Безотходная технология получения комплекса биоактивных веществ из лишайников Cladonia arbuscula и Evernia prunastri, биологические свойства и перспективы применения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Щербакова Анастасия Игоревна

• Щербакова Анастасия Игоревна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Щербакова Анастасия Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

1.1. Общие понятия о лишайниках

1.2. Лишайник Cladonia arbuscula. Его состав и свойства

1.3. Лишайник Evernia prunastri. Его состав и свойства

1.4. Свойства вторичных метаболитов лишайников C. arbuscula и E. prunastri

1.5. Способы получения экстрактов и вторичных метаболитов из лишайников

1.6. Лекарственные препараты на основе лишайников и in vivo исследования

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Оборудование

2.3. Реактивы

2.4. Методы исследования

2.4.1. Определение элементного состава

2.4.2. Экстракция

2.4.3. Разделение экстрактов с помощью колоночной хроматографии

2.4.5. Определение антимикробной активности

2.4.6. Определение цитотоксической активности

2.4.7. Определение протекторных свойств в отношении радикальных форм кислорода

2.4.8. Определение механизма цитотоксический активности методом Вестерн блота

2.4.9. Определение синергетической активности

2.4.10. Определение механизма синергетической активности

2.4.11. Моделирование токсических рисков вторичных метаболитов лишайников

2.4.12. Моделирование механизма антимикробной активности

2.4.13. Моделирование механизма цитотоксический активности

2.4.14. Статистический анализ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка технологии производства биопродуктов из лишайников

3.1.1. Оценка сырья для получения из него экстрактов и вторичных метаболитов

3.1.2. Технология получения биопродуктов из лишайников

3.2. Определение токсичности экстрактов из лишайников E. prunastri и С arbusculа, а также эверновой и усниновой кислот

3.2.1. 1п sШco моделирование возможных побочных действий (раздражжение, риски мутагенеза, канцерогенеза и влияния на репродукцию)

3.2.2. Определение цитотоксичности экстрактов и вторичных метаболитов лишайников

3.2.3. Антиоксидантная активность экстрактов и вторичных метаболитов лишайников

3.3 Определение биологической активности экстрактов лишайников и их вторичных

метаболитов

3.3.1. Противомикробная активность экстрактов, фракций и вторичных метаболитов лишайников

3.3.2. Антипролиферативная активность экстрактов и вторичных метаболитов лишайников

3.3.3. Способность экстрактов и вторичных метаболитов лишайников к синергизму

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

Практические предложения

Перспективы дальнейшей разработки темы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .... Error! Bookmark not defined.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Безотходная технология получения комплекса биоактивных веществ из лишайников Cladonia arbuscula и Evernia prunastri, биологические свойства и перспективы применения»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Использование растительных объектов, изучение активности их метаболитов и разработка биотехнологии для получения веществ для ветеринарной и фармацевтической промышленностей являются актуальными задачами [131]. Лишайники, эволюционно сформированные симбиотические организмы, представляют перспективные объекты исследования [14, 18, 212, 238], способные вырабатывать уникальные вторичные метаболиты, некоторые из которых не встречаются у свободноживущих организмов [218].

Например, усниновая кислота, известный лишайниковый метаболит, использовалась как антибиотик в СССР [17, 28]. Среди современных препаратов Isla Med Hydro + на основе Cetraria islandica применяется в качестве противопростудного препарата [129]. Вопрос разработки новых веществ антибиотического действия, в свете увеличения резистентности микроорганизмов, имеет важное значение в ветеринарии и фармацевтике.

В настоящее время, кроме усниновой кислоты, описано более 800 [50, 200] вторичных метаболитов лишайников, которые тоже могут обладать высоким потенциалом для разработки биологически активных веществ.

В данной работе были исследованы Cladonia arbuscula (Wallr.) Rabenh и Evernia prunastri (L) Ach. C. arbuscula рекомендована Фармакогнозией для получения соли усниновой кислоты, в то время как E. prunastri не входит в этот список [17].

Степень разработанности темы исследования. Изучением биологической активности вторичных метаболитов лишайников занимаются по всему миру [124, 150, 153, 169, 184, 196, 199, 205, 225],включая Россию [4, 13, 19, 20, 21, 26].

Общими для описываемых вторичных метаболитов из E. prunastri и C. arbuscula являются антимикробные, противораковые и антиоксидантные свойства. Первичные же метаболиты лишайников (полисахариды, включая лихенин, изолихенин, галактоманнан и хитин) составляют основу лишайниковых слоевищ и обладают высокой сорбционной способностью, позволяющей накапливать тяжелые металлы [23, 42] в количествах, превышающих физиологические потребности [29].

Однако, несмотря на изученность отдельных метаболитов лишайников, недостаточно исследована биологическая активность экстрактов из E. prunastri и C. arbuscula для их применения в ветеринарии и фармацевтике. Кроме того, способности лишайников к адсорбции тяжелых металлов ранее не были применены для оценки сорбционных свойств их шротов.

Цель исследования - разработать безотходную технологию получения экстрактов и шротов из лишайников E. prunastri и C. arbuscula и определить биологическую активность экстрактов в сравнении со свойствами их основных метаболитов: эверновой и усниновой кислот.

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

1) Оценить качество сырья лишайников как ресурса для получения из них биопродуктов.

2) Разработать эффективный способ получения экстрактов из лишайников.

3) Изготовить опытные серии продуктов для проведения доклинических исследований и сорбционной способности шротов;

4) Разработать методологию доклинических исследований основанную на комбинировании методов in silico и in vitro;

5) Смоделировать in silico побочные эффекты (раздражение, риски мутагенеза, канцерогенеза и влияния на репродукцию) вторичных метаболитов лишайников E. prunastri и C. arbuscula и определить in vitro цитотоксичность экстрактов на модели клеток фибробластов;

6) Исследовать биологическую активность экстрактов лишайников и чистых веществ (эверновой и усниновой кислот), спрогнозировать механизм действия наиболее активных из них с помощью in silico моделирования и подтвердить модель методами in vitro.

Научная новизна. Разработана безотходная технология получения экстрактов из лишайников E. prunastri и C. arbuscula с противобактериальной и противоопухолевой активностью и получены шроты с высокой сорбционной способностью. In silico моделирование выявило, что вторичные метаболиты лишайника C. arbuscula имеют больше побочных эффектов, чем метаболиты

лишайника E. prunastri. Эверновая кислота играет значительную роль в антимикробной активности лишайников. Была выдвинута гипотеза, что лишайники могут быть источником для разработки нового класса антибиотиков с уникальным механизмом действия. Экстракт из E. prunastri и эверновая кислота проявили антипролиферативную активность на клеточной линии глиобластомы. Впервые была разработана модель, показывающая отличный механизм действия эверновой кислоты от темозоломида. Эверновая кислота проявила синергетическую способность повышать чувствительность резистентных клеток глиобластомы к темозоломиду. Механизм данной активности связан с регулированием синтеза РНК, кодирующих белки Wnt пути, что представляет новую перспективу для комбинированной химиотерапии глиобластомы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработаны технологические процессы получения вторичных метаболитов и сорбентов тяжелых металлов из лишайников E. prunastri и C. arbuscula. Теоретически обоснована и экспериментально доказана на in silico и in vitro моделях значимость лишайника E. prunastri и его основного вторичного метаболита - эверновой кислоты для ветеринарии и фармацевтики. Разработанная в данной работе методология сочетания методов in vitro с in silico создаёт предпосылки к замене использования живых организмов в тест-системах, что соответствует биоэтическим нормам. Компьютерное моделирование позволяет сократить время и материальные затраты на скрининг (in vitro и in vivo) огромных массивов химических веществ по отношению к сравнительно небольшому числу требуемых видов биологической активности. Так, in silico анализ лишайниковых веществ позволяет выдвинуть гипотезу о механизме их антимикробного действия отличного от механизма действия антибиотиков. Данная гипотеза может служить основой для разработки нового класса антибиотиков остро необходимого как для ветеринарии, так и для фармации.

Методологические подходы, разработанные в данной работе, могут быть применены при получении других биологически-активных комплексов природного происхождения и разработке на их основе препаратов для нужд ветеринарии и фармацевтики.

Разработаны и утверждены в установленном порядке «Методические положения по применению компьютерного моделирования для прогнозирования механизмов антимикробной и антипролиферативной активностей веществ естественного происхождения» и «Методические положения по анализу РНК -секвенирования».

Результаты диссертационной работы использованы в научной и образовательной деятельности ФГБОУ ВО «Поволжский государственный технологический университет» при разработке научно-методических комплексов дисциплины «Общая биохимия и молекулярная биология» по направлению 19.03.01 «Биотехнология» (бакалавриат) и 19.04.01 «Биотехнология» (магистратура).

Методология и методы исследования. В работе использованы классические методы определения биологической активности экстрактов (биохимические, микробиологические, цитологические), методы in silico моделирования и статистического анализа данных. Дизайн экспериментов основан на анализе литературы и проведенных автором пилотных опытах.

Положения, выносимые на защиту:

1) содержание тяжелых металлов в исследуемых лишайниках, как сырья для получения биопродуктов, соответствует требованиям допустимых значений в ОФС.1.5.3.0009.15 и СП 4089-86;

2) технология безотходного производства биопродуктов из лишайников;

3) опытные партии продуктов - экстрактов и шротов;

4) методология доклинической разработки лекарственных форм для ветеринарии и фармацевтики, основанная на комбинировании методов in silico и in vitro;

5) результаты доклинических исследований безопасности - экстрактивные вещества из E. prunastri обладают меньшими побочными эффектами (раздражение, риски мутагенеза, канцерогенеза и влияния на репродукцию) на модели фибробластов, чем из C. arbuscula;

6) результаты доклинических исследований биологической активности:

- антиоксидантная активность: ацетонитрильный экстракт из E. prunastri и его основной метаболит эверновая кислота, способны защищать клетки от оксидативного стресса, вызванного Н2О2;

- вторичные метаболиты лишайников обладают антимикробной активносью и перспективны как основа для разработки нового класса антибиотиков;

- лишайник E. prunastri и его основной метаболит эверновая кислота обладают высокой антипролиферативной активностью в отношении модели глиобластомы;

- эверновая кислота способна увеличивать чувствительность резистентных к темозоломиду клеток глиобластомы человека, выбранных в качестве модели;

- шроты обладают сорбционной активностью.

Степень достоверности и апробация результатов. Базируется на достаточном объеме экспериментальных данных и применении современных методов математической обработки данных. Основные результаты работы апробированы на всероссийских и международных конференциях и симпозиумах: International Congress (Joint Meeting with ASP, AFERP, PSE and SIF) and Annual Meeting of GA (Нью-Йорк, 2012; Копенгаген, 2016), THE INTERNATIONAL CONGRESS "PHYTOPHARM" (Санкт-Петербург, 2014, 2016, 2019; Бонн, 2015), International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research (Будапешт, 2015; Бонн, 2021), Jahrestagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizerischen Gesellschaften für Hämatologie und Medizinische Onkologie (Базель, 2015; Берлин, 2019, 2020, 2021; Вена 2022), Synergy Forum 2018 (Бонн, Германия, 2018).

В 2021 г. исследование отмечено конкурсным жюри «69th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research».

По теме исследования опубликовано 24 научные работы, в том числе 7 публикаций в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 статья и 10 тезисов конференций в журналах, рецензируемых в Web Of Science.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты исследований соответствуют пп. 1, 3, 8 паспорта научной специальности 1.5.6. «Биотехнология».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, выводов, приложений, содержит 31 рисунок и 13 таблиц. Список использованной литературы включает 268 источников (в т.ч. 220 зарубежных авторов).

Личный вклад автора. Личный вклад автора присутствует на каждом этапе выполнения диссертации и заключается в планировании экспериментов, их методическом и инструментальном обеспечении, в непосредственном выполнении экспериментов, статистической обработке, анализе и обобщении результатов, написании статей и тезисов, представлении результатов работы на конференциях.

Благодарности. Диссертант выражает искреннюю признательность научному руководителю - канд. с.-х. наук, доценту Р.В. Сергееву за научное руководство; а также благодарит д-ра техн. наук, проф. А.В. Канарского, канд. техн. наук А.В. Коптину, д-ра. биол. наук, проф. Р.И. Винокурову, д-ра. ест. наук Г. Ульрих-Мерцених за оказание консультативной и научно-методической помощи при выполнении отдельных этапов исследований; лихенолога, старшего научного сотрудника Государственного природного заповедника «Большая Кокшага» Г.А. Богданова за предоставление ценных образцов и информации о лишайниках; канд. хим. наук, доцента Т.В. Смотрину, канд. биол. наук Д.В. Кочкина, канд. физ.-мат. наук А.Н. Туранова за их ценные советы и помощь при выполнении экспериментов и анализе данных. Исследования были поддержаны грантом президента Российской Федерации для молодых ученых MK5290.2012.4 (2012-2014 гг.); грантом международной мобильности от ФГБОУ ВО «Поволжский государственный технологической университет» в Уппасальском университете (Уппсала, Швеция) (2013 г.); стипендия от Немецкой службы академических обменов (DAAD) в Рейнском Боннском университете Фридриха Вильгельма (Бонн, Германия) (2014-2016 гг.).

