Белковая инженерия грибных ксиланаз 10-й семьи гликозидгидролаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Денисенко, Юрий Андреевич

• Денисенко, Юрий Андреевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Денисенко, Юрий Андреевич

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СТРОЕНИЕ И СОСТАВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ

1.1. КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА

1.2. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

1.3. ПОЛИСАХАРИДЫ МАТРИКСА

ГЛАВА 2. КСИЛАНОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ

2.1. КСИЛАНОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ФЕРМЕНТОВ

2.2. ЭНДО-1,4-В-КСИЛАНАЗЫ

2.3. МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА

2.4. КСИЛАНАЗЫ 10-Й И 11-Й СЕМЬИ ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ

2.5. БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ

2.6. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ ИЗ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР

2.6.1. ТАХ1-ТИП БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ КСИЛАНАЗ

2.6.2. Х1Р-ПОДОБНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КСИЛАНАЗ

3.1. КСИЛАНАЗЫ В ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КСИЛАНАЗ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА КОРМОВЫХ ДОБАВОК

3.3. ДРУГИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ КСИЛАНАЗ ..- 37 -

ГЛАВА 4. СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ ОПЕРАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ КСИЛАНАЗ

4.1. БИОИНЖЕНЕРИЯ ФЕРМЕНТОВ

4.2. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРНЫЕ ПАРАМЕТРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

4.2.1. ГИДРОФОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ

4.2.2. СОЛЕВЫЕ МОСТИКИ И ИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

4.2.3. П-П ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

4.2.4. КАТИОННО-П ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

4.2.5. ДИСУЛЬФИДНЫЕ МОСТИКИ

4.2.6. ТЕРМИНАЛЬНЫЕ К- И С- УЧАСТКИ ФЕРМЕНТОВ

4.2.7. ЖЕСТКОСТЬ И ГИБКОСТЬ

4.2.8. ПЕТЛИ

4.2.9. ГИДРАТАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ

4.3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

4.4. НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ

4.5. УЛУЧШЕНИЕ ДРУГИХ ОПЕРАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ КСИЛАНАЗ

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

5.1. МАТЕРИАЛЫ

5.1.1. ФЕРМЕНТЫ

5.1.2. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ФП)

5.1.3. МИКРООРГАНИЗМЫ

5.1.4. СУБСТРАТЫ

5.1.5. РЕАКТИВЫ

5.2. МЕТОДЫ

5.2.1. ВЫРАВНИВАНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

5.2.2. АМПЛИФИКАЦИЯ ЦЕЛЕВЫХ ГЕНОВ ХУЬЛ, ХУЬЕ И ХУЬЗ

5.2.3. АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОВ С ТОЧЕЧНЫМИ МУТАЦИЯМИ

5.2.4. ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА Р. УЕЖиСиЮЪиМВ1-537- 65 -

5.2.5. ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА Р. СЛШБСЕЫБ КК3-11-7

5.2.6. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ В КОЛБАХ

5.2.7. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ

5.2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА

5.2.9. ПРОВЕДЕНИЕ DS-NA-ПААГ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

5.2.10. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

5.2.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

5.2.12. ИЗУЧЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ

5.2.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО И РН-ОПТИМУМОВ АКТИВНОСТИ КСИЛАНАЗ

5.2.14. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИЗ ЭКСТРАКТА РЖИ НА АКТИВНОСТЬ КСИЛАНАЗ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. ВЫБОР ПРОВОДИМЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН

6.1. ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

6.2. АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА УВЕЛИЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ КСИЛАНАЗ

6.2.1. XYLA

6.2.2. XYLE

6.2.3. XYL3

6.3. АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА ПРИДАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ КСИЛАНАЗ К БЕЛКОВЫМ ИНГИБИТОРАМ ТИПА XIP ИЗ ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЙ

ГЛАВА 7. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ КСИЛАНАЗ

7.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

7.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТРАНСФОРМАНТОВ

7.3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КСИЛАНАЗ

7.3.1. XYLA

7.3.2. XYLE

7.3.3. XYL3

7.4. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ КСИЛАНАЗ

ГЛАВА 8. СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ КСИЛАНАЗ ДИКОГО ТИПА И ИХ МУТАНТНЫХ ФОРМ

8.1. XYLA

8.2. XYLE

8.3. XYL3

8.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ КСИЛАНАЗ БЕЛКОВЫМИ ИНГИБИТОРАМИ РЖИ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

а.к. Аминокислота

а.о. Аминокислотный остаток

ГГ Гликозидгидролазы

КМЦ Карбоксиметилцеллюлоза

КЖ Культуральная жидкость

ПААГ Полиакриламидный гель

п.о. Пара оснований

СП Степень полимеризации

ФП Ферментный препарат

Ds-Na Додецилсульфат натрия

TAXI Triticum aestivum Xylanase Inhibitor

XIP Xylanase Inhibiting Protein

XylA Эндо-1,4-Р-ксиланаза А Penicillium canescens

XylE Эндо-1,4-Р-ксиланаза Е Penicillium canescens

Xyl3 Эндо-1,4-Р-ксиланаза III Trichoderma reesei

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Белковая инженерия грибных ксиланаз 10-й семьи гликозидгидролаз»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования.

Клеточные стенки растений содержат огромный запас углерода, который потенциально является источником многих полезных продуктов, однако этот углерод в основном представлен в виде высокополимеризованной целлюлозы, других полисахаридов и лигнина. Одними из таких полисахаридов являются ксиланы, которые относятся к классу гемицеллюлоз и принадлежат к числу наиболее распространенных полисахаридов на Земле. Ксиланазы и ксиланолитическая система ферментов в целом участвуют в биодеградации ксиланов. Изучение возможности применения ксиланаз для практических целей началось около 50 лет назад. Использование ферментов и ферментных препаратов обусловлено их высокой активностью, специфичностью и экологической безопасностью.

На данный момент можно выделить ряд областей, в которых ксиланазы играют ключевую роль: биоотбеливание целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности, производство соков и вин, переработка сельскохозяйственных отходов, производство ксилита и биоэтанола. Одним из важнейших направлений использования ксиланазных ферментных препаратов является кормовая промышленность, где ксиланазы используются в качестве добавки к комбикормам. Коммерческие ксиланазные ферментные препараты производятся компаниями в России, США, Канаде, Японии, Финляндии, Германии, Дании и других странах. Большинство таких препаратов производится на основе мутантных штаммов микроскопических грибов из родов Aspergillus, Trichoderma, Pénicillium.

Использование ксиланаз в качестве биокатализаторов в биотехнологических процессах накладывает на ферменты определенные требования, такие как высокая каталитическая активность и термостабильность, возможность применения при определенных значениях рН, устойчивость к ингибиторам и т.д. В частности, для использования в качестве добавок к комбикормам ксиланазы должны обладать высокой термостабильностью и резистентностью к белковым ингибиторам из злаков. Этот факт стимулирует поиск новых ксиланаз с определенными операционными параметрами. Свойства уже известных ксиланаз могут быть улучшены с помощью методов белковой инженерии.

Цели и задачи исследования

Целями данной работы являлось увеличение методами белковой инженерии температурной стабильности трех грибных ксиланаз из 10-й семьи ГГ: эндо-1,4^-ксиланаз А и Е (XylA и XylE) Penicillium canescens, эндо-1,4^-ксиланазы III (Xyl3) Trichoderma reesei, а также получение мутантных форм ксиланаз XylA и Xyl3, которые обладают резистентностью к белковым ингибиторам злаков XIP (Xylanase Inhibiting Protein). В соответствии с поставленными целями были сформулированы следующие задачи:

• С помощью методов биоинформатики и компьютерного моделирования выявить аминокислотные (а.к.) замены, которые потенциально могли бы привести к увеличению термостабильности исследуемых ксиланаз. Выявить структурные факторы, которые могли бы привести к устойчивости ксиланаз XylA и Xyl3 к белковым ингибиторам типа XIP.

• Методом ПЦР провести амплификацию генов xylA, xylE и xyl3 с измененными нуклеотидными последовательностями, кодирующих ферменты с а.к. заменами, делециями или вставками. Получить генетические конструкции, несущие измененные гены ксиланаз, и провести их трансформацию в штаммы-реципиенты.

• Произвести культивирование полученных штаммов и выделить рекомбинантные ксиланазы дикого типа и их мутантные формы методами белковой хроматографии. Определить биохимические параметры гомогенных мутантных форм ксиланаз, изучить их свойства в сравнении со свойствами рекомбинантных форм дикого типа и таким образом выявить влияние а.к. замен на исследуемые параметры ферментов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Получен ряд мутантных форм ксиланаз XylA, XylE и Xyl3 с одинарными и двойными а.к. заменами, а также с делециями или вставками в а.к. последовательность ферментов. Определены биохимические параметры гомогенных рекомбинантных ксиланаз. Показано, что ряд а.к. замен приводит к снижению термостабильности ксиланаз XylA, XylE и Xyl3; несколько а.к. замен не повлияли на данный параметр. Получены мутантные формы XylA L18F, XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E, обладающие более высокой термостабильностью по сравнению с рекомбинантными формами ферментов дикого типа. Установлено, что XylA L18F проявляет повышенную

термостабильность за счет заполнения гидрофобной полости белковой глобулы более объемным неполярным остатком фенилаланина, тогда как замены в XylE Y134R и Y134R/D248E приводят к образованию новых солевых мостиков и, как следствие, к увеличению температурной стабильности. Введение остатка пролина в начало а-спирали в XylE (а.к. замена T196P) оказало небольшое положительное влияние на термостабильность за счет увеличения жесткости третичной структуры фермента. Показано, что вставка дополнительных 5 аминокислотных остатков в пептидную петлю в районе активного центра XylA и Xyl3 позволяет ферментам приобрести свойство резистентности к белковым ингибиторам из злаков типа XIP.

