Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Букурова, Юлия Александровна

• Букурова, Юлия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Букурова, Юлия Александровна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МЕТОДЫ ПРОТЕОМИКИ

1.1. Методы протеомики in vitro

1.1.1. Двумерный гель-электрофорез

1.1.2. Двумерный дифференциальный гель-электорофорез

1.1.3. SELDI

1.2. Методы обратной протеомики

1.2.1. SEREX

1.2.2. Proteomex

1.2.3. AMIDA

1.3. Методы протеомики in silico

1.3.1. Биоинформатический поиск в базе данных Oncomine

1.3.2. Биоинформатический поиск в базе данных EST

1.3.3. Биоинформатический поиск в базе данных SAGE 26 МЕТОДЫ ТРАНСКРИПТОМИКИ

1.4. Профилирование экспрессии микроРНК

1.5. Высокопроизводительное секвенирование нкРНК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение образцов ткани

2.2. Получение сывороток крови

2.3. Экстракция белков

2.4. Определение концентрации белков

2.5. Разделение белков в ПААГ

2.5.1. Метод одномерного гель-электрофореза

2.5.2. Метод двумерного гель-электрофореза

2.5.3. Метод трис-трицинового гель-электрофореза

2.6. Окрашивание гелей Кумасси G

2.7. Окрашивание гелей солями серебра

2.8. Гель-фильтрация объединенных белковых экстрактов

2.9. Идентификация белков

2.10. Биоинформатический поиск потенциальных белковых маркеров опухолей толстой кишки

2.10.1. Поиск в БД SAGE

2.10.2. Поиск микроРНК

2.11. Вестерн блот анализ

2.12. Иммунопреципитация зрелого дефензина 5 из сывороток крови

2.13. Получение моно- и поликлональных антител к дефензину

2.13.1. Получение рекомбинантных фрагментов и конъюгатов синтетических пептидов дефензина

2.13.2. Получение монклональных антител к зрелому дефензину

2.13.3. Получение поликлональных антител к зрелому дефензину

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Поиск сыворточных белковых маркеров опухолей толстой кишки

3.1.1. Сравнительный анализ изменений протеома нормальных и опухолевых тканей с помощью метода 2DE

3.2. Разработка алгоритма биоинформатического поиска потенциальных белковых маркеров для сывороточной диагностики опухолей

3.3. Анализ содержания идентифицированных белковых маркеров в нормальных и опухолевых тканях толстой кишки

3.4. Сывороточная диагностика рака толстой кишки с использованием основного кишечного альфа дефензина

3.4.1. Получение высокоаффинных антител к зрелому дефензину

3.4.1.1. Получение антител к конъюгатам пептидов

3.4.1.2. Получение моноклональных антител

3.4.1.3. Получение поликлональных антител

3.4.2. Сравнительный анализ количества дефензина 5 в сыворотках крови здоровых доноров и пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки»

Рак толстой кишки (РТК) является одним из наиболее распространенных видов рака в мире (Jemal et al., 2006; http://www.cancer.org/docroot/home/index.asp). В России ежегодно диагностируется более 50 ООО случаев заболевания РТК, и более половины пациентов умирают в течение пяти лет после постановки диагноза. Это связано с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания и явным недостатком эффективных методов ранней диагностики, прогнозирования и лечения РТК.

В настоящее время проводят интенсивные исследования механизмов канцерогенеза РТК для разработки новых терапевтических подходов и поиск потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и/или прогнозирования течения заболевания. Однако выявленные до настоящего момента потенциальные маркеры РТК не достаточно надежны и чувствительны и непригодны для диагностики.

Протеомные маркеры - это белки, содержание которых изменяется в опухоли по отношению к норме (Duncan et al., 2008; Ruginis et al., 2006). Использование протеомных маркеров представляется весьма актуальным: они достаточно стабильны в сыворотке крови, опухоле-специфичны и могут быть обнаружены быстрыми методами, не требующими многостадийных процедур. Для детекции протеомных маркеров применяют масс-спектрометрические и/или иммунохимические методы, которые на несколько порядков менее чувствительны, чем методы, основанные на ПНР - 10"12 - 10" 14 г по сравнению с 10"15-10"18 г.

Для выявления потенциальных белков-маркеров широко применяют профильную протеомику, основанную на сравнении белковых профилей в нормальной и опухолевой тканях методом 2DE гель-электрофореза и последующим масс-спектрометрическим определением белков с наиболее достоверными различиями в их содержании в сравниваемых парах образцов (Cho, 2007).

