Белок, образующий с актином гель в экстракте селезенки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гиоева, Фатима Константиновна

• Гиоева, Фатима Константиновна
• кандидат биологических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гиоева, Фатима Константиновна

ВВЕДЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Полимеризация актина и его организация в немышечных клетках.

2. Явление образования геля в клеточном экстракте . II

3. Актин-связывашцие гелеобразуодие белки.

4. Сокращение гелей в клеточных экстрактах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Гелеобразование в клеточном экстракте селезенки

2. Фракционирование компонентов геля.

3. Доказательства того, что высокомолекулярный компонент геля является миозином.

4. Доказательство роли миозина в образовании геля в экстракте селезенки. Реконструкция геля из очищенных компонентов.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Белок, образующий с актином гель в экстракте селезенки»

Актуальность работы, Актиновые филаменты (микрофиламенты) являются одной из основных частей цитоскелета эукариотич еско й клетки. Функции микрофиламентов разнообразны: они участвуют в процессах клеточной подвижности, в делении клеток, в движении внутриклеточных органелл, а также в поддержании внутренней организации клетки. Многие из этих функций: амебоидное движение клеток, цитокинез, образование филоподий, фагоцитоз, секреция - сопровождаются, как считается, локальными изменениями консистенции кортикальной цитоплазмы. Открытое не так давно явление образования геля в экстрактах многих немышечных клеток показало, что изменение консистенции цитоплазмы может происходить за счет объединения отдельных филаментов в трехмерные сети. Такие сети действительно обнаружены in vivo в кортексе ряда немышечных клеток. С другой стороны, гель в клеточном 'экстракте способен сокращаться, что дает основание связывать с сетями микрофиламентов и сократительные свойства цитоплазмы.

Гелеобразование в клеточном экстракте является удобной бесклеточной системой, пригодной для. исследования вопроса о том, как регулируется консистенция и осуществляется движение цитоплазмы в клетках. В настоящее время ведется интенсивное изучение состава актиновых гелей, условий их образования и роли отдельных компонентов в формировании и сокращении геля.

Благодаря феномену гелеобразования был обнаружен особый класс белков, связывающих актиновые филаменты в трехмерные сети. Показано также, что сокращение гелей, образованных с участием таких белков, основано на взаимодействии актиновых филаментов с миозином, то есть трехмерная сеть микрофиламентов в сущности является актошозиновой сократительной системой. Молекулярные механизмы образования, геля и его сокращения пока неясны. Особую трудность представляет объяснение перехода от образования геля к сокращению, потому что, хотя теоретически миозин должен сшивать актиновые филаменты, до сих пор нет экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что он может включаться в гель уже при его образовании.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование компонентов стабильного геля, образующегося в экстракте селезенки.

Экспериментальные задачи работы состояли в следующем: - I. Определить условия образования геля в экстракте селезенки;

2. Идентифицировать компоненты геля и выделить их в очищенном виде;

3. Воспроизвести явление гелеобразования с использованием очищенных компонентов;

4. Исследовать роль каждого из компонентов в реакции образования геля в экстракте.

Научная новизна работы. В результате настоящей работы впервые определены условия образования стабильного геля в экстракте селезенки. Показано, что основными компонентами такого геля являются актин и белок высокого молекулярного веса. Разработан метод диссоциации компонентов геля в растворе, содержащем высокую концентрацию АТФ. С помощью фракционирования солюбилизированного в AT© геля хроматографией на гидроксиапа-тите получен в высокоочищенном виде высокомолекулярный компонент геля. Изучение свойств очищенного высокомолекулярного белка позволило идентифицировать его как миозин селезенки.

Получены моноспецифические антитела против миозина селезенки. Найдено, что эти антитела ингибируют образование геля, в экстракте селезенки. Таким образом, впервые было показано, что немышечный миозин может являться существенным структурным компонентом актинового геля.

Научно-практическая ценность "работы. Разработанные в настоящем исследовании экспериментальные подходы могут быть использованы для изучения роли миозина в изменении вязкости цитоплазмы в других системах, а также для исследования вопроса о том, как этот процесс регулируется. Разработанный метод выделения. миозина из селезенки является быстрым и удобным к позволяет получить высокоочищенный препарат, обладающий высокой АТФазной и гелеобразущей активностью. Поэтому он может применяться для выделения немышечного миозина с целью исследования его свойств, получения антител и т.д. Результаты настоящей работы открывают новые подходы для решения вопроса о механизмах регуляции вязкости цитоплазмы в немышечных клетках и возможной роли этого процесса в подвижности и поддержании формы немышечных клеток.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЭГТА - этиленгликоль-бис-(£> -аминоэтил)- н -тетрауксус-ная кислота;

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

АТФ - аденозин-5'-трифосфат; цАШ - циклический аденозин-З'-б'-монофосфат;

Фн - неорганический ортофосфат;

ТХУ - трихлоруксусная кислота; о-актин - глобулярный актин (мономер);

Р-актин - фибриллярный актин (полимер).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ПОЖМЕРИЗАЦШ АКТИНА. И ЕГО ОРГАНИЗАЦИЯ В НЕМЫИШШХ

МЕТКАХ

Для немышечных клеток характерны три состояния актина: мономерный актин, отдельные микрогоиламенты и структуры более высокого порядка - пучки и сети микрофиламентов. in vitro в растворе низкой ионной силы актин существует в виде мономерного глобулярного белка (g-актин) с молекулярным весом 42 кД. Добавлением соли - KCl до 50-100 мМ и(или) Mgci2 до 0,5-2,0 мМ - можно индуцировать его полимеризацию, если концентрация G-актина превышает некое критическое значение. Эта критическая концентрация невысока, но различна для актинов, выделенных из разных клеток, и зависит от условий полимеризации. Для актина из Acanthamoeba , например, она составляет 0,1 мг/мл при +25°С в 0,1 М KCl /67/.