Практическая значимость работы

Получены рекомбинантные мутантные формы XylA и XylE, которые демонстрируют более высокую термостабильность по сравнению к ферментами дикого типа. Температуры фазового перехода увеличились на 3,9; 2,7; 0,2; 2,3 °С для мутантных форм XylA L18F, XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E соответственно. Получены рекомбинантные мутантные формы XylA-ins и Xyl3-ins, которые обладают устойчивостью к белковым ингибиторам злаков типа XIP в отличие от ферментов дикого типа. Полученные мутантные формы ксиланаз открывают перспективы для их использования в качестве добавок к комбикормам для сельскохозяйственных животных и птиц, а также в процессах биообработки растительного сырья, содержащего ксиланы.

Положения, выносимые на защиту

1. Аминокдолотная замена L18F в XylA повышает температурную стабильность фермента за счет более плотного заполнения гидрофобной полости белковой глобулы объемным неполярным остатком фенилаланина.

2. Аминокислотные замены Y134R, Y134R/D248E и T196P в XylE приводят к повышению термостабильности фермента за счет образования нового солевого мостика или увеличения жесткости третичной структуры белка в результате введения остатка пролина в начало а-спирали.

3. XylE дикого типа (XylE-wt) обладает устойчивостью к белковым ингибиторам типа XIP из экстракта ржи, тогда как XylA-wt и Xyl3-wt восприимчивы к действию данных ингибиторов.

4. Вставка пяти аминокислотных остатков (GQGGA) в пептидную петлю, образующую «ущелье» активного центра XylA и Xyl3, формирует устойчивость ферментов к белкам типа XIP за счет создания стерических затруднений для связывания ингибитора.

Личный вклад диссертанта

Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены автором лично или при непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование и выполнение экспериментов, обработку данных, оформление и публикацию результатов.

Степень достоверности

Достоверность представленных в диссертационной работе данных определяется использованием современных физико-химических методов исследования, выполнением экспериментов на сертифицированном оборудовании, использованием стандартных норм и протоколов, рекомендованных фирмами-производителями определенных реактивов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует специальностям 03.01.04 - «биохимия» (пункты 2, 11, 17 паспорта специальности) и 03.01.06 - «биотехнология (в том числе бионанотехнологии)» (пункты 1, 9, 11 паспорта специальности).

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены в виде тезисов и докладов на российских и международных конференциях, школах, конгрессах: VIII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2015); XXVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2015); XXII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2015» (Москва, Россия, 2015); II Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, Р.

Беларусь, 2015); XI Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, Россия, 2016); V Съезд физиологов СНГ и V съезд биохимиков России (Сочи, Россия, 2016); Международная конференция «Биокатализ-2017» (МО, Россия, 2017); V Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, Россия, 2017); Всероссийская научно-практическая конференция «Микробные технологии в птицеводстве и животноводстве» (Казань, Россия, 2018).

Публикации

По результатам диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, из которых 5 опубликованы в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus, одна статья в сборнике научных трудов, а также 9 тезисов докладов конференций.

Связь работы с государственными программами

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России, ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (идентификационный номер ПНИЭР RFMEFI60716X0159), а также с использованием научного оборудования ЦКП «Промышленные биотехнологии» и АЦКП «Биоинженерия» ФИЦ Биотехнологии РАН.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждений, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах, содержит 15 таблиц и 48 рисунков. Список литературы включает 211 ссылок.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Строение и состав клеточной стенки растений

1.1. Клеточная стенка

Большинство растительных клеток покрыты клеточной стенкой. Клеточная стенка определяет как морфологию, так и отчасти функцию клетки. Она непосредственно может регулировать растяжение самой клетки, организуя ее пограничную зону; в то же время представляет собой внеклеточную структуру, которая заключает каждую клетку в наземных растениях, грибах и водорослях [1]. Она более твердая, толстая и более прочная, чем внеклеточная матрица, произведенная животными клетками. Клеточная стенка растений играет важную роль в процессе дифференцирования клеток. Типичные клеточные стенки наземных растений состоят в основном из полисахаридов. Оболочка клетки состоит из нескольких слоев, отличающихся друг от друга строением, физическими свойствами и химическим составом.

гр и и и л

Толщина самой клеточной стенки растений варьируется в широких пределах от 1 до 100 мкм в зависимости от породы дерева. Клеточная стенка состоит из двух структурных частей: первичной стенки и вторичной стенки Клетки связываются между собой межклеточным веществом, или истинной срединной пластинкой (ML). В период развития клетки межклеточное вещество состоит из пектиновых веществ; в зрелой клетке после одревеснения клеточной стенки основным компонентом становится лигнин. Первичная стенка - тонкий слой, являющийся в период роста поверхности единственной оболочкой, заключающей в себе протопласт, ее толщина составляет от 0,1 до 0,3 мкм. Данный слой состоит из различных веществ: целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых веществ, белков и лигнина, откладывающегося в период одревеснения. Вторичная стенка в свою очередь состоит из трех слоев: внешнего S1, среднего S2 и внутреннего S3; и характеризуется большим содержанием гемицеллюллоз, чем в первичной стенке (Рисунок 1) [2].

М1 Р 5, Вг 53(Г)

Рисунок 1 - Схема распределения основных компонентов древесины в клеточной стенке. (МЬ - межклеточное пространство; Р - первичная стенка; 81, 82, 83 - внешний, средний

и внутренний слои вторичной стенки) [2].

1.2. Химический состав клеточной стенки

Основными компонентами клеточной стенки являются полисахариды, лигнин, белки и вода. Наиболее важными химическими компонентами клеточной стенки растений являются полисахариды. Полисахариды можно разделить на две большие группы. Целлюлоза является основным представителем первой группы и наиболее распространенным полисахаридом на Земле, синтез которой в природе оценивается в 100 миллиардов тонн в год [3]. Целлюлоза является основным компонентом клеточных

и Л" и и и и и

стенок растений и представляет собой линейный неразветвленный полимер, состоящий из остатков Б-глюкопиранозы, которые соединены между собой Р-1,4-гликозидными связями (Рисунок 2). Повторяющимся звеном является остаток целлобиозы. Средняя степень полимеризации (СП) целлюлозы в первичной стенке составляет около 6000, во вторичной - до 14000. Молекула целлюлозы достигает длины в несколько микрон с диаметром 2-4 нм [4, 5]. Гидроксильные группы, связанные с углеродными атомами остатка глюкозы С2, С3, С6 не замещены. Молекулы имеют лентообразную конформацию, которая им позволяет параллельно упаковываться и образовывать трехмерные микрофибриллы диметром до 25 нм. Молекулы целлюлозы имеют кристаллическую структуру за счет образования обширных межмолекулярных водородных и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий [6].

Рисунок 2 - Строение и конформация молекулы целлюлозы [1].

Микрофибриллы целлюлозы окружены матриксом, который состоит из полисахаридов второй группы. Полисахариды матрикса, в свою очередь, являются разветвленными и имеют аморфную структуру. Матрикс часто описывают как аморфный, но это относительно, поскольку полисахариды матрикса располагаются параллельно микрофибриллам. По химическому строению полисахариды второй группы делятся на гемицеллюлозы и пектины.

Гемицеллюлозы не так сильно распространены в природе, как целлюлоза, и в среднем составляют 20% от клеточной стенки растений [7]. Функциональная роль гемицеллюлоз заключается в формировании промежуточного слоя между основными компонентами клеточной стенки. В первичной клеточной стенке гемицеллюлозы связывают целлюлозу и пектин, во вторичной - целлюлозу и лигнин [1]. СП гемицеллюлоз значительно ниже СП целлюлозы: от 50 до 200 [8]. Полисахаридную структуру клеточной стенки можно сравнить со структурой железобетона: целлюлозные микрофибриллы эквивалентны стальным стержням, а полисахариды матрикса -окружающему стержни бетону (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Организация клеточной стенки высших растений [9].

Кроме полисахаридов в клеточной стенке высших растений присутствует лигнин. Лигнин - это сложный сильно разветвленный полимер, состоящий из фенилпропановых остатков. Основным компонентом лигнина хвойных пород деревьев является конифериловый спирт, также присутствует п-кумаровый спирт. Лигнин в лиственных породах деревьев состоит из кониферилового и синапового спиртов (Рисунок 4). Лигнин служит главным компонентом клеточных стенок опорных тканей растений [8]. Лигнин образует сеть, пронизывающую матрикс клеточной стенки и выполняющую важную структурную роль в клеточной стенке [10].

Также в клеточной стенке растений содержатся неорганические соединения, ферменты, структурные белки и вода.

I 2 3

сн,он сн,он сн.он

' л.. I

Рисунок 4 - Строение спиртов, входящих в состав лигнина. 1 - 3-метокси-4-оксикоричный (конифериловый); 2 - 4-оксикоричный (п-кумаровый). 3 - 3,5-диметокси-

4-оксикоричный (синаповый) спирты.