При выборе потенциального протеомного маркера следует учитывать, что в опухоли, начиная с самых ранних стадий, процессы деградации и протеолиза белка проходят значительно активнее, чем в нормальной ткани (Wasch and Engelbert, 2005; Yamasaki and Pagano, 2004). В результате этого в крови пациентов могут присутствовать небольшие фрагменты крупных белков, в том числе нерастворимых, мембранных и структурных, таких как, например, коллаген (Ylisirniö et al., 2001; Ghosh et al., 1990). Это позволяет при разработке методов сывороточной диагностики РТК ориентироваться как на небольшие секреторные белки, способные выйти в кровоток из нормальных тканей, так и на более крупные белки.

Двадцатилетние усилия по идентификации сывороточных маркеров опухолей толстой кишки привели к выявлению шестнадцати белков, лишь небольшая часть которых используется в клинической практике. Наиболее используемым маркером является карциноэмбриональный антиген (CEA) -мембранный гликопротеин, повышение уровня синтеза которого в сыворотке до 2.5 нг/мл ассоциировано с плохим прогнозом развития опухоли. Хотя специфичность экспрессии этого маркера в опухолях толстой кишки весьма высока (87%), чувствительность современных методов его детекции не превышает 30-40% (Kim et al., 2008). Кроме того, СЕА-маркер неприменим для ранней диагностики опухолей, поскольку уровень его синтеза заметно повышается при целом ряде нераковых заболеваний (воспаление кишечника, легких и панкреатит).

Вторым по значению маркером опухолей толстой кишки является полисахарид CA 19-9 (антиген группы крови Льюиса типа а), который оказался весьма информативным маркером рака поджелудочной железы, но значительно уступает CEA по специфичности детекции и прогнозирования развития опухолей толстой кишки. Наконец, третьим (хотя и малоиспользуемым) маркером является белок TIMP-1, ингибирующий активность металлопротеиназ типа 1. Повышенная экспрессия TIMP-1, по-видимому, характерна для не инвазивных опухолевых клеток, пытающихся «нащупать» способ деградации базальной мембраны и выхода в кровоток. Количественный анализ уровня синтеза этого маркера в сыворотке крови может быть использован для выявления опухолей на относительно ранних стадиях их развития.

В последнее пятилетие усилиями коммерческих компаний был идентифицирован целый ряд маркеров опухолей толстой кишки, надежность и информативность использования которых для сывороточной диагностики в настоящее время оценивается в различных лабораториях (спондин-2, TRAIL рецептор 2, 6 В рецептор TNF, а-дефензины, фактор ингибирующий миграцию макрофагов и др.).

Наконец, многообещающие данные были получены в результате анализа изменения профилей экспрессии микроРНК в опухолях толстой кишки (Schetter et al., 2008). Было показано, что повышенная экспрессия микроРНК miR-21, по-видимому, блокирующей синтез генов-супрессоров, подавляющих развитие опухолей, связана с плохим прогнозом, риском повторного роста опухоли после операции и низкой эффективностью терапевтического воздействия. Неожиданно оказалось, что повышение экспрессии miR-21 происходит в аденомах (это первый обнаруженный маркер раннего развития опухолей). Весьма вероятно, что впоследствии будут идентифицированы микроРНК, синтез которых, напротив, понижается на ранних стадиях канцерогенеза в доброкачественных опухолях. Секретируемые белки, кодируемые мишенями этих микроРНК, могут оказаться ценными маркерами для ранней сывороточной диагностики опухолей в группах пациентов повышенного риска.

Целью данной работы являлась идентификация белковых маркеров, пригодных для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей, а также сывороток крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки.

2. Дифференциальный анализ методами масс-спекрометрии, протеомов парных образцов норма-опухоль с целью идентификации белков с повышенным содержанием в опухолях по сравнению с нормой.

3. Биоинформатический поиск белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток или во внешклеточное пространство, уровень синтеза которых заметно повышается в опухолях.

4. Экспериментальный отбор белков, идентифицированных в п. 2 и 3, уровень синтеза которых наиболее заметно и часто повышается в образцах опухолей толстой кишки по сравнению с нормальными тканями.

5. Сравнительный анализ содержания отобранных белковых маркеров в образцах сыворотки крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки и здоровых доноров.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Букурова, Юлия Александровна

выводы

1. Разработаны две модификации метода сравнительного 2DE анализа протеомов, повышающие его чувствительность. Использование разработанных модификаций позволило обнаружить 10 новых белков с повышенным уровнем содержания в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой: CISH, TAF9, EEF1B2, HLA-DMA, NRL, PRDX3, SDHC, TPI1, PRDX5 и UBB.

