Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.01, кандидат биологических наук Михайлова, Галина Федоровна

• Михайлова, Галина Федоровна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Михайлова, Галина Федоровна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. История развития микроядерного метода.

1.2. Природа микроядер.

1.3. Спонтанная частота микроядер в лимфоцитах крови человека.

1.4. Кривая доза-эффект выхода микроядер и эффект мощности дозы при действии редкоионизирующего излучения.

1.5. Кривая доза-эффект выхода микроядер при воздействии нейтронов и ОБЭ.

1.6. Возможность оценки дозы бинуклеарным микроядерным методом.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методика получения бинуклеарных клеток с использованием "чистых" (выделенных на градиенте фиколл-верографин из цельной крови) лимфоцитов.

2.2. Методика получения бинуклеарных клеток с использованием плазмы крови человека.

2.3. Критерии идентификации и учета микроядер в бинуклеарных клетках.

2.4. Источники излучения и условия облучения культуры лимфоцитов.

2.5. Схема проведенных экспериментов и статистическая обработка результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Модификация метода культивирования лимфоцитов крови человека с цитохалазином-Б с целью получения бинуклеарных клеток.

3.2. Сравнительный анализ частоты бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл в зависимости от дозы облучения при различных методах культивирования лимфоцитов.

3.3. Спонтанная частота бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл в лимфоцитах крови человека.

3.4. Зависимость доза-эффект выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл после гамма-облучения культуры лимфоцитов человека.

3.5. Зависимость доза-эффект выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами и ОБЭ.

1У. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения»

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. В последнее время в радиационно-цитогенетических исследованиях все большее применение находит микроядерный метод анализа структурных повреждений хромосом. Учитывая простоту и быстроту подсчета микроядер по сравнению с метафазным анализом аберраций хромосом, авторами ряда работ предлагается использовать микроядерный тест в качестве метода биологической дозиметрии при радиационных поражениях организма. Однако, применявшиеся ранее методы идентификации микроядер (радиоавтографический, витальная окраска, флюоресцентный) были довольно сложными и неточными, что приводило к большим расхождениям в результатах исследований отдельных авторов. Применение в последнее время цитохалазина-Б для блокирования клеток в конце митоза (на стадии телофазы) позволяет, с одной стороны, более точно идентифицировать клетки с микроядрами, а с другой, попытаться объективно оценить прогностическую значимость микроядерного теста для целей биологической дозиметрии. Но для этого необходимо знать, из каких типов структурных нарушений хромосом формируются микроядра, изучить для них спонтанный уровень и характер дозовых зависимостей в области низких и высоких доз радиации, зависимость эффекта от мощности дозы, вида излучения и др.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является количественная оценка радиаци-онно-индуцированных микроядер в бинуклеарных клетках в культуре лимфоцитов человека, блокируемых при помощи цитохалазина-Б. Намеченной цели предполагалось достичь решением следующих конкретных задач: 5

- отработать методику получения бинуклеарных клеток в культуре лимфоцитов человека при помощи цитохалазина-Б;

- изучить кинетику появления бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов после облучения нестимулированных (в стадии во) лимфоцитов в зависимости от сроков фиксации клеток;

- изучить частоту бинуклеарных клеток с микроядрами в контрольных культурах различных доноров;

- исследовать зависимость доза-эффект для бинуклеарных клеток с микроядрами в диапазоне доз 0,05 - 2,0 Гр при гамма-облучении 60Со и нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ культуры лимфоцитов человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучен характер дозовых зависимостей для микроядер в бинуклеарных клетках и бинуклеарных клеток с микроядрами при действии редко- и плотноионизирующего излучений в широком диапазоне доз и на этой основе объективно оценена прогностическая значимость микроядерного теста с использованием цитохалазина-Б для целей биологической индикации и дозиметрии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Выход бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении культуры лимфоцитов человека в диапазоне низких доз (0 - 0,5 Гр) характеризуется сложной зависимостью с наличием плато на дозовой кривой, возможно, обусловленной действием репарационных систем клетки.

2. Дозовая зависимость выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении в диапазоне доз 0 - 2 Гр хорошо описывается линейно-квадратичной функцией. 6

3. Дозовая зависимость выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в области высоких доз.