Глава 1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

1.1. Общие понятия о лишайниках

Лишайники (лихенезированые грибы) - эволюционно сформированные симбиотические организмы между микобионтом (гриб) и фотобионтом (водоросль и/или цианобактерия) [14, 18]. Данный термин впервые был упомянут древнегреческим ученым Теофрастом [98] и обозначал поверхностные наросты на ветвях оливковых деревьев. В 1742 году лишайники классифицировали как отдельный таксон [98], но их двойственная природа была описана только в 1869 году швейцарским ученым Швенденером [181].

Не все грибы способны создавать симбиотическую ассоциацию с фотосинтезирующим партнёром, формируя лишайник. К настоящему времени примерно 13500 видов семейства Ascomycota и 50 видов семейства Basidiomycota описаны как формирующие лишайники [108, 181]. В качестве фотобионтов выделяют 15 видов цианобактерий (класс Cyanophyceae) and 25 видов водорослей (классы Xanthophyceae, Phaeophyceae, Chlorophyceae, и Trebouxiophyceae), которые способны вступать в симбиоз [58, 108]. Свободноживущие грибы, способные создавать симбиоз с фотосинтезирующим партнёром, формируют вегетативное тело, структурно отличное от лихенезированных грибов [58, 220].

Микобионт и фотобионт осуществляют разные роли в симбиотической ассоциации. Грибной партнёр защищает фотобионт, адсорбируя воду в гифах и защищая его от УФ с помощью вторичных метаболитов, таких как фенолы, антрахиноны и ксантоны [212]. Фотосинтезирующий партнёр обеспечивает питание: зелёные водоросли производят альдиты (рибит, эритрит и сорбит), а цианобактерии фиксируют азот из атмосферы и производят глюкозу [212, 238].

Благодаря данному симбиозу, лишайники выживали на протяжении миллионов лет [212] в экстремальных условиях [212, 243]. Они могут быть обнаружены почти во всех экосистемах (включая арктические пустыни) [74, 259]. Также благодаря данной способности биоразнообразие лишайников довольно

широко. В настоящее время известно примерно 25000 видов лишайников [74] и около 100 из них найдены исключительно только на территории Российской Федерации [44].

Кроме высоких выживаемости и биоразнообразия, лишайники также отличаются и своим метаболизмом от свободноживущих форм: они синтезируют метаболиты, моногие мз которых не могут быть сформированы лишайниковыми партнерами по отдельности [74, 266].

1.2. Лишайник Cladonia arbuscula. Его состав и свойства

Таллом C. arbuscula представляет собой горизонтальное слоевище в виде бледно-желтоватой накипной корочки. Подеции 5 -15 см высотой, бледновато-зеленовато- или синевато-сероватые, иногда с желтоватым оттенком, образующие отдельные, в верхней части густо развлетвленные кустики или разной величины подушечки. Главная ось ясная, грубая, 0,5 -3 мм в диаметре. Апотеции маленькие, темно-коричневые, встречаются редко.

К настоящему времени в составе вторичных метаболитов обнаружены усниновая кислота [10, 41, 63, 70, 84] и фумарпротоцетраровая кислота [10], а в качестве первичных метаболитов - а-глюканы, ß-глюканы, галактоманноглюканы, галактоглюкоманнаны [115].

Среди биологических свойств для C. arbuscula была описана антимикробная активность против Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Mycobacterium aurum и M. tuberculosis. Против штамма ATC29212 E. faecalis и против штамма ATCC BAA-750 S. saprophyticus ацетоновый экстракт из C. arbuscla был активен при МИК (минимальная ингибирующая концентрация) 31 мкг/мл (2.25*105 KOE, 24 ч, 35 °C) [3]. В то время как гексановый и этил ацетатный экстракты были более активны против M. aurum (МИК = 4 мкг/мл для обоих экстрактов), а против М. tuberculosis менее активными: при концентрации 100 мкг/мл они достигли 96% и 99% активности [56].

В Китае лишайник C. arbuscula используют в народной медицине при головокружении, гипертонии, туберкулезе, лихорадке, травме с образованием гноя, и кожных инфекциях [98].

1.3. Лишайник Evernia prunastri. Его состав и свойства

Таллом Е. prunastri представляет собой слегка повисающие или торчащие кустики, иногда жесткий подушкообразной или шаровидной формы, прикрепленные к субстрату хорошо или неясно выраженным гомфом; изредка гомф отсутствует, и не прикреплённый таллом живет как перекати-поле. Лопасти довольно широкие или узкие, от 0,5 -1 до 6 мм шириной, линейные, сплюснутые, с краями, слегка заворачивающимися на нижнюю сторону, на поверхности с небольшими углублениями, на концах заостренные или притупленные и немного вздутые. Верхняя поверхность лопастей беловато-, темно- или серовато-зеленая, реже зеленовато-желтая до желтовато-коричневой, нижняя - более светлоокрашенная, беловатая, часто с розовым оттенком, изредка почти одного цвета с верхней. Апотеции образуются редко, по краям лопастей с красновато -коричневым диском.

Встречается на стволах и ветвях деревьев лиственных, изредка хвойных пород, особенно на опушках леса, у лесных дорог и в других открытых, хорошо освещенных местах. Иногда переходит к обитанию на обработанной древесине (крыши, заборы и т.д.), валунах, почве, песках в речных дюнах, хвое ветвей.

В настоящее время описано более 70 веществ, обнаруженных в лишайниках E. prunastri [159]. Наиболее изученными из них являются атранол и хлоратранол [83, 119, 159, 188, 203] (аллергены), атранорин [9, 78, 159, 224], хлоатранорин [78, 224], эверновая и усниновая кислоты [9, 78, 159, 224], салациновая кислота [9, 224] и физодовая кислота [224].

Несмотря на широкое изучение биохимического состава E. prunastri, его биологические свойства изучены незначительно: в основном из-за широкого применения данного лишайника в качестве абсолюта для парфюмерной

промышленности [159]. Экстракты из E. prunastri былы протестированы на антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus. МИК метанольного экстракта составил 0,156 мг/мл [170], в то время как ацетоновый экстракт был более активным с МИК= 0,078 мг/мл [3, 190]. Наилучший эффект был обнаружен при ингибировании метицилин резистентного штамма S. aureus: МИК при этом составил 0,039 мг/мл [3, 190].

Кроме того, метанольный экстракт из Evernia prunastri был протестирован на мутагенетические и антимутагентоксические свойства на Salmonella typhimurium TA1535, S. typhimurium TA1537 и E. coli WP2uvrA (WP2) тест-системах с использованием азида натрия (NaN3) (1 мкг/ планшет), 9-аминоакридина (9-AA) (40 мкг/ планшет) и №метил-№нитро-Ы-нитрозогуанидина (MNNG) (1мкг/ планшет), соответственно, в качестве мутагенов [67]. Экстракт показал значительную антимутагенную активность в WP2 тест-системе против мутаген MNNG уже при концентрации 20 мкг. Против мутагенов NaN3 и 9-АА экстракт не проявил значительных антимутагенных свойств, но и не инициировал мутагенные свойства при концентрации до 100 мкг. Дополнительно были проведены исследования на периферальных клетках крови (лимфоцитах) с использованием афлатоксин В1 (AFB) в качестве мутагена. В данном случае E. prunastri проявила антимутагенные свойства уже при концентрации 5 мкг/мл, уменьшая при этом формирование сестринского хроматидного обмена [67].

В народной медицине Древней Греции Evernia prunastri использовали как вяжущее средство в виде мазей, а также их холодные и горячие отвары применяли при заболеваниях матки и от общей утомляемости [98].

В Европе в эпоху Возрождения данный лишайник использовали также для лечения заболеваний матки и анального пролапса, а кроме того, дополнительно для лечения кишечной слабости, при лихорадке и легочных заболеваниях [98].

1.4. Свойства вторичных метаболитов лишайников C. arbuscula и E. prunastri

Усниновая кислота. Усниновая кислота является основным вторичным метаболитом C. arbuscula и также встречается в E. prunastri. Усниновая кислота особенно известна своим антимикробным действием широкого спектра. Описано, что она обладает антибактериальной способностью против многих грамположительных бактерий (например, Streptococcus spp., Pneumococcus spp., Bacillus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus aureus (в том числе резистентные к метицилину штаммы) и Listeria monocytogenes) [61, 73, 134, 194], грамотрицательных бактерий (например, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium) [234], и микобактерий (Mycobacterium tuberculosis) [71, 151]. Усниновая кислота также была показана как вещество, обладающее противогрибковыми (например, Candida spp.) [193, 247, 249], противопротозойными (например, Leishmania ssp., Trypanosoma cruzi, Trichomonas vaginalis, доэритроцитарная стадия Plasmodium berghei) [50, 55, 110, 116, 196] и противовирусными (например, вирус Эпштейна-Барра [198], вирус папилломы человека [64, 192, 211] и вирус пандемического гриппа A / California / 07/09 (H1N1) pdm09 [64]) свойствами. Натриевая соль усниновой кислоты использовалась в качестве антибиотика (под торговыми марками Бинан и Усно) против грамположительных бактерий и микобактерий в СССР с 1955 г. [13, 17]. Усниновая кислота также содержится в различных пероральных диетических добавках, включая Lipokinetix®, который продается как средство для похудания, но в настоящее время он отменен из-за гепатотоксичности и острой печеночной недостаточности [75, 129, 139, 215, 252]. Обладая антимикробными свойствами усниновая кислота может найти применение в лечении ран. Как известно бактериальное заражение ран и последующее развитие биопленок являются основным фактором неэффективности лечений многих ран [133, 205].

Усниновая кислота также проявила себя активной в отношении некоторых раковых клеточных линий. Интересно отметить что усниновая кислота проявила активность в отношении клеточной линии DU-145 - рак простаты человека [102,

246] равную активности по отношению к нормальным клеткам HSF - фибробласты кожи человека и РЫТ2 - эпителиальные клетки простаты человека, но в отношении другой клеточной линии рака простаты человека - РС-3, она была более активна. Механизм такой селективности между разными клеточными линиями одного типа рака установлен не был, но в отношении данных клеточных линий усниновая кислота влияла на организацию актинового цитоскелета и уменьшала миграцию клеток [246].

В отношении А2780 (карцинома яичников человека), НТ-29 (аденокарцинома кишечника человека), НЬ-60 (промиелоцитарная лейкемия человека), 1игка1 (лейкемия Т клеточных лимфоцитов человека) [255] и МСЬ7 (рак молочной железы человека) [101, 102, 255] усниновая килота проявила среднюю активность в диапазоне концентраций 48,5 - 99,7 мкМ. В качестве механизма действия было обнаружено, что усниновая кислота модулировала клеточный цикл и апоптоз в отношении А2780, НЬ-60 [255] и НСТ-116 [101, 255]. В отношении МСЬ7 усниновая кислота индуцировала апоптоз через воздействие на митохондрии через генерацию реактивных форм кислорода и уменьшение потенциала митохондриальной мембраны [236].

Скрининг усниновой кислоты на различных клетках меланомы человека (НТВ-140, иАСС-62, Б16-Р10 и ЬешХ) также проявил усниновую кислоту как вещество со средней активностью по отношению к ним [104, 246]. Исключение составила клеточная линия ЬешХ, в отношении которой усниновая кислота была эффективной и индуцировала апоптоз [88].

Такие клеточные линии как Ь1210 (лимфатическая лейкемия мышей), 3ЬЬ (мышиная карцинома легкого Льюис), К-562 (хронический миелолейкоз человека), и251 (глиобластома человека) [102], НеЬа (рак шейки матки) [101] и LS174 (карцинома кишечника человека) [88] были чувствительны к усниновой кислоте.

Также была отмечена активность усниновой кислоты в отношении язвы желудка благодаря ее антиоксидантным свойствам [135].

Как было ранее исследовано усниновая кислота может проявлять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства, в зависимости от различных системных условий и / или клеточной среды. Антиоксидантный эффект усниновой кислоты связан с ее способностью улавливать пероксильные радикалы, гасить гидроксильные радикалы и снижать выработку нитрита. С другой стороны, усниновая кислота проявляет прооксидантную способность в богатой липидами системе, увеличивая образование реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS), индуцированное инкубацией 2,2'-азобис (2-амидинопропан) дигидрохлорид (AAPH). Кроме того, UA снижает жизнеспособность нейроноподобных клеток (SH-SY5Y) в культуре. Этот эффект связан с ее способностью увеличивать внутриклеточную продукцию активных форм кислорода в этих клетках [202].