1.3. Полисахариды матрикса

Практически все полисахариды матрикса построены из двух или более различных моносахаридов и имеют разветвленную структуру. Как уже говорилось, по химической природе полисахариды матрикса можно разделить на 2 группы: пектины и гемицеллюлозы. Данное разделение основано на растворимости полисахаридов: пектины экстрагируются из клеточной стенки в результате 12-часовой обработки кипящей водой, слабой кислотой или хелатирующих агентов [11], а гемицеллюлозы экстрагируются при 25 °С в 4 М гидроксиде калия [1, 12].

Гемицеллюлозы составляют порядка 20% от клеточной стенки растений [11]. Гемицеллюлозы получили свое название из-за предположения Шульца в конце XIX века, что данные полисахариды являются предшественниками целлюлозы и представляют наполовину образованные молекулы целлюлозы (hemi (гр.) - полу) [13]. В настоящее время термин гемицеллюлозы все еще используется. Не так давно

сообщалось [14], что гемицеллюлозы можно разделить на четыре подгруппы: ксиланы, Р-глюканы, маннаны и ксилоглюканы, каждая подгруппа существенно различается по моносахариду основной цепи .

Ксилоглюканами называют полисахариды, основная цепь которых состоит из остатков Б-глюкопиранозы, соединенных Р-1-4-гликозидными связями. При этом цепь содержит множественные боковые группы, которые содержат главным образом ксилозу, а также арабинозу, галактозу или фукозу. Р-Глюканы состоят из остатков Б-глюкопиранозы, соединенных Р-1-3- и Р-1-4-гликозидными связями. Основная цепь маннанов в основном состоит из Р-1-4-связанных остатков маннозы, или в случае глюкоманнанов, может содержать еще Б-глюкопиранозу.

Ксиланы состоят из Р-1-4-Б-ксилопиранозных звеньев, которые могут содержать боковые заместители в виде сахаров или олигосахаридов [15]. Ксиланы являются преобладающими нецеллюлозными полисахаридами во многих древесных породах, злаках, льне и других растениях. Ксиланы различных растений отличаются друг от друга составом и строением. Эти различия могут использоваться в качестве хемотаксономических признаков для определения групп растений.

В основной цепи ксилана остатки Б-ксилопиранозы связаны гликозидными Р-1-4-связями. До 70% остатков Б-ксилопиранозы ацетилированы, в основном по С3 атому углерода. К некоторым остаткам присоединена 4-О-метил-а-Б-глюкуроновая кислота через гликозидную а-1-2-связь. К некоторым ксилозным остаткам может быть присоединена а-1-3-глюкозидной связью а -Ь-арабинофураноза [16, 17] (Рисунок 5).

А Б В

н соон

Рисунок 5 - Строение основных моносахаридов, входящих в структуру ксилана. А - Р-Б-ксилопираноза; Б - 4-О-метил-а-Б-глюкуроновая кислота; В - а-Ь-арабинофураноза.

Ксиланы расположены в основном в среднем слое и выполняют функции скрепляющего вещества за счет формирования ковалентных и нековалентных связей с лигнином, целлюлозой и другими полимерами. Это необходимо для поддержания целостности клеточной стенки растения. Ксиланы составляют основной объем гемицеллюлоз в покрытосеменных растениях - 20-30% от общей сухой массы; но присутствуют в меньшей степени у голосеменных растений, которые содержат 7-12% ксиланов [18]. В некоторых однолетних травах и зерновых содержание ксилана составляет до 50% [19].

Арабиноглюкуроноксилан (арабиноксилан) - гетерополисахарид, основная цепь которого построена из 1,4-Р-Б-ксилопиранозных звеньев, а боковые группы представляют собой 4-0-метил-Б-глюкуроновую кислоту и Ь-арабинофуранозу, соединенных с основной цепью в основном а-1,2-связью (Рисунок 6). Высокое содержание боковых арабинозных заместителей обуславливает высокую вязкость арабиноксиланов данного типа. Арабиноксиланы однодольных растений этерифицированы по С5 атому Ь-арабинофуранозы феруловой или кумаровой кислотами [20, 21]. СП арабиноксилана варьирует в пределах от 70 до 130. Арабиноксиланы были обнаружены в пшенице, ржи, ячмене, овсе, рисе, сорго, а также в некоторых других растениях: траве панголы, побегах бамбука и ржаной траве. Эти полисахариды составляют важную часть клеточных стенок растений [19].

СООН

Рисунок 6 - Схематичная структура арабиноглюкуроноксилана.

Ацетилглюкуроноксилан (глюкуроноксилан) - основной ксилан твердых

(лиственных) пород деревьев. Это разветвленный полисахарид, главная цепь которого

построена из остатков Б-ксилопиранозы, соединенных гликозидными связями.

Страница - 17 -

Содержание его варьирует от 15 до 30% от сухой массы древесины. В основной цепи глюкуроноксилан содержит Б-ксилопиранозные остатки, соединенные Р-1,4-связями, 70% которых ацетилировано по гидроксильной группе С2 или С3 углеродных атомов ксилопиранозного кольца [1]. Кроме того, в среднем к каждому десятому ксилозному звену в качестве боковой группы присоединена а-1,2-связью молекула 4-О-метил-Б-глюкуроновой кислоты (Рисунок 7). Число боковых глюкуроновых звеньев зависит от породы, положения в стволе и возраста дерева. СП глюкуроноксилана твердых пород деревьев составляет 150-200. Предполагается, что до 40% групп уроновых кислот в глюкуроноксиланах находится не в свободном виде карбоксилат-ионов, а участвует в образовании сложноэфирных связей [22].

соон

Рисунок 7 - Схематичная структура глюкуроноксилана.

Гомоксилан (родименан) - полисахарид, построенный исключительно из P-D-ксилопиранозных звеньев. Однако его основная цепь наряду с Р-1,4-гликозидными связями содержит в соотношении 2:1 также и р-1,3-связи (Рисунок 8). Источником родименана служат морские водоросли рода Palmaria [23] Благодаря своему уникальному строению, этот полисахарид часто используют в качестве модельного субстрата для изучения механизма действия ксиланаз [24].

Рисунок 8 - Схематичная структура гомоксилана.

ГЛАВА 2. Ксиланолитические ферменты и белковые ингибиторы ксиланаз

За последние 50 лет по мере развития усилий по конверсии растительной биомассы развивались и расширялись различные методы ее гидролиза. В настоящее время использование ферментов в качестве биологических катализаторов для гидролиза природных полисахаридов активно исследуется.

2.1. Ксиланолитическая система ферментов

Из-за неоднородности и сложности структуры ксиланов их ферментативный гидролиз требует системы кооперативно действующих ферментов. Данная система обычно состоит из эндо-1,4-Р-ксиланаз, Р-ксилозидаз, a-L-арабинофуранозидаз и ацетилксиланэстераз. Присутствие такой многофункциональной ферментативной системы распространено среди бактерий и грибов [12, 25]. Ферменты, участвующие в гидролизе ксиланов и других гемицеллюлоз, условно можно разделить на две группы. К первой группе стоит отнести ферменты, которые гидролизуют основную цепь полисахарида. Ко второй группе следует отнести ферменты, которые удаляют боковые заместители с основной цепи Р-1,4-ксилана (debranching enzymes) [12].

Основными ферментами такой ксиланолитической системы являются эндо-1,4-Р-ксиланазы (КФ 3.2.1.8), часто называемые просто ксиланазами, которые гидролизуют гликозидные связи основной цепи ксилана, образуя короткие фрагменты ксилоолигосахаридов и сильно снижая степень полимеризации полисахарида [26]. Подробное описание ксиланаз приведено ниже. Высвобожденные олигосахариды могут дополнительно деградироваться Р-ксилозидазой.

Р-Ксилозидазы (КФ 3.2.1.37) были обнаружены в грибах, растениях и дрожжах. Они гидролизуют концевые связи с невосстанавливающего конца короткого ксилоолигосахарида и образуют ксилопиранозу (Рисунок 9). Короткие ксилоолигосахариды могут быть полностью преобразованы в ксилозу с помощью в-ксилозидазы. Однако сродство к ксилоолигосахаридам уменьшается с увеличением длины цепи олигомера. Поскольку гидролиз протекает с невосстанавливающего конца ксилоолигосахарида, в-ксилозидазы не функционируют при наличии бокового заместителя у концевого невосстанавливающего остатка ксилозы. Также в-ксилозидазы способны гидролизовать арильные производные ксилоолигосахаридов [27].

а-Ь-Арабинофуранозидазы (КФ 3.2.1.55). Арабинофуранозидазы были обнаружены в бактериях и грибах [28, 29]. Они катализируют отщепление боковых остатков L-арабинофуранозы, присоединенных а-1,2- или а-1,3-связями к основной цепи арабиноксиланов (Рисунок 9). Арабинофуранозидазы обладают широкой субстратной специфичностью [30]. Некоторые АФ способны отщеплять ферулоил-Ь-арабинозу. Это свойство может быть важным при гидролизе нативных арабиноксиланов, которые, как правило, содержат в качестве заместителей остатки феруловой и п-кумаровой кислот [31, 32] .

а-Ь-Глюкуронидазы (КФ 3.2.1.139). а-Ь-Глюкуронидазы были обнаружены в грибах и бактериях [33, 34]. Они расщепляют а-1,2-гликозидную связь между остатками 4-О-метил-а-глюкуроновой кислоты и ксилозы в коротких фрагментах глюкуроноксилана (Рисунок 9). Поскольку а-Ь-глюкуронидазы не гидролизуют синтетические субстраты, их изучение крайне затруднено. Наиболее исследованы бактериальные представители данного класса ферментов.