4. Радиочувствительность лимфоцитов периферической крови человека при облучении in vitro не зависит от присутствия аутоло-гичной плазмы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Практическая значимость работы определялась важностью полученных результатов для биологической дозиметрии острого облучения. На основании проведенных исследований разработаны калибровочные кривые для гамма-облучения 60Со в диапазоне доз 0,05 - 2,0 Гр и для нейтронов со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0,05 - 1,5 Гр. Представлены методические рекомендации по определению величины поглощенной дозы с помощью калибровочных кривых по бинуклеарным клеткам с микроядрами при остром гамма-облучении и по числу мя/кл - при нейтронном облучении по теме "Алмазник", № гос. регистрации 01.86.0084882.

Результаты диссертационной работы использованы в методических рекомендациях Министерства Обороны Российской Федерации "Диагностика радиационных поражений" (1994).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены и докладывались на VI Всесоюзном совещании по микродозиметрии (Канев, 1989), на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), Всесоюзной конференции, приуроченной к 90-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Рессовского (Обнинск, 1990). 7

ПУБЛИКАЦИИ. Полученные данные представлены в заключительном отчете НИР "Разработка способа определения поглощенной дозы острого облучения у личного состава ВМФ по цитогенетическим показателям лимфоцитов периферической крови", 1989-1990 гг. Основные результаты работы изложены в 8 публикациях, включая 3 журнальные статьи.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, экспериментальных исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 89 стр. (включая список литературы), иллюстрирована 17 рисунками и 9 таблицами. Список литературы, использованный в данной работе, содержит 72 наименование, из которых 16 работ отечественных и 56 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Михайлова, Галина Федоровна

ВЫВОДЫ

1. Изучение различных модификаций методики получения бинук-леарных (БН) клеток позволяет заключить, что на радиочувствительность лимфоцитов периферической крови человека при облучении in vitro не оказывает влияние присутствие аутологичной плазмы.

2. Спонтанная частота БН клеток с микроядрами и число мя/кл увеличивается с возрастом человека примерно линейно.

3. Выход БН клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении 60Со культуры лимфоцитов человека в диапазоне низких доз (0 - 0,5 Гр) характеризуется сложной зависимостью с наличием плато на дозовой кривой, возможно, обусловленной действием репарационных систем клетки.

4. Дозовая зависимость выхода БН клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении 60Со культуры лимфоцитов человека в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией, причем до 1 Гр линейная составляющая является преобладающей. Линейный коэффициент отражает, по-видимому, формирование микроядер из парных фрагментов, а квадратичный,- в основном, из интерстициальных делеций.

5. Дозовая зависимость выхода БН клеток с микроядрами при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в области высоких доз, который обусловлен, по всей вероятности, задержкой деления сильно поврежденных клеток.

6. Дозовая зависимость выхода числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается также линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в облас

81 ти высоких доз, что связано, по всей видимости, с формированием микроядер из парных фрагментов, для которых при высоких дозах наступает эффект насыщения.

7. Изучена биологическая эффекттивность нейтронов спектра деления со средней энергией 0,85 МэВ по отношению к гамма-излучению 60Со. Получена линейная зависимость между 1о§(ОБЭ) и 1о£(доза нейтронов).

8. Бинуклеарный микроядерный метод дает возможность оценить поглощенную дозу при остром гамма-облучении 60Со начиная с дозы 0,25 Гр и при облучении нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ начиная с дозы 0,05 Гр с приемлемой в практическом отношении точностью.

82

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Михайлова, Галина Федоровна, 1998 год

1. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Изучение зависимости доза-эффект для частоты бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после гамма-облучения. Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 1, с. 71-76.

2. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф., Филимонов A.C. Изучение зависимости доза-эффект для показателей микроядерного теста при использовании облучения нейтронами спектра деления.

3. Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 3, с. 414-417.

4. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Модификация способа посева лимфоцитов в культуру и приготовления препаратов при микроядерном методе, основанном на цитогенетическом блоке. -Клиническая лабораторная диагностика, 1992, №3-4, с. 17-22.

5. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Микроядра в лимфоцитах человека: предварительные данные по облучению быстрыми нейтронами in vitro. - В сб.: Нейтроны и тяжелые заряженные частицы в биологии и медицине.- Обнинск, 1989, с. 18-22.

6. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Сравнительное изучение микроядерного и метафазного методов анализа радиационно-индуцированных аберраций хромосом.- В сб.: Материалы VI Всесоюзного совещания по микродозиметрии.- Канев, 1989, с. 114-115.83

7. Бей ли Н. Математика в биологии и медицине.- М., 1970.

8. Гераськин С.А. Критический анализ современных концепций и подходов к оценке биологического действия малых доз ионизирующего излучения. Радиационая биология. Радиоэкология, 1995, т. 35, вып. 5, с. 563-571.

9. Гераськин С.А. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки. Радиационая биология. Радиоэкология, 1995, т. 35, вып. 5, с. 571-580.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия М., Высшая школа, 1980.

11. Михайлова Г.Ф., Анкина М.А. Тезисы докладов.- Пущино, 1990, с. 86-87.

12. Питкевич В.А., Виденский В.Г. Микродозиметрические характеристики спектра нейтронов деления изотопа 252Cf и пучков П-2, Б-3 реактора БР-10. Мед. радиология, 1978, №10, с. 47-52.

13. Севанькаев A.B. Радиочувствительность хромосом лимфоцитов человека в митотическом цикле М., Энергоатомиздат, 1987.

14. Севанькаев A.B., Лучник Н.Б.- Влияние гамма-облучения на хромосомы человека. YIII. Цитогенетический эффект низких доз при облучении in vitro. Генетика, 1977, т. 13, No3, с.524-532.

15. Ярмоненко С.П. Радиобиология М., Высшая школа, 1988.

16. Aghamohammadi S.L., Henderson L., Cole R.G. The human lymphocyte micronucleus assay. Respons of cord blood lymphocytes to y-radiation and bleomycin.- Mutat. Res., 1984, Afol30, p.395-401.84

17. Almassy Zs., Kanyar B.,Koteles G.J. Frequency of micronuclei in X-irradiated human lumphcytes.- Int. J. Radiat. Biol., 1986, V.49, iVo6, p.719-723.

18. Ban S., Donovan M.P., Cologne J.B., Sawada S. Gamma-ray- and fission neutron-induced micronuclei in PHA stimulatied and unstimulatied lymphocytes.- J. Radiat. Res., 1991, V.32, JVol, p.13-22.

19. Ban S., Cologne J.B., Fujita S., Awa A.A. Radiosensitivity of atomic bomb survivors as determined with a micronucleus assay.- Radiat. Res., 1993, Afol34, p.170-178.

20. Bauchinger M. Cytogenetic effectsin human lymphocytesas a dosimetry sustem. -Biological Dosimetry, 1984, Springer Verlag, p. 15-21, Berlin.

21. Bettega D., Bombana N., Pelucchi T., Poli A. Multinucleate cells and micronucleus formation in cultured human cells exposed to 12 MeV protons and gamma-rays.- Int. J. Radiat. Biol., 1980, V.37, Nol, p. 1-7.

22. Bilbao A., Prosser J.S., Edwards A.A., Moody J.C. The induction of micronuclei in huvan lymphocytes by in vitro irradiation with alpha particles from plutonium-239.- Int. J. Radiat. Biol., 1989, V.56, No3, p.287-292.

23. Catena C., Conti D., Del Nero A., Righi E. Inter-individual differences in radiation respone shown by an in vitro micronucleus assay: effects of 3-aminobenzamide on X-ray treatment.- Int. J. Radiat. Biol., 1992, V.62, No6, p.687-694.

24. Cornforth M.N., Goodwin E.H. Transmission of radiation-induced acentric chromosomal fragments to micronuclei in normal human fibroblasts.- Radiat. Res., 1991, No\26, p.210-217.

25. Counryman P.I., Heddle J.A. The production of micronuclei from chromosome aberrations in irradiated cultures of human lymphocytes.- Mutat. Res. 1976, jVo41, p.321-328.

26. Das H.K. Synthetic capacities of chromosome fragments correlated with their ability to maintain nucleolar material. -J. Cell Biol., 1962, No\5, p.121-130.85

27. Eastmond D.A.,Tucker J.D. Kinetochore localization in micronucleated cytocinesis-blocked Chinese hamster ovary cells: A new and rapid assay for identifying aneuploidy-inducing agents.- Mutat. Res. 1989, No22A, p.521-525.