Усниновая кислота также проявила фотопротекторную защиту в отношении УФ-В (Xmax = 287 нм), что не диспергирует радиацию, но представляет собой SPF фильтр [205, 254]. Кроме того, она индуцировала экспрессию простогландина Е2 и циклооксигеназы 2 (СОХ-2) в клетках кератиноцитов человека HaCaT, что говорит об ее противовоспалительных свойствах [236]. Но при высоких концентрациях и УФ-В воздействии усниновая кислота действовала на клетки негативно, разрушая клеточные мембраны и уменьшая метаболизм клеток лимфоцитов (клеточная линия Jurkat) [198]. Говоря о противовоспалительных свойствах, было показано также и на in vivo модели крыс с острым и хроническим воспалением, что усниновая кислота уменьшает его и этот эффект схож с эффектом нестероидных противовоспалительных препаратов [52]. Воспалительные процессы индуцированные липополисахалидом (LPS) на клеточной RAW264.7 (опухоль, вызванная вирусом лейкемии мышей Абельсона) [62] и его иньекцией в легкие мышей [251] также были уменьшены под воздействием усниновой кислоты. Как следствие наблюдалось уменьшение экспрессии фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-8 (IL-8) и воспалительного белка макрофагов-2 (MIP-2).

Усниновая кислота также продемонстрировала изменения скорости в сократительной мышце миокарда на in vivo модели морских свинок, что говорит о ее потенциальном применении в лечении кардиоваскулярных заболеваний [205].

Помимо положительных эффектов усниновой кислоты были зафиксированы и отрицательные. Так при концентрации 125 мкг/мл она вызывала цитотоксичность у нормальных клеток крови здоровых некурящих доноров [248]. При этом были увеличены активность каспаз 3 и 7, уровень реактивных форм кислорода и разрушения ДНК [248].

Но кроме in vitro и in vivo моделей было зафиксировано негативное воздействие коммерческих препаратов, содержащих усниновую кислоту в своем составе. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США) получило более 21 сообщения о гепатотоксичности у потребителей, которые принимали пищевые добавки, содержащие усниновую кислоту или усниат натрия, для похудения. Эти гепатотоксические эффекты привели к 1 смерти, 1 трансплантации печени, 7 случаям печеночной недостаточности, 10 случаям химического гепатита и 4 случаям умеренной токсичности для печени [205]. Также было проведено множество исследований как in vitro на клетках печени человека, так и in vivo на мышах, которые подтвержадают токсичность усниновой кислоты [162, 205].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербакова Анастасия Игоревна, 2023 год

Анализ источников литературы

Лабораторные исследования способов получения экстрактов из лишайников

1п зШсо моделирование возможнх побочных эффкетов вторичных метаболитов из исследуемых лишайников

1п \itro исследования на

нормальных клетках _фибробластов_

а

Антиоксидантная активность

Антимикробная активность

Противораковая активность

Синергетическая активность

ч о

и

Технология безотходного производства:

экстрактов с селективной активностью в отношении бактерий и клеточной линии глиобластомы для

нужд ветеринарии и фармацевтики;

шротов с высокой сорбционной активностью

Рисунок 3.1 - Структурно-логическая схема достижения цели диссертационной работы

3.1. Разработка технологии производства биопродуктов из лишайников

Согласно ГОСТ Р 57079-2016 [12] биотехнологическая продукция (биопродукт) - продукция или услуга, получение которой требует использования одной или более биотехнологических методик, включая интеллектуальные результаты (технические ноу-хау), полученные в результате биотехнологических

исследований и разработок. В предлагаемой технологии биопродуктами являются экстракты, обладающие лекарственными свойствами, и шрот, обладающий сорбционными свойствами.

3.1.1. Оценка сырья для получения из него экстрактов и вторичных

метаболитов

Количественная оценка содержания тяжелых металлов в лишайниках.

Лишайники известны своей способностью адсорбировать металлы, в том числе тяжёлые [5, 6, 42]. Таким образом, количественное определение содержания металлов (микро- и макроэлементов) в лишайниках, произрастающих на территории Республики Марий Эл, и их соответствие нормам ПДК (предел допустимых концентраций) являются очевидными.

В методике определения содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах (ОФС.1.5.3.0009.15), регламентирующей содержание тяжелых металлов, приведены предельно допустимые концентрации (ПДК) для свинца, кадмия, ртути и мышьяка. Для регламентации других тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье нормативов не существует [16]. В связи с отсутствием нормативной базы некоторые авторы [1, 16] указывают в качестве наиболее близкого эталона ПДК для лекарственного растительного сырья ПДК, установленные для сухих овощей и фруктов (СП 4089-86) [43].

Результаты измерения содержания некоторых тяжелых металлов в лишайниках представлены на рисунке 3.2 Содержание тяжелых металлов в лишайниках различно. Причем данные показатели динамичны не только в образцах, собранных с разных участков, но и внутри одного участка (таблица 3.1).

Рисунок 3.2 - Содержание тяжелых металлов в лишайнике Cladonia arbuscula, в зависимости от местопроизрастания: ЛБИГ- лишайники, болото Илюшкино, гарь; ЛП - лишайники, Песчаный карьер; ЛГ - лишайники, окрестности оз. Глухое; ЛСК - лишайники, Старожильское лесничество, культуры.

Таблица 3.1 - Изменчивость элементного состава в лишайнике СЫйота arbu.seu.la

Элемент X ср S S2 min max V, %

Pb 0,57 0,09 0,0075 0,41 0,74 15,23

Cd 0,11 0,01 0,0002 0,09 0,14 12,76

^ 1,55 0,31 0,0954 1,25 2,22 19,98

Zn 16,08 2,05 4,2165 12,08 19,23 12,77

Содержание свинца составило 0,41 - 0,74 мг/кг, что не превышает предельно допустимую концентрацию по тяжелым металлам для лекарственного растительного сырья (ОФС.1.5.3.0009.15) [31], допустимая концентрация которого 6 мг/кг. Кадмий варьирует от 0,09 до 0,14 мг/кг, что также находится в диапазоне допустимых значений (1 мг/кг) (0ФС.1.5.3.0009.15). Интересно заметить, что ПДК свинца и кадмия установленные для сухих овощей и фруктов значительно ниже, чем для лекарственного сырья (0,4 мг/кг и 0,03 мг/кг, соответственно). Данный факт можно объяснить тем, что лекарственное сырье применяется в качестве отваров, настоев, экстрактов и т.д. При экстрагировании переход тяжелых металлов в экстракт сокращается в разы [1, 15]. Медь в лишайниках обнаружена в концентрации от 1,25 до 2,22 мг/кг и не превышала допустимых концентраций по

тяжелым металлам для сухих овощей и фруктов (СП 4089-86) [43], максимальная концентрация которого 5 мг/кг. Среди исследованных элементов в наибольших количествах содержится цинк (12,08 - 19,23 мг/кг). Его концентрация превышает допустимую концентрацию цинка (10 мг/кг) для сухих овощей и фруктов (СП 408986). При экстрагировании максимальный переход цинка составляет 50% при водной экстракции, а при уменьшении полярности растворителя данный процент уменьшается [1, 15].

Для разработки и оптимизации технологических этапов производства использовали методы математического планирования эксперимента:

- однофакторный дисперсионный анализ для определения влияния места произрастания на элементный состав лишайников (таблица 3.2);

- двухфакторный дисперсионный анализ для определения влияния способа экстракции на выход экстрактивных веществ из лишайников C. arbuscula и E. prunastri (таблицы 3.3 и 3.4).

Однофакторный дисперсионный анализ (таблица 3.2) показал, что фактор «условия местопроизрастания» не влияет на содержание металлов в лишайниках (Б < Бкр и Р >0.05).

Таблица 3.2 - Однофакторный дисперсионный анализ зависимости содержания тяжелых металлов в лишайниках от места их произрастания

Источник вариации ££ V Ы8 F Р-Значение F кр.

Между группами 14,32 11 1,30 0,022 0,999 2,067

Внутри групп 2164,07 36 60,11

Итого 2178,40 47

Таким образом, лишайники соответствуют требованиям к лекарственному сырью и применены для дальнейших исследований.

Разработка эффективного способа получения экстрактов из лишайников.

Из лишайников Evernia prunastri и Cladonia arbuscula были получены разнополярные экстракты методами параллельной и последовательной мацерации.

Результаты анализа выхода экстрактивных веществ с использованием разнополярных растворителей при параллельной и последовательной экстракции приведены на рисунке 3.3 и в таблице 3.5.

700.00 - 16.00 _

(н \0

Я т ^

«" 600.00 ^ Щ 14 00 «"

I 5°° 00 ' + I ■ I 12 00 |

I400.00 ^Н ШШ ^ I |

III II 4:00 I

^ 0.00 ™™ 0.00 £

a«»***0®*

C. arbuscula E. prunastri

Гексан ^^ Дихлорметан ^^ Ацетонитрил Суммарный выход, %

Рисунок 3.3 - Выход экстрактивных веществ из лишайников

Результаты двухфакторного дисперсионного анализа приведены в табл. 3.3 (С. arbuscula) и в табл. 3.4 (E. prunastri).

Таблица 3.3 - Двухфакторный дисперсионный анализ зависимости выхода экстрактивных веществ из лишайника C. arbuscula от способа мацерации (последовательная или параллельная) и от используемого растворителя

Источник вариации SS df MS F P-Значение F кр.

Выборка 2616,06 1 2616,06 7,78 1,63E-02 4,75

Столбцы 259018,8 2 129509,4 385,32 1,30E-11 3,89

Взаимодействие 12611,44 2 6305,72 18,76 2,02E-04 3,89

Внутри 4033,33 12 336,11

Итого 278279,6 17

Таблица 3.4 - Двухфакторный дисперсионный анализ зависимости выхода экстрактивных веществ из лишайника E. prunastri от способа мацерации (последовательная или параллельная) и от используемого растворителя

Источник вариации SS df MS F P-Значение F кр.

Выборка 12853,39 1 12853,39 30,39 1,34Е-04 4,75

Столбцы 263656,4 2 131828,2 311,69 4,54E-11 3,89

Взаимодействие 94099,11 2 47049,56 111,24 1,8E-08 3,89

Внутри 5075,33 12 422,94

Итого 375684,3 17

В обоих случаях, как при экстрагировании из C. arbuscula, так и при экстрагировании из E. prunastri, взаимодействие между обоими факторами значительно (Б > Бкр.), следовательно можно сделать вывод, что как способ мацерации, так и растворитель влияют на выход экстрактивных веществ.

Суммарный выход, в процентном соотношении к сухому лишайнику, в засивисмости от способа экстракции показан в таблице 3.5.

Таблица 3.5 - Суммарный выход экстрактивных веществ из лишайников в зависимости от способа экстракции

Параллельная экстракция Последовательная экстракция

Растворитель Выход, % (масс.) Растворитель Выход, % (масс.)

Гексан 2,80 Гексан 2,73

Дихлорметан 4,73 Дихлорметан 3,80

Ацетонитрил 60% 4,78 Ацетонитрил 60% 6,22

Суммарный выход 4,10 Суммарный выход 12,75

В целом, выход экстрактивных веществ из лишайников при последовательной мацерации выше, чем при параллельной и расход лишайников в три раза меньше. При последовательной мацерации при увеличении полярности растворителей значительно возрастает выход метаболитов из лишайников в отличие от параллельной экстракции. Данный эффект можно объяснить увеличением проницаемости клеточной стенки.

Сравнение полученных результатов с результатами других авторов [20, 21] подтвердило, что параллельная мацерация с используемыми растворителями имеет преимущество в процентном выходе экстрактивных веществ из лишайников по сравнению с параллельной мацерацией: горячим ацетоном в течение 30 минут -1,7% - 2,3% [21], в этиловом спирте - 0,34% - 0,35% и в диоксане - 0,08% - 0,11% [20].

Для исследований биологической активности использовали экстракты, полученные методом последовательной мацерации.

3.1.2. Технология получения биопродуктов из лишайников

Основываясь на исследованиях экстракции в лабораторных условиях была разработана технология получения биопродуктов из лишайников (рисунок 3.6), включающая в себя несколько этапов (рисунок 3.4). Конечные продукты (биопродукты) технологии: гексановый, дихлорметановый, ацетонитрильный экстракты и шрот лишайников в качестве сорбента. Шроты лишайников, полученные в результате данного метода экстракции, охарактеризованы в качестве биосорбента динамичных систем научной группой из Поволжского государственного технологического университета и Марийского государственного университета [37-40]. Авторы пришли к выводу, что сорбционная способность шрота E. prunastri ионов свинца (0,242 ммоль/г) (потенциально канцерогенные [39, 53, 80]) превышает данное значение для целлюлозы и хитозана (0,015 и 0,217 ммоль/г соответственно [41]), что говорит о преимуществе использования шрота.

Рисунок 3.4 - Блок-схема технологии получения биопродуктов из лишайников

Высушивание в вакуумно-сублимационной сушилке осуществляется в несколько этапов (рисунок 3.5).

Рисунок 3.5 - Блок-схема технологии вакуумно-сублимационной сушки биопродуктов из

лишайников

Этап подготовки включает в себя процесс от сбора сырья и до концентрированного экстракта (рисунок 3.5). На стадии замораживания создается вакуум в камере и происходит охлаждение концентратов до температуры их затвердевания. Для получения более мелких кристалов льда, заморозка должна быть быстрой. Семеновым Г.В. и др. было установлено, что процесс заморозки сырья растительного происхождения быстрее всего протекает при температуре 10°С и давлении 250 Па [36]. Этап сублимации предполагает медленный нагрев замороженных продуктов до точки перехода льда в пар, т.е. непосредственно процесс сушки продукции. При низком атмосферном давлении (порог «тройная точка» из расчета для воды при 0,01°С давление 611,657 Па) вода существует только в твердом и газообразном агрегатном состоянии, таким образом при данных условиях можно лед перевести в пар напрямую без перевода его в жидкость.