2. Разработан новый алгоритм биоинформатического поиска секреторных белков для сывороточной диагностики опухолей. Использование алгоритма привело к отбору семи секреторных белков: AD AMTS 14, ANGPT2, CCL7, DEFA5, ММР11, ММР14 и PL AU.

3. С использованием новой технологии получены высокоаффинные поликлональные антитела к одному из белков, идентифицированных с использованием алгоритма - зрелому дефензину 5. Показано, что этот белок надежно обнаруживается в 20% сывороток онкопациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки при полном его отсутствии в крови здоровых доноров.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Букурова, Юлия Александровна, 2012 год

1. Букурова Ю.А., Ханкин С.Л., Краснов Г. С. и др. 2010. Оценка эффективности идентификации белковых маркеров опухолей толстой кишки методами 2В-анализа и биоинформатического поиска. Молекуляр. биология. 44,375-381.

2. Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Ханкин С.Л. и др. 2011. Поиск белковых маркеров для сывороточной диагностики рака на основе анализа профилей экспрессии микроРНК. Молекуляр. биология. 45, 376-381.

3. Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Краснов Г.С. и др. 2011. Идентификация белков с повышенным уровнем синтеза в злокачественных опухолях желудка: сравнение результатов двумерного электрофореза и биоинформатического поиска. Молекуляр. биология. 45, 738-743.

4. Краснов Г.С., Опарина Н.Ю., Ханкин С.Л. и др. 2009. 2-D потеомика рака толстой кишки: идентификация белков с измененным содержанием в опухоли. Молекуляр. биология. 43, 348-356.

5. Краснов Г.С., Ханкин С.Л., Букурова Ю.А. и др. 2009. Протеом злокачественных опухолей толстой кишки человека: идентификация растворимых белков с повышенным содержанием в опухоли. Молекуляр. биология. 43, 610-615.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. 1984. Молекулярное клонирование. М: Мир.

7. Никитина И.Г., Букурова Ю.А., Краснов Г.С. и др. 2012. Структура и функция а-дефензинов в норме и патологии. Молекуляр. Биология. 46, 31-36.

8. Adams M.D., Kelley J.M., Gocayne J.D., et al. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science. 252, 1651-1656.

9. Alfonso P., Nunez A., Madoz-Gurpide J., et al. 2005. Proteomic expression analysis of colorectal cancer by two-dimensional differential gel electrophoresis. Proteomics. 10, 2602-2611.

10. Alon U., Barkai N., Notterman D.A., et al. 1999. Broad patterns of gene expression revealed by clustering analysis of tumor and normal colon tissues probed by oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6745-6750.

11. Alrawi S.J., Schiff M., Carroll R.E., et al. 2006. Aberrant crypt foci. Anticancer Res.26, 107-119.

12. Al-Shahrour F., Carbonell J., Minguez P., et al. 2008. Babelomics: advanced functional profiling of transcriptomics, proteomics and genomics experiments. Nucleic Acids Res. 36, W341-6.

13. Amanda P. Liggins, Barbara A. Guinn, et al. 2005. Identification of Lymphoma-Associated Antigens Using SEREX. Methods Mol Med. 115, 109-128.

14. Bandyopadhyay S., Mitra R., Maulik U., et al. 2010. Development of the human cancer microRNA network. Silence. 1,6.

15. Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297.

16. Basile J.R., Holmbeck K., Bugge T.H., et al. 2007. MT1-MMP controls tumor-induced angiogenesis through the release of semaphorin 4D. J. Biol. Chem. 282, 6899-6905.

17. Bjellqvist B., Ek K., Righetti P.G., Gianazza E., et al. 1982 Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. JBiochem Biophys Methods. 6, 317-39.

18. Bischoff R., Luider T.M. 2004. Methodological advances in the discovery of protein and peptide disease markers. J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci. 803, 27-40.

19. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

20. Byun H.O., Han N.K., Lee H.J., et al. 2009. Cathepsin d and eukaryotic translation elongation factor 1 as promising markers of cellular senescence. Cancer Res. 69, 4638-4647.

21. Caputo E., Moharram R., Martin B.M. 2003. Methods for on-chip protein analysis. Anal Biochem. 321, 116-124.

22. Castle J.C., Armour C.D., Lower M., et al. 2010. Digital genome-wide ncRNA expression, including SnoRNAs, across 11 human tissues using polyA-neutral amplification. PLoS One. 5, el 1779.

23. Chaurand P., DaGue B.B., Pearsall R.S., et al. 2001. Profiling proteins from azoxymethaneinduced colon tumors at the molecular level by matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Proteomics. 10, 1320-1326.