Процесс полимеризации актина in vitro сопровождается ростом вязкости, который во времени описывается сигмоидной кривой. Полимеризация начинается с нуклеации - образования коротких затравок. Ее сменяет стадия элонгации, на которой к затравкам с обоих концов присоединяются мономеры актина. Увеличение длины филаментов прекращается, когда концентрация G--актина снизится до критического значения - наступает стадия равновесия /135/. Полимеризацию актина можно заметно ускорить добавлением готовых затравок - например, филаментов актина, разрушенных ультразвуком /122/.

Филаменты могут спонтанно ломаться в растворе, увеличивая число центров полимеризации /177/, причем степень фрагментации зависит от экспериментальных условий /178/, и, наоборот, отдельные филаменты могут соединяться конец в конец /122/. о -актин содержит I моль связанного АТФ на моль белка; при полимеризации актина происходит гидролиз связанного АТФ /154/.

Раствор полимеризованного актина (р-актин) содержит, как можно видеть под электронным микроскопом, длинные, до 3 мкм, нити диаметром 60-70 2. Каждый филамент актина по внешнему виду напоминает двойную спираль с периодом 36 нм /67/. Филаменты актина обладают большой гибкостью и легко перепутываются, образуя сеть /ИЗ/. Раствор актина является тиксотропным /20/;

Актиновые филаменты полярны, что хорошо видно на фила-ментах, декорированных тяжелым меромиозином /82/. Один из концов декорированного филамента выглядит под электронным микроскопом как наконечник стрелы, другой - как ее оперение. На стадии элонгации к разным концам филамента мономеры актина присоединяются с разной скоростью, эта скорость заметно выше для "оперенного" конца /136/. Поэтому после наступления равновесия, то есть когда уже не происходит увеличения длины фи-ламентов, на "оперенном" конце идет, по-видимому, преимущественно полимеризация, а на "остром" - деполимеризация актина /176/.

Актин содержится в любой эукариотической клетке, причем в довольно высокой концентрации: для подвижных клеток его содержание может составлять до 10-15$ общего белка клетки /92/.

Условия, существующие внутри клетки, и высокая концентрация актина должны были бы способствовать его полимеризации.

Тем не менее в цитоплазме немышечных клеток значительная часть актина (до 50%), как правило, содержится в неполимерном виде /14/. Существуют специальные белки, удерживающие актин от полимеризации. Один из них - профилин, белок с молекулярным весом 16 кД. Он образует очень прочный комплекс с G -актином, стабилизируя его в форме мономера /29/. Этот комплекс настолько прочен, что in vitro он диссоциирует только при денатурации актина в 2 М мочевине /109/. in vivo диссоциация комплекса актина с профилином должна, по-видимому, происходить при быстрой полимеризации актина, например, при активации тромбоцитов /103/. Эта диссоциация, вероятно, происходить при участии специальных белков; во всяком случае, для ос-актинина показана способность вызывать полимеризацию актина из комплекса с профилином in vitro /13/.

Что касается полимерного актина, то есть микрофиламентов, их организация в немышечных клетках лабильна и разнообразна. Но в сущности, все это разнообразие можно свести к двум типам структур - пучкам и сетям из микрофиламентов.

В клетках, выращенных в культуре, микрофиламенты часто выявляются в виде высокоорганихованных пучков - волокон натяжения /139, 65/. Такой тип окрашивания характерен для хорошо распластанных клеток.

В делящихся клетках микрофиламенты концентрируются в области веретена между полюсами и хромосомами /5/, а при цитокинезе образуют сократительное кольцо /151/.

Некоторые клетки имеют особые, только им свойственные структуры, состоящие из микрофиламентов. Примером могут служить клетки кишечного эпителия, имеющие множество микроворсинок; основой каждой микроворсинки служит пучок микрофиламен-тов /132/.

Пучки микрофиламентов обнаружены также в филоподиях тромбоцитов /120/, фагоцитирующих макрофагов /158/, целомоцитов морских ежей /153/.

В периферической цитоплазме многих клеток актиновые фи-ламенты организуются в густую сеть /159/. По существующим сейчас представлениям, эта сеть определяет консистенцию кортикального слоя цитоплазмы, изменения которой сопровождают многие виды клеточной подвижности. В экстрактах ряда немышечных клеток может происходить гель-золь-трансформация, которая является, вероятно, моделью аналогичных изменений консистенции кортекса ( рассмотрению этого явления посвящена следующая глава обзора). Кортикальная сеть микрофиламентов может перестраиваться с образованием пучков; при фагоцитозе, например, такая перестройка приводит к появлению филоподий Д68 /. Аналогичная реорганизация цитоскелета происходит при стимуляции тромбоцитов: в течение нескольких минут они меняют свою форму с овального диска на сферу с несколькими филоподиями, содержащими пучки актиновых филаментов /120/.

Электронно-микроскопические исследования показали тесную связь микрофиламентов с мембраной /8/. Кроме того, микрофи-ламенты часто присутствуют в препаратах мембран клеток животных /6/. Ярким примером связи микрофиламентов с мембраной является цитоскелет эритроцита /17/.

Организация актина в немышечных клетках находится под контролем разнообразных по функциям актин-связывающих белков. Таких белков сейчас описано более четырех десятков /145, 93/.

Рассмотрению свойств гелеобразующих ак ти н- с вяз ыв ающих белков посвящена третья глава обзора.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гиоева, Фатима Константиновна

- 92 -ВЫВОДЫ

1. Показано, что экстракт селезенки крупного рогатого скота образует гель, который может оставаться стабильным -не сокращаться и не разжижаться - в течение долгого времени. Исследовано влияние на гелеобразование различных факторов: температуры, ионных условий, АТФ, цитохалазина В.

2. Изучен белковый состав геля. Основными компонентами геля являются два белка: актин и белок высокого молекулярного веса.