Аппаратурно-технологическая схема получения экстрактов лишайников приведена на рис. 3.6.

До начала экстракции сырье измельчают в барабанно-ножевой дробилке 1 до размера не менее 2 мм. Измельченное сырье отправляют в бункер 3 по транспортеру 2, а из бункера заданная масса сырья отправляется в биореактор 11 с режимом перемешивания через дозирующее устройство 4. Из емкости 5 в биореактор подается гексан через дозирующее устройство 6.

Через 24 часа экстрагирования полученный экстракционный раствор отправляют на фильтрацию под вакуумом 16, предварительно грубо отфильтровав через фильтр 12 биореактора. Вакуум в фильтре создается насосом 15, а воздух, откачанный при вакуумизации, собирается в ресивере 14.

Фильтрат, прошедший через фильтр 17, направляется в выпариватель 18. Охлаждение пара растворителя осуществляется вентилятором 19, а охлажденный пар конденсируется в камере конденсации 20. После процесса выпаривания дистиллят собирается в емкость 22, а концентрат - в емкость 21. Концентрат высушивается в вакуумно-сублимационной сушилке.

Аналогичной последовательности придерживаются при экстракции дихлорметаном 7 и ацетонитриллом 9, отмеряя их объемы дозирующими устройствами 8 и 10 соответственно.

После завершения экстракции шрот может быть использован в качестве биосорбента [37-40]. Шрот, для использования в качестве биосорбента, высушивается в сушильной камере 15. Транспортирование шрота из биореактора 11 осуществляется по транспортеру 14.

1 - барабанно-ножевая дробилка; 2, 13 - транспортер; 3 - бункер; 4, 6, 8, 10 - дозирующее устройство; 5, 7, 9 - емкость для растворителей; 11 - биореактор; 12, 17 - фильтр; 14 - ресивер; 15 - вакуумный насос; 16 - вакуумный фильтр; 18 - выпариватель; 19 - вентилятор; 20 -конденсационная камера; 21 - емкость для концентрата; 22 - емкость для дестиллята.

Рисунок 3.6 - Аппаратурно-технологическая схема получения экстрактов лишайников

Для анализа рисков и критических контрольных точек (таблица 3.6) учитывались принципы изложенные в ГОСТ Р 51705.1 - 2001 «Системы качества. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. Общие требования» [11]. Критические контрольные точки производственного процесса -это контроль на любом этапе производства, где могут возникнуть риски с безопасностью выпускаемой пищевой продукции [11].

Таблица 3.6 - Определение контрольных критических точек

Наименование Опасный фактор Номер контрольной

операции критической точки

Сбор сырья Высокое содержание тяжелых металлов ККТ1

Очистка и измельчение Примеси ККТ2

Экстракция Примеси в растворителях ККТ3

По результатам проведенного анализа сделано заключение о возможности реализации ряда рисков, которые зависят от соблюдения параметров технологического процесса. Так на этапе сбора сырья (ККТ1) необходимо удостовериться в степени загрязненности лишайников тяжелыми металлами. Содержание тяжелых металлов не должно превышать норм, установленных в методике определения содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах (0ФС.1.5.3.0009.15) [31] и ПДК тяжелых металлов и мышьяка в продовольственном сырье и пищевых продуктах (СП 4089-86) [43]. На этапе очистки (ККТ2) необходимо убедиться, что содержание других видов лишайников не более 5%, органической примеси - не более 5% и минеральной примеси - не более 1% [17]. Контроль качества сырья определяется визуально. Повышенный процент примесей может изменить спектр извлекаемых веществ и повлиять на свойства экстрактов. Так же и на этапе экстрагирования (ККТ3): использование растворителя с примесями может привести к извлечению других компонентов, что может повлиять на свойства экстрактов. Таким образом, для экстрагирования рекомендуется использовать растворители не ниже чистых для анализа (ч.д.а). На этапе конечной продукции (ККТ4) проводится выходной контроль на соответствие расчетным характеристикам (таблица 3.7).

Таблица 3.7 - Характеристика изготовленных сухих экстрактов

Экстракт Цвет Растворимость (при 21°С)

гексановый экстракт грязно-желтый Этанол: 2 мг/мл ДМСО: 15 мг/мл

дихлометановый экстракт коричнево-зеленый Этанол: 2 мг/мл ДМСО: 18 мг/мл

ацетонитрильный экстракт желто-зеленый или болотный Этанол: 10 мг/мл ДМСО: 30 мг/мл

На изготовление экстрактов и шротов из лишайникво разработан лабораторный технологический регламент (Приложение 1). Разработанная технология апробирована на базе ООО «Мартрэйд» (Приложение 2). Опытную выработку проводили один раз с массой лишайников 1 кг. Сравнительные характеристики конечных продуктов указаны в таблицах 3.8 и 3.9.

Таблица 3.8 - Сравнительная характеристика экстрактов лабораторного образца с образцом опытной выработки.

Наименование показателя Характеристика Характеристика

экстрактов экстрактов

(лабораторный образец) (опытная выработка)

Выход экстрактивных веществ (от массы сухого лишайника), %:

а) гексановый экстракт 2,73 2,59

б) дихлометановый экстракт 3,80 3,68

в) ацетонитрильный экстракт 6,22 6,20

Внешний вид

а) гексановый экстракт рассыпчатые кристаллы рассыпчатые кристаллы

грязно-желтого цвета грязно-желтого цвета

б) дихлометановый экстракт рассыпчатые кристаллы рассыпчатые кристаллы

коричнево-зеленого цвета коричнево-зеленого цвета

в) ацетонитрильный экстракт кристаллы желто-зеленого кристаллы желто-зеленого

или болотного цвета, или болотного цвета,

образующие комочки образующие комочки

Таблица 3.9 - Сравнительная характеристика шротов лабораторного образца с образцом опытной выработки на сорбционную способность.

Наименование показателя Характеристика шрота (лабораторный образец) Характеристика шрота (опытная выработка)

Насыпная плотность, г/см, не 0,9 0,9

менее

Величина предельной сорбции, ммоль/г (РЬ(11)) 0,247±0,002 0,25

Эффективная энергия сорбции, кДж/моль 8,1±0,1 8,0

Время максимально возможной 10-20 мин. 10-20 мин.

степени извлечения

3.2. Разработка методологии доклинических исследований безопасности и

биологической активности

Первый этап исследования безопасности лишайниковых веществ и экстрактов включал in silico моделирование риска побочных эффектов, таких как раздражение, мутагенез, канцерогенез и воздействие на репродукцию. Модель была построена с использованием программы DataWarrior (v 5.2.1), которая является наиболее оптимальным инструментом для прогнозирования побочных эффектов благодаря наличию баз данных в своем функционале. База данных Регистрации Токсических Эффектов Химических Веществ содержит информацию о примерно 600 000 веществ (https://www.cdc.gov/), а Всемирная база Индексов Лекарственных препаратов содержит информацию о более чем 50 000 веществ (https://www.daylight.com/meetings/mug97/GCross/wdi htdm.htm) [256]. В результате моделирования получены прогнозы о риске побочных эффектов, которые послужили отправной точкой для более детальных исследований и экспериментов in vitro.

Второй этап исследования включал проведение in vitro экспериментов для оценки цитотоксической активности и подтверждения гипотезы о рисках. Вещества, которые не показали рисков или проявили минимальные риски в in silico моделировании и не проявили цитотоксичность в in vitro модели, выбраны для дальнейшей разработки.

На первом этапе исследования антимикробной активности применили in vitro модель для определения наиболее активного экстракта. Затем проводили разделение экстракта с использованием колоночной хроматографии, а полученные фракции подвергали in vitro исследованиям их активности. С помощью ЯМР была охарактеризована наиболее активная фракция, что послужило основанием для проведения in silico моделирования.

Модель была построена на основе сравнения структурных формул молекул: вторичных метаболитов лишайников с неизвестным механизмом действия и классических антибиотиков. Учитывая нелинейность и низкую размерность

данных, для прогнозирования была предложена кластеризация с использованием Стохастического вложения соседей с t-распределением (t-distributed Stochastic Neighbor Embedding, t-SNE) [107]. Антибиотики были разделены на кластеры в зависимости от механизма их действия. Данная модель позволяет эффективно анализировать и классифицировать молекулы по механизму их действия, что открывает новые перспективы в области прогнозирования активности и разработки новых антимикробных веществ.

В отношении антипролиферативной активности экстрактов проводили предварительные in vitro исследования, в ходе которых рассчитывали индекс селективности. Для дальнейшей разработки выбрали только те экстракты и вещества, которые обладали наибольшим индексом селективности.

Для проведения in silico моделирования механизма действия использовали веб-приложение ChemGPS, содержащее базу данных с информацией о более чем 2 000 000 молекул (http://chemgps.bmc.uu.se/batchelor/). Модель основывается на физико-химических параметрах молекул, а кластеризация осуществляется с использованием метода главных компонент (PCA) для снижения размерности данных [127].

В дальнейшем данный прогноз проверяли in vitro с использованием Вестерн Блота.

В случае исследования способности лишайниковых веществ и экстрактов синергизировать с препаратами химиотерапии, на первом этапе проводили in vitro исследования с последующим расчетом индекса комбинации и определением эффективных концентраций комбинаций. Для дальнейшей разработки выполняли РНК-секвенирование клеток, обработанных выбранными экстрактами и веществами, которые обладали высоким индексом комбинации и концентрациями с максимальным 5-показателем.

Это позволило исследовать изменения в генной экспрессии и молекулярных механизмах, связанных с эффектом синергии. На основании генов, которые были уникально экспрессируемые только при комбинированном воздействии, построили

сеть взаимодействия регулируемых генов с использованием веб-приложения GeneMANIA (https://genemania.org/) [235]. В функционале GeneMANIA содержится информация о геномике и протеомике из различных баз данных, таких как GEO, BioGRID, Pathway Commons и I2D, что позволяет построить более точную модель взаимодействия генов.

Для подтверждения предсказаний, полученных из in silico моделирования, проводили дальнейшие in vitro эксперименты с использованием иммуноферментного анализа (ELISA). Это позволило непосредственно измерить экспрессию определенных белков и подтвердить влияние комбинаций лишайниковых веществ и препаратов химиотерапии на активность соответствующих биологических маркеров.

Структурно-логическая схема представленной методологии комбинирования методов in silico и in vitro представлена на рисунке 3.7.

Рисунок 3.7 - Структурно-логическая схема проведения анализа цитотоксичности и биологической активности экстрактов и их вторичных метаболитов

В целом, включение in silico моделирования позволяет проводить предсказания и оценку потенциальных свойств и взаимодействий молекул на ранних стадиях исследования, сокращая время и затраты, а также уменьшая количество необходимых in vitro экспериментов. В результате были разработаны и утверждены методические положения по применению компьютерного моделирования в прогнозировании механизмов антимкробной и антипролиферативной активностией веществ натурального происхождения (Приложение 3).

3.3. Определение токсичности экстрактов из лишайников E. prunastri и C. arbuscuh, а также эверновой и усниновой кислот

3.3.1. In silico моделирование возможных побочных действий (раздражение, риски мутагенеза, канцерогенеза и влияния на репродукцию)

На основе опубликованных в научных изданиях структурных формул вторичных метаболитов лишайников E. prunastri и С. arbuscula было проведено in silico моделирование возможных побочных действий (рисунок 3.8).

Лишайниковые депсиды, являющиеся вторичными метаболитами E. prunastri (эверновая и леканоровая кислоты, атранорин и хлоратранорин) были спрогнозированы как вещества не обладающие рисками побочных эффектов, в то время как депсидоны физодовая и фумарпротоцетраровая кислоты были определены как вещества с высоким потенциальным риском вызывать раздражения. Салациновая и усниновая кислоты были определены как вещества с высоким риском влияния на репродуктивную функцию. Наибольшее количество рисков было спрогнозировано in silico для фумарпротоцетраровой кислоты, вторичного метаболита С. arbuscula: риски влияния на репродуктивную функцию, индуцирование мутаций и канцерогенеза (таблица 3.10).

File Edit Data Chemistry Database List Macro Help Table

+ # Structure name Core Fragment

7 Lecanoric acid OH

Reproductive .

Ring Systems Mutagenic Tumorigenic Effective Irritant DrugScore Q,

ПОПЕ попе ПОПЕ попе 0.5138238

попе попе ПОПЕ попе 0.5034335

ПОПЕ попе П01 попе 0.3859457

попе попе ПОПЕ попе 0.3846383

ПОПЕ попе ПОПЕ попе 0.3257832

попе попе high попе 0.2275831

low low ow high 0.09240392

none попе ПОПЕ high 0.08790775

Рисунок 3.8 - моделирование in silico побочных эффектов лишайниковых веществ. Скриншот программы DataWarrior: none - отсутствие токсического риска; low - незначительный токсический риск; high - высокий шанс токсического риска.

