Антимикробные факторы в контроле внешней и внутренней среды мясных мух: Diptera, Calliphoridae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.05, кандидат наук Кругликова, Анастасия Анатольевна

• Кругликова, Анастасия Анатольевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Кругликова, Анастасия Анатольевна

Оглавление

Оглавление

Введение

Глава I. Литературный обзор

1.1. Иммунная система насекомых

1.1.1. Клеточный иммунный ответ

1.1.1.1. Фагоцитоз

1.1.1.2. Образование узелков и капсул

1.1.2. Гуморальный иммунный ответ

1.1.2.1 .Антимикробные пептиды

1.1.2.2. Коагуляция гемолимфы

1.1.2.3. Фенолоксидазная система

1.1.2.4. Эпителиальный иммунный ответ

1.2. Личиночная терапия

I.2.1. Антибактериальные свойства экзосекрета

Глава II. Материалы и методы исследования

II. 1. Биологический материал

II. 1.1. Краткая характеристика основного модельного объекта исследования Lucilia

sericata

II. 1.2. Методика лабораторного содержания

II.2. Методы

11.2.1. Инфицирование насекомых

II.2.1.1. Получение бактериальной суспензии для иммунизации

11.2.2. Сбор гемолимфы

11.2.3. Сбор экзосекрета

11.2.4. Анализ антимикробной активности

11.2.5. Анализ фунгицидной активности

11.2.6. Методы концентрации и очистки исследуемых образцов

11.2.6.1. Метод твердофазной экстракции

11.2.6.2. Хроматографическое фракционирование

11.2.7. Масс-спектрометрия

11.2.8. Методы исследования живых гемоцитов

11.2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных

Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

III. 1. Фунгицидная активность гемолимфы личинок Lucilia sericata

Ш.2.Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilla sericata, Calliphora

vicina, Musca domestica

111.2.1. Фунгицидная активность экзосекрета Lucilia sericata

111.2.2. Фунгицидная активность экзосекрета Calliphora vicina

111.2.3. Фунгицидная активность экзосекрета Musca domestica

111.3. Фунгицидная активность фракционированного экзосекрета личинок Lucilia sericata

111.3.1. Фунгицидная активность гидрофобной фракции экзосекрета

111.3.2. Фунгицидная активность хроматографических фракций экзосекрета

111.4. Выводы

Глава IV. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia

sericata

IV. 1. Антибактериальная активность цельных экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia

sericata

IV.2. Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы

личинок Lucilia sericata

IV.3. Антибактериальная активность хроматографических фракций экзосекрета и

гемолимфы личинок Lucilia sericata

IV.4. Выводы

Глава V. Масс-спектрометрический анализ

Глава VI. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata

VI. 1. Основные типы гемоцитов Lucilia sericata

VI.2. Иммунологические реакции гемоцитов

VI.3. Выводы

Глава VII. Обсуждение

VII. 1. Фунгицидная активность гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata

VII.2. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

VII.3. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata

Заключение

Выводы

Список литературы

/

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антимикробные факторы в контроле внешней и внутренней среды мясных мух: Diptera, Calliphoridae»

Введение

В естественных местообитаниях основными конкурентами личинок мух являются микроорганизмы, грибы и бактерии. Для личинок мясных мух характерно внекишечное пищеварение, при котором питательный субстрат подвергается предварительной обработке пищеварительными ферментами (Виноградова, 1984).

Поскольку среда обитания личинок мух крайне агрессивна, экзосекрет этих насекомых, по всей видимости, должен содержать антимикробные и фунгицидные соединения. Некоторые виды насекомых, как и позвоночные (Weinbergl et al., 1998; Selsted et al., 1992), выделяют на поверхность слизистых оболочек антимикробные пептиды. Так у дрозофилы антимикробные пептиды обнаружены в нескольких видах эпителия, которые потенциально контактируют с окружающей средой; к ним относятся респираторный, пищеварительный, репродуктивный тракты, мальпигиевы сосуды и ротовые органы (Tzou et al., 2000). Для растений и грибов характерно использование вторичных метаболитов в качестве защиты от вредителей и патогенов, а также в борьбе с конкурентами (Seigler, 1999; Баринова и др., 2008). Для животных такие механизмы менее характерны. Но известно, что часть азота выделяется личинками мясных мух в форме аллантоина, образующегося в результате расщепления мочевой кислоты (Виноградова, 1984), который увеличивает значение рН, что косвенным образом подавляет развитие целого ряда микроорганизмов (Thomas et al., 1999).

Антимикробные пептиды, как известно, являются важнейшим элементом в иммунной системе насекомых, обеспечивая высокую устойчивость к широкому спектру патогенов и паразитов (Bulet et al., 1999; Hoffmann, 1995). Большинство из них индуцибельны, характеризуются небольшим молекулярным весом и являются катионными молекулами (Hoffmann, 1995). Большая часть антимикробных пептидов синтезируется клетками жирового тела и выделяется в гемолимфу (Trenszec et Faye, 1988). Известно, что для дрозофилы, так же как и для млекопитающих, характерна тканеспецифичная продукция антимикробных пептидов (Tzou et al., 2000). Однако, у личинок L. sericata подобные особенности иммунного ответа до сих пор не были исследованы.

Мухи вида L. sericata имеют огромное экономическое и клиническое значение, поскольку являются первичными факультативными паразитами, вызывающими кожные миазы прежде всего у овец несмотря на то, что могут поражать и других диких и домашних животных и человека (Hall et Hall, 1995). Однако, эта особенность жизненного цикла личинок мух может быть использована человеком в собственных интересах. На

сегодняшний день огромное количество публикаций посвящено выдающимся эффектам личиночной терапии, главные из которых очищение, дезинфекция и быстрое заживление хронических ран, зачастую не поддающихся лечению методами традиционной медицины (Nigam et al., 2006а,b; Sherman, 2003; Whitaker et al., 2007). Достоверно известно, что личинки эффективно очищают раны, зараженные таким рпасным патогеном, как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA) (Jaklic et al., 2008; Steenvoorde et Jukema, 2004). Также показана активность экзосекрета личинок в отношение MRSA в экспериментах in vitro (Bexfield et al., 2004; Kerridge et al., 2005; Thomas et al., 1999). Метициллин-устойчивый штамм Staphylococcus aureus является возбудителем одной из госпитальных инфекций и относится к группе так называемых «antibiotic-resistant superbugs» (Kerridge et al., 2005), т.е. к группе бактерий, устойчивых почти ко всем ныне существующим антибиотикам. Поэтому эффективность хирургических личинок и компонентов, синтезируемых ими, в отношение MRSA, имеет огромное значение.

Кроме того, личинки многих мух, особенно личинки Calliphoridae, питаются на разлагающихся субстратах и являются пассивными переносчиками огромного количества патогенных бактерий (Fischer et al., 2004; Habeeb et Mahdi, 2012; Paraluppi et al., 1996). Поэтому исследование антимикробных компонентов у разных видов мух представляется особенно актуальным.

