а также жирорастворимых витаминов [34].

Количество и состав жира, также как и аминокислотный состав, зависит от вида рыбы, половой принадлежности, периода онтогенеза, питания и экологических факторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пушкарев Михаил Алексеевич, 2019 год

Источники липаз

Липазы присутствуют во всех типах живых организмов. У эукариот они могут быть заключены в органеллы (лизосомы), или находиться вне клеток, где они участвуют в метаболизме, абсорбции и транспорте липидов [201]. У низших эукариот и бактерий липазы могут быть как внутриклеточными, так и секретироваться в окружающую среду для деградации липидного субстрата [202]. Липаза может быть фактором вирулентности у некоторых патогенных организмов, например, Candida albicans [203], Staphylococcus [204] и Pseudomonas [205], Metarhizium anisopliae [206].

Ферменты бактерий и грибов имеют огромный потенциал в качестве промышленных биокатализаторов, вследствие простоты получения и выделения [200]. Большинство бактериальных липаз для коммерческих препаратов получают из Pseudomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Acinetobacter, Bacillus и Chromobacterium. Наиболее широко используемыми грибными липазами являются липазы Candida, Humicola, Penicillium, Yarrowia, Mucor, Rhizopus и Aspergillus [202]. Среди липаз высших эукариот свиная панкреатическая липаза долгое время используется в качестве технического фермента [207]. Ферменты растений, такие как липазы из папайи, ананаса, молочая (Euphorbia) и липазы из семян клещевины, рапса и др., находят интересное применение в качестве биокатализатора [208], в следствии их необычной жирнокислотной селективности.

Основные молекулярные и биохимические особенности

Разнообразие липаз по происхождению, клеточной локализации и физиологическим функциям отражается и на разнообразии биохимических свойств ферментов. Липазы различных организмов или изоферменты одного организма могут значительно различаться по молекулярной массе, оптимальным значениям pH и температуры, посттрансляционной модификацией, субстратной и реакционной специфичностью [202].

Молекулярная масса известных липаз варьируется от 17,5 кДа (для липазы Rhizopus [209]) до 60 кДа (липаза Staphylococcus epidermidis [210]). Но, не смотря на это, почти все липазы имеют общую архитектуру и состоят из одного домена [211]. Исключениями являются липазы высших эукариот, для которых характерно наличие дополнительных функциональных модулей для регуляции и взаимодействия с другими молекулами [212].

Область температурного оптимума для разных липаз довольно широка, и заключена в основном в пределах 30-60 °C. Однако, температурный оптимум липаз экстремофилов выходит за эти пределы. Например, липаза термофила Bacillus thermoleovorans [213] имеет температуру оптимума 70-75 °C. Продуцируемые психрофильными бактериями ферменты обладают высокой активность при низких температурах [214]. Такие особенности липаз экстремофилов дают возможность применять эти ферменты в реакциях проводимых при высоких температурах или, наоборот, в низкотемпературных процессах (например, низкотемпературная стирка или в пищевой промышленности [215]).

Многие бактериальные липазы имеют нейтральный или щелочной оптимум pH, в некоторых случаях до pH 9,0 (липазы Pseudomonas и Bacillus). Реже встречаются кислые липазы, например, липаза Pseudomonas fluorescens SIK W1 имеет оптимум при pH 4,8. Некоторые липазы Bacillus sp. остаются активными в широком диапазоне pH (pH 3-12) [216].

Механизм липазного катализа

Благодаря сходству каталитической триады, содержащейся в липазах и протеазах, механизм липазного катализа схож с механизмом катализа сериновых протеаз, т.е. включает образование двух тетраэдрических интермедиатов. Механизм включает нуклеофильную атаку гидроксильными группами серинового остатка активного центра фермента по атому углерода в эфирной связи субстрата. Это приводит к формированию тетраэдрического интермедиата, который теряет молекулу спирта с образованием ацил-ферментного интермедиата. Затем молекула воды атакует комплекс (нуклеофильная атака) с образованием тетраэдрического интермедиата, который теряет молекулу жирной кислоты с высвобождением фермента в нативной форме [217].

Реакции катализируемые липазами

Биологической функцией липаз является катализ реакции гидролиза сложных эфиров, в особенности длинноцепочечных триацилглицеридов до свободных жирных кислот, моно- и диацилглицеридов и глицерина [218]. Липазы также способны катализировать реакции, обратные гидролизу, включая этерификацию, трансэтерификацию (ацидолиз, переэтерификацию, алкоголиз) в безводных органических растворителях [219]. Равновесие между гидролизом и синтезом контролируется активностью воды в реакционной среде [220; 221].

Полный гидролиз эфирных связей в триацилглицеридах может быть осуществлен перегретым паром при температуре 200-225 ^ и давлении 20-25 атм. Также свободные жирные кислоты могут быть получены при атмосферном давлении при гидролизе триглицеридов в присутствии щелочного или кислотного катализаторов. В промышленности реакции трансэтерификации и этерификации проводят в безводной среде при нагревании или в присутствии алкоголятов или алкилатов щелочных металлов при низкой температуре [222].

Использование липаз для синтеза, расщепления и модификации жиров и масел имеет преимущества перед описанными выше процессами [223]:

ферментативная реакция протекает в мягких условиях, с меньшим количеством отходов, простота отделения биокатализатора, возможность многократного использования катализатора, субстратная специфичность фермента.

Однако, липазы могут использовать в качестве нуклеофила не только воду и спирты, но и другие соединения. Поэтому, возможности липаз не ограничиваются только катализом гидролиза и синтеза эфиров карбоновых кислот. Они способны катализировать и другие реакции в органических растворителях, например, аминолиз [224], тиотрансэтерификация [225] и оксимолиз [226].

Структура липаз

Для липаз выделяют следующие структурные особенности:

1. Все липазы являются членами семейства альфа-бета гидролаз, т.е. они состоят из ядра образованного в основном параллельными бета-листами, окруженного альфа-спиралями [211].

2. Активный нуклеофильный сериновый остаток располагается на петле между бета-листом и альфа-спиралью и представлен канонической пентапептидной последовательностью Gly-X-Ser-X-Gly [211].

3. Активный центр фермента сформирован каталитической триадой, состоящей из серина, гистидина, аспарагиновой/глутаминовой кислоты. Активные центры липаз и сериновых протеаз химически сходны, но структурно различаются [227].

4. В структуре фермента присутствует "крышка", которая представляет собой амфифильную альфа-спираль, которая закрывает активный центр фермента [228].

5. Субстрат-связывающий центр фермента состоит из: оксианионовая дыры и трех карманов, связывающих жирные кислоты в позициях триглицерида sn-1, sn-2 и sn-3 [211].

6. Размер и гидрофобность/гидрофильность карманов субстрат-связывающего центра фермента определяет энантиоселективность и региоселективность фермента [211].

В литературе липазы разделяют на три группы по геометрии субстрат-связывающего центра [229]:

- щелеобразный субстрат-связывающий центр (липазы Rhizomucor и Rhizopus);

- воронкообразный субстрат-связывающий центр (липазы C.antarctica, Pseudomonas, панкреатическая липаза млекопитающих);

- туннелеобразный субстрат-связывающий центр (липазы Candida rugosa).

Межфазная активация

В гомогенной среде липазы проявляют низкую активность. Однако, при появлении межфазной границы, например вода-масло, активность липазы значительно возрастает. Это явление получило название межфазной активации [228]. Это увеличение активности вызвано структурной перестройкой в районе активного центра [230]. При отсутствии межфазной границы масло-вода активный центр фермента закрыт так называемой "крышкой". В присутствии гидрофобных соединений в водной среде «крышка» открыта, что делает доступными для субстрата активный центр фермента. Но не всем липазам свойственна межфазная активация. Некоторые липазы обладают крышкой, но не проявляют межфазную активацию. Например, липаза B культуры C. antarctica имеет в своей структуре очень маленькую крышку, которая в закрытом состоянии не полностью изолирует активный центр фермента от окружающей среды [231]. Так же липаза Cavia porcellus имеет крышку состоящую всего из пяти аминокислот [232].

Субстратная специфичность липаз

Специфичность липаз можно подразделить на следующие типы: жирнокислотную, позиционную, спиртовую специфичность, стерео и хиральную специфичности.

Жирнокислотная специфичность. Некоторые липазы имеют предпочтение к определенным жирным кислотам или группам жирных кислот, которые различаются по длине углеродной цепи, количеством и положением двойных связей в ней. Это проявляется в различии скоростей катализируемых реакций для разных жирных кислот.

Большинство липаз способны распознавать жирные кислоты с длиной цепи C4-C24, но с различной эффективностью. Известно [233], что изоформы фермента могут отличаться в этом свойстве. Примером могут служить четыре изоформы липазы Candida rugosa. Изоформа 1 действует в основном на среднецепочечные (С8-С10) субстраты, изоформа 3 на короткоцепочечные растворимые субстраты, а изоформы 2 и 4 на длинноцепочечные молекулы (C16-C18). Липаза G. candidum проявляет низкую активность по отношению к жирным кислотам с длиной углеродной цепи более C18 [234].

Влияние количества двойных связей. Активность липаз Candida rugosa и G. candidum при действии на C18 жирные кислоты возрастает в следующем порядке: стеариновая кислота (18:0) < олеиновая кислота (18:1n-9) < линолевая кислота (18:2n-3) <а-линоленовая кислота (18:3n-3). В общем, липазы действуют слабо на субстраты с полиненасыщенными ЖК (ПНЖК), такие как арахидоновая кислота (AA; 20:4n-6), эйкозапентаеновая кислота (EPA; 20:5n-3) и докозагексаеновая кислота (DHA; 22:6n-3) [235].

В случае гидролиза метиловых эфиров докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот липаза C. rugosa проявляет наибольшую дискриминацию по отношению к метиловому эфиру докозагексаеновой кислоты, а липазы P. fluorescens и P. cepacia, напротив, к метиловому эфиру эйкозапентаеновой кислоты [236].

Влияние положения двойных связей. Многие липазы реагируют слабо с ЖК обладающими двойными связями вблизи карбоксильной группы [237].

В работе [238] описан гидролиз триглицеридов содержащих 15 изомеров жирной кислоты C18:1 с различным положением двойной связи (от Д2 до Д16) панкреатической липазой. Триглицериды, содержащие изомеры С18:1 с

положением двойной связи от Д2 до Д7 более устойчивы к липолизу, а наименьшая скорость липолиза наблюдается у изомера Д5. Так же в работе

[239] для семи липаз (панкреатическая свиная липаза, липаза из ростков пшеницы, липазы Rhizopus arrhizus, Candida cylindracea, Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum, иммобилизованная липаза Mucor miehei) показана дискриминация в реакции гидролиза по отношению к жирным кислотам с положением двойной связи Д5.