Ацетилксиланэстеразы (КФ 3.1.1.72). Ацетилксиланэстеразы были обнаружены в грибах и бактериях [35, 36, 37]. Ацетилксиланэстеразы являются важной группой ферментов для эффективного гидролиза ксиланов твердых пород деревьев. Ацетилксиланэстеразы способны гидролизовать не только эфирные связи от алифатических и сложных эфиров, но и удалять О-ацетильные группы у С2 и С3 атомов ксилана (Рисунок 9). За счет удаления ацетильных групп обеспечивается лучший доступ ксиланаз для гидролиза основной цепи полисахарида.

Ферулоилэстеразы (КФ 3.1.1.73). Ферулоилэстеразы также были обнаружены в грибах и бактериях [38, 39], они гидролизуют связь между остатками феруловой кислоты и арабинозы в арабиноксиланах (Рисунок 9), тем самым, остаток арабинозы становится доступным воздействию арабинофуранозидазами.

Рисунок 9 - Теоретическая обобщенная структура ксилана и связи, которые подвергаются гидролизу в процессе биодеградации ксилана. Rl - гидроксильная группа или L-арабиноза; R2 - гидроксильная группа или остаток феруловой кислоты; Rз -гидроксильная группа или остаток уксусной кислоты.

2.2. Эндо-1,4-р-ксиланазы

Истинные эндо-1,4-Р-ксиланазы (КФ 3.2.1.8, 1,4-0-Б-ксилан ксиланогидролазы) -ферменты, состоящие из единственного каталитического домена и демонстрирующие преимущественно эндо-1,4-Р-ксиланазную активность. Они представляют собой гликозидгидролазы (ГГ), которые гидролизуют ксилан. Согласно классификации Хенриссата, ксиланазы в основном представлены в 10-й и 11-й семьях ГГ (бывшие F и G соответственно) [40]; но также присутствуют в других семьях ГГ: 5, 8, 30, 43, 51, 98, 141 (Таблица 1). Представители этих семей отличаются между собой физико-химическими свойствами, биохимическими параметрами, структурой и субстратной специфичностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Денисенко, Юрий Андреевич, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М. 1986., Т. 1. С. 71.

2 Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В.. Химия древесины и синтетических полимеров. СПб.: Темплан. 1999. С. 214-220.

3 Klemm D., Heublein B., Fink H.-P., A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material, Angew. Chem. Int. 2005. P. 3358.

4 Newman R., Davies L., Harris P. Solid-state 13-C nuclear magnetic resonance characterization of the cell walls of Arabidopsis thaliana leaves. Plant physiology. 1996. T. 111. P. 475-485.

5 Smith B., Harris P., Melton L., Newman R. Crystalline cellulose in hydrated primary cell walls of three monocotyledons and one dicotyledon. Plant and Cell Physiology. 1998. T. 39. P. 711-720.

6 Himmel M. E.. Biomass recalcitrance. Deconstructing the plant cell wall for bioenergy. Blackwell Publishing Ltg. 2008. P. 61-134.

7 Шестрем Э., Янсон Я. Гемицеллюлозы. В сб. Химия древесины. М.: Мир. 1982. С. 130.

8 Eriksson O., Lindgren B.. About the linkage between lignin and hemicelluloses in wood. Svensk Papperstidn. 1997. P. 59-64.

9 Doherty W.O.S., Mousavion P., Fellows C.M. Value-adding to cellulosic ethanol: Lignin polymers. Industrial Crops and Products. 2011. V. 22. P. 259-270.

10 Rahikainen J., Mikander S., Marjamaa K., Lappas A. Inhibition of enzymatic hydrolysis by residual lignins from softwood — study of enzyme binding and inactivation on lignin-rich surface. Biotechnology and Bioengineering. 2011. DOI 10.1002/bit.23242.

11 Williams P., Heinze T., Daus S. Renewable resources for fuctional polymers and biomaterials. The royal Society of Chemistry. 2011. Ch. IV. P. 1-27.

12 Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London. 1993. V.4. P. 120.

13 Schulze E. Zur Kentniss der chemischen Zusammensetzung der pflanzlichen Zellmembranen, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1891. P. 2277-2287.

14 Ebringerova A. Structural diversity and application potential of hemicelluloses.

15 Ebringerova A., Heinle P^lXy^ and xylan derivatives - biopolymers with valuable

properties. Naturally occurring xylans structures, isolation procedures and properties. Macromolecular Rapid Communications. 2000. P. 542-556.

16 Viikari L., Suurnaki A. Forest products: Biotechnology in pulp and paper processing. Encyclopedia of microbiology. 2009. P. 80-94.

17 Somerville C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2006. P. 53-78.

18 Bajpai P. Xylanolytic enzymes. 2014. P. 9-18.

19 Stephen A. Other plant polysaccharides. New York. 1983. V. 2. P. 98-183.

20 Holguin-Acuna A. Non-starch polysaccharides in maize and oat: ferulated arabinoxylans and P-glucans. 2011.

21 Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P.J. Linkage of p-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res. 1986. V.148, P.71-85.

22 Holtzapple M.. Hemicelluloses. Encyclopedia of food science and nutrition. 2003. P.3060-3071

23 Deniaud E., Quemener B.. Structural studies of mix-linked P-(1-3)/p-(1-4)-D-xylans from cell wall of Palmariapalmate (Rhodophyta). J. Physiol. 2003. P. 75-83.

24 Deniaud E., Fleurence J., Dahlman O. Preparation and chemical characterization of cell wall fractions enriched in structural proteins from Palmaria palmate (Rhodophyta). Bot. Mar. 2004. P. 365-379.

25 Woodward J. Xylanases: functions, properties, and applications. Top. Enzyme Ferment. Biotechnol. 1984. P. 8-48.

26 Beg Q. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Amer. Chem. Soc. 1996. P. 323-330.

27 Gomes M., Isorna P., Rojo M., Estrada P. Kinetic mechanism P-xylosidase from Trichoferma reesei QM9414. J. Molecular Catalyst. 2001. V. 16. P. 7-15.

28 Kaji A., Sato M., Tsutsui Y. An a-Larabinofuranosidase produced by the wild-type Streptomyces sp. no. 17-1. Agric. Biol. Chem. 1981. P. 925-931.

29 Poutanen K. An a-L-arabinofuranosidase of Trichoderrna reesei. J. Biotechnol. 1988. P. 271- 282.

30 Beldman G., Schols H.Arabinans and arabinan degrading enzymes. Ad. Macromol. Carbohydr. Res. 1996.

31 Kroon P.A., Williamson G. Release of ferulic acid from sugar-beet pulp by using arabinase, arabinofuranosidase and an esterase from Aspergillus niger. Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V. 23. P. 263-267.

32 Luonteri E., Kroon P.A., Tenkanen M., Teleman A., Williamson G. Activity of an Aspergillus terreus a-arabinofuranosidase on phenolic-subtituted oligosaccharides. J. Biotechnol. 1999. V. 67. P. 41-48.

33 Khandke K.M., Vithayathil P.J., Murthy S.K. Purification and characterization of an a-D-glucuronidase from a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Arch. Biochem. Biophys. 1989. P. 511-517.

34 Puls J., Schmidt O., Granzow C. a-Glucuronidases in two microbial xylanolytic systems. Enzyme Microb. Technol. 1997. P. 83-88.

35 Biely P., Mackenzie C.R., Pul J. Cooperativity of esterases and xylanases in the enzymatic degradation of acetyl xylan. BioiTechnology. 1986. P. 731-733.

36 Biely P., Mackenzie C.R., Schneider H. Production of acetyl xylan esterase by Ttichoderma reesei and Schizophyllum commune. Can. J. Microbiol. 1988. P. 767-772.

37 Lee S. F., Forsberg C. W. Isolation and some properties of a P-D-xylosidase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Appl. Environ. Microbiol. 1987. P. 65 1-654.

38 Mackenzie C.R., Bilous D. Ferulic acid esterase activity from Schizophyllum commune. Appl. Environ. Microbiol. 1988. P. 1170-1173.

39 Bomeman W. S., Ljungdahl L. G., Hartley R. D., Akin D. E. Feruloyl and p-coumaroyl esterases from the anaerobic fungus Neocallimastix strain MC-2: properties and functions in plant cell wall degradation. Hemicclluloses and Hemicellulases. 1993. P. 85-102.

40 Henrissat B., Bairoch A. New families in classification of glycosyl hydrolases based on amino acid secuence similarities. J. Biochem. 1993. P. 781-788.

41 Li K., Azadi P., Collins R., Tolan J., Kim J.S., Eriksson. Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enzyme Microb Technol. V. 27. 2000. P. 89-94.

42 Sunna A., Antranikian G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria. Crit Rev

43 po&W.W.,lRiZZa^i Monti R., Terenzi H.F., Jorge, J.A. Xylanases from

fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology. V. 67. 2005. P. 577-591.

44 Rye C.S., Withers S.G. Glycosidase mechanism. Curr. Opin. Chem. Biol. V. 4. 2000. P. 463-580.

45 McCarter J.D., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. V. 4. 1994. P. 885-892.

46 Charnock S.J., Spurway T.D., Xie H., Beylot M-H., Virden R., Antony R., Warren J., Hazlewood G.P., Gilbert H.J. The topology of the substrate binding clefts of glycosyl hydrolase family 10 xylanases are not conserved. J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (48). P. 32187-32199.