Цель работы: Изучение факторов гуморального и клеточного иммунитета личинок Lucilia sericata и их роли в контроле внешней и внутренней среды.

Для выполнения целей работы были поставлены следующие задачи:

• Исследование состава и титра антибактериальных компонентов в экзосекрете и гемолимфе иммунизированных личинок Lucilia sericata.

• Исследование состава и титра фунгицидных компонентов в гемолимфе и экзосекрете личинок Lucilia sericata, а также в экзосекрете личинок Musca domestica и Calliphora vicina.

• Исследование клеточных защитных механизмов личинок Lucilia sericata: описание основных типов гемоцитов; изменение состава гемоцитов в ходе развития; иммунологические реакции гемоцитов.

Автор выражает благодарность за помощь и содействие в проведении экспериментов и написании работы научному руководителю Сергею Ивановичу Чернышу, сотрудникам лаборатории биофармакологии и иммунологии насекомых: Тулину Д. В., Яковлеву А. Ю., Гордя Н. А., Несину А. П., Симоненко Н. П., Кинд Т. В.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федеральной программы поддержки ведущих научных школ (проект НШ-3332.2010.4) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Глава I. Литературный обзор 1.1. Иммунная система насекомых

Насекомые, достигшие наивысшего уровня эволюционного развития среди беспозвоночных животных, имеют сложную систему защиты от патогенных микроорганизмов. Покровы стенки тела, кишки и трахей являются надежной механической преградой для проникновения паразитов из окружающей среды в полость тела насекомого. Однако в случае повреждения покровов чужеродные объекты могут попадать в гемолимфу. Попавшие в гемолимфу патогены становятся мишенью для клеточных и гуморальных факторов сложной координированной системы защиты.

В основе клеточного иммунитета лежат реакции, реализуемые клетками гемолимфы насекомых - гемоцитами. Ключевым эффекторным звеном гуморального иммунитета являются цитотоксические молекулы, образующиеся в ходе реакций, опосредуемых ферментом - фенолоксидазой, а также целый спектр антимикробных пептидов.

1.1.1. Клеточный иммунный ответ

Основными структурными элементами, участвующими в формировании клеточного иммунного ответа насекомых, являются клетки кроветворной ткани, перикардиальные клетки, фиксированные и свободноживущие клетки гемолимфы -гемоциты. Гемоциты представляют собой гетерогенную популяцию клеток, принимающих активное участие в иммунных реакциях. На сегодняшний день существует множество классификаций гемоцитов насекомых и есть мнение, что единой системы деления гемоцитов на группы нет (Тулин, Чага, 2003). Традиционно у насекомых выделяют шесть типов гемоцитов: прогемоциты, плазматоциты, гранулоциты, сферулоциты, цистоциты и эноцитоиды; эта классификация основана на исследованиях гемлимфы чешуекрылых (Gupta, 1985; Lackie, 1988; Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).

Прогемоциты являются базовым типом клеток, из которых дифференцируются все остальные гемоциты (Lackie, 1988).

Плазматоциты представляют собой чаще всего агранулярные клетки, обычно специализированные на выполнении фагоцитарных функций. Практически все эти клетки содержат лизосомальные ферменты. В некоторых плазматоцитах выявляется пероксидазная и эстеразная активность, а у представителей отрядов Odonata и Coleóptera -

еще и фенолоксидазная активность. Определенная часть этих клеток способна синтезировать лектины (Lackie, 1988).

Гранулоциты - клетки со специфическими включениями в цитоплазме метаболического характера. Эти клетки высвобождают содержимое гранул, например, в процессе капсулообразования. Доказанной функцией гранулярных гемоцитов бабочек является фагоцитоз, кроме того они первыми контактируют с чужеродным объектом в гемолимфе и секретируют содержимое своих гранул (Ribeiro et Brehelin, 2006). У личинок Calliphoridae настоящих гранулярных клеток не обнаружено, поскольку включения плазматоцитов имеют доказанное катаболическое происхождение (Тулин, Чага, 2003; Кинд, 2007).

Сферулоциты - большие округлые клетки, которые содержат небольшое количество крупных включений, сферул. О функциях этих клеток ничего неизвестно (Lackie, 1988; Ribeiro et Brehelin, 2006).

Чаще всего к группе эноцитоидов относят клетки, содержащие фенолоксидазу (Ribeiro et Brehelin, 2006). У дрозофилы это хорошо описанные кристаллические клетки (Lemaitre et Hoffmann, 2007).

Цистоциты иногда описывают как коагулоциты. Они содержат большое количество гранул, которые активно высвобождаются при препарировании. Возможно, это определенный тип гранулоцитов, принимающих участие в коагуляции гемолимфы (Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).

Результатом гемоцитарных защитных реакций является изоляция «чужого» от внутренней среды организма в результате фагоцитоза либо образования многоклеточных узелков и капсул вокруг патогена.

1.1.1.1. Фагоцитоз

Фагоцитоз является первым механизмом защиты насекомых от патогенов. Он является специализированной формой рецептор-опосредованного эндоцитоза. Фагоцитироваться могут разнообразные нерастворимые субстанции, от инертных частичек (тушь, латекс) до мелких биологических объектов, таких как бактерии.

Фагоцитирование чужеродной частицы - это многоступенчатый процесс. Первым этапом фагоцитоза является аггрегация гемоцитов в месте повреждения. Далее происходит прикрепление фагоцита к частице и ее распознавание. Этап распознавания является ключевым в формировании иммунного ответа. При встрече с чужеродным агентом гемоциты могут использовать весь «арсенал» рецепторов, способных связываться с инородными телами, в том числе и рецепторы, экспрессированные после индукции

какого-либо сигнала. Распознавание антигенов осуществляется при помощи специфических рецепторов к основным микробным детерминантам, расположенных на поверхности клетки, либо гуморальных факторов, выполняющих роль опсонинов. В качестве опсонинов у насекомых были идентифицированы следующие соединения: лектины, гемолин (входит в состав иммуноглобулинового семейства), ЛПС-связывающий белок, белок, распознающий грамотрицательные бактерии, белок, распознающий пептидогликаны и тиоэфир-содержащий белок а-ТЕР1, близкий к а2-макроглобулину позвоночных (Bulet et al., 1999; Schmidt et al., 2001). Исследования показали, что некоторые из этих факторов действительно усиливают фагоцитоз, образование узелков и капсул. Например, у Anopheles gambiae а-ТЕР1 связывается с грамотрицательными бактериями, и подавление этого фактора с помощью интерферирующей РНК приводит к снижению фагоцитоза бактерий гемоцитами (Lavine, 2002). Связывание антигена с рецептором запускает процесс передачи сигнала в ядро иммуноцита. Следствием этого является образование клеткой псевдоподий, поглощение чужеродной частицы и образование фагосомы (Hoffman et Lemaitre, 2007). Механизм, по которому идет уничтожение патогена внутри фагосомы, до конца не изучен. Есть основания полагать, что поглощенные бактерии элиминируются под действием активных соединений кислорода и азота, выделяемых в фагосому.