Липаза Rhizopus delemar при ацидолизе каприловой кислотой масла

[240], проявляет высокую активность в отношении альфа-линоленовой кислоты и не проявляет активность в отношении гамма-линоленовой.

Позиционная специфичность. Позиционная специфичность липаз очень важна для реакций с маслами. Липазы делятся на две группы: 1,3-региоспецифичные ферменты, которые распознают эфирные связи на 1,3-положении триацилглицерина (распознает первичный эфир спирта), и неспецифичные ферменты, которые распознают все эфирные связи триацилглицерина (распознает первичный и вторичный эфир спирта) [202]. Липазы из поджелудочной железы млекопитающих и липазы грибов, таких, как Aspergillus niger, Rhizomucor miehei, Rhizopus oryzae, Thermomyces lanuginosa и Rhizopus arrhizus являются 1,3-региоспецифичными. Ферменты из Candida rugosa, Geotrichum candidum и Penicillium являются неспецифичными и гидролиз эфирной связи в позиции 1,3 - и 2-триацилглицерида идет с той же скоростью. Липазы бактерий, таких как Pseudomonas, Burkholderia и Alcaligenes также неспецифические, но гидролиз эфирных связей в 1,3-положении идет более легко, чем в позиции 2 триацилглицерина. Geotrichum candidum производит по крайней мере четыре изофермента и минорных компонента, III и IV, как сообщается, преимущественно распознают эфирную связь во 2-положении триацилглицерина. Однако не было найдено липаз специфичных к конкретно 2-му положению.

Позиционная специфичность как правило, не зависит от условий реакции, она не меняется от 1,3-положения специфичных к неспецифичным, или от неспецифичных к 1,3-положение-специфичным. Однако, иммобилизованные липазы Candida antarctica изменяют позиционную специфичность. Липазы действуют на 1, 3 - и 2-положение триацилглицерина с той же скоростью в спиртовом гидролизе с небольшим количеством (<1/3 моля триацилглицерина) метанола и этанола. Кроме того, липаза отдает предпочтение 1,3-позиции при этерификации свободных жирных кислот с глицерином и специфична к 1,3-позиции при алкоголизе триацилглицерина при избыточном количестве метанола и этанола [235].

Специфичность по отношению к спирту. В работе [241] получали с помощью липазы Mucor miehei эфиры лауриновой и олеиновой кислот со спиртами с различной длиной углеродной цепи С3 - С12. Для спиртов C3-C5 наблюдалось увеличение денатурирующего эффекта при уменьшении длины углеродной цепи спирта, в то же время наибольшую активность фермент показал в отношении н-бутанола. Наименьшая активность наблюдалась для спиртов С8 - н-октанол и 2-этилгексанол. Причем эти спирты не проявляют денатурирующего эффекта. Это может означать, что фермент имеет низкую аффинность по отношению к С8 спиртам. Аналогичный результат был получен в работе [242] - скорость этерификации, катализируемой липазой Mucor miehei, зависит от длины углеродной цепи спирта.

Стерео- и хиралъная специфичность. Стереоспецифичность определяется как способность липазы различать Sn-1 и Sn-3 позиции TAG [243] Примеры этого типа липаз: липаза человеческого языка, липаза C. antarctica B, и липаза желудка собак; липазы Т. lanuginosa и Pseudomonas fluorescens [235] Pseudomonas cepatia [244]. Липазы также способны различать энантиоизомеры хиральных молекул. Эта способность в последнее время стала очень важной в производстве чистых хиральных изомеров в качестве промежуточных продуктов для синтеза лекарственных препаратов. Многие виды позиционно - неспецифичных липаз, таких как липазы

Pseudomonas sp., Burkholderia sp., Serratia marcescens, C. rugosa и C. antarctica, были использованы для разделения хиральных соединений [235].

1.5 Методы очистки и выделения липаз

Традиционные методы очистки липаз

В основном микроорганизмы продуцируют липазы внеклеточно, поэтому для выделения фермента используют культуральную жидкость. Поэтому первым шагом в получении препаратов липаз является удаление клеток и других нерастворимых веществ из культуральной жидкости. Это достигается с помощью микрофильтрации или центрифугирования. Ультрафильтрацию используют чтобы сконцентрировать полученную жидкость. Затем ферменты обычно осаждают органическими растворителями или солями. Пожалуй, самый распространенный метод осаждения белка это осаждение сульфатом аммония. После стадии осаждения обычно используют хроматографические методы разделения белков. Методы осаждения часто имеют гораздо более высокий выход (приблизительно 87 %) по сравнению с хроматографическими (60-70 %) [245; 246].

Хроматографические методы

В литературе, касающейся очистки и характеристики липазы, содержит множество хроматографических методов для очистки ферментов. Однако одной хроматографической стадии очистки белка недостаточно, поэтому обычно комбинируют различные типы хроматографических методов [245].

В настоящее время существуют три основных хроматографических метода для очистки белка [246]:

- ионообменная хроматография - наиболее часто используемая;

- гель-фильтрация - второй наиболее широко используемый метод, метод ограничен из-за его небольшой емкости загрузки белка и обычно используется на заключительных стадиях очистки белка;

- аффинная хроматография или ее разновидность - гидрофобная хроматография, из-за наличия гидрофобных участков на поверхности молекулы липаз вокруг активного центра.

Типичные функциональные группы гидрофобных адсорбентов используемых для очистки липаз: бутил, метил, октил и фенил [245; 246]. Другим широко используемым адсорбентов применяемым в аффинной хроматографии липаз является гидрооксиапатит. Несмотря на высокие затраты, методы аффинной хроматографии обычно характеризуются высокими степенями очистки от 2 до 10 [245].

Kumar и соавторы [247] очищали липазу Bacillus safensis DVL-43 на колонке фенил-сефарозой CL-4B - с гидрофобным сорбентом. Для это вносили концентрированную фракцию белка, полученную после о осаждения сульфатом аммония, на колонку с сорбентов уравновешенным 1,0 М сульфатом аммония в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). Связанную липазу элюировали в обратном градиенте от 1,0 М до 0,0 М сульфата аммония в 50 мМ фосфатном буфере (рН 8,0). Удельная активность липазы составила 45,9 U/мг с выходом 24,1 % и степенью очистки 11,5.

Sharon и соавторы в работе [248] очищали липазы Pseudomonas aeruginosa, для чего белок вначале осаждали сульфатом аммония (с выходом 74 %), затем наносили на колонку с гидроксиапатитом, степень очистки составила 11.

Wu и соавторы [249] очистили липазу из Rhizomucor miehei в 42 раза, наблюдаемая активность составляла 32 %, а молекулярная масса составила 31,6 кДа. Очистку проводили, используя три метода: осаждение сульфатом аммония, быстропроточная гидрофобная хроматографии с фенил-сефарозой и быстропроточная анионообменная хроматография на DEAE-сефарозе.

Mozaffar и соавторы [250] очищали липазу Pythium ultimum осаждением сульфатом аммония (с выходом 81%), а затем на хроматографических колонках с диэтиламиноэтил-сефарозой CL-6B и Sephacryl S-200. Очищенная липаза имела молекулярную массу 68 кДа, определенную при электрофорезе

в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), однако гель-фильтрационная хроматография показала, что молекулярная масса липазы составляет 270 кДа, что может быть связано с тетрамерной структурой фермента.

Описанные выше хроматографические способы очистки постоянно совершенствуются. Так например, Li и соавторы [251] синтезировали термочувствительный N-алкилзамещенный полиакриламидный аффинный полимер PNNB. Этот полимер использовали для очистки липазы прямо из культуральной жидкости. Удельная активность липазы составила 506 U/мг, а выход 82 %.

Cunha и соавторы [252] очищали липазу Penicillium simplicissimum путем селективной адсорбции на трех различных гидрофобных матрицах бутил-агарозе (низкая гидрофобность), фенилагарозе (средняя гидрофобность) и октил-агарозе (высокая гидрофобность). После соответствующих трех стадий очистки выход составил 85 %.

Golaki и соавторы в работе [253] изучали липазу из бактерии Cohnella sp. A01. Фермент очищали с помощью двухступенчатой анионообменной хроматографии на смоле DE52 с переменным рН от 5,5 до 4,3. Выход липазы составил 38%, а степень очистки 13,4. Очищенная липаза имела молекулярную массу (SDS-PAGE) 29,5 кДа.

Gurruraj и соавторы [254] очищали термостабильную, устойчивую к органическим растворителям, липазу путем осаждения сульфатом аммония (с выходом 70 %). Затем образец диализованного белка хроматографировали через анионообменную колонку с ДЭАЭ-сефарозой с выходом 36% и степенью очистки 2,2 раза, удельная активность составила 83 U/мг. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка (pI) составляли 41,196 кДа и 7,14 соответственно.

Мембранные процессы

Мембранные процессы все чаще применяют в очистке различных биомолекул. Мембранные системы обладают такими преимуществами, как низкое энергопотребление, непрерывность процесса, простота в эксплуатации,

воспроизводимость, масштабируемость и «мягкие» условия для продукта очистки[255].

Также мембранные процессы очень привлекательны в очистке биомолекул из-за их возможности работы при сравнительно невысоких температурах и давлении, не вызывая при этом разделения смеси на разные фазы, тем самым минимизируя возможные нежелательные эффекты денатурации и деактивации белка, или разложения продуктов ферментации [256].

Наиболее известными методами мембранных процессов являются микро- и ультрафильтрация, которые используются в очистки культуральной жидкости, буферов и в концентрировании белков.

Другими, не менее привлекательными применениями мембранных процессов, которые недавно начали набирать популярность, являются: мембранные биореакторы, мембранная хроматография и мембраные контакторы, хотя и эффективны, но на данный момент данные методы не используются в полной мере для очистки ферментов [257].

Среди описанных выше методов наиболее перспективным для очистки ферментов является метод мембранной хроматографии. Данный метод позволяет достичь определенной селективности, чистоты и выхода продукта, которые необходимы [258].

Мембранными материалами, используемые в мембранной хроматографии, в основном являются целлюлоза, полисульфоны, полиамиды, гидразиды и композитные мембраны, такие как смесь полиэфирсульфона и оксида полиэтилена, которые связаны со слоем гидроксиэтилцеллюлозы [259].