24. Cho W.C., Cheng C.H. 2007. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev. Proteomics. 4, 401^410.

25. Collet B., Guitton N., Sa'ikali S., et al. 2011. Differential analysis of glioblastoma multiforme proteome by a 2D-DIGE approach. Proteome Sci. 9, 16

26. Cottingham K. 2006. HUPO Plasma Proteome Project: challenges and future directions. J Proteome Res. 5, 1298.

27. Cummins J.M., He Y., Leary R.J., et al. 2006. The colorectal microRNAome. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 3687-3692.

28. Duncan R., Carpenter B., Main L.C., et al. 2008. Characterisation and protein expression profiling of annexins in colorectal cancer. Br J Cancer. 98, 426-433.

29. Dundas S.R., Lawrie L.C., Rooney P.H., et al. 2005. Mortalin is over-expressed by colorectal adenocarcinomas and correlates with poor survival. J. Pathol. 205, 74-81.

30. Elphick D., Liddell S., Mahida Y.R. 2008. Impaired luminal processing of human defensin-5 in Crohn's disease: persistence in a complex with chymotrypsinogen and trypsin. Am J Pathol. 172, 702-713.

31. Eskinazi R., Thony B., Svoboda M., et al., 1999. Overexpression of pterin-4a-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 in human colon cancer. Am. J. Pathol. 155, 1105-1113.

32. Friedman D.B., Hill S., Keller J.W., et al., 2004. Proteome analysis of human colon cancer by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics. 4, 793-811.

33. Friedman R.C., Farh K.K., Burge C.B., et al. 2009. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105.

34. Gallego M., Virshup D.M. 2007. Post-translational modifications regulate the ticking of the circadian clock. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 139-148.

35. Garrisi V.M., Abbate I., Quaranta M., et al. 2008. SELDI-TOF serum proteomics and breast cancer: which perspective? Expert. Rev. Proteomics. 5, 779-785.

36. Gelfi C., Bossi M.L., Bjellqvist B., et al. 1987. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients in the pH 10-11 range. J Biochem Biophys Methods. 15, 41-48.

37. Ge X., Yamamoto S., Tsutsumi S., et al. 2005. Interpreting expression profiles of cancers by genome-wide survey of breadth of expression in normal tissues. Genomics. 86, 127-141.

38. Ghavami S, Kerkhoff C, Los M, et al, 2004. Mechanism of apoptosis induced by S100A8/A9 in colon cancer cell lines: the role of ROS and the effect of metal ions. J. Leukoc. Biol. 76, 169-175.

39. Ghosh M, Aroor A.R, Raghavan M.R. 1990. Clinical utility of serum fibrinogen degradation products (FDP) in the diagnostic and prognostic evaluation of oral cancer. Ann Dent. 49, 11-12.

40. Ghosh D, Porter E, Shen B, et al. 2002. Paneth cell trypsin is the processing enzyme for human defensin-5. Nat. Immunol. 3, 583-590.

41. Gires O, Münz M, Schaffrik M, et al. 2004. Profile identification of disease-associated humoral antigens using AMIDA, a novel proteomics-based technology. Cell. Mol. Life Sei. 61, 1198-1207.

42. Graudens E, Boulanger V, Mollard C, et al. 2006. Deciphering cellular states of innate tumor drug responses. Genome Biol. 7, R19.

43. Gibb E.A, Brown C.J, Lam W.L. 2011. The functional role of long non-coding RNA in human carcinomas. Mol. Cancer. 10, 38.

44. Griffiths-Jones S, Saini H.K, van Dongen S, et al. 2008. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-8.

45. Guttman M, Garber M, Levin J.Z, et al. 2010. Ab initio reconstruction of cell type-specific transcriptomes in mouse reveals the conserved multi-exonic structure of lincRNAs. Nat. Biotechnol. 28, 503-510.

46. Haleem J. Issaq and Timothy D. Veenstra. 2008. Two-dimensional Polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE): advances and perspectives. BioTechniques. 44, 697-700.

47. Horton P, Park K.J, Obayashi T, et al. 2007. WoLF PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Res. 35(Web Server issue):W585-587.

48. Hsiao L.L, Dangond F, Yoshida T, et al. 2001. A compendium of gene expression in normal human tissues. Physiol Genomics. 7, 97-104.

49. Hutchens T.W., Yip T. 1993. New Desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules. Rapid Commun Mass Spectrom. 7, 576-580.

50. Issaq H.J., Veenstra T.D., Conrads T.P., et al. 2002. The SELDI-TOF MS approach to proteomics: Protein profiling and biomarker identification. Biochem Biophys Res Comm. 292, 587-592.

51. Jastaniah W.A., Alessandri A.J., Reid G.S., et al. 2006. HLA-DM expression is elevated in ETV6-AML1 translocation-positive pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leuk. Res. 30, 487-489.