1.1.1.2. Образование узелков и капсул

Более сложным механизмом изоляции патогена является образование капсул, или инкапсуляция. Формирование капсул может происходить также вокруг собственных поврежденных тканей насекомого - процесс, лежащий в основе регенерации. Этот процесс осуществляется при согласованном участии нескольких типов гемоцитов. Различают две формы инкапсуляции: 1) образование узелков - многоклеточных образований, способных изолировать сразу несколько мелких патогенов, например бактерии; 2) формирование капсул - многослойных скоплений гемоцитов, изолирующих объекты, размер которых превышает размер гемоцита: простейших, многоклеточных паразитов, личинки и яйца паразитоидов (Hoffman et Lemaitre, 2007). Принципиальных различий между этими процессами нет. Сигнальными молекулами, запускающими образование капсулы, являются микробные детерминанты типа липополисахаридов, зимозана, ламинарина или молекул гликополипротеинов (Lackie, 1988). Как при образовании узелков, так и при образовании капсул гемоцитами формируется псевдоткань, изолирующая проникший в гемоцель объект.

Процесс образования капсулы изучен достаточно полно (Götz, 1986). Распознавание «чужого» инициирует переход гемоцитов из взвешенного состояния в прикрепленное, в котором возможно присоединение гемоцитов к патогену и другим гемоцитам. Клетками, контактирующими непосредственно с чужеродной поверхностью, являются гранулоциты. При контакте гранулоцитов с бактериями происходит лизис и дегрануляция клеток, в результате выделенный материал прилипает к мишенной поверхности, а дегранулировавшие клетки образуют агрегаты. Они выделяют хемоаттрактанты, вызывающие появление адгезионных молекул на поверхности плазматоцитов (Lavine, Strand, 2002). Некоторые хемотаксические молекулы, привлекающие плазматоциты, известны (Clark et al., 1997). Каркас капсулы формируется несколькими слоями сильно уплощенных плазматоцитов. Образование капсулы заканчивается появлением на ее поверхности слоя, подобного базальной мембране (Lavine, Strand, 2002). Он формируется монослоем нативных гранулоцитов, прикрепившихся к капсуле на конечном этапе ее образования. Сигнальные молекулы, синтезируемые плазматоцитами для привлечения гранулоцитов, не известны.

Капсула может выполнять функции механического барьера и ограничивать развитие патогена. Как правило, проникшие в гемоцель насекомого организмы погибают в ее пределах. Внутренний слой капсулы иногда меланизируется. Было показано, что толщина стенки капсулы зависит от количества содержащегося в ней меланина. Введение ингибиторов реакций синтеза меланина ведет к уменьшению толщины капсульной стенки (Hoffmann, 1995). Гибель патогена может быть обусловлена как наличием свободнорадикальных соединений в составе меланотической капсулы, так и образованием высокореакционных соединений в виде промежуточных продуктов реакций в процессе меланизации (Nappi et Christensen, 2005). Антимикробные пептиды, синтезируемые гемоцитами внутрь капсулы, также способны оказывать токсическое действие на патоген (Lavine, Strand, 2002).

1.1.2. Гуморальный иммунный ответ

Иммунная система насекомых напоминает систему врожденного иммунитета позвоночных животных. Механизм распознавания «чужого» как у позвоночных, так и у насекомых основан на детектировании консервативных структур микроорганизмов, которые принято называть патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП) (Medzhitov et Janeway, 2000). В организме насекомых существует определенный набор рецепторов, распознающих ПАМП (ПРР - паттерн-распознающие рецепторы). Большинство известных ПАМП - это компоненты наружной мембраны и клеточной

стенки бактерий (липополисахариды, пептидогликаны) или клеточной стенки грибов ф-1,3-глюкаиы), вирусная двунитевая РНК или фрагменты этих молекул (Med/hitov et Janevvay, 2000). ПАМП обладают некоторыми особенностями, необходимыми для их иммуногенной активности. Они продуцируются только микроорганизмами, а не клетками хозяина, и являются необходимыми для выживания и патогенное™ компонентами (Medzhitov et Janeway, 2000). Иммунные клетки могут связываться с ПАМП как напрямую, так и опосредовано через гуморальные ПРР. к которым относятся лектины. гемолин, ЛПС-связывающий белок, белок, распознающий пептидогликаны, белок, распознающий грамотрицательных бактерий и др. (Hoffman et Lemaitre, 2007). Способность этих молекул связываться с ПАМП с одной стороны и клеточными Г1РР - с другой обусловливает их функции: агрегацию паразитов, привлечение гемоцитов в очаг инфекции, облегчение фагоцитирования гемоцитами патогенных микроорганизмов и их опсонизацию, запуск синтеза цитотоксических молекул клетками жирового тела (Hoffman et Lemaitre, 2007).

К группе соединений, обеспечивающих гуморальную защиту, оi носят различные ферменты, которые могут запускать каскадные реакции, такие как коагуляция гемолимфы (Bidla et al., 2005), репарация повреждений, активация гемоцитов (Lavine et Strand, 2002) и детоксикация продуктов жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести и тс вещества, которые не обладают ферментативной активностью, но способные участвовать в формировании иммунитета - антимикробные и фунгицидные белки, ингибиторы протеаз и др.

1.1.2.1.Антимикробные пептиды

В ответ на септическую травму насекомые продуцируют огромное количество антимикробных и фунгицидных пептидов. Большинство из них избирательно активны по отношению к различным группам микроорганизмов, грамотрицательным и грамположительным бактериям, дрожжам и простейшим грибам (Bulet et al., 1999; Chernysh, 1996). В соответствии с особенностями строения все пептидные антибиотики насекомых можно разделить на три группы: цекропины; дефензины и другие антимикробные пептиды, содержащие дисульфидные связи и пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами (пролин-богатые и глицин-богатые) (Bulet et al., 1999; Chernysh, 1996).

Цекропины

Цекропины впервые были выделены из гемолимфы куколок гигантского шелкопряда Hyalophora cecropia (Steiner et al., 1981). В дальнейшем гомологичные пептиды были выделены и охарактеризованы из гемолимфы чешуекрылых и двукрылых насекомых. Цекропины - это линейные катионные полипептиды, состоящие из 35-39 аминокислотных остатков. Молекула цекропина условно может быть разделена на полярный положительно заряженный N-концевой участок, переходящий в преимущественно гидрофобный срединный участок, соединяемый пролином и (или) глицином с амидированной С-концевой последовательностью (Holak et al., 1988). Вторичная структура представляет собой короткий неупорядоченный N-концевой участок, переходящий в амфипатическую а-спираль, которая с помощью шарнира соединена с гидрофобной С-концевой а-спиралью (Holak et al., 1988). Цекропины чешуекрылых активны как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, но не проявляют активности по отношению к эукариотическим клеткам (Boman et al., 1991; Moore et al., 1996). Известный цекропин С. vicina активен только в отношение грамотрицательных бактерий (Chernysh, 1996). Более узкий спектр действия цекропшшв двукрылых может быть объяснен наличием у этих насекомых другой группы пептидов -дефензинов, активных против грамположительных бактерий. У чешуекрылых подобных дефензинов нет, описанный у Heliothis virescens цисгеии-богатый пептид, высоко гомологичный дефензинам других насекомых, не эффективен по отношению к бактериям, однако обладает сильной фунгицидной активностью (Lamberty et al., 1999).