Простой мембранный адсорбер состоит из функцианализрованной макропористой мембраны с лигандами соединенными с внутренней поверхностью мембраны. Благодаря пористой структуре мембраны массоперенос не лимитирован диффузией через поры, как в случае с хроматографией на основе адсорбционных смол, и в основном скорость взаимодействия вещества с мембраной определяется конвекцией [257].

Данный метод был предложен около 20 лет назад Bastida и соавторами в работе [260], в которой сообщили, что большое количество бактериальных липаз может быть быстро и эффективно иммобилизированы на различные гидрофобных матрицы, такие как октил-агарозные гели.

В тоже время Cunha и соавторы [252] сообщили о модификации данного метода, что позволило отделить липазу Penicillium simplicissimum иммобилизированную селективной адсорбцией на гидрофобной подложке с тремя различными матриксами. Липаза была сначала загружена на бутил-агарозный матрикс (слабая гидрофобность), затем на фенил-агарозу (средняя гидрофобность) и последующее присоединение к октил-агарозе (сильная гидрофобность). По окончании всех трех ступеней, полученная белковая фракция имела выход по липолитической активности 85 %. Большое количество нецелевого белка было задержано бутил-агарозным матриксом. Фенил-агарозная и октил-агарозная подложки содержали меньшее количество белка по сравнению с бутил-агарозой, что означало, что селективность матрикса увеличивалась с каждым этапом.

Beutel и соавторы [261] очистил липазу, производимую Staphylococcus carnosus, используя два подхода. Первый подход включал использование капсул для мембранной хроматографии Sartobind® Phenyl (гидрофобные свойства), во втором использовались капсулы с мембранами смешенного состава, обладающими сульфокислотными (катионообменные свойства) и гидрофобными группами. Для Sartobind® Phenyl мембраны оптимальные условия для специфического связывания липазы из клеточного лизата составили pH 7,0 и 0,5 M сульфата аммония. Выход продукта 89 %, и степень очистки 3,2. Для мембраны смешанного состава, оптимальные условия связывания липазы составляли pH 5,0, при которых выход продукта составил 93% и степенью очистки 7,8 раз.

Новые методы очистки липаз

Рекомбинантные технологии в очистке липаз

Иммуноаффинная хроматография или иммуноочистка это вид аффинной хроматографии, в которой целевой белок очищается посредством взаимодействия антитело-антиген [262]. Иммуноочистка на сегодняшний день является наиболее селективным методом очистки белков, с фактором очистки в интервале от 1000 до 10000 раз за одну стадию. Данный метод используется в тех случаях, когда другие существующие методы не позволяют выделить целевой белок с необходимой степенью очистки [263].

Большинство методов иммуноочистки белков используют либо моноклональные, либо аффинно-очищенные поликлональные антитела [264]. Для использования иммунноочистки необходимо определится с двумя важными параметрами: (1) имеется ли подходящее антитело для целевого белка и (2) присутствуют ли загрязнения в белковом растворе, а также известны ли концентрации и состав данных загрязнений [264]. Несмотря на то что иммунноочистка является очень селективным и эффективным методом очистки белков, его стоимость достаточно велика, так как получение подходящего антитела для целевого белка влечет большое количество лабораторной работы [262]. Таким образом, более легким и дешевым методом очистки является использование уже существующих антител и антигенов, сшиванием целевого белка с аффинной меткой (аффинный таг) [265]. Аффинные метки являются очень эффективным инструментом в детекции, характеристки и очистки белков. Эпитоп - короткая последовательность аминокислот, которая в основном служит как детерминант антигена, или участок, к которому прикрепляется антитело [266]. Таким образом, принцип эпитопного мечения заключается в том, что короткая последовательность аминокислот (т.е. эпитоп) сшивается с целевым белком методами рекомбинантных технологий [266; 267].

Специально сконструированные метки способны к эффективной очистке рекомбинантных белков, с высоким выходом и чистотой целевого

продукта [267]. Данные метки, в основном, прикрепляются к N- или C- концам целевого белка, тем самым обеспечивают связывание целевого белка со специфичным антителом, аффинными матриксами или таг-зависимыми осадителями или агрегаторами [266]. К меткам, которые используются в очистке липаз относятся: полигистидиновые (poly-His) таги, чаще называются His-таг, которые придставляют из себя пептидную конструкцию. Преимущества His-тагов заключаются в их малой иммуногенности и малом размере (0,84 кДа), состоят такие таги как правило из последовательности от 3 - 10 гистидинов. В добавок, множество белков, сшитых с His-тагами можно очищать как в нативных, так и в денатурирующих условиях [266; 268].

Далее приведены примеры использования His-тага в очитске липаз из различных источников.

Rivera и соавторы [269] впервые функционально экспрессировали липазу 1 Carica papaya из гена данного растения (CpLipl), клонировав данную последовательность в плазмиду pGAPZaB и инкорпорировав данную плазмиду в Pichia pastoris для наработки рекомбинантного белка. Рекомбинантный белок содержал С-терминальный His6 таг, который позволил очистить данный белок аффинной хроматографией на колонке HisTrap объемом 5 мл. Степень очистки липазы составил 7 раз, а удельная липазная активностью 25 U/мг. Биохимическая характеристика очищенной CpLipl липазы показала, что данный фермент предпочтительно гидролизует длиноцепочечные триглицериды с оптимальными значениями pH 8,5 и температуры 35 °C [269].

В другой работе Memarpoor-Yazdi и соавторы [270] клонировали и эксперессировали в Escherichia coli ген, кодирующий термо-галофильную GDSL липазу, полученный из Rhodothermus marinus. Оптимальные условия экспрессии липазы составляли: 0,1 мМ изопропил-ß-D-b тиогалактопиранозид, период экспрессии 12 часов при 28 °С. Экстрагированная из супернатанта клеточного лизата рекомбинантная липаза содержала His-таг в N-терминальном конце, данный белок был очищен

аффинной хроматографией на колонке Ni-NTA, фактор очистки липазы составил 6,4 с выходом 53,8 %. Фермент имел молекулярную массу 40 кДа и обладал наибольшей гидролитической активностью в отношении пара-нитрофенилбутирата (активность 1055,3 U/мг) при температуре 70 °C и pH 8,5. При инкубировании в течении 60 минут при той же температуре, фермент сохранил 78,6 % от начальной активности.

К другим часто используемым в очистке липаз тагам относятся: FLAG эпитопный таг (короткая гидрофильная последовательность из 8 аминокислот (DYKDDDDK)) и c-Myc таг (протоонкогеный продукт (EQKLISEEDL)) [271274].

Применение FLAG и c-Myc тагов в очистке липаз было описано Berryman и соавторами [274], предложившими способ очистки и выявления липазы клеток печени крысы, используя эпитопные таги. Авторы поместили myc и flag эпитопные таги на С-конец липазы. Был использован метод иммунно - ферментного анализ, где анти-myc антитело 9E10 было выбрано для связывания, а анти-:Г^-М2 конъюгат пероксидазы для детекции. Авторы также высказали возможность использования данных антител в методах иммунноочистки липаз. Результатами было установлено, что липаза состояла из двух олигомерных частей, молекулярная масса мономера составляла 76 кДа, удельная липазная активность myc/flag таггированной липазы была 8696 U/мг (субстрат три-(ЗН)олеоилглицерол).

Kumari и соавторы [275] получили липазы lip 11 и lip12 из Yarrowia lipolytica MSR80 с использованием IgG тага. Липаза была экспрессированна и клонирована с IgG тагом в Escherichia coli HB101, с использованием плазмиды pEZZ18. Белок был очищен аффинной хроматографией на колонке IgG-Sepharose и анализирован на SDS-PAGE. Молекулярные массы липаз составляли 47,51 и 48 кДа соответственно; удельные активности 314,35 U/мг и 198 U/мг, соответственно.

Разрабатываются и применяютя новые таги для очистки липаз. Так например, Xing и соавторы [276] описали процесс очистки липазы А (lipA),

основанный на индуцированном агрегировании белков. Команда исследователей протестировала два амфипатических пептида (18A и ELK16) для поиска расщепляемых агрегатов, которые могут быть использованы в методах очистки белков. Lip A была инкорпорирована в lipA-ELK16 и lipA-18A агрегаты. Lip A была освобождена из LipA-ELK16 агрегата в связи с самоиндуцированным таговым расщеплением в диапазоне pH от 5,6 до 8,5; фермент имел удельную активность равную 133,4 U/мг. LipA полученная из агрегата LipA-18A имела меньшую активность, равную 72,8 U/мг. Агрегат расщеплялся в тех же значениях рН. Полученный белок в обоих случаях имел молекулярную массу 21 кДа. Липаза LipA не обладала гидролитической активностью по отношению к пара-нитрофенил пальмитату.

Singh и соавторы в работе [277] сообщили о своем подходе одновременной очистки и рефолдинга белков гиперэкспрессированных в Escherichia coli ER2566 с интеиновым тагом. Полученные тельца включения были растворены в буфере, содержащим 8 M мочевины или бромидом цетилтриметиламмония. Растворенная липаза была осаждена хитозаном, таким образом был получен комплекс полимера с белком. Интеиновый таг был отрезан от липазы дитиотреитолом и был получен в активной форме рефолдированный белок, с 80 % восстановлением активности. Удельная активность липазы составила 2965 U/мг. Очищенная липаза выявилась одиночным бэндом на SDS-PAGE электрофорограмме, молекулярная масса равнялась 29 кДа.

Разделение в водных двухфазных системах

В последнее время возрастает количество публикаций, описывающих методы очистки липаз с использованием многофазных систем, такие как например водная двухфазная экстракция (от англ. aqueous two-phase extraction или ВДЭ) [278]. Сегодняшние производства находятся в поиске дешевых и эффективных методов очистки липаз с возможностью масштабирования [279; 280]. Традиционные методы очистки липаз являются не только дорогими, но и требуют значительного количества времени и обладают низким выходом

продукта [281]. Таким образом, острая необходимость в новых и альтернативных методах очистки липаз, в обозримом будущем будет составлять основу для многих исследовательских работ [282].

Фазовое разделение происходит, когда два раствора водорастворимых полимеров смешиваются. Водные двухфазные системы (ВДС) - это эффективная технология разделения жидкостей, все чаще употребляемая в получении биологически активных молекул. Преимущество данной методики в ее низко-энергетическом быстром разделении молекул между фазами. Водные двухфазные системы в основном формируются комбинацией либо полимер/полимером, либо полимер/солью, как фазообразующие компоненты [282].