52. Jemal A., Siegel R., Ward E., et al. 2006. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 56, 106-130.

53. John B., Enright A.J., Aravin A., et al. 2004. Human MicroRNA targets. PLoS Biol. 2, e363.

54. Joo M., Shahsafaei A., Odze R.D. 2009. Paneth cell differentiation in colonic epithelial neoplasms: evidence for the role of the Apc/beta-catenin/Tcf pathway. Hum Pathol. 40, 872-880.

55. Kaiser S., Park Y.K., Franklin J.L., et al. 2007. Transcriptional recapitulation and subversion of embryonic colon development by mouse colon tumor models and human colon cancer. Genome Biol. 8, R131.

56. Ki D.H., Jeung H.C., Park C.H., et al. 2007. Whole genome analysis for liver metastasis gene signatures in colorectal cancer. Int J Cancer. 121, 2005-2012.

57. Kim H.J., Kang H.J., Lee H., et al. 2009. Identification of S100A8 and S100A9 as Serological Markers for Colorectal Cancer. J. Proteome Res. 8, 1368-1379.

58. Kim K.I., Baek S.H. 2006. SUMOylation code in cancer development and metastasis. Mol. Cells. 22, 247-253.

59. Klade C.S., Voss T., Krystek E., et al. 2001. Identification of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis. Proteomics. 1, 890-898.

60. Klade C.S. 2002. Proteomics approaches towards antigen discovery and vaccine development. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 216-223.

61. Kobayashi K.S., Chamaillard M., Ogura Y., et al. 2005. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract Science. 307, 731-734.

62. Koenig R., Stegemann H., Francksen H., et al. 1970. Protein subunits in the potato virus X group. Determination of the molecular weights by polyacrylamide electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta. 207, 184-189.

63. Komatsu K., Murata K., Kameyama M., et al. 2002. Expression of S100A6 and S100A4 in matched samples of human colorectal mucosa, primary colorectal adenocarcinomas and liver metastases. Oncology. 63, 192-200.

64. Krueger K.E., Srivastava S. 2006. Posttranslational protein modifications: current implications for cancer detection, prevention, and therapeutics. Mol. Cell Proteomics. 5, 1799-1810.

65. Kummola L., Hamalainen J.M., Kivela J., et al. 2005. Expression of a novel carbonic anhydrase, CA XIII, in normal and neoplastic colorectal mucosa. BMC Cancer. 5, 41.

66. Kuramochi J., Arai T., Ikeda S., et al. 2006. High Pinl expression is associated with tumor progression in colorectal cancer. J. Surg. Oncol. 94, 155-160.

67. Kussmann M., Roepstorff P. 2000. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 146, 405-424

68. Laemmly U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

69. Lee S.K., Calin G.A. 2011. Non-coding RNAs and cancer: new paradigmsin oncology. Discov. Med. 11, 245-254.88

70. Le Naour F., Hohenkirk L., Grolleau A., et al. 2001. Profiling changes in gene expression during differentiation and maturation of monocyte-derived dendritic cells using both oligonucleotide microarrays and proteomics. J. Biol.Chem. 276, 17920-17931.

71. Lichtenfels R., Kellner R., Bukur J., et al. 2002. Heat shock protein expression and anti-heat shock protein reactivity in renal cell carcinoma. Proteomics. 2, 561-570.

72. Lin J.L., Geng X., Bhattacharya S.D., et al. 2002. Isolation and sequencing of a novel tropomyosin isoform preferentially associated with colon cancer. Gastroenterology. 123, 152-162.

73. Li S.J., Peng M., Li H., et al. 2009. Sys-BodyFluid: a systematical database for human body fluid proteome research. Nucleic Acids Res. 37(Database issue) :D907-912.

74. Lisitsyn N.A., Bukurova Y.A., Nikitina I.G., et al. 2012. Enteric alpha defensins in norm and pathology. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 11, 1.

75. Liu L., Zhao L., Zhang Y., et al. 2007. Proteomic analysis of Tiaml-mediated metastasis in colorectal cancer. Cell Biol. Int. 31, 805-814.

76. Liu J.Y., Jin L., Zhao M.Y., et al. 2011. New serum biomarkers for detection of tuberculosis using surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry. Clin. Chem. Lab. Med. 49, 1727-1733.

77. Lu J., Getz G., Miska E.A., et al. 2005. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838.

78. Luo L., Chen W.D., Pretlow T.P. 2005. CpG island methylation in aberrant crypt foci and cancers from the same patients. Int. J. Cancer. 115, 747-751.