Дефензины насекомых и другие антимикробные пептиды, содержащие

дисульфидные связи Дефензины насекомых были открыты независимо двумя группами исследователей. В 1988 они были обнаружены в культуре эмбриональных клеток Sarcophuga peregr'ma и названы сапецины (Matsuyama et Natori 1988); в 1989 дефензины были выделены из гемолимфы личинок Phormia terranovae и получили название формицина А и В (Lambert et al., 1989). Дефензины насекомых являются катионными молекулами, состоящими из 3451 аминокислотных остатков. Для всех дефензинов характерно присутствие шести цистеиповых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика (Hoffamnn et Hetru, 1992). Молекулярная структура дефензинов насекомых представлена тремя разными доменами: гибкая N-концевая петля, центральная амфипатическая а-сгжраль и С-концевой ß-слой, сформированный двумя антипараллельными ß-тяжами (Bonmatin et al., 1992). Дефензины насекомых токсичны преимущественно для грамположительных бактерий, в отличие от дефензинов позвоночных. Дефензины были

обнаружены у представителей отрядов Díptera, Coleóptera, Hemiptera, Hymenoptera, Trychoptera, Odonata (Hoffamnn et Hetru, 1992) и Lepidoptera (Lamberty et al., 1999).

Помимо дефензинов y насекомых были обнаружены другие полипептиды, содержащие дисульфидные связи. Септическая травма индуцирует синтез дрозомицина у плодовой мушки Drosophila melanogaster (Fehlbaum et al., 1994). Этот пептид содержит 8 остатков цистеина, формирующих четыре внутримолекулярных дисульфидных мостика. Дрозомицин проявляет мощное антифунгальное действие. Ни на клетки бактерий, ни на клетки животных этот пептид не оказывает токсического эффекта. Из гемолимфы клопа Podisus maculiventris был выделен танатин, включающий 21 аминокислотный остаток, в том числе и два цистеина, формирующие один дисульфидный мостик (Fehlbaum et al., 1996). Танатин обладает широким спектром цитотоксического действия. Он токсичен для многих грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также для мицелиальных грибов.

Пептиды с высоким содержанием пролииа и аргинина

Данная группа пептидных антибиотиков широко представлена у насекомых. К этой группе относятся апидацин (Casteels et al., 1989) и абецин (Casteels et al., 1990), выделенные из гемолимфы медоносной пчелы Apis mellifera. Характерной особенностью апидацина является комбинация остатков пролина и аргинина в аминокислотной последовательности, которые формируют PRP и РР-повторы. Подобные последовательности встречаются и в пептиде из гемолимфы D. melanogaster - дрозоцине (Bulet et Hetru, 1993). К этой же группе относится пиррокорицин клопа Pyrrhocoris apterus (Cociancich et al., 1994) и лебоцин, выделенный из гемолимфы иммунизированных личинок тутового шелкопряда, Bombyx mori (Нага et Yamakawa, 1995). И дрозоцин, и пиррокорицин, и лебоцин являются гликопептидами. В отличие от пиррокорицина метальниковины - пептиды, обнаруженные в гемолимфе клопов семейства Pentatomidae, не гликозилированы и проявляют более слабую антимикробную активность (Chernysh et al., 1996). Все перечисленные пролин/глицин-богатые пептиды обладают антиграмотрицательной активностью. Однако есть пептиды, обладающие комбинированной бактерицидной и фунгицидной активностью. К ним относится мечниковин, выделенный из дрозофилы (Levashina et. al., 1995).

Недавно были описаны пролин-богатые пептиды С. vicina, не имеющие близких аналогов среди известных антимикробных пептидов насекомых. Они токсичны для грамположительных бактерий (Черныш и др., 2008). Р-пептиды в различных отрядах насекомых характеризуются значительным разнообразием структуры. Примером этому

служат метальниковины, выделенные из гемолимфы клопа Palomería prasina (Chernysh et al., 1996).

В работе, посвященной исследованию индуцибельных генов личинок Lucilia sericata, экспрессия которых во много раз усиливается под действием септической травмы, были идентифицированы открытые рамки считывания, кодирующие потенциальные пролин-богатые антимикробные пептиды (Altincicek et Vilcinskas, 2009). Они обладают некоторым сходством с дрозоцином и мечниковином дрозофилы. Эти искусственно синтезированные пептиды обладают антимикробной активностью по отношению к грамположительному M. luteus.

Пептиды с высоким содержанием глицина

У чешуекрылых глицин-богатые полипептиды представлены аттацинами (Boman, 1991). Для аттацинов характерен довольно узкий спектр антибактериальной активности, направленный против некоторых грамотрицательных бактерий, обитающих в кишечнике насекомых. Однако их активность, вероятно, может существенно увеличиваться в присутствии других антимикробных факторов, секретируемых в гемолимфу одновременно с аттацинами.

Наиболее близкий аналог аттацинов - полипептид саркотоксин II был выделен из S. peregrina (Ando et al., 1987). Колеоптерицин и холотрицин - другие глицин-богатые полипептиды были обнаружены в гемолимфе жесткокрылых насекомых (Cociancich et al.,

1994). Все эти антибиотики токсичны главным образом для грамотрицательных бактерий. Более широкий спектр антибактериальной активности, который включает также и грамположительные бактерии, характерен для гименоптецина медоносной пчелы (Casteels etal., 1993).

Еще одни глицин-богатые пептиды - диптерицины - найдены у некоторых двукрылых, в том числе у синей мясной мухи Calliphora vicina (Chernysh, 1996) и зеленой мясной мухи L. sericata (Altincicek et Vilcinskas, 2009). Диптерицины представляют собой химерические молекулы, которые состоят из пролин-богатого и глицин-богатого доменов. При этом последовательность первого домена гомологична таковой апидацина, а последовательность второго - последовательности аттацинов и особенно саркотоксину II (Cociancich et al., 1994 (b)). Диптерицины токсичны для грамотрицательных бактерий и мицелиальных грибов Neurospora crassa (Chernysh, 2000).