Souza и соавторы [283] сравнили два различных способа очистки липаз: (1) ВДС состоящая из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и фосфата калия, и (2) традиционную процедуру очистки - ультрафильтрация, осаждение ацетоном и очистка на каолине. В случае традиционного подхода фактор очистки составил 6,55, а удельная активность липазы 1208,96 Шмг. При очистке в ВДС в условиях pH 6 и температура 4 фактор очистки равнялся 41 и удельной активностью 7665,27 Шмг. Таким образом показано, что при правильном использовании, ВДС могут очищать липазу с большей эффективностью и с меньшими издержками в сравнении с традиционными методами очистки.

Существуют определенные факторы, которые при очистке белка методами ВДС, могут повлиять снижение активности белка и снижению выхода продукта. Так, например, Femandes Duarte и соавторы [284] исследовали методы ВДС для очистки липазы выделенной из Leucosporidium scottii L117. Они исследовали три ВДС различного состава: (1) полиэтиленгликоль (ПЭГ)/фосфат калия, (2) ПЭГ/полакриловая кислота (ПК) с различной молекулярной массой (1500, 4000, и 8000 г/моль), и (3) Тритон Х-114 (ТХ-114)/ цитрат-фосфатный буфер рН 7.0 в различных температурных условиях. При использовании систем ПЭГ/фосфат калия и ПЭГ/ПК, наблюдались потери ферментативной активности, что указывает на

возможное влияние компонентов ВДС. В тоже время система ТХ-114/ цитрат-фосфатный буфер продемонстрировала фактор очистки 12.

Кроме того, те же авторы в другом исследовании [285] сообщили об использовании ВДС, образованной ионной жидкостью на основе холина (и его солей) и тетрагидрофураном, для очистки липазы Bacillus sp. ITP-001. Выявлено, что наилучший состав ВДС для очистки фермента это 40 % ТГФ и 30 % битартрата холина (при 25 °С), при использовании которого степень очистки составила 130,1 раз, а выход липазы 90,0 %. Коэффициент распределения фермента в фазе на ионной жидкост составил 0,11, а коэффициент распределения нецелевых белков в тетрагидрофурановой фракции 1,16.

Ramakrishnan и соавторы [286] очищали липазу Enterococcus faecium MTCC5695, используя ВДС полиэтиленгликоль 8000/гидрофосфат натрия. которая разделялась на нижнюю фазу полиэтиленгликоля PEG8000 / Na2HPO4. Липаза распределялась в основном в нижнюю (полиэтиленгликоль) фазу, в которой наблюдалось 75,69% от исходной активности. При совместном использовании ВДС и ультрафильтрации авторы получили фермент с выходом 82,09% и фактором очистки 5,99. Молекулярная масса липазы MTCC5695 составляет 19,2 кДа. Наибольшая активность фермента наблюдается при рН 10,8. Фермент показал стабильность в диапазоне рН 7,0-12,0. Оптимальная температура активности липазы составляет 40 °C, липаза устойчива в температурном диапазоне 30-70 °C.

Разделение в системах обратных мицелл

Система обратных мицелл (СОМ) представляют собой гетерогенную систему жидкость-жидкость, в которой в объеме органического растворителя диспергированы капли воды, стабилизированные амфифильными молекулами, но оптически однородный и термодинамически стабильный жидкий раствор. Молекулы поверхностно-активных веществ образуют мономолекулярный слой вокруг капли воды нанометрового размера таким образом, что гидрофобные углеводородные цепочки направлены к

органическому растворителю, а полярные части молекулы внутрь гидрофильного ядра мицеллы [287].

Экстракция в СОМ является привлекательным и легко масштабируемым методом разделения белков Факторы, влияющие на эффективность разделения в СОМ, включают характер и концентрацию целевого белка, рН и ионную силу водной фазы, температуру экстракции, тип и концентрацию поверхностно-активного вещества, и время экстракции [288].

Как правило, процесс выделения состоит из двух простых этапов: прямой процесс экстракции, заключающийся во включение белков из исходного супернатанта в водную фазу обратных мицелл в неорганическом растворителе, и обратная экстракция, при которой белки переходят из обратных мицелл в другой водный раствор [289]. Применение СОМ ограничено по нескольким причинам. Чем выше концентрация поверхностно-активного вещества, тем труднее выделить и восстановить белок, также диапазон органических растворителей, позволяющие растворять белки без денатурирующего эффекта, ограничен для данного применения [289-291].

Nandini и соавторы [292] исследовали возможность применения катионного поверхностно-активного вещества

цетилтриметиламмонийбромида в системе обратных мицелл для очистки липазы. Поиск оптимальных условий проведения процесса разделения белков осуществляли с использованием методов математического планирования. Наилучшие условия для прямой экстракции - концентрация соли 0,16 М, концентрация поверхностно-активного вещества 0,20 М и рН 9,0; для обратной экстракции - концентрация соли 0,80 М и рН 7,23. В данных условиях получен фермент с выходом 78 % и степенью очистки 4,0.

Raghavendra и соавторы [293] очищали липазу Pseudomonas sp. CSD3, применяя экстракцию в системе ОМ поверхностно-активного вещества AOT (бис-2-этилгексил) сульфосукцинат натрия) - изооктан. В такой системе липазу удалось очистить в 15 раз с выходом 80 %. Для прямой экстракции исходный раствор фермента смешивали с 25 мМ АОТ и изооктаном, смесь

инкубировали при 25 °С в течение 30 мин в условиях постоянного перемешивания. Обратную экстракцию проводили с использованием 0,05 М NaCl в 50 мМ буфере Трис-С1, рН 7,0 и 15% изопропанола (1:1) при 25 °С в течение 30 мин.

Флотация в водных двухфазных системах

Флотация в водной двухфазной системе (ФВДС) представляет собой метод, объединяющий два процесса - флотацию белка, т.е. перенос с пузырьком газа (например, азот) адсорбировавшегося на его поверхности белка, и процесс распределения белков в водной двухфазной системе. В данном случае восходящий поток газа улучшает массоперенос поверхностно-активных белков и, как следствие, повышает эффективность процесса разделения и повышение концентрационного коэффициента при использовании небольших количеств ПЭГ [294].

Tan и соавторы сообщили [295] об использовании флотации в ВДС, состоящей из ПЭГ8000 и цитрата натрия, для очистки термостабильной липазы 42 из рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Оптимальные условия очистки липазы: длина рабочей линии (TLL) 25,4%, объемное соотношение (VR) 0,3, массовая доля загрузки 20 %, рН 7, среднее время флотации 10 мин и объемный расход азота 20 мл/мин. В этих условиях степень очистки липазы составила 4,05 с эффективностью разделения 99 %.

В другом исследовании, проведенном Preshna Mathiazakan и соавторами [296], для выделения липазы из культуральной жидкости Burkholderia cepacia использовали ФВДС состоящей из спирта и соли. Были исследованы и подобраны параметры процесса, включая количество исходного раствора фермента, тип спирта и соли, концентрации спирта и соли, объемы буферного раствора и спирта. Проссес флотации в системе 1 -пропанола и сульфата аммония характеризовался фактором очистки 12,2, эффективность разделения 93 % и селективностью 40. Кроме того, авторы провели сравнение между мелкомасштабным и крупномасштабным применением ФВДС, которое

показало, что данный метод может использоваться для промышленных процессов.

В работе [294] описано выделение липазы из культуральной жидкости Burkholderia cepacia ST8 с помощью ФВДС, состоящей из термочувствительного сополимера EOPO (этиленоксида и пропиленоксида) и сульфата аммония. Авторами подобраны условия процесса: молекулярная масса EOPO 3900 г/моль, концентрация сульфата аммония 250 г/л, рН 6, исходный объем фазы EOPO 10 мл, концентрация EOPO 50 %, общий объем водной системы 200 мл, доля загрузки раствора фермента 40 %, расход азота 30 мл/мин, время флотации 60 мин. В таких условиях средняя эффективность разделения и очистки составили 76 % и 13 %, соответственно.

1.6 Выводы по разделу

Производство рыбы на душу населения увеличилось на 17,5 % за 10-летний период. Россия входит в десятку ведущих стран по добыче рыбы в мире. Доля продовольственных потерь и отходов в мировом рыбном хозяйстве достигает 35 % от вылова. Большая часть послепромысловых потерь и отходов рыбы обусловлены недостатками технического, технологического и/или инфраструктурного характера

Рыбоперерабатывающая промышленность генерирует большое количество твердых отходов. Твердые отходы составляют 20-60% от массы исходного сырья и представлены различными остатками.

Основные направления использования отходов - производство рыбной кормовой муки и жира, хотя отходы могут служить источником ряда ценных продуктов, обладающих биологической активностью.

Липидсодержащие отходы от разделки рыбы являются ценным источником полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), в особенности эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой кислот (ДГК), а также жирорастворимых витаминов. ПНЖК обладают большой физиологической значимостью для здоровья человека.

Чтобы сконцентрировать жирные кислоты в любом жире, первое, что нужно сделать, это превратить природные триглицериды в этиловые эфиры (ЭЭ) или свободные жирные кислоты (СЖК). Трансэтерификацию жира с этанолом можно проводить и с помощью ферментов - липаз.

Использование липаз для синтеза, расщепления и модификации жиров и масел имеет ряд преимуществ: ферментативная реакция протекает в мягких условиях, с меньшим количеством отходов, простота отделения биокатализатора, возможность многократного использования катализатора, субстратная специфичность фермента.

Методы концентрирования ПНЖК многочисленны, но лишь немногие из них подходят для крупномасштабного производства. Фракционирование мочевиной рассматривалось в течение многих лет как интересный инструмент для производства концентратов омега-3 ПНЖК. Данный метод обладает высокой селективностью по отношению к длине углеродной цепи, количеству двойных связей, степени разветвленности молекулы.

Основные отрасли промышленности, где липазы находят применение: пищевая, молочная, масложировая переработка, аграрная, производство бумаги, как добавка к моющим средствам, органический синтез, косметическая и фармацевтическая промышленности. Ферменты бактерий и грибов имеют огромный потенциал в качестве промышленных биокатализаторов, вследствие простоты получения и выделения. Липазы различных организмов или изоферменты одного организма могут значительно различаться по молекулярной массе, оптимальным значениям рН и температуры, посттрансляционной модификацией, субстратной и реакционной специфичностью.

В основном микроорганизмы продуцируют липазы внеклеточно, поэтому для выделения фермента используют культуральную жидкость. Поэтому первым шагом в получении препаратов липаз является удаление клеток и других нерастворимых веществ из культуральной жидкости. Это достигается с помощью микрофильтрации или центрифугирования.

Ультрафильтрацию используют чтобы сконцентрировать полученную жидкость. Затем ферменты обычно осаждают органическими растворителями или солями. Пожалуй, самый распространенный метод осаждения белка это осаждение сульфатом аммония. После стадии осаждения обычно используют хроматографические методы разделения белков.