79. Mann M., Jensen O.N. 2003. Proteomic analysis of post-translational modifications. Nat. Biotechnol. 21, 255-261.

80. Maupas-Schwalm F., Bedel A., Auge N., et al. 2009. Integrin alpha(v)beta(3), metalloproteinases, and sphingomyelinase-2 mediate urokinase mitogenic effect. Cell Signal. 21, 1925-1934.

81. Mazzanti R., Solazzo M., Fantappie O., et al. 2006. Differential expression proteomics of human colon cancer. Am. J.Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 1329-1338.

82. Melle C., Ernst G., Schimmel B., et al. 2006. Different expression of calgizzarin (S100A11) in normal colonic epithelium, adenoma and colorectal carcinoma. Int. J. Oncol. 28, 195-200.

83. Melle C., Ernst G., Schimmel B., et al. 2008. Colon-derived liver metastasis, colorectal carcinoma, and hepatocellular carcinoma can be discriminated by the Ca(2+)-binding proteins S100A6 and S100A11. PLoS One. 3, e3767.

84. Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M., et al. 2008. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 10513-10518.

85. Morrissy A.S., Morin R.D., Delaney A., et al. 2009. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling. Genome Res. 19, 18251835.

86. Morrissy S., Zhao Y., Delaney A., et al. 2010. Digital gene expression by tag sequencing on the illumina genome analyzer. Curr. Protoc. Hum. Genet. Chapter 11: Unit 11.11.1-36.

87. Mortz E., Krogh T., Vorum H., Gorg A. 2001. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 13591363.

88. Naqvi A.R., Islam M.N., Choudhury N.R., et al. 2009. The fascinating world of RNA interference. IntJBiol Sci. 5, 97-117.

89. Notterman D.A., Alon U., Sierk A.J., et al. 2001. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res. 61, 3124-3130.

90. O'Farrell P.H. 1975. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021.

91. Panzitt K., Tschernatsch M.M., Guelly C., et al. 2007. Characterization of HULC, a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma, as noncoding RNA. Gastroenterology. 132, 330-342.

92. Park K.J., Kanehisa M. 2003. Prediction of protein subcellular locations by support vector machines using compositions of amino acids and amino acid pairs. Bioinformatics. 19, 1656-1663.

93. Patel D.J., Ma J.B., Yuan Y.R., et al. 2006. Structural biology of RNA silencing and its functional implications. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 71, 81-93.

94. Petrova D.T., Asif A.R., Armstrong V.W., et al. 2008. Expression of chloride intracellular channel protein 1 (CLIC1) and tumor protein D5 2 (TPD52) as potential biomarkers for colorectal cancer. Clin. Biochem. 41, 1224-1236.

95. Pierleoni A., Martelli P.L., Fariselli P., et al. 2007. eSLDB: eukaryotic subcellular localization database. Nucleic Acids Res. 35(Database issue):D208-212.

96. Radeva M.Y., Jahns F., Wilhelm A., et al. 2010. Defensin alpha 6 (DEFA 6) overexpression threshold of over 60 fold can distinguish between adenomaand fully blown colon carcinoma in individual patients. BMC Cancer. 10, 588.

97. Raffel J., Bhattacharyya A.K., Gallegos A., et al. 2003. Increased expression of thioredoxin- in human colorectal cancer is associated with decreased patient survival. J. Lab. Clin. Med. 142, 46-51.

98. Rajabi M., de Leeuw E., Pazgier M., et al. 2008. The conserved salt bridge in human alpha-defensin 5 is required for its precursor processing and proteolytic stability. The Journal of biological chemistry. 283, 21509-21518.

99. Rauch J., Ahlemann M., Schaffrik ML, et al. 2004. Allogenic antibody-mediated identification of head and neck cancer antigens. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 156-162.

100. Rauch J., Gires O. 2008. SEREX, Proteomex, AMIDA, and beyond: Serological screening technologies for target identification. Proteomics Clin. Appl. 2,355-371.

101. Rhodes D.R., Kalyana-Sundaram S., Mahavisno V., et al. 2007. Oncomine 3.0: genes, pathways, and networks in a collection of 18,000 cancer gene expression profiles. Neoplasia. 9, 166-180.

102. Rhodes D.R., Yu J., Shanker K., et al. 2004. ONCOMINE: a cancer microarray database and integrated data-mining platform. Neoplasia. 6, 1-6.

103. Roth R.B., Hevezi P., Lee J., et al. 2006. Gene expression analyses reveal molecular relationships among 20 regions of the human CNS. Neurogenetics. 7, 67-80.

104. Ruginis T., Taglia L., Matusiak D., et al. 2006. Consequence of gastrin-releasing peptide receptor activation in a human colon cancer cell line: a proteomic approach. JProteome Res. 5, 1460-1468.