Фунгицидные компоненты гемолимфы насекомых

К противогрибковым веществам относятся глицин/гистидин-богатые фунгицидные белки и полипептиды: например, холотрихин из личинок Holotrichia diomphalia (Lee et al.,

1995), антифунгальный белок AFP из серой мясной мухи Sarcophaga peregrina (Iijima et

al., 1993), тенецин из Tenebrio molitor (Dae-Hee et al., 1998). Все вышеперечисленные вещества ингибируют рост Candida albicans, очень распространенного патогена человека. Однако, механизм их действия изучен недостаточно хорошо. Кроме того, гемолимфа насекомых содержит ряд фунгицидных пептидов, которые могут синтезироваться под действием септической травмы, как дрозомицин - цистеин - богатый белок (Lemaitre et al., 1996) и мечниковин - пролин-богатый полипетид (Levashina et al., 1995), выделенные из Drosophila melanogaster или танатин из клопа Podisus maculiventris (Fehlbaum et al., 1996). К тому же было показано, что существует синергизм в действии фунгицидных белков и антимикробных пептидов. Небольшое количество саркотоксина I значительно усиливает летальный эффект фунгицидного белка S. peregrina по отношению к С. albicans (Iijima et al., 1993). Сами по себе дефензины насекомых активны в отношении некоторых грибов и дрожжей, в то время как основной их мишенью являются грамположительные бактерии (Hetru et al., 1998). Но дефензин, выделенный из гемолимфы иммунизированных гусениц Heliothis virescens, гелиомицин (Lamberty et al., 1999), а также цистеин-богатый полипетид жука-носорога, скарабецин (Tomie et al., 2003), обладают преимущественно фунгицидной активностью. Аминокислотная последовательность гелиомицина обладает большим сходством с фунгицидным пептидом дрозофилы, дрозомицином, и дефензинами насекомых, и содержит шесть остатков цистеина. Искусственно синтезированные гелиомицин и скарабецин характеризуется широким спектром действия в отношении различных типов грибов. Гелиомицин проявляет активность и по отношению к С. albicans (Lamberty et al., 1999).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кругликова, Анастасия Анатольевна, 2014 год

Список литературы

1. Баринова К. В. Грибы - продуценты антибиотических веществ / К. В. Баринова, Н. В. Псурцева, Д. Ю. Власов // Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в «Наукограде»,- СПб: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2008,- 256 с. (Труды Биол. НИИ СПбГУ; Вып. 54).- С. 232-243.

2. Виноградова Е. Б. Диапауза мух и ее регуляция / Е. Б. Виноградова.- СПб: «Наука», 1991,- 256 с. (Труды Зоол. ин-та АН СССР; Т. 214).

3. Виноградова Е. Б. Мясная муха (Calliphora vicina) - модельный объект физиологических и экологических исследований / Е. Б. Виноградова,- Л.: «Наука». 1984,- 272 с. (Труды Зоол. ин-та АН СССР; Т. 118).

4. Дольник Е. Действие экзосекрета и гемолимфы личинок Calliphora vicina на рост и размножение плесневых грибов / неопубликованные данные.

5. Кинд Т. В. Агглютинация и фагоцитоз нейтральных частиц гемоцитами мясной мухи Calliphora vicina in vivo / Т. В. Кинд // Цитология.- 2005.- Т. 47, № 7.- С. 609-622.

6. Кинд Т. В. Гемоциты с различиными типами защитной реакции в онтогенезетрех видов мясных мух рода Calliphora / Т. В. Кинд // Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в «Наукограде».- СПб: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2008,- 256 с. (Труды Биол. НИИ СПбГУ; Вып. 54).

7. Тулин Д.В. Гемоциты личинки Calliphora vicina. I. Гистологический анализ / Д.В. Тулин, О.Ю. Чага // Цитология,- 2003.- Т. 45, № 10, С. 976-985.

8. Черныш С.И. Иммунная система насекомых как источник новых лекарственных средств / С.И. Черныш, Н.А. Гордя, А.П. Несин, Н.П. Симоненко, Д.В. Тулин, А.Ю. Яковлев // Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в «Наукограде».- СПб: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2008.- 256 с. (Труды Биол. НИИ СПбГУ; Вып. 54).- С. 119-126.

9. Altincicek В. Septic injury-inducible genes in medicinal maggots of the green blow fly Lucilia sericata / B. Altincicek, A. Vilcinskas // Insect Molecular Biology.- 2009.- V.18, №1.-P. 119-125.

10. Ando K. Purification of sarcotoxin II, antibacterial proteins of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvae / K. Ando, M. Okada, S. Natori // Biochemistry.- 1987,- V.26, № 1.- P.226-230.

11. Ashida M. Activation of prophenoloxidase. Release of a peptide from prephenoloxidase by the activating enzyme / M. Ashida // J.Bioch.Bioph.Commun.-1974.- V.57.- P. 1089-1095.

12. Ashida M. Biochemistry of the phenoloxidase system in insects with special reference to its activation / M. Ashida, H.I. Yamazaki // Molting and Metamorphosis.-1990.- P. 239-265.

13. Barber M. Infection by penicillin-resistant staphylococci / M. Barber, M. Rozwadowska-Dowzenko // Lancet.- 1948,- V.2.- P.641-644.

14. Barnes K. M. An assessment of the antibacterial activity in larval excretion/secretion of four species of insects recorded in association with corpses, using Lucilia sericata (Meigen) as the marker species / K. M. Barnes, D. E. Gennard, R. A. Dixon // Bulletin of entomological research.- 2010,- V. 100, № 6,- P. 635-640.

15. Baer W.S. The treatment of chronic osteomyelitis with the maggots (larva of the blowfly) / W.S. Baer// J. Bone Joint Surg.- 1931.- V.13.- P.438-475.

16. Bexfield A. Detection and partial characterisation of two antibacterial factors from the excretions/secretions of the medicinal maggot Lucilia sericata and their activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) / A. Bexfield, Y. Nigam, S. Thomas, N.A. Ratcliffe // Microbes and Infection.- 2004,- №6.- P. 1297-1304.

17. Bexfield A. The antibacterial activity against MRSA strains and other bacteria of a less than 500 Da fraction from maggot excretions/secretions Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) / A. Bexfield, E. Bond, E.C. Roberts, E. Dudley, Y. Nigam, S. Thomas, R.P Newton, N.A. Ratcliffe // Microbes and Infection.- 2008.- №10,- P. 325-333.

18. Bidla G. Hemolymph coagulation and phenoloxidase in Drosophila larvae / G. Bidla, M. Lindgren, U. Theopold, M.S. Dushay // Developmental and Comparative Immunology. -2005,- №29 .- P. 669-679.

19. Bierbaum G. Induction of autolysis of Staphylocci by the basic peptide antibiotics pep5 and nisin and their influence on the activity of autolytic enzymes / G. Bierbaum, H.-G. Sahl // Arch. Microbiol.-1985.- V.141.- P.249-254.

20. Bogus M. I. Different defense strategies of Dendrolimus pini, Galleria mellonella, and Calliphora vicina against fungal infection / M. I. Bogus, E. Kedra, J. Bania, M. Szczepanik, M. Czygier, P. Jabonski, A. Pasztaleniec, J. Samborski, J. Mazgajska, A. Polanowski // Journal of Insect Physiology.- 2007.- V. 53.- P. 909-922.