2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

Коллекционные штаммы микроорганизмов кафедры ТМС СПбГТИ(ТУ), образцы компоста ТКО (Опытный завод МПБО, пос. Горелово) и выделенные из них термофильные продуценты липаз, образцы жиров различного происхождения, коммерческие препараты липаз (Novozym 435, Lipozyme ЯМ 1М, Lipozyme ТЬ 1М), питательные среды для культивирования продуцентов липаз, процессы ферментативной трансэтерификации липидов, комплексообразования ЭЭЖК с мочевиной.

2.2 Выделение жиров из отходов рыбопереработки

Свежие отходы рыбопереработки (головы, хвосты, плавники и внутренности), полученные с рыбообрабатывающего предприятия Санкт-Петербурга измельчали, замораживали, и лиофильно сушили. Из высушенных образцов экстрагировали липиды в экстракционном аппарате Сокслета разными органическими растворителями - н-пентаном, н-гексаном, ацетоном, диэтиловым эфиром, хлороформом.

2.3 Анализ физико-химических показателей липидного сырья

Содержания влаги в сырье определяли по ГОСТ Р 50456-92 [297].

Для определения йодного числа использовали методику по ГОСТ 207082 [298].

Определение кислотного числа проводили по ГОСТ Р 50457-92 [299].

Содержание фосфорсодержащих веществ в липидном сырье определяли по ГОСТ Р 52676-2006 [300].

Для определения количества неомыляемых веществ в сырье использовали методику по ГОСТ 5479-64 [301].

Перекисное число определяли по ГОСТ Р 51487-99 [302].

2.4 Тонкослойная хроматография жиров

Методом тонкослойной хроматографии анализировали фракционный состав сырья. Использовали пластины для тонкослойной хроматографии silufol 150х150 мм иу 254.

Исследуемый образец липидов объемом 0,1 мл растворяли в 0,9 мл хлороформа. Полученный раствор при помощи микрошприца наносили на пластину с интервалами между исследуемыми пробами 1,5 см, отступая при этом от нижнего края и с обеих сторон по бокам пластинки 1,5 см. Объем каждой из проб, нанесенной на пластинку посредством микрошприца, составил 1 мкл.

В качестве хроматографической камеры использовали стеклянную камеру с притертой стеклянной крышкой

Система растворителей: петролейный эфир - диэтиловый эфир -уксусная кислота (70:30:1). Проявители: йод, сульфат аммония, серная кислота.

Подвижность компонентов в смеси определяли по фактору удерживания Rf, который вычисляли по уравнению 1.

(1)

> X/ к у

где X1 - расстояние, пройденное зоной вещества от стартовой линии до центра зоны, Xf - расстояние, пройденное растворителем за тоже время (расстояние от стартовой линии до границы фронта растворителя к концу опыта).

2.5 Газохроматографический анализ

Методом газовой хроматографии определяли жирнокислотный состав липидного сырья (ГОСТ Р 51483-99 [303]). Предварительно пробу трансэтерифицировали в растворе гидроксида калия в метаноле.

Колонка SE-52 (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм), детектор - пламенно-ионизационный. Газ-носитель - гелий, скорость потока 1 мл/мин. Температура испарителя и детектора 250 °C и 230 °C, соответственно. Начальная температура колонки 100 °C и время выдержки 4 мин, затем нагрев до 180 °C со скоростью 10 °Омин, время выдержки при 180 °C - 10 мин, и затем нагрев до 250 °C со скоростью 5 °Омин.

Идентификацию компонентов смеси проводили по времени удерживания, сравнивая со стандартной смесью Supelco 37 Component FAME Mix.

2.6 Ферментативный этанолиз липидного сырья

10 г рыбьего жира и 1,47- 4,4 г этанола переносили в плоскодонный стеклянный реактор (объемом 50 см3, внутренний диаметр 35 мм) с рубашкой, подключенной к водному термостату. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании 300 мин-1 до достижения необходимой температуры (25 - 60 °C), затем вносили ферментный препарат (от 5 до 50%масс. от массы рыбьего жира). Реакцию проводили в атмосфере аргона. Периодический отбирали образцы объемом по 100 мкл. Также ферментативный этанолиз проводили в атмосфере воздуха для определения влияния атмосферного кислорода конечный продукт.

По окончании реакции к реакционной смеси добавляли 20 мл хлороформа, и полученную суспензию фильтровали. Ферментный препарат промывали 10 мл хлороформа для удаления масла и затем сушили. Раствор ЭЭЖК в хлороформе трижды промывали порциями по 50 мл дистиллированной воды в делительной воронке. Органический растворитель удаляли на роторном испарители, и ЭЭЖК сушили в токе инертного газа (азота или аргона) при температуре 40 °C 2 часа.

2.7 Дробное комплексообразование с мочевиной

В 100 мл колбе смешивали 10 г этиловых эфиров жирных кислот, 15 мл циклогексана, 3 г мочевины и 10 мл метанола. Полученную смесь нагревали

при перемешивании на магнитной мешалки до тех пор, пока мочевина полностью не растворялась. После этого смесь охлаждали до комнатной температуры (25 °С) при перемешивании на магнитной мешалке. Затем колбу присоединяли к роторному испарителю и удаляли растворители.

Затем 15 мл циклогексана добавляли в колбу, размешивали на магнитной мешалке и фильтровали через мелкопористый фильтр Шотта под разряжением. Осадок промывали дважды порциями по 15 мл циклогексана.

Фильтрат объединяли в колбе объемом 100 мл и удаляли растворитель на роторном испарителе. Затем в колбу добавляли 15 мл циклогексана, 3 г мочевины и 10 мл метанола и процедура описанная выше повторялась восемь раз.

Фракции содержащие осадок комплекса мочевины с ЭЭЖК были растворены в смеси 100 мл теплой (40-50 °С) дистиллированной воды и 50 мл н-гексана в делительной воронке. Фракции содержащие н-гексан и ЭЭЖК отмывались дважды в делительной воронке теплой дистиллированной водой по 100 мл. Органический растворитель удаляли на роторном испарителе. Оставшиеся ЭЭЖК сушили в токе азота до постоянного веса. Жирнокислотный состав фракций определяли газовой хроматографией. .

2.8 Оценка влияние скорости охлаждения и соотношения компонентов

Был проведен полный факторный эксперимент для определения влияния соотношения компонентов и скорости охлаждения реакционной смеси на состав фракции ЭЭЖК не вошедших в комплекс с мочевиной. Факторы варьировали на двух уровнях: соотношение мочевина:ЭЭЖК 1:1 и 2:1; время охлаждения от 60 °С до 25 °С - 5 мин (охлаждая проточной холодной водой в стакане с рубашкой) и 300 мин (с использованием водного термостата). План эксперимента представлен в Таблице 4.

По результатам полного факторного эксперимента была построена математическая модель.

Таблица 4 - План эксперимента для оценки влияния скорости охлаждения и соотношения компонентов на жирнокислотный состав комплексов липидов и мочевины

№ эксперимента Соотношение (масс.) мочевина : ЭЭЖК Время охлаждения, мин

1 1 5

2 2 5

3 1 300

4 2 300

2.9 Изоляция термофильных продуцентов из компоста твердых

коммунальных отходов

Для выделения липазопродуцирующих микроорганизмов из компоста твердых коммунальных отходов возрастом 1, 2 и 3 года 10 г компоста разводили в 100 мл стерильной водопроводной воды, перемешивали в течении 1 часа на качалке (230 мин-1) при 30 °С. Объем 10 мл полученной суспензии переносили в колбы с элективной средой, следующего состава: растительное масло - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 1 г/л; №С1 - 2 г/л; MgSO4 - 0,4 г/л; MgQ2 - 0,7 г/л; СаСЪ - 0,5 г/л; КН2РО4 - 0,3 г/л; (№>2804 - 0,5 г/л. рН среды доводили до 7,0. Среду автоклавировали при избыточном давлении 0,5-105 Па в течении 30 минут. Накопительные культуры микроорганизмов получали при 50 °С в течении 24 часов в термостатированной установке с перемешиванием посредством магнитной мешалки. Наработанные данным методом культуры микроорганизмов были пересеяны штрихом на чашки Петри с селективной средой с Родамином Б для идентификации липазопродуцентов.

2.10 Родаминовый метод определения липолитической активности

Качественный анализ гидролитической активности липаз бактерий проводили с использованием агаризованной среды следующего состава: 36,5 г/л сухого питательного агара; 4 г/л хлорида натрия; 31,25 г/л растительного масла, 2,5 г/л твина-80, 10 мг/л ромдамин Б.

Среда подвергалась автоклавированию при избыточном давлении 0,5-105 Па в течение 30 мин. Отдельно готовился 0,1 % водный раствор родамина Б в стерильной воде. Растительное масло стерилизовали отдельно от основной среды в таких же условиях. Среду охлаждали до 50 °С, добавляли к ней растительное масло и родамин В при интенсивном перемешивании. После выдерживали в течение 10 мин при 50 °С до снижения вспенивания. Далее среду разливали в чашки Петри по 15-20 мл.

Посев микроорганизмов производился штрихом. После 24 часов инкубации при температуре 50 °С агаровые пластины были визуально изучены под УФ светом. Наличие липолитической активности определяли по появлению оранжевой люминесцирующей зоны вокруг штриха культуры микроорганизмов. Культуры, образующие такие зоны, были пересеяны на чашки Петри с питательной средой с кальциевыми солями, для дальнейшего исследования.

2.11 Определение липолитической активности по образованию зон

кальциевых солей

Определить наличие у микроорганизмов липолитической активности можно высевая его на среду с соответствующим липидом. Однако липиды не смешиваются с водой, поэтому обычно вместо липидов в среду вводят твины - эфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-60 - стеариновую, твин-80 - олеиновую кислоту. Твины хорошо растворимы в воде, имеют нейтральную реакцию. На присутствие внеклеточной липазы указывает образование вокруг колонии или штриха непрозрачной (мутной) зоны кальциевых солей жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза твина.

Для разделения липопродуцирующих микроорганизмов по морфологическим признакам использовали агаризованную среду с кальциевыми солями. Состав данной среды: пептон - 10 г/л; К2НР04 - 1,0 г/л; СаС12 - 0,1 г/л; агар-агар - 20 г/л, №С1 - 5,0 г/л. Среда подвергалась

стерилизации при избыточном давлении 1 • 105 Па в течение 30 мин. Отдельно готовили 20 % водный раствор твина-80 и стерилизовали с помощью стерильного фильтра. Его добавляли в количестве 5 мл на 100 мл стерильной среды, остывшей до 50 °С. Колонии бактерий, показавших липолитическую активность, пересевали с чашек с родамином В на чашки с кальциевыми солями. Бактерии культивировали при 50 °С в термостате в течении 24 часов. Морфологически различные культуры, которые образовывали кальциевые соли, пересевали на пробирки со скошенным агаром (состав - сухой питательный агар), идентифицировали и использовали в дальнейшей работе.