Таблица 3.10 - Побочные эффекты вторичных метаболитов лишайников C. arbuscula и E. prunastri.

Лишайник Семейство веществ Вторичный метаболит Побочный эффект

C. arbuscula депсидон фумарпротоцетраровая кислота Раздражение

C. arbuscula депсидон фумарпротоцетраровая кислота Репродукция

C. arbuscula депсидон фумарпротоцетраровая кислота Мутагенез

C. arbuscula депсидон фумарпротоцетраровая кислота Канцерогенез

C. arbuscula, E. prunastri производные усниновой килоты усниновая кислота Репродукция

E. prunastri депсидон салациновая кислота Репродукция

E. prunastri депсидон физодовая кислота Раздражение

E. prunastri депсид атранорин -

E. prunastri депсид хлоратранорин -

E. prunastri депсид леканоровая кислота -

E. prunastri депсид эверновая кислота -

Анализ данных in silico моделирования позволяет выдвинуть гипотезу о том, что экстракты из С. arbuscula обладают большей токсичностью, чем экстракты из E. prunastri, так как вторичные метаболиты С. arbuscula обладают потенциально большим количеством рисков.

3.3.2. Определение цитотоксичности экстрактов и вторичных метаболитов

лишаиников

Данная гипотеза была подтверждена экспериментально in vitro исследованием на модели фибробластов (рисунок 3.9).

Рисунок 3.9 - График влияния экстрактов из С. arbuscula и Е. prunastri, эверновой и усниновой кислот на пролиферацию клеток фибробластов человека: А) С. агЬтси1а гексановый экстракт (ГС50=44 мкг/мл); В) Е. prunastri дихлорметановый экстрает (ГС50=29 мкг/мл); С) С. агЬтси1а ацетонитрильный экстракт (ГС50=16 мкг/мл); D) Е. prunastri ацетонитрильный экстракт (ГС50=79 мкг/мл); E) усниновая кислота (ГС50>66 мкг/мл (200 мкM)); F) эверновая кислота (ГС50>69 мкг/мл (200 мкM)); G) темозоломид (IC50>155 мкг/мл (800 мкM)); H) паклитаксель (IC50>85,5

мкг/мл (100 мк^).

Эверновая и усниновая кислоты (чистые вещества сравнения) не проявили цитотоксичность в отношении клеток фибробластов при концентрации до 200 мкМ. При этом экстракты из C. arbuscula и E. prunastri проявили способность ингибировать пролиферацию фибробластов при различных концентрациях. Минимальная концентрация полуингибирования (IC50) была определена при воздействии CarACN (16 мкг/мл). Концентрация EprACN, обеспечивающая 50% выживаемости клеток составила 79 мкг/мл - наиболее перспективный результат среди экстрактов. Таким образом, в опытах in vitro экспериментально подтверждается вывод из in silico моделирования, в котором было спрогнозировано, что компоненты C. arbuscula имели больший риск проявления побочных эффектов в сравнении с E. prunastri.

Стоит отметить, что большое число публикаций продемонстрировали гепатотоксические свойства усниновой кислоты [163, 173, 205, 206]. Также усниновая кислота обладает аллергическими эффектами, вызывая контактный дерматит [59, 97, 205]. Токсичность других соединений лишайников на сегодняшний день практически не исследована.

При поддержке in silico было смоделировано, что усниновая кислота и депсидоны имеют токсический риск, что соответствует данным научных публикаций. С другой стороны, депсид (класс к которому принадлежит эверновая кислота) не был связан с рисками токсичности.

Интересно отметить, что Alpsoy et al. проверили метанольный экстракт из E. prunastri на его антигенотоксическую способность (подробное описание в первой главе) [67]. Полученные данные ясно показали, что экстракт обладает значительными антигенотоксическими эффектами, которые, как считается, частично связаны с антиоксидантной активностью [67]. Данные исследования соответствуют результатам токсических исследований in vitro полученным в данной диссертации.

Таким образом, депсиды можно рассматривать как безопасные для разработки препаратов для ветеринарии и фармацевтики.

3.4 Определение биологической активности экстрактов лишайников и их

вторичных метаболитов

3.4.1. Антиоксидантная активность экстрактов и вторичных метаболитов

лишайников

Несмотря на то, что живые системы способны защищать себя от вредного воздействия реактивных форм кислорода [258], переизбыток их в клетке/ткани может привести к серьезным последствиям [258], в том числе, к канцерогенезу [81]. Перекись водорода (Н2О2) - основная реактивная форма кислорода, способная разрушать клетки и ткани [258].

Таким образом, для in vitro определения антиоксидантной активности использовали модель фибробластов (HSKF) и 3% перекись водорода (Н2О2), в качестве реактивной формы кислорода.

В эксперименте фибробласты культивировали в микротитровальных планшетах с добавлением 3% перекиси водорода в каждой ячейке. На рисунке 3.10 показаны результаты протекционной способности экстрактов.

EprDCM EprACN CarHex CarACN ЕА UA

Рисунок 3.10 - Гистограмма влияния экстрактов лишайников на выживаемость клеток при оксидативном стрессе, вызванном перекисью водорода (Н2О2). Концентрация экстрактов выражена в единицах «мкг/мл», а концентрация эверновой и усниновой кислот - в единицах

«мкМ»

Как известно реактивные формы кислорода в небольшом количестве участвуют в основных функциях клетки, включая экспрессию генов. Количественное увеличение реактивных форм кислорода в клетке ведет к мутациям ДНК и, как следствие, к таким патологиям как рак [210].

Имея фенольную природу усниновая кислота обладает антиоксидантной способностью [205]. Известно, что фенолы обладают высокой антиоксидантной способностью, в основном за счет их восстанавливающей способности. Они способны улавливать и нейтрализовать свободные радикалы и активные формы кислорода [85].

Так было опубликовано, что усниновая кислота в концентрации 100 мг/кг массы тела вызывала значительное ингибирование образования реактивных частиц, снижение перекисного окисления липидов и повышение активности антиоксидантных ферментов, таких как пероксид глутатиона и супероксиддисмутаза у крыс с индуцированной язвой желудка [118, 135]. В таких раковых клеточных линиях человека, как MCF7 (рак молочной железы), HeLa (рак шейки матки) и HCT-116 (рак кишечника) усниновая кислота в концентрации 50 мкМ не вызвала повышение реактивных форм кислорода [100], в то время как в нормальных клетках крови, изолированных от здоровых, некурящих доноров усниновая кислота при концентрации 75 мкг/мл (= 217,8 мкМ) индуцировала апоптоз и повреждение ДНК незначительной части клеток, повышая уровень реактивных форм кислорода [248]. Таким образом, усниновая кислота в низких дозах обладает антиоксидантными свойствами. Несмотря на высокие антиоксидантные свойства усниновая кислота не проявила защитных свойств в Н2О2 индуцированной клеточной смерти на клеточной линии нейробластом SH-SY5Y [202]. Данные результаты согласуются с результатами протекторной способности усниновой кислоты в отношении in vitro модели, полученными в диссертационной работе, где UA при увеличении концентрации показала увеличивающуюся протекторную способность: от 1% при концентрации 100 мкМ до 4% при концентрации 200 мкМ (рисунок 3.10).

Эверновая кислота показала наибольшую протекторную способность с максимальной защитой 12% клеток при концентрации 50 мкМ, при этом при увеличении концентрации данный эффект снижается: 5% защищенных клеток при концентрации 200 мкМ (рисунок 3.10). Эверновая кислота эффективнее усниновой кислоты в качестве протекторов клеток от вредного воздействия перекиси водорода максимум на 20 % при низких концентрациях и на 0,4% при высоких концентрациях.

ЕА, согласно данным из научных источников, также обладает высокой антиоксидантной активностью [72]. Но, в отличие от усниновой кислоты, эверновая кислота проявила защитные свойства против Н2О2 индуцированной клеточной смерти на клеточных линях U373-MG (астроцитома) и $Н-8У5У (нейробластома) [150], что согласуется с данными полученными в диссертации.

Наибольший протекторный эффект среди исследуемых экстрактов был отмечен для ЕргАСМ В диапазоне концентраций от 6,25 мкг/мл до 25 мкг/мл пролиферация обработанных EprACN была выше в сравнении с пролиферацией клеток, подвергшихся только воздействию перекиси водорода приблизительно на 4%. С увеличением концентрации данный эффект не наблюдался. Также СагНех при концентрации 6,25 мкг/мл показал незначительные протекторные свойства, увеличив пролиферацию клеток примерно на 1% (рисунок 3.10).

ЕрЮСМ и СагЛСК для всех исследуемых концентраций увеличили ингибирующее действие перекиси водорода в среднем на 10%.

Таким образом, ЕргЛСК и ЕА проявили себя как объекты с низкой возможностью проявления побочных эффектов, низкой цитотоксичностью и высокой протекторной способностью.

Результаты данного исследования соответствуют пт. 8 Паспорта специальности по направлению Биотехнология: «разработка научно-методических основ для применения стандартных биосистем на молекулярном, клеточном, тканевом и организменных уровнях в научных исследованиях, контроле качества и оценки безопасности использования пищевых, медицинских, ветеринарных и

парфюмерно-косметических биопрепаратов». Выдвинув гипотезу на основе результатов in silico моделирования и подтвердив ее in vitro на клеточном уровне была разработана научно методическая основа в оценке безопасности использования E. prunastri в качестве потенциального растительного ресурса для ветеринарии и фармацевтики.

3.4.2. Противомикробная активность экстрактов, фракций и вторичных

метаболитов лишайников

Несмотря на то, что в настоящее время разработано достаточно большое число различных антибиотиков, вопрос связанный с инфекционными заболеваниями остается актуальным из-за способности многих микроорганизмов вырабатывать резистентность к ним. Например, Staphylococcus aureus, как известно, устойчив к пенициллину, так как имеет фермент - пеницилиназу, способный расщеплять молекулу пенициллина. Кроме того, некоторые штаммы S. aureus выработали устойчивость к таким антибиотикам, как метицилин (MRSA) и ванкомицин (VRSA) [89]. Такие высокорезистентные бактерии вызывают значительную долю внутрибольничных инфекций [145, 207]. Учеными было отмечено ингибирующее действие таких лишайниковых веществ как гибокарпон из Lecanora conizaeoides Nyl. ex Cromb., лихенколин А из неопознаного лишайника и усниновой кислоты на данные штаммы [162, 177, 181]. Таким образом, в данном исследовании была проверена способность экстрактов из C. arbuscula и E. prunastri ингибировать рост микроорганизмов.

Результаты, полученные в ходе эксперимента, представлены в таблице 3.11. Усниновая кислота, как компонент с широко изученными свойствами, был использован в качестве чистого вещества сравнения.

Таблица 3.11 - Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) экстрактов из лишайников C. arbuscula и E. prunastri, мкг/мл.

Образец Staphylococcu Pseudomonas Escherichia Candida

s Aeruginosa Coli albicans

aureus

CarTCM 6±2* 167±33 >500 100±0

EprHex 2i±9(0.9) 150±41(08) >500 150±50(02)

EprDCM 4±1* 167±33(05) >500 150±50(02)

EprACN 14±3(°л) 133±33(10) 25°±1(0-3) 38±13*

UA 21±2 133±33 225±25 100±0

Результаты представлены как среднее значение по крайней мере трех независимых повторений ±SD (среднеквадратичное отклонение)

*Р-значение < 0,05

Эксперимент показал, что в отношении грамположительной S. aureus все исследуемые экстракты были активны, в концентрациях равной или ниже концентрации усниновой кислоты. Эффективные концентрации CarTCM и EprDCM были значительно ниже, чем для усниновой кислоты и составляли 6 мкг/мл и 4 мкг/мл, соответственно.

Ранее была описана высокая активность усниновой кислоты по отношению к резистентным штаммам грамположительных бактерий, таких как ванкомицин резистентные энтерококки (VRE) и метицилин резистентный S. aureus (MRSA) [205]. Стоит отметить, что эффективность усниновой кислоты по отношению к резистентным микроорганизмам была выше, чем по отношению к чувствительным [57, 111, 230]. Значения МИК усниновой кислоты по отношению к различным клиническим изолятам S. aureus варьирует от 8 до 50 мкг/мл [57, 68, 174, 179], в зависимости от концентрации клеток бактерий. Результаты активности усниновой кислоты, полученные в данном исследовании, в основном повторяют результаты других авторов.

Если же говорить про активность других вторичных метаболитов и целых экстрактов из C. arbuscula и E. prunastri, то опубликованных научных данных в их отношении мало. Так, было опубликовано, что ацетоновый экстракт из E. prunastri активен в отношении S. aureus при концентрациях от 0,078 мг/мл и 0,5 мг/мл и в отношении метицилин резистентного клинического изолята при концентрации

0,039 мг/мл [3, 189], а метанольный экстракт продемонстрировал активность при концентрации 0,156 мг/мл [74]. Результаты антимикробной активности ацетонового и метанольного экстрактов из E. prunastri, описанные выше значительно хуже результатов активности полученных в данной работе. Столь значительные различия можно объяснить отличным дизайном исследований (количеством микроорганизмов, временем экспозиции, различием питательных сред). Активность гексанового экстракта из E. prunastri (EprHex) полученная в отношении S. aureus схожа с эффектом усниновой кислоты и не вызывает противоречий.