3. Разработан метод выделения из геля компонента высокого молекулярного веса, включающий в себя всего две стадии: растворение геля в среде с высокой концентрацией АТФ и фракционирование его на гидроксиапатите. Метод позволяет получить высокоочищенный препарат "тяжелого" компонента геля.

4. Изучение свойств очищенного высокомолекулярного компонента геля показало, что он содержит тяжелые цепи с молекулярным весом 200 кД и легкие цепи с молекулярным весом 21 и 16 еД, обладает Са^+- и К^/ЭДТА-АТФазной активностью, имеет коэффициент седиментации около 6 б и образует биполярные фи-ламенты; кроме того, киназа из экстракта селезенки фосфорили-рует его по легкой цепи с молекулярным весом 21 кД. Следовательно, высокомолекулярный компонент геля является миозином; разработанный метод очистки этого компонента можно рассматривать как метод выделения миозина из селезенки.

5. При добавлении к Р-актину очищенный миозин селезенки индуцирует образование геля. Этот результат является первым экспериментальным доказательством того, что немышечные миозины обладают гелеобразующей активностью.

6. Гель, образованный очищенным миозином из селезенки и актином, может сокращаться. Следовательно, стабильность геля в экстракте селезенки не обусловлена тем, что селезеночный миозин вообще не способен обеспечивать сокращение или был поврежден при приготовлении экстракта.

7. Получены антитела против миозина селезенки и показано, что они полностью ингибируют гелеобразование в клеточном экстракте. В совокупности с гелеобразующей активностью очищенного миозина этот результат означает, что миозин является существенным функциональным компонентом геля в экстракте селезенки.

8. Продемонстрированное в настоящей работе образование стабильного актомиозинового геля в клеточном экстракте свидетельствует о принципиальной возможности включения миозина в гель в качестве его составной части еще на стадии гелеобра-зования, до перехода к стадии сокращения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гиоева, Фатима Константиновна, 1985 год

1. Поглазов Б.®., Левицкий ДД. "Миозин и биологическая подвижность", М.: Изд=во "Наука", 1982, с.119-128.

2. Banks P., Sharrard M., Peace C. "The formation of actin-con-taining gels by extracts of bovine splenic nerve". Neuroscience, 1978, v.3, p.II09-IH6.

3. Barber D.A., Crumpton M.J. "Actin associated with purified lymphocyte plasma membrane". FEBS Lett., 1976, v.66, p.215--220.

4. Begg D.A., Rebhun L.I. "pH regulates the polymerization of actin in sea urchin egg cortex". J. Cell Biol., 1979» v.83, p.241-248.

5. Begg D.A., Rodewald R., Rebhun L.I. "The vizualization of actin filament polarity in thin sections. Evidence for the uniform polarity of membrane-associated filaments". J. Cell Biol., 1978, v.79, p.846-852.

6. Bennett V., Davis J. "Erythrocyte ankyrin: immunoreactive analogues are associated with mitotic structures in cultured cells and with microtubules in brain". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1981, v.78, p.7550-7554.

7. Bennett V., Davis J., Fowler W.E. "Brain spectrin, a membrane-associated protein related in structure and function to erythrocyte spectrin". Nature, 1982, v.299, p.I26-I3I.

8. Bennett D., Stenbuck P.J. "Human erythrocyte ankyrin. Purification and properties". J. Biol. Chem., 1980, v.255,p.2540-2548.

9. Bennett J.P., ZanerK.S., Stossel T.P. "Macrophage oc-acti-nin: isolation and properties". J. Cell Biol., 1983» v.97» 5, pt.2, p.280a.

10. Blikstad I., Eriksson S., Carlsson L. " (X-Actinin promotes polymerization of actin from profilactin". Eur. J. Biochem.1980, v.109, p.317-323.

11. Blikstad I., Markey P., Carlsson L., Persson T., Lindberg U.,"Selective assay of monomeric and filamentous actin in cell extracts, using inhibition of deoxyribonuclease I". -- Cell, 1978, v.I5» p.935-943.

12. Boxer L.A., Richardson S., Floyd A. "Identification of ac-tin-binding protein in membrane of polymorphonuclear leukocytes" . Nature, 1976, v.263, p.249-251.

13. Boxer L.A., Stossel T.P. "Interactions of actin, myosin and an actin-binding protein of chronic myelogenous leukemia leukocytes". J. Clin. Invest., 1976, v.57, p.964-976.

14. Branton D., Cohen C.M., Tyler J.,"Interaction of cytoskele-lal proteins on the human erythrocyte membrane". Cell,1981, v.24, p.24-32.- J. Cell Biol., 1983, v.97, 5, pt.2, p.283a.

15. Frederiksen D.W. "Physical properties of myosin from aortic smooth muscle". biochemistry, 1979* v.18, p.l65I-l656.

16. Glenney J.R.,Jr., Glenney P., Osborn M., Weber K. "An F-actin and calmodulin-binding protein from isolated brush borders has a morphology related to spectrin". Cell, 1982, v.28, p.843-854.

17. Glenney J.R., Jr., Glenney P., Weber K. "F-actin-binding and cross-linking properties of porcine brain fodrin, a spectrin related molecule". J. Biol. Chem., 1982, v.257, p.9781-9787.

18. Glenney J.R., Jr., Glenney P., Weber K. "Membrane-microfi-lament interactions; spectrin-like molecules as structural elements of the cortical cytoplasm in non-erythroid cells".- J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2, p.28Ia.

19. Goldman R,, Lazarides E., Pollack G., Weber K. "The distribution of actin in non-muscle cells. The use of actin-an-tibody in the localization of actin within the microfilament bundles in mouse 3T3 cells". Exp. Cell Res., 1975, v.90, p.333-344.

20. Goodman S.R., Zagon I.S., Whitfield C.F., Casoria L.A., McLaughlin P.J. "Nonerythroid spectrin-like proteins: phosphorylation of a spectrin analoque from mouse brain".- J. Cell Biol., 1983, v.97, 5, pt.2, p.286a.