28. Fenech M., Morley A.A. Measurement of micronuclei in lymphocytes.- Mutat. Res., 1985,7Vol47, p.29-35.

29. Fenech M., Morley A.A. Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in vivo ageing and low dose X- irradiation.- Mutat. Res., 1986, iVol62, p. 193-200.

30. Fenech M., Morley A.A. Ageing in vivo does not influence micronucleus induction in human lymphocytes by X-irradiation. Mech. Ageing Dev., !987, No39, p.113-119.

31. Fenech M., Morley A.A. Kinetochore detection in micronuclei: an alternative method for measuring chromosome loss.- Mutagenesis, 1989, iVo4, p.98-104.

32. Fliedner T.M., Andrews G.A., Cronkite E.P., Bond V.P. Early and late cytologic effects of whole-body irradiation on human marrow.- Blood, 1964, iVo23, p.471-477.

33. Gantenberg H.W., Wuttke K., Streffer C., Muller W.U. Micronuclei in human lymphocytes irradiated in vitro or in vivo.- Radiat. Res., 1991, iVol28, p.276"281.

34. Gosh S., Paweletz N. Synchronous DNA synthesis and mitosis in multinucleate cells with one chromosome in each nucleus.- Chromosoma, 1984, 7Vo89, p. 197-200.

35. Hall S.C., Wells J. Micronuclei in human lymphocytesas a biological dosimeter: preliminary data following beta irradiation in vitro.- J. Radiat. Prot., 1988, V.8, No2, p.97-102.

36. Heddl J. A., Carrano A.V. The DNA content of micronuclei induced in mouse bone marrow by gamma-irradiation: evidence that micronuclei arise from acentric chromosomal fragments.- Mutat. Res., 1977, JV641, p.63-70.

37. Henning U.G.G., Rudd N.L., Hoar D.I. Kinetochore immunofluorescence in micronuclei: A rapid method for the in situ detection of aneuploidy and chromosome breakage in human fibroblasts.- Mutat. Res., 1988, M>203, p.405-414.

38. Huber R., Streng S., Bauchinger M. The suitability of the human lymphocyte micronucleus assay system for biological dosimetry.- Mutat. Res., 1983, iVo 111, p.185-192.

39. Huber R., Braselman H., Bauchinger M. Screening for interindividual differences in radiosensitivity by means of the micronucleus assay in human lymphocytes.- Radiat. Environ. Biophys., 1989, vVo28, p. 113-120.

40. Huber R., Braselman H., Bauchinger M. Intra-and inter-individual variation of background and radiation-induced micronucleus frequencies in human lymphocytes.- Int. J. Radiat. Biol., 1992, V.61, No5, p.655-661.

41. Kenneth L., Pinney S.M., Livingston G.K. Sources of variability in the human lumphocyte micronucleus assay: a population-based stady.- Environ. Mol. Mut., 1995, No26, p.26-36.

42. Kligerman A.D., King S.C. Frequency of micronucleated-binucleated lumphocytes is not significantly affected by the harvest time following Go exposure to X-radiation.- Int. J. Radiat. Biol., 1995, V.68, JVol, p.19-23.

43. Koksal G., Lloyd D.C., Edwards A.A., Prosser J.S. tse dependence of the micronucleus yeild in human lymphocytes on culture and cytokenesis blocking times.-Radiat. Protect. Dos., 1989, No29, p.209-212.87

44. Kolin-Gerresheim I., Bauchinger M. Dependence of the frequency of harlequin-stained cells on BrdU concentration in human lymphocyte cultures.-Mutat. Res., 1981, M>91, p.251-254.

45. Kormos C., Koteies G.J. Micronuclei in X-irradiated human lymphocytes.-MutatRes., 1988,7Vol99,p.31-35.

46. Kramer M. Untersuchungen zur Induktion von Chromosomenaberrationen und Mikrokernen mit durchfluszytometrischen Techniken und einer Immunfluores-zenzmethode zur Anfarbung von Kinetochoren.- GSF-Bericht 10/90, GSF München, ISSN 0721-1694, 1990.

47. Krepinsky A.B., Heddle J.A. Micronuclei as a rapid and inexpensive measure of radiation-induced chromosomal aberrations.- In: Ishihara T., Sasaki M.S. (eds.). Radiation-induced chromosome damage in man, 1983, Liss, New York, p.93-109.