47 Pell G., Taylor E.J., Gloster T.M., Turkenburg J.P., Fontes C.M.G.A., Ferreira L.M.A., Nagy T., Clark S.J., Davies G.J., Gilbert H.J. The mechanisms by which family 10 glycoside hydrolases bind decorated substrates. J. Biol. Chem. V. 279 (10). 2004. P. 9597-9605.

48 Biely P. Diversity of microbial endo-b-1,4-xylanases. Applications of Enzymes to Lignocellulosics. 2003. P. 361-380.

49 Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-beta-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties. J. Biotechnol. V. 57. 1997. P. 151-166.

50 Hu J., Saddler J.N. Why do GH10 xylanase have better performance than GH11 xylanase for the deconstruction of preteated biomass. Biomass and Bioenergy. 2018. P. 13-16.

51 Biely P., Vrsanska M., Kremnicky L., Tenkanen M. Stereochemistry of the hydrolysis of glycosidic linkage by endo-1,4-b-xylanases of Trichoderma reesei. FEBS Lett. V. 356. 1994. P. 137-140.

52 Schmidt A., Schlancher A., Steiner W., Schwab H., Kratky C. Xylanase from Penicillium simplicissimum and its complexes with xylooligomers. Protein Sci. 1998. V. 7. P. 2081-2088.

53 Schmidt A., Gübitz G., Kratky C. Xylan binding subsite mapping in the xylanase from

Penicillium simplicissimum using xylooligosaccharides as cryo-protectant.

54 Nate^h R., Bhanumo^rt^hy P^Viith^^thil P. J, Sekar K., Ramakumar S., Viswamitra M. A. Crystal Structure at 1.8 AE Resolution and Proposed Amino Acid Sequence of a Thermostable Xylanase from Thermoascus aurantiacus. J. Mol. Biol. 1999. P.999-1012.

55 Natesh R., Manikandan K., Bhanumoorthy P., Viswamitra M.A., Ramakumara S. Thermostable xylanase from Thermoascus aurantiacus at ultrahigh resolution (0,89 Ä) at 100 K and atomic resolution (1,11 Ä) at 293 K refined anisotropically to small-molecule accuracy. Acta Cryst. 2003. V. 59. 105-117.

56 Leggio L.L., Kalogiannis S., Eckert K., Teixeir S.C.M., Bhat M.K., Andrei C., Pickersgill R.W., Larsen S. Substrate specificity and subsite mobility in Thermoascus aurantiacus xylanase 10A. FEBS Lett. V. 509. 2001. P. 303-308.

57 Ntarima P., Nerinck W., Klarskov K., Devreese B., Bhat M.K., van Beeumen J., Claeyssens M. Epoxyalkyl glycosides of D-xylose and xylo-oligosaccharides are active-site markers of xylanases from glycoside hydrolase family 11, not from family 10. Biochem. J. V. 347. 2000., P. 865-873.

58 Tahir T., Berrin J-G., Flatman R., Roussel A., Roepstorff P., Williamson G., Juge N. Specific characterization of substrate and inhibitor binding sites of a glycosyl hydrolase family 11 xylanase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem.. V. 277 (46). 2002. P. 4403544043.

59 Szendefy J, Szakacs G and Christopher L (2006) Potential of solidstate fermentation enzymes of Aspergillus oryzae in biobleaching of paper pulp. Enzyme Microb. Technol. 39, 1354-1360.

60 Souza M., Carvalho M.C. Two ß-xylanases from Aspergillus terreus: Characterization and influence of phenolic compounds on xylanase activity. Fungal Genetics and Biology. 2013. V. 60. P. 46-52.

61 Salles B.C., Cunha R.B., Fontes W., Sousa M., Filho E.X. Purification and characterization of a new xylanase from Acrophialophora nainiana. Journal of Biotechnology. 2000. V. 81(2-3). P. 199-204.

62 Gubitz G. Purification and characterization of a new low molecular weight

endoxylanase from Penicillium capsulatum. Enzyme and Microbial Technology.

63 Lao H A neW^cidophilic endo-P-1,4-xylanase from Penicillium oxalicum: cloning,

purification, and insights into the influence of metal ions on xylanase activity. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. V.41(7). 2014. P. 1071-1083.

64 Basit A., Liu J., Miao T., Zheng F., Rahim K., Jiang W. Characterization of two endo-P-1,4-xylanases from Myceliophthora thermophila and their saccharification efficiencies, synergistic with commercial cellulase. Microbiotechnology, ecotoxicology and bioremediation. 2018.

65 Sharma M. Purification and characterization of two thermostable xylanases from Malbranchea flava active under alkaline conditions. Bioresource Technology. 2010. P. 8834-8842.

66 Ziaie-Shirkolaee Y., Talebizadeh A., Soltanali S. Comparative study on application of T. lanuginosus SSBP xylanase and commercial xylanase on biobleaching of non wood pulps. Biores.Technol. 2088. V. 99. P. 7433-7437.

67 Bibi Z., Ansari A., Rahmat R.R., Aman A. Production of xylan degrading endo-1,4-b-xylanase from thermophilic Geobacillus stearothermophilus KIBGE-IB29. 2008. J. Rad. Res. App. Sci. V. 7. P. 478-485.

68 Brecca J., Sineriz F., Baigori M. Purification and characterization of a thermostable xylanase from Bacillus amyloliquefaciens. 1998. Enzyme and Microbial Technology. V. 22. P. 42-49.

69 Mahilrajan S. Purification of xylanase from Bacillus Pumilus and its characterization. Pure Science. 2014. P. 357-361.

70 Hurlbert J.C., Preston J.F. Functional characterization of a novel xylanase from corn strain of Erwinia chrysanthemi. J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 2093-2100.

71 Kumar M., Joshi A., Kashyapa R. and Khanna S. Production of xylanase by Promicromonospora sp MARS with rice straw under non sterile conditions. Process Biochem. 2011. V. 46. 1614-1618.

72 Petegem F., Collins T., Meuwis M.A., Gerday C., Feller G., van Beeumen J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of a xylanase from psychrophile

Pseudoalteromonas haloplanktis. Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr. 2002. V. 58. P. 1494-1496.

73 Garcia-Olmedo F., Salcedo G., Sanchez-Monge R., Gomez L., Royo J., Carbonero P., Plant proteinaceous inhibitors of proteinases and a-amylases. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology. 1987. P. 275-334.

74 MacGregor A.W., Macri L.J., Schroeder S.W., Bazin S.L. Purification and characterization of limit dextrinase inhibitors from barley. Journal of Cereal Sciense. 1994. P. 33-41.

75 Debyser W., Derdelinck G., Delcour J.A. Arabinoxylan solubilisation and inhibition of the barley malt xylanolytic system by wheat during brewing with wheat whole meal adjunct: evidence for a new class of enzyme inhibitors. J. Amer. Soc. Brew. Chem. V. 55. 1997. P. 153-156.

76 Bellincampi D., Camardella L., Delcour J.A., Desseaux V., D'Ovidio R., Durand A., Elliot G., Gebruers K., Giovane A., Juge N., Frisbaek J., S?rensen J.F., Svensson B., Vairo D. Potential physiological role of plant glycosidase inhibitors. Biochim. Biophys. Acta. V. 1696. 2004. P. 265- 274.

77 Debyser, W. Arabinoxylan solubilisation during the production of Belgian white beer and a novel class of wheat proteins that inhibitendoxylanases. 1999. PhD dissertation Katholieke Universiteit Leuven, Leuven, Belgium.

78 Gebruers K., Dornez E., Bed? Z., Rakszegi M., Courtin C., Delcour J. Variability in xylanase and xylanase inhibition activities in different cereals in the healthgrain diversity screen and contribution of environment and genotype to this variability in common wheat. J. Agric. Food Chem. 2010. P. 9362-9371.

79 Gebruers K., Debyser W., Goesaert H., Proost P., van Damme J., Delcour J.A. Triticum aestivum L. endoxylanase inhibitor (TAXI) consists of two inhibitors, TAXI I and TAXI II, with different specificities. Biochem. J. V. 353. 2001. P. 239-244.

80 Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Fierens K., Goesaert H., Rabijns A., Readschelders G., Robben J., Sansen S., S?rensen J.F., van Campenhout S., Delcour J.A. Properties of TAXI-type endoxylanase inhibitors. Biochim. Biophys. Acta. V. 1696 (2). 2004. P. 213-221.

81 Goesaert H., Elliott G., Kroon P.A., Gebruers K.,Courtin C.M., Robben J., Delcour

J.A., Juge N. Occurrence of proteinaceous endoxylanase inhibitors in cereals. Biochim.

82 ^ans^n S^ De Ran^e^C J^^gGebrueif Kög^^s K., Courtin C.M., Delcour J.A., Rabijns

A. Structural Basis for Inhibition of Aspergillus niger Xylanase by Triticum aestivum Xylanase Inhibitor-I. J. Biol. Chem.. 2004. V. 279. P. 36022-36028.

83 Sansen S., De Ranter C.J., Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Delcour J.A., Rabijns A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of two complexes of a TAXItype xylanase inhibitor with glycoside hydrolase family 11 xylanases from Aspergillus niger and Bacillus subtilis. Acta Crystallographica. Section D: Biological Crystallography. 2004. V. 60. P. 555-557.