21. Gordon D.J., Boyer J.L., Korn E.D. "Comparative biochemistry of non-muscle actins". J. Biol. Chem., 1977, v.252,p.8300-8309.

22. Bray D. "Gel motility". Nature, 1977, v.270, p.560-561.

23. Brenner S.L., Korn E.D. "Spectrin-actin interaction. Phos-phorylated and dephosphorylated spectrin tetramer cross link F-actin". J. Biol. Chem., 1979, v.254, p.8620-8627.

24. Brotschi E.A., Hartwig J.H., Stossel T.P. "The gelation of actin by actin-binding protein". J. Biol. Chem., 1978, v.253, p.8988-8993.

25. Bryan J. "Redistribution of actin and fascin during fertilization in sea urchin eggs". Cell Differ., 1982, v.II, p.279-280.

26. Bryan J., Kane R.E. "Separation and interaction of the major components of sea urchin actin gel". J. Mol. Biol., 1978, v.125, p.2o7-224.

27. Burns N.R., Ohanian V., Gratzer W.B. "Properties of brain spectrin (fodrin)". FEBS Lett., 1983, v.153, p.165-168.

28. Burridge K., Bray D. "Purification and structural analysis of myosins from brain and other non-muscle tissues". J. Mol. Biol., 1975, v.99, p.I-14.

29. Burridge K., Feramisco J.R. "I\lon-muscle o(-actinins are calcium-sensitive actin-binding proteins". Nature, 1981,v.294, p.565-567.

30. Burridge K., Feramisco J.R. " <X-Actinin and vinculin from non-muscle cells: calcium-sensitive interactions with actin". "Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol.", 1982, v.46, part 2, p.587-597.

31. Z7. Burridge K., Kelley T., Mangeat P. "Nonerythrocyte spectrins: actin-membrane attachment proteins occuring in manycell types11. J. Cell Biol., 1982, v.95, p.478-486.

32. Burridge K., McCullough L. "The association of ot-actinin with the plasma membrane". J. Supramol. Struct., 1980, v.I3, p.53-61.

33. Carlsson L., Wystrom I.-E., Sundkvist I., Markey I., Lindberg U. "Actin polymerizability is influenced by profilin, a low molecular weight protein in non-muscle cells". J. Mol. Biol., 1977, v.465-483.

34. Carraway K.L., Moore P.B. "Gelation of cytoplasmic extracts of sarcoma 180 cells". J. Cell Biol., 1978, v.79, 2, pt.2, p.258a.

35. Clark T.D. "The isolation of an actin-like and high molecular weight binding protein from oocytes of Zenopus laevis".- J. Cell Biol., 1976, v.70, 2, pt.2, p.I9Ia.

36. Clark T.D., Merriam R.W. "Actin in Xenopus oocytes. I. Polymerization and gelation in vitro". J. Cell Biol., 1978, v.77, p.427-438.

37. Cleveland D.W., Tischer S.G., Kirschner M.W., Laemmli U.K. "Peptyde mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis". J. Biol. Chem., 1977, v.252, p.1102-1106.

38. Cohen C.M., Foley S.F. "Band 4.I is required for spectrin dependent attachment of actin to erythrocyte membranes".- J. Cell Biol., 1981, v.9I, 2, pt.2, p.305a.

39. Cohen C.M., Foley S.F., Korsgren K. "Localization of immu-noreactive forms of erythrocyte band 4.I to fibroblast stress fibers". J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2, p.285a.

40. Cohen C.M., Korsgren C. "Band 4.1 causes spectrin-actin gels to become thixotropic". BBRC, 1980, v.97, p.1429--1435.

41. Cohen C.M., Langley R., Korsgren C. "Biochemical properties of purified human erythrocyte spectrin ct and chains".-- J. Cell Biol., 1983, v.97, 5, pt.2, p.284a.

42. Condeelis J., Geosits S., Vahey M. "Isolation of a new ac-tin-binding protein from Dictyostelium discoideum". Cell Motility, 1982, v.2, p.273-286.

43. Condeelis J., Salisbury J. "A new protein that gels F-actin in the cell cortex of Dictyostelium discoideum". Mature, 1981, v.292, p.161-163.

44. Condeelis J., Taylor D.L. "The contractile basis of amoeboid movement. V. The control of gelation, solation, and contraction in extracts of Dictyostelium discoideum". J. Cell Biol., 1977, v.74, p.901-927.

45. Condeelis J., Vahey M. "A calcium- and pH-regulated protein from Dictyostelium discoideum that cross-links actin filaments". J. Cell Biol., v.94, p.466-471.

46. Corwin H.L., Hartwig J.H. "Isolation of actin-binding protein and villin from toad oocytes". J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2, p.286a.

47. Craig R., Magerman J. "Assembly of smooth muscle myosin into side-polar filaments". J. Cell Biol., 1977, v.75,p.990-996.

48. Craig R., Smith R., Kendrick-Jones J. "Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebrate non-muscleand smooth, muscle myosin molecules". Nature, 1983, v.302, p.436-439.

49. Daniel J.L., Adelstein R.S. "Isolation and properties of platelet myosin light chain kinase". Biochemistry, 1976,v. 15, p. 2.370-2377«

50. Davies P., ShizutaY., Olden K., Gallo M., Pastan I. "Phosphorylation of filamin and other proteins in cultured fibroblasts". BBRC, 1977, v.74, p.300-307.

51. Davies P., Shizuta Y., Pastan I. "Purification and properties pf avian and mammalian filamins". Methods in Enzy-mol., 1982, v.85, p.322-328.

52. Davies P., Wallach D., Willingham M.C., Pastan I., Yama-guchi M., Robson R.M. "Pilamin-actin interaction. Dissociation of binding from gelation by Ca2+-activated proteolysis" . J. Biol. Chem;, 1978, v.253, p.4036-4042.

53. Duhaiman A.S., Bamburg J.R. "Comparative studies on muscle and brain oC-actinin". J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2, p.286a.