105. Ruijter J.M., Van Kampen A.H., Baas F. 2002. Statistical evaluation of SAGE libraries: consequences for experimental design. Physiol Genomics. 11, 37-44.

106. Sabates-Bellver J., Van der Flier L.G., de Palo M., et al. 2007. Transcriptome profile of human colorectal adenomas. Mol Cancer Res. 5, 1263-1275.

107. Saha S., Sparks A.B., Rago C., et al. 2002. Using the transcriptome to annotate the genome. Nat Biotechnol. 20, 508-512.

108. Salzman N.H., Hung K., Haribhai D., et al. 2010. Enteric defensins are essential regulators of intestinal microbial ecology. Nat Immunol. 11, 76-83.

109. Scanlan M.J., Gout I., Gordon C.M., et al. 2001. Humoral immunity to human breast cancer: antigen definition and quantitative analysis of mRNA expression. Cancer Immun. 1, 4.

110. Scanlan M.J., Simpson A.J., Old L.J. 2004 The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary. Cancer Immun. 4, 1.

111. Scanlan M.J., Welt S., Gordon C.M., et al. 2002. Cancer-related serological recognition of human colon cancer: identification of potential diagnostic and immunotherapeutic targets. Cancer Res. 62, 4041-4047.

112. Schagger, H., von Jagow G. 1987. Tricine sodium sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the sepration of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379.

113. Schetter A.J., Leung S.Y., Sohn J.J., et al. 2008. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA. 299, 425-436.

114. Segditsas S., Sieber O., Deheragoda M., et al. 2008. Putative direct and indirect Wnt targets identified through consistent gene expression changesin APC-mutant intestinal adenomas from humans and mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3864-3875.

115. Seliger B., Kellner R. 2002. Design of proteome-based studies in combination with serology for the identification of biomarkers and novel targets. Proteomics. 2, 1641-1651.

116. Shibata M, Takekawa M, Amano S. 1998. Increased serum concentrations of soluble tumor necrosis factor receptor I in noncachectic and cachectic patients with advanced gastric and colorectal cancer. Surg. Today. 28, 884888.

117. Shiota M, Izumi H, Miyamoto N, et al, 2008. Ets regulates peroxiredoxinl and 5 expressions through their interaction with the high-mobility group protein Bl. Cancer Sci. 99, 1950-1959.

118. Shyamsundar R, Kim Y.H, Higgins J.P, et al. 2005. A DNA microarray survey of gene expression in normal human tissues. Genome Biol. 6, R22.

119. Sipina L.V, Bukurova Y.A, Nikitina I.G, et al. 2010. Identification of proteins overexpressed in papillary thyroid tumors. Biochemistry (Mosc). 75, 1148-1152.

120. Song M.H., Ha J.C, Lee S.M, et al. 2011. Identification of BCP-20 (FBX039) as a cancer/testis antigen from colon cancer patients by SEREX. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 195-201.

121. Sounni N.E, Dehne K, van Kempen L, et al. 2010. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis Model Mech. 3, 317-332.

122. Sprenger J, Lynn Fink .J, Karunaratne S, et al. 2008. LOCATE: a mammalian protein subcellular localization database. Nucleic Acids Res. 36(Database issue):D23 0-233.

123. Stronati L, Negroni A, Pierdomenico M, et al. 2010. Altered expression of innate immunity genes in different intestinal sites of children with ulcerative colitis. Dig Liver Dis. 42, 848-853.

124. Su A.I, Cooke M.P, Ching K.A, et al. 2002. Large-scale analysis of the human and mouse transcriptomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 44654470.

125. Tan H.T, Zubaidah R.M, Tan S, et al. 2006. 2-D DIGE analysis of butyrate treated HCT-116 cells after enrichment with heparin affinity chromatography. J. Proteome Res. 5, 1098-1106.

126. Tariq M.A., Kim H.J., Jejelowo 0., et al. 2011.Whole-transcriptome RNAseq analysis from minute amount of total RNA. Nucl. Acids Res. 39, el 20.

127. Thadani R., Tammi M.T. 2006. MicroTar: predicting microRNA targets from RNA duplexes. BMC Bioinformatics. 7 Suppl 5, S20.

128. Thomson J.M., Hansen R., Berry S.H. et al. 2011. Enterohepatic helicobacter in ulcerative colitis: potential pathogenic entities? PLoS One. 6, el7184.

129. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein B., et al. 1995. Serial analysis of gene expression. Science. 270, 484-487.

130. Vougas K., Gaitanarou E., Marinos E., et al. 2008. Two-dimensional electrophoresis and immunohistochemical study of calreticulin in colorectal adenocarcinoma and mirror biopsies. J. BUON. 13, 101-107.