2.12 Идентификация культуры продуцентов липаз с помощью метода

MALDI-TOF масс-спектрометрии

Для масс-спектрометрического исследования из чашек Петри отбирали небольшое количество микроорганизмов и наносили на мишень. Параллельно, на соседнюю лунку матрицы наносили такое же количество микроорганизмов и покрывали лизирующим буфером, состоящего из 70 % раствора муравьиной кислоты, 30 % раствора ацетонитрила и 0,1 % раствора додецилсульфата натрия (SDS) для лучшего разрушения клеточных стенок и давали высохнуть. После высыхания образца на него наслаивали 1 мкл матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота). Масс-спектрометрическая идентификация микроорганизмов производилась на масс-спектрометре МююР1ех (Вгикег, Германия), рисунок 1.

Рисунок 1 - Масс-спектрометр MALDI TOF компании Bruker

Каждый образец тестировали в 2-х повторах. Снятие спектров проводилось в автоматическом режиме. Режим детекции стандартный -MBT_FC (линейная поляризация, с диапазоном детекции белков от 2-20 кДа). С каждого образца получали 240 спектров, которые в конечном итоге накладывались друг на друга. Идентификация производилась с помощью базы данных MALDI BioTyper database (version 3.0; количество спектров [MSP] 5627 клеточных микроорганизмов) (Bruker, Германия). Для определения степени согласия предложенного метода с референсными была использована биоинформатическая статистика - мера согласия, которая имеет максимум 3,000 при полном согласии, и равна от 0 до 1,699 в том случае, если согласие между оценками (тестами) наблюдается не чаще, чем можно было бы ожидать при случайном совпадении, когда как показания от 1,700 до 1,999 показывают приблизительные результаты. Значения от 2,000 до 2,299 считаются хорошей степенью согласия, которая позволяет точно определить вид культуры, но род культуры не имеет 100 % гарантии идентификации. Коэффициенты от 2,299 до 3,000 показывают 100 % совпадение рода и вида микроорганизмов.

2.13 Определение наиболее активного продуцента липаз

Для нахождения наиболее активного продуцента липаз проводилось глубинное культивирование потенциальных культур микроорганизмов. Вначале готовился посевной материал, для этого культуры бактерий культивировали в пробирках со скошенным агаром (состав - сухой питательный агар) при температуре 50 °С в течение 1 суток.

Состав полусинтетической жидкой среда для глубинного культивирования: масло растительное- 2,5 г/л; пептон - 4,5 г/л; КН2Р04 - 0,5 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; N^N03 - 1,0 г/л; MgS04x7Н20 - 0,5 г/л; СаС12 - 0,1 г/л; вода водопроводная - 1 л. Среду стерилизовали в автоклаве насыщенным паром при избыточном давлении 0,5-105 Па в течении 30 минут.

Инокуляцию жидкой питательной среды производили смывом стерильной водопроводной водой бактериальных культур из пробирок со скошенным агаром в колбы Эрлеймейера объемом 750 мл с 200 мл жидкой питательной среды. Культивирование проводили на роторной качалке (частота вращения 230 мин-1) при 30 °С в течении 24 часов. По истечении 24 часов культуры микроорганизмов сравнивались на липолитическую активность фотоколориметрическим методом с использованием пара-нитрофенилпальмитата. Штамм, с наибольшей липолитической активностью отобран для дальнейшей наработки фермента.

2.14 Определение концентрации белка методом Лоури

Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли методом Лоури [304]. Экстинкцию раствора измеряли на фотометре КФК-3 при длине волны 750±3 нм. Концентрацию белка в исследуемом растворе определяли по калибровочному графику.

2.15 Определение липолитичекой активность по гидролизу 4-

нитрофенилпальмитата

Определение липолитической активности осуществляли по гидролизу 4-нитрофенилпальмитата. Нами был модифицирован метод, предложенный в литературе [305].

Суть метода заключается в определении единиц активности (Е) липаз, как количестве микромолей 4-нитрофенола, отщепившегося в процессе гидролиза 4-нитрофенилпальмитата за 1 мин при 30 °С [306-308].

Реакционная смесь состояла из смеси двух растворов: реактив А -приготавливается путем растворения 50 мг 4-нитрофенилпальмитата в 25 мл изопропанола; реактив Б - готовится 0,5% раствор Triton X-100 в 0,2 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,14.

Опыт проводили следующим образом: в пробирку вносили 4,5 мл реактива Б, затем приливали 0,25 мл исследуемого образца фермента, после этого добавляли 0,25 мл реактива А. Контроль был приготовлен аналогичным образом, где вместо исследуемой липазы вносили 0,25 мл дистиллированной воды. Смесь для осуществления ферментной реакции помещали в термостат при 30 °С на 15-60 минут. По истечении указанного времени измеряли экстинкцию полученного раствора при длине волны 405±3 нм (паранитрофенол имеет максимум поглощения в пределе от 400 до 410 нм) против контроля в кюветах с толщиной слоя 10 мм. По полученным данным рассчитывают единицы ферментативной активности липазы (Е) по формуле 2.

D Vm

А = — • —EL. (2)

К Уф-t' v у

где D - оптическая плотность раствора, K = 12310 - молярный коэффициент экстинкции при рН 7,14 (при толщине полгощающего слоя 10 мм), 1/моль;

Уср - объем среды, мл,

Уф - объем исследуемого образца, мл,

t - время с внесения в образец субстрата, мин.

Удельную активность рассчитывали, как отношение единиц активности (Е) к концентрации белка.

2.16 Методика скрининга продуцентов липаз

Скрининг продуцентов липаз проводили в два этапа. На первом этапе выявляли наличие/отсутствие липолитической активности на агаризованной питательной среде. На втором этапе определяли количественным методом липолитическую активность на жидкой питательной среде.

Для первого этапа скрининга использовали агаризованные среды различного состава для бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. Для скрининга бактерий и дрожжей на агаризованной среде был использован метод, описанный в [309]. Для определения активных штаммов среди микромицетов был использован метод описанный в [310].

Среда для скрининга бактерий, г/л: пептон - 10,0; K2HPO4 - 1,0; CaCl2 -0,1; агар-агар - 20; NaCl - 5,0.

Среда для скрининга дрожжей, г/л: сухой питательный агар - 40; глюкоза - 10; CaCl2 - 0,2.

Среды стерилизовали автоклавированием при избыточном давлении 50,7 кПа в течение 30 минут. Отдельно готовили 20 % водный раствор Твина-80, стерилизовали при избыточном давлении 50,7 кПа 30 минут в автоклаве и добавляли к стерильной среде. Концентрация Твин-80 в питательной среде - 5 %. Среду разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. На поверхность агаровой пластинки делали посев исследуемых бактерий/дрожжей со скошенного агара штрихом в трёх повторностях.

Состав среды для скрининга микромицетов, г/л: KH2PO4 - 0,7; K2HPO4

- 0,3; MgSO4 X7H2O - 0,5; NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; FeSO4*7H2O - 0,01; сахароза

- 30; родамин В (0,1 % раствор) - 2 мл; оливковое масло - 30 мл; Твин-80 -0,25 мл; агар-агар - 10. Среду подвергали стерилизации автоклавированием при избыточном давлении 50,7 кПа в течение 30мин. Отдельно готовили 0,1 % водный раствор родамина В в стерильной воде. Оливковое масло и Твин-80

стерилизовали отдельно от основной среды при избыточном давлении 50,7 кПа в автоклаве в течение 30 минут. Среду охлаждали до 60 °С, смешивали оливковое масло, Твин-80 и родамин В и добавляли к остывшей стерильной среде при интенсивном встряхивании. После выдерживали в течение 10 мин при 60 °С до снижения вспенивания. Далее среду разливали в чашки Петри по 20 мл. Культуры высевали уколом в центр агаровой пластинки и инкубировали при 30 °С.

Глубинное культивирование продуцентов липаз проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл среды на роторной качалке (частота вращения 230 мин-1) при 28-32 °С. Посевной материал для глубинного культивирования выращивали в два этапа. На первом этапе культуры бактерий со скошенного агара петлёй вносили в жидкую питательную среду, г/л: масло оливковое - 5,0; Твин 80 - 5,0; пептон - 3,0; КН2РО4 - 1,0; дрожжевой экстракт - 1,0; NH4N03 - 1,0; MgS04x7H20 - 0,5. Через сутки культивирования на качалке (второй этап) получали посевной материал на жидкой среде, которым засевали колбы с таким же составом питательной среды. Количество посевного материала составляло 5 % от объёма среды в колбе. Культивирование проводили в течение суток.

От культуральной жидкости клетки отделяли центрифугированием при 4000 g в течении 15 минут. В нативном растворе определяли количество белка методом Лоури и липолитическую активность по гидролизу Твин-80.

2.17 Определение липолитичекой активность по гидролизу Твин-80

Активность липазы измеряли модифицированным методом Shukla [311]. В качестве субстрата липазы использовали 40 % Твин-80. К 5 мл 40 % раствора Твина-80 добавляли 4 мл дистиллированной воды и 1 мл нативного раствора. Ферментативную реакцию проводили при 37 °С, на качалке при 250 мин-1 в течение 3-х суток, реакцию останавливают добавлением 30 мл этанола 95 %. Освобождённые из Твина-80 кислоты титровали 0,05 н раствором КОН в присутствии 1% раствора фенолфталеина в качестве индикатора. Отдельно

готовили контрольную пробу: к 5 мл 4 0% раствора Твина-80 добавляли 4 мл воды и ставили на качалку при 250 мин-1 на 3-е суток. После добавляли 30 мл этанола 95 % и 1 мл нативного раствора. За единицу активности липазы (Е) принимали количество фермента, необходимое для освобождения 1 мкмоля олеиновой кислоты за 1 минуту при заданной температуре.

2.18 Оптимизация состава питательных сред

Оптимизацию состава питательных сред проводили в три этапа: первый этап - отсеивающий эксперимент (план Плакетта-Бермана) [312], второй этап - оптимизация состава по методу крутого восхождения [313]; третий этап -эксперимент на основе плана Бокса-Бенкена [314] для описания области оптимума. Все расчеты проводились с помощью пакета прикладных программ «ЗТАТЭТГСА». Уровень доверительной вероятности принимали равным 95%.