54. DeRosier D.J., Censullo R. "Structure of P-actin needles from extracts of sea urchin oocytes". J. Mol. Biol., 1981, v.146, p.77-99.

55. DeRosier D.J., Edds K.T. "Evidence for fascin cross-links between the actin filaments in coelomocyte filopodia".- Exp. Cell Res., 1980, v.126, p.490-494.

56. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. "Electrophoretic analysis of the major polypeptydes of the human erythrocyte membrane". Biochemistry, 1971, v.10, p.2606-2617.

57. Fechheimer №., Brier J., Rockwell M., Luna E.J., Taylor D.L. "A calcium regulated and pH regulated actin binding protein from Dictyostelium discoideum". Cell Motility,1982, v.2, p.287-308.

58. Fechheimer M., Brier J., Taylor D.L. "Content, biosynthesis, and distribution of the 95 000 dalton actin-binding protein from D.discoideum". J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2,p.298a.

59. Fechheimer M., Taylor D.L. "Isolation and characterization of a calcium-sensitive 30,000 dalton actin-binding protein from D. discoideum". J. Cell Biol., 1983, v.97., 5, pt.2, p. 281a.

60. Feramisco J.R., Burridge K. "A rapid purification of oC-ac-tinin, filamin, and a 130,000 dalton protein from smooth muscle". J. Biol. Chem., 1980, v.255, p.Il94-II99.

61. Fishkind D., Mooseker M., Bonder E., Keene D., Morrow J., Pelligrino L. "Brush border spectrin (TW 260/240) and its interaction with actin and membranes". J. Cell Biol.,1983, v.97, 5, pt.2, p.285a.

62. Schook W., Ores C., Puszkin S. "Isolation and properties of brain oc-actinia". Biochem. J., 1978, v.175, p.63-72.

63. Schroeder T.E. "Dynamics of the contractile ring". in: Molecules and cell movement, Rawen Press, New York, 1975, p.305-338.

64. Shotton D.M., Burke B.E., Branton D. "Molecular structure of human erythrocyte spectrin: biophysical and electron microscopic studies". J. Mol. Biol., 1979, v.131, p.303-329.

65. Spudich A., Greenberg Giffard R., Spudich J.A. "Molecular aspects of cortical actin filament formation upon fertilization". Cell Differ., 1982, v.II, p.281-284.

66. Spudich J.A., Huxley H.E., Pinch J.T. "Regulation of skeletal muscle contraction. ii.Structural studies on the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin". J. Mol. Biol., 1972, v.72, p.619-632.

67. Spudich J.A., Watt S. "the regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I.Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin". J. Biol. Ghem., 1971, v.245, p.4866-4871.

68. Stendahl 0.1., Hartwig J.H., Brotschi E.A., Stossel T.P.

69. Hartwig J., Niederman R., Peters L., Stossel T.P. "The 3-D organization og actin filaments in motile cytoplasm".- J. Cell Biol., 1983, v.97, 5, pt.2, p.274a.

70. Hartwig J., Stossel T.P. "Isolation and properties of actin, myosin and a new actin-binding protein in rabbit alveolar macrophages". J. Biol. Chem., 1975, v.250, p.5696-5705.

71. Hartwig J., Stossel T.P. "Interaction of actin, myosin,and an actin-binding protein of rabbit pulmonary macrophages. III. Effects of cytochalasin B". J. Cell Biol., 1976, v.71, p.295-303.

72. Hartwig J., Stossel T.P. "Cytochalasin B dissolve actin gels by breaking actin filaments". J. Cell Biol., 1978, v.79, 2, pt.2, p.27Ia.

73. Hartwig J., Stossel T.P. "Cytochalasin B and the structure of actin gels". J. Mol. Biol., 1979, v.134, p.539-553«

74. Hartwig J., Stossel T.P. "Structure of macrophage actin-binding protein molecules in solution .and interacting with actin filaments". J. Mol. Biol., 1981, v.145, p.563-581.

75. Hartwig J., Stossel T.P. "Macrophage actin-binding protein".- Methods in Enzymol., 1982, v.85, p.480-488.

76. Hartwig J., Tyler J., Stossel T.P. "Actin-binding protein promotes the bipolar and perpendicular branching of actin filaments". J. Cell Biol., 1980, v.87, p.841-848.

77. Hellewell S.B., Taylor D.L. "The contractile basis of amoeboid movement. IV. The solation-contraction coupling hypothesis". J. Cell Biol., 1979, v.83, p.633-648.

78. Hesketh J.E., Virmaux N., Aunie D. "Some observations on bipolar filaments formed by non-muscle myosins". Experi-entia, 1978, v.35, p.31-33.

79. Hinkley R.E.,"Effects of volatile anesthetics on brain actin gel formation in vitro". J. Cell Biol., 1982, v.95} 2, pt.Z, p.292a.

80. Hirokawa N., Cheney R.E., Willard M. "Location of a protein of the fodrin, spectrin, TW 26o/240 family in the intestinal brush border". - Cell, 1983, v.32, p.953-966.

81. Hitchcock S.E. "Actin deoxyribonuclease I interaction. De-polymerization and nucleotyde exchange". J. Biol. Chem., 1980, v.255, p.5668-5673.

82. Husain A., Sawyer W.H., Howiett G.J. "The effect of cross-linking spectrin-actin complexes with band 4.1 on the state of polymerization of the actin". BBRC, 1983, v.Ill,p.360-365.

83. Ishikawa H., Bischoff R., Holtzer H. "Formation of arrowhead complexes with heavy meromyosin in a variety of cell types". J. Cell Biol., 1969, v.43, p.312-328.

84. IshiuraM., Okada Y. "The role of actin in temperature-dependent gel-sol transformation of extracts of Ehrlich ascites tumor cells". J. Cell Biol., 1979, v.80, p.465-480.