В отношении грамотрицательных P. aeruginosa и E. coli эффект был ниже, летальная доза была выше в 6 - 40 раз (в зависимости от экстракта). Наиболее эффективными против P.aeruginosa проявили себя усниновая кислота и EprACN: в обоих случаях значение МИК составило 133 мкг/мл. Для CarTCM, EprHex и EprDCM эффективная концентрация была незначительно выше и составила 167, 150 и 167 мкг/мл, соответственно.

Согласно опубликованным данным, в отношении P. aeruginosa усниновая кислота также проявляет активность ниже, чем по отношению к S. aureus: значения МИК усниновой кислоты по различным источникам варьируют от 5,2 до 256 мкг/мл [111, 253]. Значительное различие в эффектах может быть объяснено различной концентрацией бактерий в экспериментах: низкий эффект был получен при использовании в эксперименте числа бактерий в 50 раз превышающее число бактерий исследования с высоким эффектом. Если же говорить про экстракты, то было опубликовано, что различные экстракты из E. prunastri являются активными против P. aeruginosa при концентрациях от 2,5 мг/мл до 25 мг/мл [170, 189]. Согласно Тапальскому и др. ацетоновый экстракт из E. prunastri не эффективен против P. aeruginosa при концентрациях ниже 500 мкг/мл [3]. В нашем случае активность экстрактов в отношении P. aeruginosa сравнима с эффектом усниновой кислоты и выше, чем эффекты экстрактов представленных выше опубликованных работ.

В отношении грамотрицательной бактерии E. coli было опубликовано, что усниновая кислота проявляет антибактериальные свойства против чувствительных штаммов при концентрации от 5,2 мкг/мл до 20 мкг/мл [111, 174] и не активна при концентрации ниже 100 мкг/мл против резистентных штаммов [111]. В данных случаях разница эффективности усниновой кислоты полученная различными авторами и отличная от результатов полученных в данной работе (МИК = 225 мкг/мл) определяется разницей концентрации бактерий, используемых при исследованиях. В нашем исследовании было использовано 106 КОЕ/мл в то время как Тапальский и др. использовали 104 КОЕ/мл, поэтому эффективность усниновой кислоты полученная нами была ниже опубликованной эффективности. Эффективность EprACN, в целом, была сравнима с эффективностью усниновой кислоты (МИК = 250 мкг/мл). Остальные экстракты CarTCM, EprHex и EprDCM не проявили никакой активности в отношении E. coli в концентрациях ниже 500 мкг/мл.

По опубликованным данным усниновая кислота эффективна по отношению к C. albicans в концентрации 75 мкг/мл [249]. Данная активность усниновой кислоты была незначительно выше, чем полученная в ходе проведения исследований для диссертации (МИК = 100 мкг/мл). А ацетоновые экстракты из E. prunastri и C. arbuscula согласно Тапальскому и др. эффективны по отношению к C. albicans в концентрации превышающей 500 мкг/мл [3]. Но, в соответствии с публикацией Millot et al., ацетоновый экстракт из E. prunastri ингибирует образование биопленок C. albicans при значении МИК = 25 мкг/мл [66]. Столь значительные различия могут быть объяснены разным дизайном исследований. Результаты исследований для данной диссертации показали, что экстракты были более активны в отношении C. albicans: EprACN показал наилучший эффект ингибируя рост C. albicans в концентрации 38 мкг/мл, а CarTCM показал эффект равный усниновой кислоте.

В целом, активность экстрактов и усниновой кислоты в отношении тестируемых штаммов микроорганизмов сравнительно одинаковая. Исключение

составил только ацетонитрильный экстракт из E. prunastri (EprACN), чья активность в отношении S. aureus и C. albicans была значительно выше чем активность усниновой кислоты.

Таким образом, для выявления вещества с наибольшей активностью, EprACN разделяли на фракции и определяли наиболее активную из них с применением метода направленных проб. Экстракт был разделен с использованием колоночной хроматографии, в результате которой была собрана 91 проба объемом 8 мл каждая. На основании разделения веществ на тонкослойной хроматографии (ТСХ) пробы с одинаковым разделением веществ были объединены в 15 фракций. Фракции, обозначенные X - XIII в таблице, изначально составляли одну пробу, но при проверке на ТСХ содержимое пробирки разделялось на компоненты, поэтому она была дополнительно разделена. Полученные фракции в дальнейшем были проверены на их антимикробные свойства (таблица 3.12).

Таблица 3.12 - Минимальные ингибирующие концентрации фракций, полученных после разделения экстракта из Е. ртппаъЫ в ацетонитриле, мкг/мл

Фракции Масса МИК, мкг/мл

фракции, мг Staphylococcus Pseudomonas Escherichia Candida

aureus aeruginosa coli albicans

I 5 >500 >500 250 500

II 3,4 >500 >500 >500 >500

III 12,4 62,5 >500 >500 >500

IV 10,7 >500 >500 500 >500

V 10,6 1,95 31,25 31,25 62,5

VI 31,8 0,98 31,25 125 62,5

VII 31,1 1,95 >500 >500 31,25

VIII 44,9 0,49 >500 >500 62,5

IX 12,6 3,91 >500 >500 125

X >500 125 500 >500

XI 13,0* 500 125 500 >500

XII 500 500 >500 >500

XIII 125 500 >500 >500

XIV 11,8 15,63 >500 >500 500

XV 224,6 125 125 500 500

Результаты фракционирования EprACN методом направленных проб

показали значительную разницу в эффективности фракций между собой. Так,

наибольший эффект проявили фракции с V по VII, чья активность была схожа с активностью усниновой кислоты [57, 68, 123, 174, 179]. Результаты полученные в данном исследовании были сравнены с концентрациями рекомендованными Институтом клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) [94] и Европейской комиссии по тестированию антимикробной чувствительности (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST) [121, 122].

Фракции с V по VIII проявили наибольшую эффективность в отношении S. aureus в диапазоне концентраций 0,49 - 1,95 мкг/мл. Наибольший эффект был обнаружен для фракции VIII, чье значение МИК составило 0,49 мкг/мл. Остальные фракции проявили себя менее активными. Согласно CLSI рекомендованные значения МИК варьируют от 0,12 мкг/мл до 32 мкг/мл в зависимости от используемого класса антибиотика [94]. Рекомендации EUCAST незначительно отличаются при ранжировании рекомендованных МИК от 0,03 мкг/мл до 16 мкг/мл [122]. Таким образом, S. aureus является чувствительной к фракциям с V по X и XIV как при сравнении полученных результатов с рекомендациями CLSI, так и при сравнении с рекомендациями EUCAST.

Фракции V и VI были одинаково активны против грамотициательной бактерии P. aeruginosa: их МИК составил 31,25 мкг/мл, что значительно ниже, чем МИК усниновой кислоты (133 мкг/мл). Другая грамотрицательная бактерия - E. coli, была чувствительна к фракции V, которая проявила ингибирующий эффект в концентрации 31,25 мкг/мл и менее чувствительна к фракции VI, которая проявила ингибирующий эффект в концентрации 125 мкг/мл. Остальные фракции были значительно менее активны в отношении грамотрицательных бактерий.

Несмотря на это, эффект данных фракций на грамотрицательных бактериях P. aeruginosa и E. coli был незначителен. Оба штамма могут быть отнесены к резистентным согласно рекомендациям CLSI и EUCAST [94, 122].

Против кандиды фракции с V по VIII проявили высокие ингибирующие свойства. Наибольшая активность была обнаружена для фракции VII, значение

МИК которой составило 31,25 мкг/мл. Фракции V, VI и VIII ингибировали C. albicans в концентрации 62,5 мкг/мл и показали активность выше, чем усниновая кислота. Но, несмотря на это, согласно EUCAST, C. albicans не является чувствительной к данным фракциям [121].

Фракции V и VI были активны против всех исследуемых микроорганизмов и их активность была выше, чем активность усниновой кислоты. Схожесть эффекта этих фракций можно объяснить перекрестным присутствием одинаковых компонентов во фракциях.

Так как фракция VI была получена в большем объеме, она была выбрана для дальнейшей характеризации на ЯМР.

Анализ 1H и 13C ЯМР спектров показал, что основным действующим веществом фракции VI является эверновая кислота (рисунок 3.11) [69]. Химические сдвиги (5, ppm) и константы взаимодействия (J, Гц) для экстракта и стандарта эверновой кислоты следующие:

Экстракт

1H NMR (CDCl3), 5, ppm (J, Hz): 2.59 s (3H, 8СН3), 2.76 s (3H, 8'СЮ), 3.89 s (3H, ОШ3), 6.42 m (2H, 3CH, 5CH), 6.57 d (1H, 5'СЮ, J 2.0), 6.69 d (1H, 3'СЮ, J 2.0), 11.08 s (3H, 2COH, 2'COH, 7'COH).

13C NMR (CDCl3), 5, ppm: 24.43, (8С), 24.73 (8'С), 55.57 (ОШ3), 99.04 (3C), 104.38 (1C), 109.09 (1'C), 109.18 (3'С), 112.11 (5С), 117.09 (5'С), 143.59 (6С), 144.96 (6'С), 155.08 (4'С), 160.09 (2'С), 165.04 (2С), 165.47 (4С), 166.67 (7С), 169.70 (7'С).

Эверновая кислота

1H NMR (CDCl3), 5, ppm (J, Hz): 2.58 s (3H, 8СЮ), 2.70 s (3H, 8'СЮ), 3.88 s (3H, ОШ3), 6.41 m (2H, 3CH, 5CH), 6.56 d (1H, 5'СЮ, J 2.0), 6.68 d (1H, 3'СЮ, J 2.0), 11.04 s (2H, 2COH, 2'COH), 11.41 s (1H, 7'COH).

13C NMR (CDCl3), 5, ppm: 24.24 (8С), 25.83 (8'С), 57.42 (OOT3), 98.78 (3C), 105.69 (1C), 109.06 (1'C), 109.13 (3'С), 114.58 (5С), 119.05 (5'С), 143.22 (6С), 144.75 (6'С), 155.08 (4'С), 160.24 (2'С), 164.00 (2С), 165.44 (4С), 166.66 (7С), 169.71 (7'С).

Нумерация атомов углерода является стандартной для депсидов и депсидонов, C-7 и C-8 относятся к атомам углерода карбоновой кислоты и метильной группы соответственно [185]. Корреляции 1H-13C HMBC и 1H-1H COSY были приемлемы для структуры (рисунок 3.11).

Рисунок 3.11 - Структура и ключевые корреляции 1H-13C HMBC (A) и 1H-1H COSY (B)

Определенная молекулярная формула и анализ данных ЯМР были сопоставлены с опубликованными литературными данными, которые подтверждают, что исследуемое соединение представляет собой эверновую кислоту ((2-гидрокси-4 - [(2-гидрокси-4-метокси-6-метилбензоил) окси] -6 -метилбензоат) [144, 185]. Для дальнейшей проверки этого был проведен ЯМР-анализ чистой эверновой кислоты, и ее ЯМР-спектры были сопоставлены со спектрами ЯМР экстракта EprACN фракции VI.

Научные данные о механизмах действия эверновой кислоты по отношению к микроорганизмам незначительные.

Чтобы выяснить потенциальный механизм действия эверновой кислоты, был проведен сравнительный анализ структурных формул вторичных метаболитов из E. prunastri с антибиотиками различных механизмов действия (рисунки 3.12 и 3.13).

ОН О

1Н-13С НМВС

1Н-1Н COSY

основного соединения из фракции VI

Рисунок 3.12 - Карта подобия структуры молекул вторичных метаболитов из Е. ртипа$1п и антибиотиков с различными механизмами действия по отношению к эверновой кислоте. Цвет от красного к зеленому обозначает процент схожести с эверновой кислотой: от 0% до 100%.

Карта подобия антибиотиков отображает их положение относительно эверновой кислоты. Вещества с отличающейся структурой от эверновой кислоты расположены на большем расстоянии, в то время как похожие вещества сконцентрированы ближе к ней. Кластеры антибиотиков сформированы на основе их механизма действия, обозначены разными цветами (ингибиторы клеточных стенок (обведены голубым), ингибиторы синтеза протеинов (обведены розовым), ингибиторы синтеза ДНК (обведены лиловым), ингибиторы синтеза РНК (обведены малиновым), ингибиторы синтеза миколовой кислоты (обведены синим) и ингибиторы синтеза фолиевой кислоты (обведены темно-зеленым)). Окраска точек на карте указывает на процент схожести структурных формул веществ, отсутствие схожести обозначено красным, а полная схожесть - зеленым.