84 Гусаков А.В. Белковые ингибиторы микробных ксиланаз. БИОХИМИЯ. 2010. Т. 75. С. 1331 - 1347.

85 Fierens K., Gils A., Sansen S., Brijs K., Courtin C.M., Declerck P.J., De Ranter C.J., Gebruers K., Rabijns A., Robben J., Van Campenhout S., Volckaert G., Delcour J.A. His374 of wheat endoxylanase inhibitor TAXI-I stabilizes complex formation with glycoside hydrolase family 11 endoxylanases. FEBS J. 2005. V. 272. P. 5872-5882.

86 McLauchlan W.R., Garcia-Conesa M.T., Williamson G., Roza M., Ravestein P., Maat J. A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. Biochem. J. V. 338. 1999. P. 441- 446.

87 Flatman R., Mclauchlan W.R., Juge N., Furniss C., Berrin J-G., Hughes R.K., Manzanares P., Ladbury J.E., O'Brien R., Williamson G. Interactions defining the specificity between fungal xylanases and the xylanase-inhibiting protein XIP-I from wheat. Biochem. J. V. 365. 2003. P. 773-781.

88 Berrin J.G., Juge N. Factors affecting xylanase functionality in the degradation of arabinoxylans.Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 1139-1150.

89 Belien T., Van Campenhout S., Van Acker M., Volckaert G. Cloning and characterization of two endoxylanases from the cereal phytopathogen Fusarium graminearum and their inhibition profile against endoxylanase inhibitors from wheat. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 327. P. 407-414.

90 Belien T., Van Campenhout S., Van Acker M., Robben J., Courtin C.M., Delcour J.A.,

Volckaert G. Mutational analysis of endoxylanases XylA and XylB from the

Страница - 126 -

phytopathogen Fusarium graminearum reveals comprehensive insights into their inhibitor insensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 4602-4608.

91 Vardakou M., Dumon C., Murray J.W., Christakopoulos P., Weiner D.P., Juge N., Lewis R.J., Gilbert H.J., Flint J.E. .Understanding the structural basis for substrate and inhibitor recognition in eukaryotic GH11 xylanases. J. Mol. Biol. 2008. V. 375. P. 1293-1305.

92 Furniss C.S.M.., Williamson G., Kroon P.A. The substrate specificity and susceptibility to wheat inhibitor proteins of Penicillium funiculosum xylanases from a commercial enzyme preparation. J. Sci. FoodAgr. 2005. V. 85. P. 574-582. DOi: 10.1002/jsfa.1984

93 Gusakov A.V., Ustinov B.B. Assaying sensitivity of fungal xylanases to proteinaceous inhibitors from a rye extract: Two GH10 family xylanases resistant to XIP-like inhibitors. Ind. Biotechnol. 2009. V. 5. P. 104-109.

94 Payan F., Flatman R., Porciero S., Williamson G., Juge N., Roussel A. Structural analysis of xylanase inhibitor protein I (XIP-I), a proteinaceous xylanase inhibitor from wheat. Biochem. J. 2003. V. 372. P. 399-405.

95 Payan F., Leone P., Porciero S., Furniss C., Tahir T., Williamson G., Durand A., Manzanares P., Gilbert H.J., Juge N., Roussel A. The dual nature of the wheat xylanase protein inhibitor XIP-I. J. Biological. Chem. V. 279 (34). 2004. P. 36029-36037.

96 Kumar D., Kumar S., Kumar J., Kumar O., Mishra S.V., Kumar R., Malyan S. Xylanases and their industrial application: a review. Biochem. Cell. Arch. V. 17. 2017. P. 353-360.

97 Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Appl Microbiol Biotechnol. V. 56. 2001 P. 326-338

98 Techapun C., Poosaran N., Watanabe M., Sasaki K. Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulose-free xylanases produced from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching bioprocesses: a review. Process Biochem. V. 38. 2003. P. 1327-1340.

99 Buchert J., Tenkanen M., Kantelinen A., Viikari L. Application of xylanases in the pulp and paper industry. Bioresourse Technol. V. 50. 1994. P. 65-72.

100 Garg A.P., McCarthy A.J., Roberts J.C. Biobleaching effect of Streptomyces thermoviolaceus xylanase preparations on birchwood kraft pulp. Enzyme and Microbial Technology. V. 18. 1996. P. 261-267.

101 Paice M., Gurnagul N., Page D.H., Jurasek L. Mechanism of hemicellulose-direct prebleaching of kraft pulps. Enz. Microbiol. Technol. V. 14. 1992. P. 272-276.

102 Buchert J., Ranua M., Kantelinen A., Viikari L. The role of two Trichoderma reesei xylanases in the bleaching of pine kraft pulp. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 37. 1992. P. 825-829.

103 Jeffries T.W. Conserved motifs in xylanases for pulp bleaching. IBCs 3rd annual symposium on commercial enzymes. 1998. P. 212-218.

104 Godfrey T., West S. Industrial enzymology. Second edition. Macmillan Press. 1996. P. 69-382.

105 Bedford M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition - their current value and future benefits. Animal Feed Sci. Technol. V. 86. 2000. P. 1-13.

106 Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. М. ДеЛи принт. 2002. C. 335.

107 Bedford M.R., Morgan A.J. The use of enzymes in poultry diets. World's Poultry Science Journal. V. 52. 1996. P. 61-68.

108 Супрунов Д. Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-бройлеров. Комбикорма. T. 1. 2000. С. 47-48.

109 Choct M. Enzymes for the feed industry: past, present and future. World's Poultry. Science Journal. V. 62. 2006. P. 5-16.

110 McLauchlan W.R., Flatman R.H., Sancho A.I., Kakuta, J. Xylanase inhibitors from cereals: implications for baking, brewing and plant technology. 2nd European Symposium on Enzymes in Grain Processing. 1999. P. 55.

111 Ganga M.A., Pinaga F., Valles S., Ramón D., Querol A. Aroma improving in microvinification processes by the use of a recombinant wine yeast strain expressing the Aspergillus nidulans xlnA gene. Int. J. Food Microbiol. V. 47. 1999. P. 171-178

112 Screenath H.K., Jeffries T.W. Production of ethanol from wood hydrolysate by yeasts. Bioresour Technol. V. 72. 2000. P. 253-260.

113 Parajo J.C., Domingues H., Domingues J.M. Biotechnological production of xylitol. Part 1, interest of xylitol and fundamentals of its biosynthesis. Bioresour Technol. V. 65. 1998. P. 191-201.

114 Aditya B., Kenneth B., Nirmal U., Venkatesh B. Novel thermostable endo-xylanase

cloned and expressed from bacterium Geobacillus sp. WSUCF1. Bioresource

115 Rib^iro^ et a^.^A no^ S^hermoftablf xylanase GH10 from Malbranchea pulchella

expressed in Aspergillus nidulans with potential applications in biotechnology. Biotechnology for Biofuels. 2014. V. 7. P. 115.

116 Gupta S.K., Srivastava S.K., Sharma A., Nalage V.H., Salvi D., Kushwaha H. Metabolic engineering of CHO cells for the development of a robust protein production platform. PLoS ONE. V. 12. e0181455. 2017.

117 Chang A., Scheer M., Grote A. BRENDA, AMENDA and FRENDA the enzyme information system: New content and tools in 2009. Nucleic Acids Research. V. 37. 2009. P. 588-592.

118 Han N., Miao H., Ding J. Improving the thermostability of a fungal GH11 xylanase via site-directed mutagenesis guided by sequence and structural analysis. Biotechnology for Biofuels. V. 10. 2017. P. 133. https://doi.org/10.1186/s13068-017-0824-y.

119 Qian C., Liu N., Yan X., Wang Q., Zhou Z., Wang, Q. Engineering a high-performance, metagenomic-derived novel xylanase with improved soluble protein yield and thermo-stability. Enyzme and Microbial Technology. V. 70. 2015. P. 35-41.

120 Wahab A., Jonet M.A.B., Illias R.M. Thermostability enhancement of xylanase Aspergillus fumigatus RT-1. Journal of Molecular Catalysis. V. 134. 2016. P. 154-163.

121 Acevedo J.P., Reetz M.T., Asenjo J.A., Parra L.P. One-step combined focused epPCR and saturation mutagenesis for thermostability evolution of a new cold-active xylanase. Enzyme and Microbial Technology. V. 100. 2017. P. 60-70.

122 Souza A.R., de Araùjo G.C., Zanphorlin L.M., Ruller R., Franco F.C., Torres F.A. Engineering increased thermostability in the GH-10 endo-1,4-ß-xylanase from Thermoascus aurantiacus CBMAI 756. International Journal of Biological Macromolecules. 2016. V. 93A. P. 20-26.

123 Ruller R., Alponti J., Deliberto L.A., Zanphorlin L.M., Machado C.B., Ward R.G. Concommitant adaptation of a GH11 xylanase by directed evolution to create an alkalitolerant thermophilic enzyme. Protein Engineering, Design & Selection. 2014. V. 27(8). P. 255-262.

124 Xie H.F., Flint J.E., Vardakou M., Lakey J.H., Lewis R.J., Gilbert H.J., Dumon C.

Probing the structural basis for the difference in thermostability displayed by family 10

125 Zhang H., Li J., ^Wang J., Yang Y-^Wu M-i Determinants for the improved xylanase. Journal of Molecular Biology. 2006. P. 157-167.

thermostability of a mesophilic family 11 xylanase predicted by computational methods. Biotechnology for Biofuels. 2014. V. 7(3). P. 1-10.