Оптимизация состава питательной среды для ВЛкыг^1ет1Б

В качестве исходного состава питательной среды была взята среда, содержащая семь компонентов. Для оценки эффектов влияния концентраций этих компонентов на продукцию липазы культурой B. thuringiensis проводили эксперимент в соответствии с планом Плакетта-Бермана (Таблица 5) для семи компонентов питательной среды (факторов): Х1 - Масло оливковое, Х2 -Твин-80, Х3 - Пептон, Х4 - Дрожжевой экстракт, Х5 - КН2РО4, Х6 -N^N0^ Х7- MgS04. В качестве отклика определялась удельная липолитическая активность культуральной жидкости. Исходному составу питательной среды соответствуют среды .№9 и .№10 в Таблице 5 (центральные точки плана).

Таблица 5 - Отсеивающий эксперимент для B.thuringiensis

№ Х1, г/л Х2, г/л Х3, г/л Х4, г/л Х5, г/л Х6, г/л Х7, г/л

1 2,5 2,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0,25

2 7,5 2,5 1,5 0,5 0,5 1,5 0,75

Продолжение таблицы 5

№ XI, г/л Х2, г/л Х3, г/л Х4, г/л Х5, г/л Х6, г/л Х7, г/л

3 2,5 7,5 1,5 0,5 1,5 0,5 0,75

4 7,5 7,5 1,5 1,5 0,5 0,5 0,25

5 2,5 2,5 4,5 1,5 0,5 0,5 0,75

6 7,5 2,5 4,5 0,5 1,5 0,5 0,25

7 2,5 7,5 4,5 0,5 0,5 1,5 0,25

8 7,5 7,5 4,5 1,5 1,5 1,5 0,75

9 5,0 5,0 3,0 1,0 1,0 1,0 0,50

10 5,0 5,0 3,0 1,0 1,0 1,0 0,50

Отобранные значимые факторы, на следующем этапе оптимизации состава питательной среды, варьировали используя метод крутого восхождения по градиенту [313]. Траектория крутого восхождения определялась линейной моделью полученной на основе плана Плакетта-Бермана.

Для изучения области оптимума варьировались концентрации компоненты питательной среды, отобранные ранее как наиболее значимые, в соответствии с планом Бокса-Бенкена (Таблица 6) [314].

Таблица 6 - План и эксперимента по Боксу-Бенкену для B.thuringiensis

№ Х1, г/л Х2, г/л Х3, г/л

1 2,0 7,0 5,5

2 3,0 7,0 5,5

3 2,0 8,0 5,5

4 3,0 8,0 5,5

5 2,0 7,5 5,0

6 3,0 7,5 5,0

7 2,0 7,5 6,0

8 3,0 7,5 6,0

9 2,5 7,0 5,0

10 2,5 8,0 5,0

11 2,5 7,0 6,0

12 2,5 8,0 6,0

13 2,5 7,5 5,5

14 2,5 7,5 5,5

15 2,5 7,5 5,5

Оптимизация состава питательной среды для ЯкойососсыБ едш

В таблице 7 представлена матрица планирования эксперимента по Плакетту-Берману для семи компонентов питательной среды.

В качестве откликов определялась липолитическая активность культуральной жидкости (как объемная, так и удельная).

Таблица 7 - Таблица отсеивающего эксперимента для Rh. equi

№ среды Концент зация компонентов среды, г/л

Масло Твин-80 Пептон Дрожжевой экстракт KH2PO4 NH4NOз MgSO4•7H20

1 2,5 2,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0,25

2 7,5 2,5 1,5 0,5 0,5 1,5 0,75

3 2,5 7,5 1,5 0,5 1,5 0,5 0,75

4 7,5 7,5 1,5 1,5 0,5 0,5 0,25

5 2,5 2,5 4,5 1,5 0,5 0,5 0,75

6 7,5 2,5 4,5 0,5 1,5 0,5 0,25

7 2,5 7,5 4,5 0,5 0,5 1,5 0,25

8 7,5 7,5 4,5 1,5 1,5 1,5 0,75

9 5,0 5,0 3,0 1,0 1,0 1,0 0,50

На втором этапе оптимизации состава питательной среды был проведен эксперимент на основе плана Бокса-Бенкена, в котором варьировались компоненты питательной среды, отобранные на первом этапе как наиболее значимые (Таблица 8).

Таблица 8 - План эксперимента по Боксу-Бенкену для Rh. equi

№ среды Концентрация компонентов среды

Масло, г/л Соотношение твин-80 : масло, г/г Пептон, г/л

1 1,0 1,0 0,5

2 1,0 1,0 2,5

3 1,0 3,0 0,5

4 1,0 3,0 2,5

5 4,0 1,0 0,5

6 4,0 1,0 2,5

7 4,0 3,0 0,5

8 4,0 3,0 2,5

9 1,0 2,0 1,5

10 4,0 2,0 1,5

11 2,5 1,0 1,5

Продолжение таблицы 8

№ среды Концентрация компонентов среды

Масло, г/л Соотношение твин-80 : масло, г/г Пептон, г/л

12 2,5 3,0 1,5

13 2,5 2,0 0,5

14 2,5 2,0 2,5

15 2,5 2,0 1,5

16 2,5 2,0 1,5

Оптимизация состава питательной среды для Bacillus licheniformis

В таблице 9 представлена матрица планирования эксперимента по Плакетту-Берману для семи компонентов питательной среды. В качестве откликов определялась липолитическая активность культуральной жидкости (как объемная, так и удельная).

Таблица 9 - Таблица отсеивающего эксперимента для B. lichenofirmis

№ среды Концентрация компонентов среды, г/л

Масло Пептон Дрожжевой Экстракт О Рч С~1 к ^ со О £ К £ О С~1 к V О со ад CaCl2

1 2 3,5 0,25 0,75 2 0,50 0

2 2 3,5 0,75 0,75 1 0,00 0,2

3 2 5,5 0,25 0,25 2 0.00 0,2

4 2 5,5 0,75 0,25 1 0,50 0

5 3 3,5 0,25 0,25 1 0,50 0,2

6 3 3,5 0,75 0,25 2 0.00 0

7 3 5,5 0,25 0,75 1 0.00 0

8 3 5,5 0,75 0,75 2 0,50 0,2

9 2,5 4,5 0,50 0,50 1,50 0,25 0,1

На втором этапе оптимизации состава питательной среды был проведен эксперимент на основе плана Бокса-Бенкена, в котором варьировались компоненты питательной среды, отобранные на первом этапе как наиболее значимые, приведено в таблице 10.

Таблица 10 - План эксперимента по Боксу-Бенкену для В. lichenofirmis

№ Среды Концентрация компонентов, г/л

Масло Пептон КН2РО4

1 2 4 0,75

2 4 4 0,75

3 2 7 0,75

4 4 7 0,75

5 2 5,5 0,5

6 4 5,5 0,5

7 2 5,5 1

8 4 5,5 1

9 3 4 0,5

10 3 7 0,5

11 3 4 1

12 3 7 1

13 3 5,5 0,75

14 3 5,5 0,75

15 3 5,5 0,75

16 3 5,5 0,75

Глубинное культивирование

Для подготовки посевного материала для глубинного процесса культивирования штаммы бактерий выращивали в пробирках на скошенном агаре (из сухого питательного агара) при температуре 28 - 30 °С. Выращивание проводили до полного зарастания поверхности агара в течение двух суток. Биомассу переносили смывом в колбы Эрленмейера с жидкой питательной средой (состава №9 Таблицы ХХХ1) и культивировали одни сутки при температуре 28 - 30 °С. Глубинную культуру использовали в качестве инокулюма. На 100 мл питательной среды вносили 5 мл инокулюма.

Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера объёмом 0,75 л со 100 мл среды на роторной качалке (частота вращения 230 мин-1) при 28 - 30 °С.

Клетки бактерий отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при относительном ускорении 4800 g в течение 15 мин.

В полученном супернатанте определяли активность липолитических ферментов по гидролизу 4-нитрофелипальмитата и концентрацию белка методом Лоури.

2.19 Изучение динамики накопления липаз при глубинном

культивировании

Ферментацию продуцента липазы B. licheniformis проводили в аппарате Biostat A компании Sartorius, (Германия), объемом 5 л. Ферментер стерилизовался с питательной средой в автоклаве при избыточном давлении 50,7 кПа в течение 60 минут. Посевной материал выращивали глубинно в колбах Эрленмейера при 30 °С в течении 24 часов и вносился в ферментер через технологическое отверстие.

Культивирование проводилось при температуре 50 °С. Значение рН среды поддерживалось при 7,75 в автоматическом режиме, расход воздуха составлял 1699 мл/мин, частота вращения мешалки 348 мин-1. Общее время культивирование составило 24 часа, в течении которого каждый час отбирались пробы из ферментационной среды. Определяли экстинкцию проб при длине волны 600 нм (контроль - вода дистиллированная), по которой оценивали концентрацию микроорганизмов. Также в пробах определяли липолитическую активность по гидролизу 4-нитрофенилпальмитата и концентрацию белка методом Лоури.

2.20 Метод осаждения фермента сульфатом аммония

Для очистки фермента от клеток микроорганизмов, культуральную жидкость сначала центрифугировали при 9000 g и температуре 4 °С в течении 30 мин.

Для концентрирования культуральной жидкости использовали метод ультрафильтрации. Процесс ультрафильтрации проводили на ультрафильтрационной установке непроточного типа марки High-Output Stirred Cell (Millipore) объемом 1 литр. Для создания избыточного давления использовали воздушный компрессор. Марка используемых

ультрафильтрационных мембран - Ultracel YM с порогом отсечения по молекулярной массе 10 кДа.

После ультрафильтрации проводили выделение фермента методом осаждения белков сульфатом аммония. Для этих целей измеряли объем супернатанта и помещали его на ледяную баню в стеклянном стакане объемом 2 л. Кристаллический сульфат аммония добавляли небольшими порциями при постоянном перемешивании.

Первое осаждение проводили при 30%-ом насыщении сульфатом аммония (за 100 % насыщение принимают концентрацию сульфата аммония в насыщенном растворе при 0 °С).

Раствор выдерживали в течении 48 часов при 4 °С. Затем раствор центрифугировали 45 мин при 9000 g при температуре 4 °С. Надосадочную жидкость декантировали. Осадок собирали, растворяли в 30 мл охлажденного 0,1 М фосфотно-солевого буфера (PBS) pH 7,14 и помещали в холодильник.