21. Bohn H. Hemolymph clotting in insects / H. Bohn // Immunity in invertebrates: cells, molecules, and defense reactions.- Berlin: Springer.- 233 p.

22. Braconnier M. F. (Z)-l,17-Diaminooctadec-9-ene, a novel aliphatic diamine from Coccinellidae / M. F. Braconnier, J. C. Braekman, D. Daloze, J. M. Pasteels // Experientia.-1984,- V. 41.- P. 519-520.

23. Brey P. T. Role of integument in insect immunity: epicuticular abrasion and induction of cecropin synthesis in cuticular epithelial cells / P.T. Brey, W.-J. Lee, M. Yamakawa, Y. Koizumi, S. Perrot, M. Francois, M. Ashida // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993.- V.90.-P.6275-6279.

24. Boman H.G. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins / H.G. Boman // J. Biochem.- 1991,- V.201.- P.23-31.

25. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity / H.G. Boman // Annu. Rev. Immunol.-1995.-V. 13,- P. 61-92.

26. Bonmatin J.M. Two dimensional 'H NMR study of recombinant insect defensin A in water: resonance assignments, secondary structure and global folding / J.M. Bonmatin, J.L. Bonnat, X. Gallet, F. Vovelle, M. Ptak, J.M. Reichhart, J.A. Hoffmann, E. Keppi, M. Legrain, T. Achstetter // J. Biomol. NMR.- 1992,- V.2, № 3,- P. 235-256

27. Bucalo B. Inhibition of cell proliferation by chronic wound fluid / B. Bucalo, W. H. Eaglstein, V. Falanga// Wound Repair Regen.- 1993,- V.I.- P. 181-186.

28. Bulet F. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosilated substitution / F. Bulet, S. Hetru // J. Biol. Chem.- 1993.- V. 268,- P. 14893-14897.

29. Bulet P. Antimicrobial peptides in insects; structure and function / P. Bulet, C. Hetru, J.L. Dimarcq, D. Hoffmann // Developmental and Comparative Immunology.- 1999,- №23.-P. 329-344.

30. . Casteels P. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees / P. Casteels, C. Ampe, F. Jacobs, M. Vaek, P. Tempst // EMBOJ.- 1989.- V.8.- P. 2387-2391.

31. Casteels P. Isolation and characterization of abaecin, a major antimicrobial response peptide in the honeybee (Apis mellifera) / P. Casteels, C. Ampe, L. Riviere, J. Van Damme, C. Elicone, M. Fleming, F. Jacobs // Eur. J. Biochem. -1980.- V.187.- P.381-386.

32. Casteels P. Functional and chemical characterization of hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera) / P. Casteels, C. Ampel, F. Jacobs, P. Tempst // J. Biol. Chem.- 1993,- V.268, №10,- P. 7044-7054.

33. Cazander G. The influence of maggot excretions on PAOl biofilm formation on biomaterials / G. Cazander, K.E.B. van Veen, L.H. Bouwman, A.T. Bernards, G.N. Jukema // Clin Orthop Relat Res.- 2009(a).- V. 467, №2,- P. 536-545.

34. Cazander G. Do maggots have an influence on bacterial growth? A study on the susceptibility of strains of six different bacterial species to maggots of Lucilia sericata and their excretions/secretions / G. Cazander, K.E.B. van Veen, A.T. Bernards, G.N. Jukema // Journal of Tissue Viability.- 2009(b).- V. 18, №3,- P. 80-87.

35. Chambers L. Degradation of extracellular matrix components by defined proteases from the greenbottle fly larva Lucilia sericata used for chemical debridement of non-healing wounds / L. Chambers, S. Woodrow, A.P. Brown, P.D. Harris, D. Phillips, M. Hall, J.C.T. Church, D.I. Pritchard // Br J Dermatol.- 2003,- №148,- P.14-23.

36. Charalambidis N. D. Hemocyte surface phenoloxidase (PO) and immune response to lipopolysaccharide (LPS) in Ceratitis capitata / N.D. Charalambidis, L.C. Foucas, C.G. Zervas, V.J. Marmaras // Insect Biochem. Molec. Biol.- 1996.- V.26, №8-9.- P. 867-874.

37. Chen P. H. Expression of human p-defensin 2 in human nasal mucosa / P.H. Chen, S.Y. Fang //Eur. Arch. Otorhinolaryngol.- 2004.- V.261.- P.238-241.

38. Chernysh S. I. Antimicrobial substances from insects // Bioresources and Biotechnology, Proceeding of the I Korea/Russia joint symposium, Taejon, 1996.- P. 281-296.

39. Chernysh S. I. The inducible antibacterial peptides of the hemipteran insect Palomena prasina: identification of a unique family of proline-rich peptides and of a novel insect defensin / S.I. Chernysh, S.Cociancich, J.-P. Briand, C. Hetru, P. Bulet //J. Insect Physiol. -1996,- V. 42, №1,- P.81-89.

40. Chernysh S. I. Diapause and immune response: induction of antimicrobial peptides synthesis in the blowfly, Calliphora vicina R.-D. (Dipter, Calliphoridae) / S.I. Chernysh, N.A. Gordja, N.P. Simonenko // Entomological Science.- 2000,- V.3, №1,- P. 139-144.

41. Chernysh S. I. Cytotoxic activity of blowfly Calliphora vicina hemocytes S. I. Chernysh, N. A. Filatova, N. S. Chernysh, A. P. Nesin//J. Ins. Physiol.- 2004,- V. 50.- P. 777-781.

42. Chicz R. M. High-performance liquid chromatography: effective protein purification by various chromatographic modes / R.M. Chicz, F.E. Regnier // J. Methods in enzymology. -1990,- V.182.-P. 392-421.

43. Christensen B. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes / Christensen B., Fink J., Merrifield R.B., Mauzerall D. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1988.-V.85,- P. 5072-5076.

44. Clark K. D Isolation and identification of a plasmatocyte-spreading peptide from the hemolymph of the lepidopteran insect Pseudoplusia includens / K. D. Clark, L. L. Perch, M. R. Strand // J. Biol. Chem.-1997.-V.272,- P. 23440-23447.

45. Cociancich S. Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect, the sap sucking-bug Pyrrhocoris apterus I S. Cociancich, A. Dupont, G. Hegyi, R. Lanot, F. Holder, C. Hetru // II Biochem. J.- 1994 (a).- V.300.- P. 567-575.

46. Cociancich S. The inducible antibacterial peptides of insects / S. Cociancich, P. Bulet, C. Hetru, J. Hoffmann // J. Parasitology Today.-1994 (b).- V. 10, №4,- P.132-139.

47. Constable S. A. A comparison of proteases produced by larvae of Lucilia cuprina (Wiedemann), L. sericata (Meigen), Calliphora augur (F.) and C. stygia (F.) (Diptera: Calliphoridae) / S. A. Constable // J. Aust. Ent. Soc.-1994.- V.33.- P. 203-210.