Анализ карты подобия показал, что эверновая кислота не имеет структурной схожести с существующими антибиотиками. Структурная схожесть подтверждена только с лишайниковыми кислотами: леканоровой кислотой, атранорином и хлоратранорином (от 87 до 99%), физодовой и салациновой кислотами (63% и 61%, соответственно) (приложение 4).

Кроме обучения без учителя, примененного в данной работе, существуют способы обучения с учителем. В Российской Федерации разработана и развивается компьютерная система PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances - прогноз спектров биологической активности органических соединений) [46]. Для данной части работы стояли более легкие задачи, которые были решены менее масштабным способом.

При анализе научной литературы был обнаружен механизм борьбы эверновой кислоты с резистентностью. Оказалось, что эверновая кислота способна ингибировать ферменты FabI и FabZ Plasmodium falciparum, а также фермент FabI E. coli и S. aureus [196]. Данные энзимы необходимы для синтеза жирных кислот в клетках микроорганизмов [152], а жирные кислоты необходимы для нормального функционирования клетки [139]. Также описано, что эверновая кислота подавляет экспрессию генов lasB (эластаза) и rhlA (выработка рамнолипидов) в отношении P. aeruginosa [136]. LasB и RhlA - вирулентные факторы, ответственные за выработку так называемого чувства кворума (дистанционное микроб-микробное взаимодействие) [93, 226]. Благодаря ингибированию чувства кворума выработка резистентности сильно затруднена [93]. Имеются также данные о способности экстрактов из E. prunastri предотвращать созревание биопленок, формируемых C. albicans [66]. Данный механизм (формирование биопленок) используют микроорганизмы для большей устойчивости к антибиотикам [65]. Данный механизм может быть обоснован присутствием эверновой кислоты, как основного вторичного метаболита экстрактов из E. prunastri [224].

Сравнение структурного сходства эверновой кислоты не выявило структурного сходства с такими классами антибиотиков, как ингибиторы синтеза клеточной стенки и ингибиторы синтеза белка. Эверновая кислота и другие депсиды имеют структуру, немного похожую на ингибиторы синтеза фолиевой кислоты (до 38% схожести, приложение 4) и ингибиторы синтеза ДНК (до 34% схожести, приложение 4).

Фолат (фолиевая кислота) - это обозначение кофакторов, состоящих из трех частей: парааминобензойная кислота (ПАБК), птерин и глутаматы [141, 169]. Тетрагидрофолат (кольцо птерина) играет важную роль в биосинтезе пуринов, тимидилата, пантотената, РНК и аминокислот [141, 169]. Среди ингибиторов фолиевой кислоты сульфаметоксазол и триметоприм были наиболее похожи на соединения эверновой кислоты.

Ингибиторы синтеза ДНК (хинолоны) блокируют аппарат репликации ДНК за счет связывания с комплексами ДНК с ДНК-топоизомеразой IV и ДНК-гиразой [143]. ДНК-топоизомераза IV и ДНК-гираза катализируют двухцепочечный разрыв с последующим дублированием цепей [143]. Фторхинолоны - это хинолоны, замещенные фтором. Налидиксовая кислота и норфлоксацин - фторхинолоны, наиболее похожие на эверниновую кислоту. Моксифлоксацин и гатифлоксацин оказались наиболее идентичными усниновой кислоте. Все эти антибиотики действуют как ингибиторы ДНК-гиразы [100].

Кроме того, основой эверновой кислоты является фенилсалицилат (ZINC, http://zinc.docking.org/). Было показано, что салицилаты обладают ингибирубщим действияем на формирование биопленок и антиметаболическим действием на бактерии [106].

Если же рассматривать атранорин, то он активен против грамотрицательных бактерий, что необычно для других известных соединений лишайников [225]. Таким образом, наличие атранорина или (и) сходство структуры эверновой кислоты могло бы объяснить активность против грамотрицательных бактерий, наблюдаемую в наших экспериментах.

Усниновая кислота больше похожа по структуре на антибиотики (рисунок 3.13). Наибольшее сходство усниновая кислота имеет с ингибитором синтеза клеточной стенки - ванкомицином (54%); и ингибитором синтеза РНК -рифампицином (52%) (приложение 4).

Кроме того, описаны некоторые механизмы антимикробной активности усниновой кислоты. В отношении грамположительных бактерий S. aureus

усниновая кислота может действовать в качестве агента, повреждающего мембраны [179]. Более того, исследования на Bacillus subtilis, моделях искусственных двухслойных липидных мембран и митохондрий печени крыс показали, что потенциальный механизм антибиотической способности усниновой кислоты может быть связан с ее протонофорной активностью [178]. Усниновая кислота, будучи липофильной, проникает через двухслойную мембрану, вызывая утечку протонов и разрушая бактериальную мембрану [178, 196].

Рисунок 3.13 - Карта подобия структуры молекул вторичных метаболитов из Е. prunastri и антибиотиков с различными механизмами действия по отношению к усниновой кислоте. Цвет от красного к зеленому обозначает процент схожести с усниновой кислотой: от 0% до 100%.

Влияние усниновой кислоты на прооксидантно-антиоксидантный баланс было описано как механизм противокандидозного эффекта [245].

Другой возможный механизм действия усниновой кислоты против Mycobacterium tuberculosis, E. coli, S. aureus - связывание с аллостерическими сайтами на поверхности белка FabI (фермент еноилредуктазы), что влияет на активность фермента [196]. Более того, этот механизм описан для активности усниновой кислоты против эритроцитарной (кровяной) стадии Plasmodium falciparum, а также доэритроцитарной (печеночной) стадии P. berghei [196]. Кроме того, усниновая кислота проявляет активность против других паразитов Leishmania spp. индуцируя их апоптоз [110].

Несмотря на то что, ряд исследований описывают соединения лишайников как потенциальные антибиотики (особенно против грамположительных бактерий) [133, 218, 244], на сегодняшний день соединения лишайников не были отнесены к какому-либо классу антибиотиков. В связи с тем, что при т sШco моделировании ни один вторичный метаболит из E. prunastri не сформировал ни одного кластера ни с одним известным антибиотиком, а механизм их активности еще не изучен, то можно выдвинуть гипотезу, что лишайниковые кислоты, обладая антимикробной активностью имеют механизм действия отличный от механизмов современных антибиотиков.

То же самое относится и к другим метаболитам E. prunastri, таким как атранорин, хлоратранорин, леканоровая кислота, салациновая кислота и физодовая кислота. Эти соединения структурно подобны эверновой кислоте и поэтому являются возможными кандидатами в антибиотики, гипотетически представляющие новый класс веществ с антимикробной активностью.

Следовательно, лишайниковые кислоты, обладая антимикробной активностью, могут иметь механизм действия, отличающийся от современных антибиотиков. Данный результат имеет высокую практическую значимость для разработки новых антибиотиков.

3.4.3. Антипролиферативная активность экстрактов и вторичных

метаболитов лишайников

Вторичные метаболиты лишайников известны своей способностью ингибировать клеточную пролиферацию некоторых раковых линий [218, 265].

Однако, активность и механизм действия многокомпонентных экстрактов данных лишайников на раковые клетки не изучены. Активность многокомпонентных экстрактов может быть значительно выше/ниже из-за синергизма/антагонизма между различными их составляющими. Таким образом, исследования антипролиферативной активности экстрактов из лишайников, эверновой кислоты и усниновой кислоты (чистое вещество сравнения) проводили

in vitro на моделях глиобластомы U-87 (рисунок 3.14) и рака молочной железы MCF7 (рисунок 3.15).

Рисунок 3.14 - График влияния экстрактов из С. агЪшеи1а и Е. prunastri, эверновой и усниновой кислот и темозоломида на пролиферацию клеточной линии глиобластомы ^87: А) С. агЪтеи1а гексановый экстракт (ГС50=43±3 мкг/мл); В) Е. prunastri дихлорметановый экстрает (ГС50=13±3

мкг/мл); С) С. а^теиШ ацетонитрильный экстракт (ГС50=33±2 мкг/мл); D) Е. prunastri ацетонитрильный экстракт (ГС50=31±6 мкг/мл); E) усниновая кислота (ГС50=70 мкг/мл (203±15 мкM)); F) эверновая кислота (IC50=21мкг/мл (62±9 мк^); G) темозоломид (IC50=115 мкг/мл

(593±33 мкИ)).

Рисунок 3.15 - График влияния экстрактов из С. агЪтси1а и Е. ргипа$№, эверновой и усниновой кислот и паклитакселя на пролиферацию клеточной линии рака молочной железы MCF7: А) С. агЪшси1а гексановый экстракт (ГС50=85±14 мкг/мл); В) Е. prunastri дихлорметановый экстрает (ГС50=72±8 мкг/мл); С) С. агЪшси1а ацетонитрильный экстракт (ГС50=67±7 мкг/мл); D) Е. ргипа$Г ацетонитрильный экстракт (ГС50=107±13 мкг/мл); E) усниновая кислота (ГС50=58 мкг/мл (167±27 мкM)); F) эверновая кислота (ГС50>66 мкг/мл (200 мкM)); G) паклитаксель

(ГС50=11 мкг/мл (136±15 мкИ)).

Концентрация полуингибирования (ГС50) клеточной пролиферации

рассчитана с использованием программы OriginLab. Все опыты проведены как

минимум в трех независимых экспериментках по 3 повторности в каждом эксперименте.

Клетки глиобластомы и-87 чувствительны к темозоломиду при концентрации полуингибирования (1С5о) менее 500 мкМ [164]. В результате эксперимента установлено, что концентрация полуингибирования темозоломида составила 593 мкМ (рисунок 3.14, О), что свидетельствует о том что данные клетки являются резистентными к темозоломиду [164].

Анализ полученных данных показал, что экстракты из C. arbuscula и E. prunastri активны против клеток глиобластомы. Наибольшую активность в отношении глиобластомы и-87 показал дихлорметановый экстракт из E. prunastri (ЕргЭСМ) для которого 1С50 составила 13 мкг/мл. Но данный экстракт оказался токсичным в отношении модели фибробластов при 1С50=29 мкг/мл (рисунок 3.9). В то же время, ацетонитрильный экстракт из E. prunastri (ЕргАСК) показал достаточно высокую активность в отношении клеток глиобластомы при 1С50=31 мкг/мл и наименьшую токсичность в отношении фибробластов при 1С50=79 мкг/мл (рисунок 3.9). Гексановый экстракт из C. arbuscula (СагНех) показал схожую с ЕргАСК активность в отношении клеток глиобластомы (1С50=43 мкг/мл), но при этом он был токсичнее по отношению к фибробластам при 1С50=44 мкг/мл. Ацетонитрильный же экстракт из C. arbuscula (СагАСК) проявил большее ингибирующее действие в отношении клеток фибробластов (1С50=16 мкг/мл), чем на пролиферацию клеток глиобластомы (1С50=33 мкг/мл).

Экспериментально установлено, что эффективность эверновой кислоты (ЕА) в отношении И-87 (1С50=21 мкг/мл) была существенно выше, чем усниновой кислоты (ИА) (1С50=70 мкг/мл). Но, согласно публикациям других авторов, усниновая кислота была также активна в отношении клеточной линии и-87 при значении 1С50 41,55 мг/л (= 120,67 мкМ), при этом концентрация клеток составила 1 х 105 клеток / лунку, а время экспозиции - 48 часов [233].

В отношении клеток рака молочной железы (МСБ7) наибольшую активность проявила усниновая кислота, при концентрации 58 мкг/мл она ингибировала 50%

клеток (рисунок 3.15, Е). Стоит отметить, что данная активность была выше, чем при лечении стандартным химиопрепаратом - паклитакселем, активная концентрация которого составляет 116 мкг/мл (рисунок 3.15, О). В то же время наименьшая ингибирующая активность была отмечена для ЕргАСК (1С50 = 107 мкг/мл) (рисунок 3.15, Э), что в свою очередь ниже чем ингибирующая активность в отношении клеток фибробластов. Отсутствие эффективного действия на клетки рака молочной железы показали СагНех, СагАСК и ЕргЭСМ (1С50 = 85 мкг/мл, 67 мкг/мл и 72 мкг/мл, соответственно). Экспериментально установлено, что эверновая кислота не проявляла биологической активности по отношению к клеткам рака молочной железы, т.е. не оказывала влияния даже при максимальной концентрации (66 мкг/мл) (рисунок 3.15, Б). Данная активность была выше, чем у паклитакселя, активная концентрация которого составила 116 мкг/мл (рисунок 3.15, О).

Однако ранее сообщалось о различных результатах активности усниновой кислоты по отношению к клеткам MCF7. Клетки MCF7 (1*104 клеток / лунку, 72 часа экспозиции) были чувствительны к усниновой кислоте при 1С50 равной 94,6 мкМ [255]. BrisdeШ et а1. сообщили, что для усниновой кислоты 1С50 составляет 75,7 мкМ при воздействии в течение 48 часов (концентрация клеток не уточнялась) [101]. Другое исследование показало активность усниновой кислоты в отношении клеток MCF7 (2*103 клеток / лунку, 72 часа экспозиции) при 1С50 17,8 мкг/мл (= 51,7 мкМ) [102]. Различия в результатах по сравнению с нашими, вероятно, основаны на дизайне эксперимента. В данной работе, экспериментальный план был более строгим: время воздействия составило 24 часа, а количество клеток 50х103 клеток / лунку.