85. Jockusch B.M., Isenberg G. "Interaction of oC-actinin and vinculin with actin; opposite effects on filament network formation". Proc. Hatl. Acad. Sci. U.S.A., 1981, v.78, p.3005-3009.

86. Kane R.E. "Preparation and purification of polymerizedactin from sea, urchin egg extracts". J. Cell Biol., 1975, v.66, p.305-315.

87. Kane R.E. "Actin polymerization in temperature-induced gelation of sea urchin egg extracts". J. Cell Biol., 21976, v.7I, p.704-714.

88. Kane R.E. "Induction of either contractile or structural actin-based gels in sea urchin egg cytoplasmic extract". -- J. Cell Biol., 1980, v.86, p.803-809.

89. Kane R.E. "Structural and contractile roles of actin in sea urchin egg cytoplasmic extracts". Cell Differ., 1982, v.II, p.285-287.

90. Kane R.E. "Interconversion of structural and contractile actin gels by insertion of myosin during assembly". J. Cell Biol., 1983, v.97, p.I745-I752.

91. Koenig C.S., Dabike M., Vial J.D. "Actin and myosin in oxyntic cell gelation and contraction of crude extract in vitro". Exp. Cell Res., 1981, v. 131, p.319-329.

92. Koffer A., Gratzer W.B., Clarke G.D., Hales A. "Phase equilibria of cytoplasmic actin of cultured epithelial BHK cells". J. Cell Sci., 1983, v.6l, p.191-218.

93. Korn E.D. "Biochemistry of actomyosin-dependent cell motility". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978, v.75, p.588-599.93« Korn E.D. "Actin polymerization and its regulation by proteins from nonmuscle cells". Physiol. Rev., 1982, v.62, p.672-737.

94. Koteliansky V.E., Glukhova M.A., Shirinsky V.P., Babaev V.R.,

95. Koteliansky V.E., Shirinsky V.P., Gneushev G.N., Smirnov V.N. "Filamin, a high relative molecular mass actin-binding protein from smooth muscles, promotes actin polymerization". FEBS Lett., 1982, v.136, p.98-100.

96. Kuo P.P., Mimura N., Asano A. "Purification and characterization of actinogelin, a calcium-sensitive actin accessory protein from rat liver". Eur. J. Biochem., 1982, v.I25, p.277-282.

97. Laemmli U.K. "Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" • Nature, 1970, v. 227, p.680-685.

98. Lazarides E., Burridge K. "Alpha-actinin: immunofluores-cent localization of a muscle structural protein in non-muscle cells." Cell, 1975, v.6, p.289-298.

99. Levine J., Willard M. "Fodrin: axonally transported poly-peptydes associated with the internal periphery of many cells". J. Cell Biol., 1981, v.90, p.631-643.

100. Lin D.C., Lin S. "Actin polymerization induced by a moti-lity-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane". Proc. Natl. Acad. Sci.

101. U.S.A., 1979, v.76, p.2345-2349. IQ2. Lin S., Windisch P., Kim S. Palek J. "Oligomeric species of spectrin in extracts of normal erythrocyte membranes".- J. Cell. Biol., 1983, v.97, 5, pt.2, p.284a.

102. Lindberg U., Hoglund A.S., Karlsson R. "On the ultrastructural organization of the microfilament system and the possible role of profilactin". Biochimief 1981, v.63,p.307-323.

103. Lowry O.H., Rosenbrough .M.J., Parr A.L., Randall R.J. "Protein determination with the Polin phenol reagent".- J. Biol. Chem., 1951, v.193, p.265-275.

104. Maclean-Pletcher S.D., Pollard t.d. "Viscometric analysis of the gelation of Acanthamoeba extracts and purification of two gelation factors". J. Cell Biol., 1980, v.85,p.414-428.

105. MacLean-Pletcher s.d., Pollard t.d. "Identification of a factor in conventional muscle actin preparations which inhibits actin filameht self-association". BBRC, 1980, v.96, p.18-27.

106. Malik M.N., Penko M.D., Scotto L., Merz P., Rothman J., Tusio H., Wisniewski H.M. "Purification and characterization of myosin from calf brain". J. of Meurochem., 1983,v.40, p. 1620-1629.

107. Mannherz. H.G., Leigh J.B., Leberman R., Pfrang H. "A specific 1:1 G-actin:DMAse I complex formed by the action of DNAse I on F-actin". PEBS Lett., 1975, v.60, p.34-38.

108. Markey P., Lindberg U. "Biochemical evidence for actin filament formation as a primary response in stimulation of platelets with thrombin; the possible role of the profi-lin:actin complex". Protides Biol. Fluids. Proc. 26 Colloq., 1978, p.487-492.

109. Markey P., Persson T., Lindberg ÏÏ. "Characterization of platelet extracts before and after stimulation with respect to the possible role of profilactin as microfilament precursor". Cell, 1981, v.23, p.145-153.

110. Maruta H., Korn E.D. "Purification from Acanthamoeba cas-tellanii of proteins that induce gelation and syneresis of F-actin", J. Biol. Chem., 1977, v.252, p.399-402.

111. Maruyama K., Ebashi S. " cK-Actinin, a new structural protein from striated muscle". J. Biochem., 1965, v.58,p.13-19.

112. Maruyama K., Kaibara M., Fukada E. "Rheology of F-actin. I.Network of F-actin in solution". BBA, 1977, v.371, p. 20-2.9 •2+

113. Matsuda S., Yagi K. "The apparent binding constant of Ca to EGTA and heavy merorayosin". J. Biochem., 1980, v.88, p. 1515-152.0.

114. Mimura N., Asano A. "Actin-related gelation of Ehrlich tumor cell extracts is reversibly inhibited by low concentrations of Ca2+". Nature, 1978, v.272, p.273-276.

115. Mimura N., Asano A. "Ca2+-sensitive gelation of actin filaments by a new protein factor". Nature, 1979, v.282,p.44-48.

116. Mimura N., Asano A. "Actinogelin: a Ca2+-sensitive regulatory protein of microfilament organization". Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1982, v.46, p.579-586.