131. Wang G., Wang X., Wang S., et al. 2008. Colorectal cancer progression correlates with upregulation of S100A11 expression in tumor tissues. Int. J. Colorectal Dis. 23, 675-682.

132. Wang J., Bo T.H., Jonassen I., et al. 2003. Tumor classification and marker gene prediction by feature selection and fuzzy c-means clustering using microarray data. BMC Bioinformatics. 4, 60.

133. Wang X., Chen W., Li X., et al. 2008. Heat shock protein 72 associated with CD44v6 in human colonic adenocarcinoma. Cell Biol. Int. 32, 860-864.

134. Wang X., Wilson M.J., Slaton J.W., et al. 2009. Increased aggressiveness of human prostate PC-3 tumor cells expressing cell surface localized membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP). J. Androl. 30, 259-274.

135. Wasch R., Engelbert D. 2005. Anaphase-promoting complex-dependent proteolysis of cell cycle regulators and genomic instability of cancer cells. Oncogene. 24, 1-10.

136. Wilcox A.S., Khan A.S., Hopkins J.A., et al. 1991. Use of 3' untranslatedsequences of human cDNAs for rapid chromosome assignment and95conversion to STSs: implications for an expression map of the genome. Nucleic Acids Res. 19, 1837-1843.

137. Wilson C.L., Ouellette A.J., Satchell D.P., et al. 1999. Regulation of intestinal alpha-defensin activation by the metalloproteinase matrilysin in innate host defense. Science. 286, 113-117.

138. Wong S.C., Chan C.M., Ma B.B., et al. 2009. Advanced proteomic technologies for cancer biomarker discovery. Expert. Rev. Proteomics. 6, 123-134.

139. Wu Y.I., Munshi H.G., Snipas S.J., et al. 2007. Activationcoupled membranetype 1 matrix metalloproteinase membrane trafficking. Biochem. J. 407, 171-177.

140. Yamamoto M., Wakatsuki T., Hada A., et al. 2001. Use of serial analysis of gene expression (SAGE) technology. J Immunol Methods. 250, 45-66.

141. Yamasaki L., Pagano M. 2004. Cell cycle, proteolysis and cancer. Curr Opin Cell Biol. 16, 623-628.

142. Yanai I., Benjamin H., Shmoish M., et al. 2005. Genome-wide midrange transcription profiles reveal expression level relationships in human tissue specification. Bioinformatics. 21, 650-659.

143. Yang Y., Pospisil P., Iyer L.K., et al. 2008. Integrative genomic data mining for discovery of potential blood-borne biomarkers for early diagnosis of cancer. PLoS One. 3, e3661.

144. Yasui Y., Tanaka T. 2009. Protein expression analysis of inflammation-related colon carcinogenesis. J. Carcinogenesis. 8, 10.

145. Ylisirnio S., Hoyhtya M., Makitaro R., et al. 2001. Elevated serum levels of type I collagen degradation marker ICTP and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) 1 are associated with poor prognosis in lung cancer. Clin Cancer Res. 7, 1633-1637.

146. Yoshikawa R., Yanagi H., Hashimoto-Tamaoki T., et al. 2004. Gene expression in response to anti-tumour intervention by polysaccharide-K (PSK) in colorectal carcinoma cells. Oncol Rep. 12, 1287-1293.

147. Zhang Y, Luoh S.M., Hon L.S., et al. 2007. GeneHub-GEPIS: digital expression profiling for normal and cancer tissues based on an integrated gene database. Nucleic Acids Res. 35, W152-8.

148. Zhang Z., Song T., Jin Y., et al. 2009. Epidermal growth factor receptor regulates MT1-MMP and MMP-2 synthesis in SiHa cells via both PI3-K/AKT and MAPK/ERK pathways. Int J Gynecol Cancer. 19, 998-1003.1. БЛАГОДАРНОСТИ

149. От всей души благодарю всех, кто помог в ходе выполнения диссертационной работы: Рожкову Е.А., Зацепину О.Г., Юшенову И.А., Гарбуза Д.Г., Машкову Т.Д. и Кропотову Е.С. за помощь в проведении ряда экспериментов и обсуждении полученных результатов.

150. Отдельную благодарность выражаю Григорьевой Евгении за неоценимую помощь при освоении методики двумерного гель-электрофореза и постановке дальнейших экспериментов.

151. Безграничную благодарность выражаю Краснову Георгию за помощь в биоинформатическом поиске и оформление статей.

152. Кроме того, благодарю моих родителей и близких за терпение и понимание на протяжении всего периода выполнения диссертационной работы.