Фермент, находящийся в супернатанте подвергали дальнейшему осаждению, предварительно определив объем надосадочной жидкости. Второе осаждение сульфатом аммония проводили при 50 %-ном насыщении сульфатом аммония. Раствор обрабатывали и центрифугировали аналогично предыдущему осаждению. Осадок растворяли в 30 мл буфера. После осаждения фермента определяли объем надосадочной жидкости (супернатанта).

Аналогичным образом проводили 2 последовательных осаждения липазы при концентрациях сульфата аммония 70 % и 90 %, предварительно определив объем полученного раствора.

В полученных при осаждении сульфатом аммония четырех фракциях определяли концентрацию белка методом Лоури и липолитическую активность фотоколориметрическим методом.

2.21 Ионообменная хроматография белков

Ионообменную хроматографию проводили на колонке с ДЭАЭ-Сефарозой (5,0х22 см).

Подбор значения рН буфера для хроматографии белков проводился эмпирически по следующей схеме. В разные пробирки вносились шпателем примерно одинаковые (по 0,5 мл) порции влажного сорбента. Многократной декантацией каждая порция уравновешивалась в 10 мл 0,1 М буфера, значения рН Tris/HQ буфера варьировали через 0,5 единицы в диапазоне рН от 7,0 до 9,0. Потом трехкратной декантацией концентрированные буферы заменялись буферами концентрацией 0,01—0,05 М с такими же значениями рН. Затем вносились одинаковые количества препарата липазы, полученного после высаливания, каждую пробирку, перемешивали в течение 10 мин, давали осесть обменнику и в отстое определяли содержание исходного вещества методом Лоури. Значение рН, при котором вещество в отстое только перестает обнаруживаться соответствует начальному моменту практически полной сорбции всего препарата на колонку.

Ферментный препарат наносили на колонку, которую предварительно уравновесили 0,05 М Tris/HQ буфером рН 8,0. В условиях эксперимента ферментный препарат, обладающий липазной активностью, связывался с сорбентом. Элюцию препарата вели 0,05 М Tris/HQ буфером, содержащим №С1 в диапазоне концентраций 0,1 до 1,0 М с шагом 0,1. В полученных фракциях определяли липолитическую активность и концентрацию белка методом Лоури.

2.22 Эксклюзионная хроматография белков

Для очищения полученных после ионообменной хроматографии фракций препарата был использован метод эксклюзионной хроматографии с использованием Сефадекса G-75. Гель для хроматографии готовили следующим образом: сухой Сефадекс G-75 суспендировали в 0,05 М Tris/HQ

буфере рН 8,0 буфере и оставляли для набухания на 24 часа. Перед набивкой колонки раствор с гелем дегазировали с помощью вакуумного насоса.

Для калибровки колонки использовали окрашенные вещества, для обнаружения которых не требуется прибегать к специальным методам определения. Для расчета коэффициентов распределения (К) определяли свободный объем колонки (Усв) и общий объем колонки (Уобщ). В качестве высокомолекулярного вещества, имеющего нулевой коэффициент распределения и выходящего со свободным объемом был использовали синий декстран. В качестве низкомолекулярного вещества, имеющего К=1 и выходящего с объёмом элюции равном Уобщ использовали красную кровяную соль. Третьим компонентом с коэффициентом распределения больше нуля, но меньше единицы, которым послужил витамин В12 (м.м. 1500). Пробу готовили путём смешивания равных объёмов исходных растворов (декстран синий, витамин В12, красная кровяная соль).

После калибровки колонки проводили хроматографическое разделение исследуемого ферментного препарата. Для нанесения образца использовали автоматический дозатор. Разделение проводили в течении времени не превышающем времени прохождения низкомолекулярного вещества.

Детекцию выходящих белков из колонки осуществляли с помощью проточного спектрофотометра при длине волны 245 нм. Собирались фракции отдельных «пиков». Фракции подвергали количественному определению белка по методу Лоури и ферментативной активности, рассчитывали удельную активность исходного препарата фермента и полученных фракций (пиков).

2.23 Иммобилизация фермента на частицах хитозана

Ферментный препарат липаз иммобилизовали на частицах хитозана (молекулярная масса 73 кДа, степень дезацетилирования 82%).

Перед иммобилизацией хитозан активировали глутаровым альдегидом. Для этого 3 г порошка хитозана заливали 30 мл воды и выдерживали в течение 3 часов при перемешивании на магнитной мешалке. Затем частицы фильтровали на стеклянном фильтре и промывали на фильтре 30 мл буфера 0,2 М Tris/HQ (рН 8). Отмытые частицы суспендировали в 20 мл 0,2 М Tris/HQ буфера (рН 8). К суспензии добавляли 2 мл 25% раствора глутарового альдегида и выдерживали 5 часов при перемешивании при температуре 20-30 °С. Затем частицы фильтровали на стеклянном фильтре, промывали буфером 0,05 М Tris/HQ (рН 8) и переносили в стеклянный стакан (50 мл).

В стакан к влажному хитозану добавляли концентрат 15-20 мл ферментного препарата (с концентрацией белка 1,5-2,0 мг/мл) и инкубировали 12 часов в холодильнике при 4 °С при перемешивании на магнитной мешалке. Затем частицы фильтровали на стеклянном фильтре, промывали сначала буфером 0,05 М Tris/HQ (рН 8), затем дистиллированной водой.

2.24 Методы определения кинетических констант выделенной липазы

Констант (^ и Vmax) ферментантивной реакции определяли графически, используя методы Лайнуивера-Берка и Хайнса-Вульфа, в которых осуществлена линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая зависимость скорости реакции V от концентрации субстрата переведена в линейную [315].

Для линеаризации по методу Лайнуивера-Берка использовали формулу (3) [316]:

Км А+—. (3)

^0 Ушах [5] V,

тах

В соответствии с методом Хайнса-Вульфа, уравнение Лайнуивера-Берка преобразуется путем умножения правой и левой частей на концентрацию субстрата, показано в уравнении (4) [316]:

[s] _ KM + (4)

Vmax Vmax

Для построения экспериментальных кривых определяли начальные скорости ферментативной реакции в одинаковых условиях, как описано в подразделе 2.17, но при различных концентрациях субстрата 4-нитрофенилпальмитата в диапазоне от 0,5 до 2,0 мМ.

2.25 Определение температурного оптимума липазы

Для определения оптимальной температуры липолитической активности фермента инкубировали 0,25 мл белкового раствора, добавленного к 5 мл раствора 4-нитрофенилпальмитата (конечная концентрация 2 мМ) в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,44) с 0,5 % Triton X-100, в течении 0,5-1 часов при температурах 30 °С, 40 °С, 50 °С, 55 °С, 60 °С и 65 °С. Затем измеряли экстинции полученных растворов на спектрофотометре КФК-3 при длине волны (405±3) нм.

2.26 Статистические методы обработки результатов

Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась стандартными методами расчета ошибок средних, доверительных интервалов, стандартных отклонений. При выборе подходящего метода математического анализа, применимого к результатам конкретного эксперимента, руководствовались рекомендациями, приведенными в соответствующей литературе [317; 318]. Все расчеты и математические анализы выполнены с помощью программы STATISTICA.

3 ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ЭТИЛОВЫХ

ЭФИРОВ ПНЖК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОММЕРЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ

3.1 Выделение жира из отходов рыбопереработки

Свежие отходы рыбопереработки (головы, хвосты, плавники и внутренности), полученные с рыбообрабатывающего предприятия Санкт-Петербурга (содержание воды варьировалось 66,4-89,2 %, содержание жиров на сухой вес 11,5 - 38,8 %), измельчали, замораживали и лиофильно сушили.

Из высушенных образцов экстрагировали липиды в экстракционном аппарате Сокслета органическим растворителем. Так как ПНЖК чувствительны к температурам, для предотвращения длительного нагрева образцов при экстракции липидов был использован н-пентан, температура кипения которого 36 °С Выход жиров при экстракции н-пентаном меньше, чем при использовании диэтилового эфира, н-гексана или ацетона, но получаемый экстракт характеризуется большим содержанием триацилглицеридов и меньшими значениями кислотного и перекисного чисел. Получаемые липидные экстракты имели следующие характеристики: содержание воды 0,16±0,09 %, йодное число 93 - 164 г 12 100 г-1, кислотное число 6,0 - 26,4 мг KOH г-1, перекисное число 1,6 - 10,8 ммэк O2 кг-1, содержание полиненасыщенных жирных кислот 18,7 - 33,2 %, содержание триацилглицеридов 65,4 - 91,4 %.

Очевидно, что высокое содержание свободных жирных кислот делает невозможным (без значительных потерь в выходе продукта из-за образования мыла) проведение трансэтерификации данных жиров с использование щелочного катализатора.

Полученные фракции жиров объединяли (за исключением фракций с высоким содержанием перекисного числа) и использовали в дальнейшей работе - получение этиловых эфиров жирных кислот.

3.2 Характеристика липидного сырья

В таблице 11 приводится сравнение значениий основных показателей качества жира экстрагированного из отходов рыбопереработки и жиров морских гидробионтов, полученных из разных источников: рафинированный рыбий жир, производитель ООО «Полярис», г. Мурманск; рыбий жир для животных, производитель ООО «НВЦ Агроветзащита С.-П.», г. Сергиев Посад; рыбий жир последней вытопки, производитель ООО «Полюс», г. Москва; рыбий жир после кислотного гидролиза отходов кильки, производитель ЗАО «Гипрорыбфлот-ЭКОС», г. Ивангород; тюлений жир рафинированый «Тюленол», производитель ООО «Квант МКБ», г. Москва.

Таблица 11 - Характеристика жиров

Образец Содержание воды, % Йодное число, г 12 100 г-1 Кислотное число, мг КОН г-1 Количество фосфорсоде ржащих веществ, мг/кг Перекисное число, Мэк О2 кг-1

1. Рыбий жир рафинированный 0,04 126 2,63 3,74 3,7

2. Рыбий жир экстракт 0,16 130 14,9 4,57 7,3

3. Рыбий жир для животных 0,023 93 3,46 4,03 н.о.

4. Рыбий жир последней вытопки 2,76 110 172,91 4,62 н.о.

5.Рыбий жир после кислотного гидролиза 0,77 94 5,16 н.о.

6. Тюлений жир рафинированый 0,38 113 5,1 3,59 н.о.

Примечание: н.о. - показатель не определялся

Тонкослойная хроматография указанных образцов (Рисунок 2) показала, что в составе липидного экстракта содержатся свободные жирные кислоты, диглицериды, моноглицериды и фосфолипиды.