126 Basheer S.M., Chellappan S. Bioresources and bioprocess in biotechnology. Enzyme engineering. Singapore: Springer. 2017. P. 151-168.

127 Pucci F., Rooman M. Physical and molecular bases of protein thermal stability and cold adaptation. Current Opinion in Structural Biology. 2017. V. 42. P. 117-128.

128 Sammond D.W., Kastelowitz N., Himmel M.E., Yin H., Crowley M.F., Bomble Y.J., Comparing residue clusters from thermophilic and mesophilic enzymes reveals adaptive mechanisms. PLoS One. 2016. DOi 11:e0145848.

129 Goldstein R.A. Amino-acid interactions in psychrophiles, mesophiles, thermophiles, and hyperthermophiles: insights from the quasi-chemical approximation. Protein Sci. 2007. V. 16. P. 1887-1895.

130 Chen J., Lu Z., Sakon J., Stites W.E. Increasing the thermostability of staphylococcal nuclease: implications for the origin of protein thermostability. J. Mol. Biol. 2000. V. 303. P. 125-130.

131 Oda K., Kinoshita M. Physicochemical origin of high correlation between thermal stability of a protein and its packing efficiency: a theoretical study for staphylococcal nuclease mutants. Biophys Physicobiol. 2015. V. 12. P. 1-12.

132 Dorra A. et al. Improvement of Trichoderma reesei xylanase II thermal stability by serine to threonine surface mutations. International Journal of Biological Macromolecules. 2015. V 72. P. 163-170.

133 Wang J., Tan Z., Wu M., Li J., Wu J. Improving the thermostability of a mesophilic family 10 xylanase, AuXyn10A, from Aspergillus usamii by in silico design. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2014. DOi 10.1007/s10295-014-1463-y.

134 Ge M., Xia X.Y., Pan X.M. Salt bridges in the hyperthermophilic protein Ssh10b are resilient to temperature increases. J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 31690-31696.

135 Thomas A.S., Elcock A.H. Molecular simulations suggest protein salt bridges are

uniquely suited to life at high temperatures. J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 2208136 Baj ^W., Zhou C., Xue Y., Huang C.H., Guo R.T. Three-dimensional structure of an

alkaline xylanase Xyn11A-LC from alkalophilic Bacillus sp. SN5 and improvement of

its thermal performance by introducing arginines substitutions. Biotechnol. DOI

10.1007/s10529-014-1512-7.

137 Karshikoff A., Ladenstein R. Ion pairs and the thermotolerance of proteins from hyperthermophiles: a "traffic rule'' for hot roads. Trends Biochem Sci. 2001. V. 26. P. 550-556.

138 Xiao S., Patsalo V., Shan B., Bi Y., Green D.F. Raleigh D.P. Rational modification of protein stability by targeting surface sites leads to complicated results. Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. V. 10. P. 11337-11342.

139 Pezzullo M., Del Vecchio P., Mandrich L., Nucci R., Rossi M., Manco G. Comprehensive analysis of surface charged residues involved in thermal stability in Alicyclobacillus acidocaldarius esterase 2. Protein Eng. Des Sel. 2013. V. 26. P. 47-58.

140 Gribenko A.V., Patel M.M., Liu J., McCallum S.A., Wang C., Makhatadze G.I. Rational stabilization of enzymes by computational redesign of surface charge-charge interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. V. 106. P. 2601-2606.

141 Yip K.S. The structure of Pyrococcus furiosus glutamate dehydrogenase reveals a key role for ion-pair networks in maintaining enzyme stability at extreme temperatures. Structure. 1995. V. 3. P. 1147-1158.

142 Jonsdottir L.B. The role of salt bridges on the temperature adaptation of aqualysin I, a thermostable subtilisin-like proteinase. Biochim. Biophys. Acta. 2014. P. 2174-2181.

143 Irfan M., Gonzalezb C.F., Razaa S., Rafiqa M., Hasana F., Khana S., Shah A. Improvement in thermostability of xylanase from Geobacillus thermodenitrificans C5 by site directed mutagenesis. Enzyme and Microbial Technology. 2018. V. 111. P. 3847.

144 Lanzarotti E., Biekofsky R.R., Estrin D.A., Marti M.A., Turjanski A.G. Aromatic-aromatic interactions in proteins: beyond the dimer. J. Chem. Inf. Model. 2011. V. 51. P. 1623-1633.

145 Madhusudan M.K., Mahalakshmi R. Implications of aromatic-aromatic interactions:

146 Mahanta P., Bhardwaj A., Reddy V.S,., Ramakumar S. Role „of long-range aromatic from protein structures to peptide models. Protein Sci.2015. V. 24. P. 1920-1933.

clique and community in protein stability. BioRvix. 2018.

147 Gromiha M.M., Thomas S., Santhosh C. Role of cation-p interactions to the stability of thermophilic proteins. Prep. Biochem. Biotechnol. 2002. V. 32. P. 355-362.

148 Folch B., Dehouck Y., Rooman M. Thermo- and mesostabilizing protein interactions identified by temperature-dependent statistical potentials. Biophys. J. 2010. V. 98. P. 667-677.

149 Prajapati R.S., Sirajuddin M., Durani V., Sreeramulu S., Varadarajan R. Contribution of cation-p interactions to protein stability. Biochemistry. 2006. V. 45. P. 15000-15010.

150 Tang M.A., Motoshima H., Watanabe K. Cold adaptation: structural and functional characterizations of psychrophilic and mesophilic acetate kinase. Protein J. 2014. V. 33. P. 313-322.

151 Pecher P., Arnold U. The effect of additional disulfide bonds on the stability and folding of ribonuclease A. Biophys. Chem. 2009. V. 141. P. 21-28.

152 Bagarolo M.L., Porcelli M., Martino E., Feller G., Cacciapuoti G. Multiple disulfide bridges modulate conformational stability and flexibility in hyperthermophilic archaeal purine nucleoside phosphorylase. Biochim. Biophys. Acta. 2015. P. 1458-1465.

153 Jo B.H., Park T.Y., Park H.J., Yeon Y.J., Yoo Y.J., Cha H.J. Engineering de novo disulfide bond in Bagarolo bacterial a-type carbonic anhydrase for thermostable carbon sequestration. Sci Rep. 2016. V. 6. P. 29322.

154 Niu C., Zhu L., Xu X., Li Q. Rational design of disulfide bonds increases thermostability of a mesophilic 1,3-1,4-b-glucanase from Bacillus terquilensis. PLOS ONE. 2016. DOi 11:e0154036.

155 Dick M., Weiergraber O.H., Classen T., Bisterfeld C., Bramski J., Gohlke H., Pietruszka J. Trading off stability against activity in extremophilic aldolases. Sci. Rep. 2016. Doi 6:17908.

156 Siddiqui K.S., Poljak A., Guilhaus M., Feller G., D'Amico S., Gerday C., Cavicchioli R. Role of disulfide bridges in the activity and stability of cold-active alpha amilase. J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 6206-6212.

157 Ogawa K. Roles of a short connecting disulfide bond in the stability and function of

psychrophilic Shewanella violacea cytochrome c (5). Extremophiles. 2007. V. 11. P.

158 Feng(T., Daiwen C., Bing Y., Yuheng L., Ping Z., Xiangbing M., Jie Y., Jun H.

Improving the thermostability of Trichoderma reesei xylanase 2 by introducing disulfide bonds. Electronic Journal of Biotechnology. 2017. V. 26. P. 52-59.

159 Turunen O., Etuaho K., Fenel F., Vehmaanperä J., Wu X., Rouvinen J., Leisola M. A combination of weakly stabilizing mutations with a disulfide bridge in the alpha-helix region of Trichoderma reesei endo-1,4-beta-xylanase II increases the thermal stability through synergism. J. Biotechnol. 2001. V. 88(1). P. 37-46.

160 Die H., Jianfang L., Qin W., Jia Z., Jianqing C., Minchen W. Improved Temperature Characteristics of an Aspergillus oryzae GHF11 Xylanase, by In Silico Design and Site-directed Mutagenesis. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2016. V. 21. P. 704711. DOi 10.1007/s12257-016-0339-6.

161 Gruber K., G. Kintschar M., Hayn A., Schlacher W., C. Kratky. Thermophilic xylanase from Thermomyces lanuginosus: High-resolution X-ray structure and modeling studies. Biochem. 1998. V. 37. P. 13475-13485.

162 Gao S.J., Wang J.Q., Wu M.C., Zhang H.M., Yin X., Li J.F. Engineering hyper-thermostability into a mesophilic family 11 xylanase from Aspergillus oryzae by in silico design of N-terminus substitution. Biotechnol. Bioeng. 2013. V. 110. P. 10281038.

163 Cheng Y.S., Chen C.C., Huang C.H., Ko T.P., Luo W.H., Huang J.W., Liu J.R., Guo R.T. Structural analysis of a glycoside hydrolase family 11 xylanase from Neocallimastixpatriciarum. J. Biol. Chem. 2014. V. 289. P. 11020-11028.