117. Moore P.B., Carraway K.L. "Proteolytic enhancement of gelation of ascites tumor cell extracts. Relationship to actin-binding protein". BBRC, 1978, v.80, p.560-567.

118. Morrow J.S., Marchesi V.T. "Self-assembly of spectrin oligomers in vitro: a basis for a dynamic cytoskeleton".- J. Cell Biol., 1981, v.88, p.463-468.

119. Nachmias V.T. "Cytoskeleton of human platelets at rest and after spreading". J. Cell Biol., 1980, v.86, p.795--802.

120. Nagata K., Sagara. J., Ichikawa Y. "Changes in actin-rela-ted gelation of crude cell extracts during differentiation of myeloid leukemia cells". Cell Struct, and Function, 1983, v.8, p. I7I-I83.

121. Nakaoka Y., Kasai M. "Behavior of sonicated actin polymers: adenosine triphosphate splitting and polymerization".- J. Mol. Biol., 1969, v.44, p.319-332.

122. Wiederman R., Amrein R.C., Hartwig J. "Three-dimensional structure of actin filaments and of an actin gel made with actin-binding protein". J. Cell Biol., 1983, v.96, p. I400-I4I3.

123. Nunnally M.H., D'Angelo J.M., Craig S.W. "Filamin concentration in cleavage furrow and midbody region: frequence of occurence compared with that of alpha-actinin and myosin". J. Cell Biol., 1980, v.87, p.219-226.

124. Ogihara S., Condeelis J.S. "Electron microscopic localization of myosin and I20K actin-binding protein in the cortical actin matrix using IgG-gold". J. Cell Biol., 1983, v.96, 2, pt.2, p.270a.

125. Palmer E., Harnandez, J.M., Saborio J.L. "Actin-based gelation of cytoplasmic extracts from brain tissue". J. of Neurochemistry, 1984, v.43, p.994-1002.

126. Panusz; H.F., Graczyk G., Wilmanska D., Scarzynsky J. "Analysis of orthophosphate-pyrophosphate mixtures resulting from weak pyrophosphotase activities". Analyt. Biochem., 1970, v.35, p.494-504.

127. Perrie W.T., Perry S.V. "An electrophoretic study of the low-molecular weight components of myosin". Biochem. J., 1970, v.II9, p.31-38.

128. Pearl M.L., Fishkind D.J., Mooseker M.S. "High molecular weight actin crosslinker from intestinal brush border".- J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2, p.282a.

129. Pearl M.L., Pishkind,D.J., Mooseker M.S., Keene D., Keller T.III. "Studies on the spectrin-like protein from the intestinal brush border, TW 260/240, and characterization of its interaction with the cytoskeleton and actin".

130. J. Cell Biol., 1984, v.98, p.66-78.

131. Pollard T.D. "The role of actin in the temperature dependent gelation and contraction of extracts of Acanthamoeba".- J. Cell Biol., 1976, v.68, p.579-601.

132. Pollard T.D. "Cytoplasmic contractile proteins". J. Cell Biol., 1981, v.91, I, pt.2, p.I56s-l65s.

133. Pollard T.D. "Purification of a calcium-sensitive actingelation protein from Acanthamoeba". J. Biol. Chem., 1981, v.256, p.7666-7670.

134. Pollard T.D. "Purification of nonmuscle myosins".- Methods in Enzymol., 1982, v.85, p.331-356.

135. Pollard T.D,, Aebi U., Cooper J.A., Fowler W.E., Tseng P. "Actin structure, polymerization, and gelation". Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1982, v.46, p.513-524.

136. Pollard T.D., Mooseker M.S. "Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron-microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores".- J. Cell Biol., 1981, v.88, p.654-659.

137. Pollard T.D., Levy I., Isenberg G., Aebi U. "The new Acanthamoeba proteins involved with regulation of actin filament cross-linking". J. Cell Biol., 1980, v.87, 2, pt.2, p.223a.

138. Ralston G.B.,"Physico-chemical characterization of the spectrin tetramer from bovine erythrocyte membranes".- BBA, 1976, v.455, p.163-172.

139. Rathke P.C., Osborn M., Weber K. "Immunological and ultrastructural characterization of microfilament bundles: polygonal nets and stress fibers in an established cell lines". Eur. J. Cell Biol., 1979, v.19, p.40-48.

140. Robson R.M., Goll D.E., Arakawa N., Stromer M.H. "Purification and properties of oC-actinin from rabbit skeletal muscle". BBA, 1970, v.200, p.296-318.

141. Rosenberg S., Stracher A. "Effect of actin-binding protein on the sedimentation properties of actin". J. Cell Biol.,1982, v.94, p.51-55.

142. Rosenberg S., Stracher A., Burridge K. "Isolation and characterization of a calcium-sensitive oC-actinin-like protein from human platelet cytoskeleton". J. Biol. Chem., 1981, v.256, p.I2986-I299I.

143. Rosenberg S., Stracher A., Lucas R.S. "Isolation and characterization of actin and actin-binding protein from human platelets". J. Cell Biol., 1981, v.9l, p.201-211.

144. Schliwa M. "Proteins, associated with cytoplasmic actin".-- Cell, 1981, v.25, p.587-590.

145. Schliwa M., van Blerkom J. "Structural interaction of cy-toskeketal components". J. Cell Biol., 1981, v.90,p.222-235.

146. Schloss J.A., Goldman R.D. "Isolation of a high molecular weight actin-binding protein from baby hamster kidney (BHK-2I) cells". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v.76, p.4484-4488.

147. Distribution of actin-binding protein and myosin in macrophages during spreading and phagocytosis". J. Cell Biol., 1980, v.84, p.215-224.

148. Stendahl 0.1., Stossel T.P. "Actin-binding protein amplifies actomyosin contraction, and gelsolin confers calcium control on the direction of contraction". BBRC, 1980, v.92, p.675-681.