48. Crossley A. C. S. An experimental analysis of the origins and physiology of haemocytes in the blue blowfly Calliphora erythrocephala, (Meig.) / A. C. S. Crossley // J. Exp. Zool.-1964,- V.157.- P. 375-397.

49. Daeschlein G. In vitro antibacterial activity of Lucilia maggot secretions / Daeschlein G., Mumcuoglu K. Y., Assadian O., Hoffmeister B., Kramer A. // Skin Pharmacol Physiol.-2007.- №20.-P. 112-115.

50. Dunbar G. Notes on the Ngemba tribe of the Central Darling River of Western New South Wales / G. Dunbar // Mankind.- 1944,- V.3.- P.140-148.

51. Elkington R. A. Lucilia cuprina excretory-secretory protein inhibits the early phase of lymphocyte activation and subsequent proliferation / R. A. Elkington, M. Humphries, M. Commins, N. Maugeri, T. Tierney, T. J. A. Mahony// Parasite Immunology, 2009.- V. 31.-P. 750-765.

52. Erdmann G. R. Antibacterial action of myiasis-causing flies / G. R. Erdmann // Parasitology Today.- 1987,- V.3, №7,- P.214-216.

53. Falanga V. Workshop on the pathogenesis of chronic wounds / V. Falanga, F. Grinnell, B. Gilchrist, Y. T. Maddox, A. Moshell // J. Invest. Dermatol.- 1994,- V.102.- P. 125-127.

54. Fehlbaum P. Insect immunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides / P. Fehlbaum, P. Bulet, L. Michaut, M. Lagueux, W. Broekaert, S. Hetru, J. Hoffmann // J Biol Chem.-1994,- V. 269.- P. 31159-31163.

55. Fehlbaum P. Structure-activity analysis of thanatin, a novel 21-residue inducible insect defense peptide with sequence homology to frog skin antimicrobial peptides / P. Fehlbaum, P. Bulet, S. Chernysh, J.-P. Briand, J.-P. Roussel, L. Letellier, J. A. Hoffmann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996,- V. 93,- P. 1221-1225.

56. Ferrandon D. The Drosophila systemic immune response: sensing and signaling during bacterial and fungal infections / D. Ferrandon, J.-L. Imler, C. Hetru, J. A. Hoffmann // Nat ure Reviews Immunology.- 2007,- V. 7,- P. 862-874.

57. Finnerty C. M. The insect immune protein scolexin is a novel serine proteinase homolog / C. M. Finnerty, P. A. Karplus, R. R. Granados // Protein Sci.- 1999.- V.8.- P.242-248.

58. Fischer O. A. Blowflies Calliphora vicina and Lucilia sericata as passive vectors of Mycobacterium avium subsp. avium, M. a. paratuberculosis and M. a. hominissuis / O. A. Fischer, L. Matlova, L. Dvorska, P. Svastova, J. Bartl, R. T. Weston, I. Pavlik // Medical and Veterinary Entomology.- 2004,- V. 18.- P. 116-122.

59. Franc N. C. Innate recognition systems in insect immunity and development: new approaches in Drosophila / N. C. Franc, K. White // Microbes Infect.- 2000,- V.2.- P.243-250.

60. Garlanda C. Pentraxins at the crossroads between innate immunity, inflammation, matrix deposition, and female fertility / C. Garlanda, B. Bottazzi, A. Bastone, A. Mantovani // Annu. Rev. Immunol.- 2005,- V.23.- P.337-366.

61. Geng C. Hemostasis in larvae of Manduca sexta: formation of a fibrous coagulum by hemolymph proteins / C. Geng, P. E. Dunn // Biochem. Biophys. Res. Com.- 1988.-V.155.- P.1060-1065.

62. Gillespie J. P. Biological mediators of insect immunity / J. P. Gillespie, M. R. Kanost, T. Trenczec // Annu. Rev. Entomol.-1997.- V. 42,- P. 611-643.

63. Greenberg B. Flies through history / B. Greenberg // Flies and disease.- Princeton: Princeton University Press, 1973.

64. Grenier D. Cleavage of human immunoglobulin G by Treponema denticola / D. Grenier, D. Mayrand // Anaerobe.- 2001,- V.7.- P. 1^1.

65. Golebiowski M. The antimicrobial activity of the alcohols from Musca domestica / M. Goleb'iowski, M. Dawgul, W. Kamysz, M. I. Bogus, W. Wieloch, E. Wloka, M. Paszkiewicz, E. Przybysz, P. Stepnowski // J. Exp. Biol. Advance.- 2012.- V. 215, № 19.-P. 3419-3428.

66. Golebiowski M. Free fatty acids in the cuticular and internal lipids of Calliphora vomitoria 3 and their antimicrobial activity / M. Golebiowski, M. Cerkowniak, M. I. Bogus, E. Wloka, M. Dawgul, W. Kamysz, P. Stepnowski // J. Ins. Physiol.- 2013.67. Gotz P. Encapsulation in arthropods / P. Gotz // Immunity in Invertebrates: Cells,

Molecules and Defense Reactions.-1986,- P.153-170.

68. Gupta A. P. Arthropod hemocytes and phylogeny / A. P. Gupta // J.Arthropod Phylogeny.-1979.- P.669-735.

69. Gupta A. P. Cellular elements in the hemolymph / A. P. Gupta // J.Comprehensive Insect Physiology.-1985.- V.3.- P.401-451.

70. Habeeb M. A. Mechanical transmission of bacteria via animal agents truefly species // M. A. Habeeb, M. A. Mahdi // Advanced Studies in Biology.- 2012,- V. 4, №12, P. 583-591.

71. Hall M. Myiasis of humans and domestic animals / M. Hall, R. Hall // Advances in Parasitology.- 1995.- V. 35.- P. 257-334.

72. Hara S. A novel antibacterial peptide family isolated from the silkworm, Bombyx mori / S. Hara, M. Yamakawa // Biochem. J.- 1995,- V.310.- P.651-656.

73. Hetru C. Antimicrobial peptides from insects / C. Hetru, D. Hoffmann, P. Bulet // Molecular mechanisms of immune responses in insects. -Chapman & Hall, 1998.- P. 40-66.

74. Hoffmann J. A. Innate immunity of insects / J. A. Hoffmann // Current Opinion in Immunology.- 1995.-№7.- P. 4-10.

75. Hoffmann J. A. Insect defensins: inducible antibacterial peptides / J. A. Hoffmann, C. Hetru//Immunology Today.- 1992.- V.13,№10.- P. 411-415.

76. Hoffmann J. A. The inducible antibacterial peptides of dipteran insects / J. A. Hoffmann, D. Hoffmann // Research in immunology.- 1990,- V.141, №9.- P. 910-918.

77. Hoffmann J. A. The humoral antibacterial response of Drosophila / J. A. Hoffmann, C. Hetru, L.-M. Reichhart // FEBS.-1993.- V.325, №1-2.- P. 63-66.