164 Hu H., Chen K., Li L., Long L., Ding S. Characterization of the wild-type and truncated forms of a neutral GH10 xylanase from Coprinus cinereus: roles of C-terminal basic amino acid-rich extension in its SDS resistance, thermostability and activity. J. Microbiol. Biotechnol. 2017. P.775-784. DOi 10.4014/jmb.1609.09011

165 Rafaela Z.V., Tiago A.M.cImpact of the removal of N-terminal non-structured amino acids onactivity and stability of xylanases from Orpinomyces sp. PC-2. International Journal of BiologicalMacromolecules. 2017. DOi 10.1016/j.ijbiomac.

166 Siddiqui K.S. Defying the activity-stability trade in enzymes: taking advantage of

entropy to enhance activity and thermostability. Crit. Rev. Biotechnol. 2016. V. 3. P. 1167 K^rshiko A., Nilsson L., Ladenstein R. Rigidity versus flexibility: the dilemma of

understanding protein thermal stability. FEBS J. 2015. V. 282. P. 3899-3917.

168 Chiuri R. Exploring local exibility/rigidity in psychrophilic and mesophilic carbonic anhydrases. Biophys J. 2009. V. 96. P. 1586-1596.

169 Isaksen G.V., Aqvist J., Brandsdala B.O. Enzyme surface rigidity tunes the temperature dependence of catalytic rates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. P. 7822-7827.

170 Wenhan Y., Yongzhi Y., Lingdi Z., Hang X., Xiaojing G., Xu Y., Bing D., Yunhe C. Improved thermostability of an acidic xylanase from Aspergillus sulphureus by combined disulphide bridge introduction and proline residue substitution. Scientific Reports. 2017. V. 7. P. 1587. D0i:10.1038/s41598-017-01758-5.

171 Dagan S., Hagai T., Gavrilov Y., Kapon R., Levy Y., Reich Z. Stabilization of a protein conferred by an increase in folded state entropy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P. 10628-10633.

172 Gavrilov Y., Dagan S., Levy Y. Shortening a loop can increase protein native state entropy. Proteins. 2015. V. 83. P. 2137-2146.

173 Boone C.D., Rasi V., Tu C., McKenna R. Structural and catalytic effects of proline substitution and surface loop deletion in the extended active site of human carbonic anhydrase II. FEBS J. 2015. V. 282. P. 1445-1457.

174 Feng X., Tang H., Han B., Zhang L., Lv B., Li C. Engineering the thermostability of P-glucuronidase from Penicillium purpurogenum Li-3 by loop transplant. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016.

175 Kovacic F., Mandrysch A., Poojari C., Strodel B., Jaeger K.E. Structural features determining thermal adaptation of esterases. Protein Eng. Des Sel. 2016. V. 29. P. 6576.

176 Bellissent-Funel M.C. Water determines the structure and dynamics of proteins. Chem. Rev. 2016. V. 116. P. 7673-7697.

177 Glass D.C., Krishnan M., Nutt D.R., Smith J.C. Temperature dependence of protein dynamics simulated with three different water models. Journal of Chemical Theory and computation. V. 6(4). P. 1390-1400. D0i:10.1021

178 Sterpone F., Bertonati C., Briganti G., Melchionna S. Water around thermophilic proteins: the role of charged and apolar atoms. J. Phys. Condens. Matter. 2010. V 22. P. 284113.

179 Mou Z., Ding Y., Wang X., Cai Y. Comparison of protein-water interactions in psychrophilic, mesophilic, and thermophilic Fe-SOD. Protein Pept. Lett. 2014. V. 21. P. 578-583.

180 Paredes D.I., Watters K., Pitman D.J. Comparative void-volume analysis of psychrophilic and mesophilic enzymes: Structural bioinformatics of psychrophilic enzymes reveals sources of core flexibility. BMC Struct. Biol. 2011. V. 11. P. 42.

181 Aissaoui N., Landoulsi J., Bergaoui L. Catalytic activity and thermostability of enzymes immobilized on silanized surface: In uence of the crosslinking agent. Enyzme and Microbial Technology. 2013. V. 52. P. 336-343.

182 Mateo C., Palomo J. M., Fernandez-Lorente G. Improvement of enzyme activity, sta bility and selectivity via immobilization techniques. Enyzme and Microbial Technology. 2007. V. 40. P. 1451-1463.

183 Brady D., Jordaan J. Advances in enzyme immobilisation. Biotechnology Letters. 2009. V. 31. P. 1639-1650.

184 Chiyanzu I., Cowan D.A., Burton S.G. Immobilization of Geobacillus pallidus RAPc8 nitrile hydratase (NHase) reduces substrate inhibition and enhances thermostability. Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic. 2010. V. 63. P. 109-115.

185 Tang C., Saquing C.D., Sarin P.K. Nano brous membranes for single-step immobilization of hyperthermophilic enzymes. Journal of Membrane Science. 2014. V. 472. P. 251-260.

186 Cakmak U., Ertunga N.S. Gene cloning, expression, immobilization and characterization of endo-xylanase from Geobacillus sp. TF16 and investigation of its industrial applications. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2017. https://doi. org/10.1016/j.molcatb.2017.01.016.

187 Heinen P. R., Pereira M.G., Rechia C.G.V. Immobilized endo-xylanase of Aspergillus tamarii Kita: An interesting biological tool for production of xylooligosaccharides at high temperatures. Process Biochemistry. 2010. V. 53. P. 145-152.

188 Jampala P., Preethi M., Ramanujam S. Immobilization of levan-xylanase nanohybrid on

an alginate bead improves xylanase stability at wide pH and temperature. International

189 Kumar ,S.,, Haq I., Prakash J. Improved, enzyme ^properties upon glutaraldehyde cross-

Journal of BiologicalMacromolebules. 2017: V. 95. P. 843-849. & 7

linking of alginate entrapped xylanase from Bacillus licheniformis. International Journal of BiologicalMacromolecules. 2017. V. 98. P. 24-33.

190 Chen M., Zeng G., Xu P. How do enzymes "Meet" nanoparticles and nanomaterials? Trends in biochemical sciences. 2017. V. 42(11). P. 914-930.

191 Liu M., Dai X., Guan R.. Immobilization of Aspergillus niger xylanase A on Fe304-

coated chitosan magnetic nanoparticles for xylooligosaccharide preparation. Catalysis Communications. 2014. V. 55. P. 6-10.

192 Fukura K., So Y., Young J.. Jeong C. Enhancing the activity of Bacillus circulans xylanase by modulating the flexibility of the hinge region. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2014. DOi 10.1007/s10295-014-1454-z.

193 Qin L., Baoguo S., Ke X., Chao T., Youqiang X., Liangjun L.,Xiuting L. Improving special hydrolysis characterization into Talaromycesthermophilus F1208 xylanase by engineering of N-terminal extensionand site-directed mutagenesis in C-terminal. International Journal of Biological Macromolecules. 2017. V. 96. P. 451-458.

194 Xiuyun W., Zhennan T., Xukai J., Qun Z., Lushan W. Enhancement in catalytic activity of Aspergillus niger XynB by selective site-directed mutagenesis of active site amino acids. ApplMicrobiol Biotechnol. 2017. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8607-8.

195 Tahir T.A., Durand A., Gebruers K., Roussel A.,Williamson G., Juge N. Functional importance of Asp37 from a family 11 xylanase in the binding to two proteinaceous xylanase inhibitors from wheat. FEMSMicrobiol. Lett. 2004. V. 239. P. 9-15.

196 Bourgois T.M., Nguyen D.V., Sansen S., Rombouts S., Belien T., Fierens K., Raedschelders G., Rabijns A., Courtin C.M., Delcour J.A., Van Campenhout S., Volckaert G. Targeted molecular engineering of a family 11 endoxylanase to decrease its sensitivity towards Triticum aestivum endoxylanase inhibitor types. J. Biotechnol. 2007. V. 130. P. 95-105.

197 Aslanidis C., de Jong P.J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. P. 6069-6074.

198 Sambrook J., Russell D. Molecular cloning, a laboratory manual . Cold Spring Harbor Laboratory. 2001.

199 Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. of Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

200 Aleksenko A., Makarova N., Nikolaev .I, Clutterbuck A. Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene. Current Genetics. 1995. V. 28. P. 474-478.

201 Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва: Мир. 544 с.

202 Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars . Journal of Biological Chemistry. 1952. V. 195. P. 19-23.

203 Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биокнверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебн.пособие. Москва: Изд-во МГУ. 1995. 224с.

204 Privalov P.L., Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 1986. V. 131. P. 4-5.

205 Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. Курс лекций. Москва: Книжный Дом Университет. 2002. C. 376.

206 Vieille C., Zeikus G.J. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. MicrobiolMol Biol Rev. 2001. V. 65(1). P. 1-43.

207 Ooi T., Oobatake M., Nemethy G. Accessible surface areas as a measure of the thermodynamic parameters of hydration of peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 3086.

208 Vila J., Williams R.L., Velasquez M. Empirical solvation models can be used to differentiate native from near-native conformations of dovine hancreatic trypsin nhibitor. Proteins. 1991. V. 10. P. 199.

209 Wesson L., Eisenberg D. Atomic solvation parameters applied to molecular dynamics of proteins in solution. Protein Science. 1992. V. 1. P. 227.

210 Zheng F., Huang J., Hu H. N- and C-terminal truncations of a GH10 xylanase significantly increase activity and thermostability but decrease SDS resistance. Appl.

211 Mongol iBSgcAoSlOm to 0EF?!??35 (?5thermostable fungal GH10 xylanase, importance of N-terminal amimo acids. Biotech. & Bioengin. 2015. DOi

10.1002/bit.25533.