149. Stossel T.P., Hartwig J.H. "Interaction of actin, myosin, and a new actin-binding protein of rabbit pulmonary macrophages. II.Role in cytoplasmic movement and phagocytosis", J. Cell Biol., 1976, v.68, p.602-619.

150. Stossel T.P., Hartwig J.H., Yin H.L., Zaner K.S., Stendahl 0.1. "Actin gelation and the structure of cortical cytoplasm". Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1982, v.46, p.569-578.

151. Sutoh K., Iwane M., Matsuzaki P., Kikuchi M., Ikai A., "Isolation and characterization of a high molecular weight actin-binding protein from Physarum polycephalum Plasmodia". J. Cell Biol., 1984, v.98, p.1611-1618.

152. Thorstensson R., Utter G., Norberg R., Pagraeus A., Hartwig J.H., Yin H.L., Stossel T.P. "Distribution of actin, myosin, actin-binding protein and gelsolin in cultured lymphoid cells". Exp. Cell Res., 1982, v.I40,p.395-400.

153. Towbin M., Staehelin T., Gordon J. "Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proc. .\latl.

154. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v.76, p.4350-4354.

155. Trinick J., Offer G. "Cross-linking of actin filaments by heavy meromyosin". J. Mol. Biol., 1979, v.133,p.549-556.

156. Trotter J.A., Adelstein R.S. "Macrophage myosin. Regulation of actin-activated ATPase activity by phosphorylation of the 20,000-Dalton light chain". -J. Biol. Chem., 1979, v.254, p.8781-8785.

157. Trotter J.A., Scordilis S.P., Margossian S.S. "Macrophages contain at least two myosins". FEBS Lett., 1983, v.156, p.135-140.

158. Tseng P., Cooper J.A., Pollard T.D. "Localization of actin, profilin, capping protein and gelation protein in Acanthamoeba by fluorescence microscopy". J. Cell Biol., 1982, v.95, 2, pt.2, p.326a.

159. Vahey M., Condeelis J. "Properties of I20K and 95K actin--binding proteins from Dictyostelium and solation-contraction coupling". J. Cell Biol., 1982, v.95, 2,pt.2, p.299a.

160. Valerius K.H., Stendahl 0., Hartwig J.H., Stossel T.P. "Distribution of actin-binding protein and myosin in polymorphonuclear leukocytes during locomotion and phagocytosis". Cell, 1981, V.24, p.195-202.

161. Venuti-Henderson J., Edds K.T. "A spectrin-like protein concentrates in developing filipodia during coelomocyte transformation". J. Cell Biol., 1983, v.97, 5, pt.2, p.286a.

162. Wallach D., Davies P.J.A., Pastan I. "Cyclic AMP-dependentphosphorylation of filamin in smooth muscle". J. Biol. Chem., 1978, v.253, p.4739-4745.

163. Wang K. "Filamin, a new high-molecular-weight protein found in smooth muscle and nonmuscle cells. Purification and properties of chicken gizzard filamin". Biochemistry, 1977, v.16, p,1857-1865.

164. Wang K., Ash J.P., Singer S.J. "Filamin, a new high-molecular-weight protein found in smooth muscle and non-muscle cells". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1975, v.72,p.4483-4486.

165. Weber K., Osborn M. "The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis". J. Biol. Chem., 1969, v.244, p.4406-4412.

166. Wegner A. "Head to tail polymerization".- J. Mol. Biol., 1976, v.108, p.139-150.

167. Wegner A. "Spontaneous fragmentation of actin filaments in physiological conditions". Nature, 1982, v.296,p.266-267.

168. Wegner A., Savko P. "Fragmentation of actin filaments". -- Biochemistry, 1982, v.21, p.I909-I9I3.

169. Weihing R.R. "Cytochalasin B inhibits actin-related gelation of HeLa cell extracts". J. Cell Biol., 1976, v.71,p.303-307.

170. Weihing R.R. "Effects of myosin and heavy meromyosin on actin-related gelation of HeLa cell extracts". J. Cell Biol., 1977, v.75, p.95-103.

171. Weihing R.R. "Early time effects of heavy meromyosin on actin-related gelation of HeLa cell extracts". J Cell Biol. ,1978, v.79, 2, pt.2, p.258a.

172. Weihing R.R. "Purification of a HeLa cell high molecular weight actin-binding protein and its identification in HeLa cell plasma membrane ghosts and intact HeLa cells".-- Biochemistry, 1983, v.22, p.I839-I847.

173. Wilkins J.A., Lin S. "High-affinity interaction of vincu-lin with actin filaments in vitro". Cell, 1982, v.28, p.83-90.

174. Wray W., Boulikoes T., Wray V.P., Hancock R. "Silver staining of proteins in polyacrylamide gels". Analyt. Bio-chem., 1981, v.118, p.197-203.

175. Yeltman D.R., Jung G., Carraway K.L. "Isolation of oc-ac-tinin from sarcoma 180 ascites cell plasma membrane and comparison with smooth muscle oc-actinin". BBA, 1981,v.688, p.201-208.

176. Yerna M.-J., Aksoy M.O., Hartshorne D.J. "BHK-2I myosin: isolation, biochemical characterization and intracellular localization". J. Cell Sci., 1978, v.31, p.411-429.

177. Yin H.L., Hartwig J.H., Maruyama K., Stossel T.P. "Ca2+--control of actin filament lenght. Effect of macrophagegelsolin on actin polymerization". J. Biol. Chem., 1981, v.256, p.9693-9697.

178. Yin h.l., Stossel T.P. "Control of cytoplasmic actin gel-sol transformation by gelsolin, a calcium-dependent regulatory protein". Nature, 1979, v.281, p.583-586.

179. Zhuang Q.-Q., Rosenberg S., Lawrence J., Stracher A. "Role of actin binding protein phosphorylation in platelet cytoskeleton assembly". BBRC, 1984, v.118, p.508-513.