Эверновая кислота ранее не тестировалась на клеточных линиях MCF7 и и-87 [148, 218]. Но, согласно научным публикациям, эверновая кислота полученная из E. prunastri проявляла антипролиферативную активность в отношении FemX (меланома человека), LS174 (карцинома толстой кишки человека) [125], ММ98 (злокачественная мезотелиома), А431 (карцинома вульвы) и клеток НаСаТ (не

малигнантные первичные эпидермальные кератиноциты) [218]. Среди этих клеточных линий только клетки FemX и LS174 были чувствительны к эверновой кислоте при концентрациях 33,61 мкг/мл (101,14 мкМ) и 42,42 мкг/мл (127,66 мкМ) соответственно [125]. Значения IC50 для эверновой кислоты были незначительно ниже результатов, полученных на in vitro модели в данном исследовании.

Кроме того, согласно научным публикациям, другие соединения лишайников также активны в отношении клеточных линий MCF7 и U-87. Было показано, что дифрактовая кислота эффективна в отношении MCF7 при значении IC50 93,4 мкМ, при этом время экспозиции составило 48 часов [101]. Производные орселлината проявили антипролиферативную активность в отношении клеток MCF7 [149]: клетки были чувствительны к н-пропилорселлинату в концентрациях 23,5 мкг/мл (111,78 мкМ), к н-бутилорселлинату 14,0 мкг/мл (62,43 мкМ), к н-пентилорселлинату 18,5 мкг/мл. (77,64 мкМ), в изопропилорселлинат 30,2 мкг/мл (143,65 мкМ), в втор-бутил орезеллинат 16,2 мкг/мл (72,24 мкМ) и в трет-бутил-орселлинат 17,8 мкг/мл (79,37 мкМ) [149].

Клетки U-87 (1*105 клеток / лунку) были чувствительны к дифрактовой кислоте (35,67 мг/л = 95,27 мкМ), к лобаровой кислоте (5,77 мг/л = 12,64 мкМ) [233], к оливеторовой кислоте (17,55 мг/л = 37,14 мкМ), физодовой кислоте (410,72 мг/л = 872,94 мкМ) и псоромовой кислоте (56,22 мг/л = 156,91 мкМ) [148] при времени воздействия 48 часов. Среди этих соединений только лобаровая кислота и оливеторовая кислота были более активными, чем эверновая кислота.

Анализируя полученные в эксперименте результаты можно сделать вывод о селективности действия EprACN и эверновой кислоты на in vitro модели глиобластомы (рисунок 3.16).

3.5

1 3 1 2.5

'. i . . I I

EprDCM EprACN CarHex CarACN EA UA U-87 MCF7

Рисунок 3.16 - Гистограмма индексов селективности. Индекс селективности рассчитан как отношение IC50 в отношении клеток фибробластов человека к IC50 в отношении клеток глиобластомы и рака молочной железы человека. Индекс больше 2 говорит о высоком уровне

селективности.

Результаты исследования находят подтверждение в работах Lee et al. [184], в которых эверновая кислота проявляет нейропротекторные свойства. Последующие исследования механизма действия проводили только с ацетонитрильным экстрактом из E. prunastri и эверновой кислотой на клетках глиобластомы U-87.

Моделирование механизма цитотоксического действия эверновой кислоты (как наиболее активного вещества в отношении U-87 модели) было проведено с использованием программы ChemGPS-NP (рисунок 3.17). Алгоритм программы сравнил показатели эверновой кислоты с реферативными цитотоксическими веществами по 3 параметрам: размер молекулы, ароматичность, липофильность. В результате чего построил модель распределения веществ в химическом пространстве по отношению к эверновой кислоте.

Мeтодика моделирования биологической активности молекулы в программе ChemGPS включен в учебный процесс для студентов по направлению 19.03.01 «Биотехнология» (бакалавриат) и 19.04.01 «Биотехнология» (магистратура) (Приложение 5)

Эверновая кислота находится в одном химическом пространстве с ингибиторами топоизомеразы I (TOP1) и может проявлять их свойства (рисунок

3.17, С). Ингибиторы топоизомеразы I - полусинтетические производные растительного алкалоида камптотецина. Они стабилизируют расщепляемые комплексы ТОР1-ДНК (Тор1сс) [143, 242]. Эверновая кислота продемонстрировала также химическое сходство с тубулин-активными соединениями (рисунок 3.17, А) (эти соединения связываются с тубулином микротрубочек, влияя на их динамику [156, 160]) и была диаметрально противоположна с веществами алкилирующего типа (рисунок 3.17, Е). К веществам алкилирующего типа относится темозоломид, резистентность к которому имеется у модельных клеток глиобластомы. Темозоломид наиболее часто используемый химиотерапевтическое средство для лечения глиобластомы [154], он приводит к несоответствию оснований ДНК, что инициирует бесполезные циклы репарации ДНК. В конце концов, цепи ДНК разрываются, что, в свою очередь, вызывает гибель клеток [230].

Рисунок 3.17 - Позиция эверновой кислоты (куб) в химическом пространстве в сравнении со справочными компонентами: A) тубулин активные компоненты; B) антиметаболиты; C) ингибиторы топоизомеразы I; D) ингибиторы топоизомеразы II; E) компоненты алкилирующего

типа.

Как говорилось ранее, положение эверновой кислоты в химическом пространстве схоже с веществами ингибиторами топоизомеразы I и тубулин активных веществ, что влияет на клеточный цикл и приводит к замедлению

(прекращению) пролиферации. Ключевым сигнальным путем, регулирующим пролиферацию, дифференцировку и апоптоз, является путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) [120]. Члены семейства MAPK - ERK1 и ERK2 регулируют передачу сигналов в нормальных и патофизиологических условиях и играют роль в развитии и прогрессировании рака [120]. Путь Ras / Raf / MEK / ERK взаимодействует с путем Ras / PI3K / PTEN / Akt для регулирования роста и в некоторых случаях туморогенеза [209]. Akt является центральным участником многих путей, регулирующих выживание, пролиферацию, миграцию, метаболизм и ангиогенез клеток [77, 204]. Кроме того, протоонкоген - cJun, являющийся компонентом белка-1, активирующего фактор транскрипции (AP-1), является фокусом передачи сигналов, измененных раком [213]. Таким образом, на следующем этапе были проведены in vitro исследования по определению влияния EprACN и эверновой кислоты на фосфорилирование ERK1, ERK2, cJun и Akt (рисунки 3.18 и 3.19, соответственно).

EprACN влияет на синтез и фосфорилирование ERK1/2, Akt и cJun в зависимости от концентрации и времени воздействия. Данный экстракт значительно снижает синтез ERK1/2 уже через 12 часов воздействия (рисунок 3.18, А.1). Уровень фосфорилирования ERK1/2 через 12 часов был значительно снижен только при воздействии EprACN максимальной концентрации (рисунок 3.18, А.2), а через 24 часа при воздействии данного экстракта во всех концентрациях. Уровень фосфорилирования cJun и Akt также был значительно снижен через 24 часа воздействия экстракта во всех тестируемых концентрациях (рисунок 3.18, В.1 и С.1). В случае cJun наблюдалось значительное увеличение его фосфорилирования с течением времени (рисунок 3.18, В.1), в то время как в случае с ERK1/2 и Akt не наблюдалось значительного изменения их фосфорилирования (рисунок 3.18, А.2 и С.1). Таким образом, таргетирование cJun является ключевым механизмом действия экстракта.

A.l) 2

1.75 с 1.5

Z125

f

B.l)

Ü ЯШ

II

*» f

B.2)

A.2)

pcJun

ß-actin

и L iü

C.l)

с 2.5

я

li 2

A.3)

pERKI/2

0 6h П Control 12h ■ 20 ng/ml ■ 30 |ig/ml 24h ■ 40 jig/ml

*---«---

«Юн • — *= яж

_______________ - —----

^ / / / ^ / / J ^ / / /

dl

ii Ii

C.2)

pAkt

ß-actin

6h 12h 24h

J äÄ „

n —---- -----

^ / / / ■ ^ ^ / / /

Рисунок 3.18 - Способность EprACN регулировать синтез и фосфорилирование ERK1/2 (А) и фосфорилирование cJun (В) и Akt (С) в зависимости от времени воздействия (6, 12 и 24 ч) и концентрации (0, 20, 30, 40 мкг/мл). #Р-значение <0.05 в сравнении с экспрессией после 6 ч воздействия (12ч vs 6ч, 24ч vs 6ч), *Р-значение <0.05 в сравнении с экспрессией контроля

внутри временного промежутка.

Эверновая кислота так же как и экстракт значительно уменьшила синтез ERK1/2 уже через 12 часов (рисунок 3.19, А.1) при всех исследуемых концентрациях, но его фосфорилирование - только через 24 часа (рисунок 3.19,

A.2). В отношении cJun эверновая кислота проявила себя аналогично экстракту, значительно уменьшив уровень его фосфорилирования через 24 часа (рисунок 3.19,

B.1) и проявила более слабый эффект по отношению к Akt (рисунок 3.19, С.1): значительно редуцировала его фосфорилирование только при воздействии двух концентраций. Основное отличие эверновой кислоты от экстракта состояло в том, что она таргетировала два протеина МАРК сигналинга: ERK1/2 и cJun при их значительно увеличенном фосфорилировании в раковых клетках она редуцировала данный процесс (рисунок 3.19, А.2 и В.1).

Рисунок 3.19 - Способность EA регулировать синтез и фосфорилирование ERK1/2 и фосфорилирование (А), cJun (В) и Akt (С) в зависимости от времени воздействия (6, 12 и 24 ч) и концентрации (0, 40, 50, 60 мкМ). #Р-значение <0.05 в сравнении с экспрессией после 6 ч воздействия (12ч vs 6ч, 24ч vs 6ч), *Р-значение <0.05 в сравнении с экспрессией контроля

внутри временного промежутка.

Ингибирование синтеза и фосфорилирования ERK1/2 при стимулировании клеточной линии U-87 EprACN и EA согласовывалось с их антипролиферативной активностью. Однако через 6 часов наблюдалось временное повышение в экспрессии ERK1 / ERK2 и фосфорилировании cJun. Полученные результаты могут указывать на временную индукцию стресса после 6 часов экспозиции.

Увеличение уровня cJun в клетках описано для различных опухолевых клеток [54, 77, 157]. В частности, повышенная экспрессия cJun в опухолях головного мозга способствует его злокачественности [54]. Предыдущие исследования Blau et al.

продемонстрировали, что накопление cJun в условиях опухоли регулируется трансляционно, на матрице которого происходит синтез белка, при этом количество мРНК не увеличивается [54]. Фосфорилированный cJun (pcJun) защищен от убиквитинирования и последующей деградации, что увеличивает стабильность cJun [54, 157]. В нашем случае увеличение pcJun было обнаружено только после 6 часов экспозиции, и через 24 часа EprACN и эверновая кислота значительно снизили уровень pcJun.

Влияние EprACN и эверновой кислоты на фосфорилирование Akt зависело от времени и концентрации. В частности, концентрация EprACN равная 30 мкг/мл привела к желаемому снижению pAkt через 12 и 24 часа. Концентрация эверновой кислоты для достижения этого эффекта составила 40 мкМ.

Подавление фосфорилирования Akt согласуется с обнаружением антипролиферативной активности в клетках U-87. Избыточная экспрессия Akt и его высокое фосфорилирование имеют прямую корреляцию с негативными прогнозами для пациентов с глиобластомой [176]. Высокий уровень фосфорилирования Akt нацелен на фосфорилирование GSK3ß, что приводит к его инактивации и транслокации бета-катенина в ядро [49, 176]. Оба пути активируют факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию генов [77]. Их можно активировать независимо друг от друга, что может приводить к резистентности [49]. Подавление AKT с помощью EprACN и эверновой кислоты может также играть роль в преодолении резистентности U-87 клеток глиобластомы к темозоломиду в исследованиях синергии.

Методика исследований сигнальных путей клеток с использованием Вестерн Блота включена в учебный процесс для студентов по направлению 19.03.01 «Биотехнология» (бакалавриат) и 19.04.01 «Биотехнология» (магистратура) (Приложение 5)

Таким образом, экстракт и эверновая кислота регулируют экспрессию ключевых протеинов сигнальных путей, которые ведут к апоптозу и влияют на пролиферацию и клеточное деление не напрямую через топоизомеразную

активность, как это было смоделировано в ChemGPS-NP, а через сигнальные пути МАРК и PI3K.

Результаты данной in vitro модели имеют научную значимость в области первичного скрининга лекарственных средств в отношении глиобластомы, которая является наиболее гетерогенной опухолью головного мозга и характеризуется агрессивным поведением с неблагоприятными прогнозами [154]. На основе результатов in silico и in vitro моделей можно рекомендовать in vivo исследования на животных.

3.4.4. Способность экстрактов и вторичных метаболитов лишайников к

синергизму