48. Littlefield L.G., Sayer A.M., Frome E.L. Comparison of dose-response parameters for radiation-induced acentric fragments and micronuclei observed in cytokinesis-arrested lymphocytes.- Mutagenesis, 1989, V.4, No4, p.265-270.

49. Miller B.M., Werner T., Weier H.U., Nüsse M. Analysis of radiation-induced micronuclei by fluorescence in situ hybridization (FISH) simultaneously using telomeric and centromeric DNA probes.- Radiat. Res., 1992, iVol31, p.177-185.

50. Mitchell J.C., Norman A. The induction of micronuclei in human lymphocytes by low doses of radiation.- Int. J. Radiat. Biol., 1987, V.52, No5, p.527-535.

51. Perry P., Wolff S. New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids.- Nature (London), 1974,7Vo251, p. 156-161.

52. Pincu M., Bass D., Norman A.An improved micronuclear assay in lymphocytes.- Mutat. Res., 1984, M>139, p.61-68.

53. Prosser J.S., Moquet J.E., Lloyd D.C., Edwards A.A. Radiation induction of micronuclei in human lymphocytes.- Mutat. Res., 1988, No 199, p.37-45.88

54. Ramalho A., Sunjevaric I., Natarajan A.T. Use of the frequencies of micronuclei as quantitative indicators of X-ray-induced chromosomal aberrations in human peripheral blood lymphocytes: comparison of two methods.- Mutat. Res., 1988, NolOl, p.141-146.

55. Ruch R. An anomalous lymphocyte: possible diagnostic for exposure to ionizing radiation or radiomimetic agents.-An. J. Roentgenol. Radium. Therapy., 1964, No91, p. 192-201.

56. Savage J.R.K. A comment on the quantitative relationship between micronuclei and chromosomal aberrations.- Mutat. Res., 1988, No207, p.33-36.

57. Schmid W. The micronucleus test.- Mutat. Res., 1975,JV631, p.9-16.

58. Scott D., Evans H.J. Influence on the nucleolus on DNA synthesis and mitosis in Vicia faba.- Mutat. Res., 1967, JVo4, p.579-599.

59. Scott D., Lyons C.Y. Homogeneous sensitivity of human peripheral blood lymphocytes to radiation-induced chromosome damage.- Nature, 1979, iVo278, p.756-758.

60. Takahashi E., Hirai M., Tobari J., Utsugi T.- Radiation-induced chromosome aberrations in lymphocytes from man and crabeating monkey. The dose-responce relationships at low doses.- Mutat. Res., 1982, TVol, p.l 15-1233.

61. Thierens H., Vrai A., De Ridder Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.- Health Physics, 1991, V.61,7Vo6, p.630-632.

62. Thoday J.M. The effect of ionizing radiation on the broad bean root.Chromosome breakage and the lethality of ionizing radiations to the root meristem.- Br. J. Radiol., 1951, V.24, No6, p.572-577.

63. Thomson E.J., Perry P.E. The identification of micronucleated chromosomes: a possible assay for aneuploidy.- Mutagenesis, 1988, V.3, No6, p.415-441.

64. Uchida I.A., Viola L., Byrnes E.M. Chromosome aberrations induced in vitro by low doses of radiation: Nondisjunction in lymphocytes of young adults. -Am. J. Hum. Genet., 1975, V.27, No5, p.419-429.

65. Vral A., Thierens H., De Ridder L. Study of dose rate and split dose effects on the in vitro micronucleus yieldin human lymphocytes exposed to X-ray.- Int. J. Radiat. Biol., 1992, V.61, No6, p.777-784.

66. Vral A., Verhaegen F., Thierens H., De Ridder L. Micronuclei induced by fast neutrons versus 60Co gamma rays in human peripheral blood lymphocytes.-Int. J. Radiat. Biol., 1994a, V.65, No2, p.321-328.

67. Vulpis N., Panetta G., Tognacci L. Radiation-induced chromosome aberrations in radiological protection. Dose-response curves at low dose levels. Int. J. Radiat. Biol., 1976, V.48, No6, p.595-600.

68. Wagner R, Schmid E., Bauchinger M. Application of conventional and FPG staining for the analysis of chromosome aberrations induced by low levels of dose in human lymphocytes.- Mutat. Res., 1983,7Vol09, p. 65-71.