78. Hoffmann J. A. The host defence of Drosophila melanogaster / J. A. Hoffmann, B. Lemaitre // Annu. Rev. Immunol. - 2007. - V. 25.- P. 697-743.

79. Holak T. A. The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study / T. A. Holak, A. Engstrom, P. J. Kraulis, G. Lindeberg, H. Bennich, T. A. Jones // Biochemistry.- 1988.- V.27.- P. 7620-7629.

80. Horobin A. J. Maggots and wound healing: an investigation of the effects of secretions from Lucilia sericata larvae upon interactions between human dermal fibroblasts and extracellular matrix components / A. J. Horobin, K. M. Shakesheff, D. I. Pritchard, C. Robinson // British Journal of Dermatology.-2003,- V.148.- P. 923-933.

81. Horobin A. J. Maggots and wound healing: an investigation of the effects of secretions from Lucilia sericata larvae upon the migration of human dermal fibroblasts over a fibronectincoated surface / A. J. Horobin, K. M. Shakesheff, D. I. Pritchard // Wound repair and regeneration.- 2005,- V.13, № 4,- P. 422-433.

82. Huberman L. Antibacterial substances of low molecular weight isolated from the blowfly, Lucilia sericata / L. Huberman, N. Gollop, K. Y. Mumcuoglu, E. Breuer, S. R. Bhusare, Y. Shai, R. Galun // Medical and Veterinary Entomology.- 2007,- №21.- P. 127-131.

83. Hultmark D. Immune reactions in Drosophila and other insects: a model for innate immunity / D. Hultmark // J. Trends Genet.-1993,- V.9.- P. 178-183.

84. Huttner K. M. Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defense / K. M. Huttner, C. L. Bevins // Pediatr. Res.- 1999.- V.45.- P.785-794.

85. Iijima R. Purification, characterization, and cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvae / R. Iijima, S. Kurata, S. Natori //J. Biol. Chem.- 1993.-№268.- P. 12055-12061.

86. Iwanaga S. New types of factors and defense molecules found in horseshoe crab hemolymph - their structures and functions / S. Iwanaga, S. Kawabata, T. Muta // J. Biochem.- 1998.- V.123.- P.l-15.

87. Jaklic D. Selective antimicrobial activity of maggots against pathogenic bacteria / D. Jaklic, A. Lapanje, K. Zupancic, D. Smrke, N. Gunde-Cimerman // Journal of Medical Microbiology.-2008,- №57,- P. 617-625.

88. Jevons M. P. Celbenin-resistant staphylococci / M. P. Jevons // Br. Med. J.- 1961.- V.I.-P.124-125.

89. Kaaya G. P. Comparative study of hemocytes and associated cells of some medically important dipterans / G. P. Kaaya, N. A. Ratcliffe // Journal of Morphology.- 1982,-V.173.- P.351-365.

90. Karlsson C. Proteomic analysis of the Drosophila larval hemolymph clot / C. Karlsson, A. M. Korayem, C. Scherfer, M. S. Dushay, U. J. Theopold // Biol. Chem.- 2004,- V.279.-P.52033-52041.

91. Kerridge A. Antibacterial properties of larval secretions of the blowfly, Lucilia sericata / A. Kerridge, H. Lappin-Scott, J. R. Stevens // Med. Vet. Entomol.-2005.- №19,- P. 333337.

92. Kotani E. Cloning and expression of the gene of hemocytin, an insect humoral lectin which is homologous with the mammalian von Willebrand factor / E. Kotani, M. Yamakawa, S. Iwamoto, M. Tashiro, H. Mori, M. Sumida // Biochim. Biophys. Acta.- 1995.- V.1260.-P.245-258.

93. Kragol G. The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding / G. Kragol, S. Lovas, G. Varadi, B. A. Condie, R. Hoffmann, L. Jr. Otvos // Biochemistry.-2001.- V.40, №10,- P.3016-3026.

94. Kurata S. Recognition and elimination of diversified pathogens in insect defense systems / S. Kurata // Molecular Diversity.- 2006,- V.10.- P.599-605.

95. Lackie A.M. Hemocyte behaviour / A. M. Lackie // Adv. Insect Physiol.-1988.- V.21.- P. 85-178.

96. Lambert J. Insect immunity: isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides / J. Lambert, E. Keppi, J.-L. Dimarcq, C. Wicker, J.-M. Reichhart, B. Dunbar, P. Lepage, A. V. Dorsselaer, J. Hoffmann, J. Fothergilli, D. Hoffmann // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1989,- №86.- P.262-266.

97. Lamberty M. Insect Immunity: Isolation from the lepidopteran Heliotis virescens a novel insect defensin with potent antifungal activity / M. Lamberty, S. Ades, S. Uttenweiler-

Joseph, G. Brookhart, D. Bushey, J. A. Hoffmann, P. Bulet // J. Biol. Chem.- 1999.- V.274, №14.- P.9320-9326.

98. Lavine M. D. Insect hemocytes and their role in immunity / M. D. Lavine, M. R. Strand // Insect Biochemistry and Molecular Biology.- 2002.- №32.- P. 1295-1309.

99. Leem J. Y. Purification and characterisation of N-b-alanyl-5-Sglutathionyl-3-4-dihydroxyphenylalanine, a novel antibacterial substance of Sarcophaga peregrina (fleshfly) / J. Y. Leem, C. Nishimura, S. Kurata, I. Shimada, A. Kbayashi, S. Natori // J. Biol. Chem.- 1996,- V.271.- P.13573-13577.

100. Leem J.Y. Isolation of p-hydroxycinnamaldehyde as an antibacterial substance from the saw fly, Acantholyda parki I J. Y. Leem, I. J. Jeong, K. T. Park, H. Y. Park // FEBS Lett.-1999,- V.442.- P.53-56.

101. Lemaitre B. The host defense of Drosofila melanogaster II B. Lemaitre, J. Hoffmann // Annu. Rev. Immunol.- 2007.- V.25.- P.697-743.

102. Levashinia E. A. Metchnikowin, a novel immune-inducible proline-rich peptide from Drosophila with antibacterial and antifungal properties / E. A. Levashinia, S. Ohresser, P. Billet, J. M. Reichhart, C. Hetrn, J. A. Hoffmann // Eur. J. Biochem.-1995.- V.233, №2,-P.694-700.

103. Li J. Phenoloxidase activity in hemolymph compartments of Aedes aegypti during melanotic incapsulation reactions against microfilariae / J. Li, J. W. Tracy, B. M. Christensen // Develop. And Comp. Immunol.-1992,- V.16.- P. 41-48.

104. Lord J. C. A proposed role for the cuticular fatty amides of Liposcelis bostrychophila (Psocoptera: Liposcelidae) in preventing adhesion of entomopathogenic fungi with dry-conidia / J. C. Lord, R. W. Howard // Mycopathologia.- 2004,- V. 158.- P. 211-217.

105. Luckhart S. Morphological and functional classification of the hemocytes of adult female Simulium vittatum / S. Luckhart, M. S. Cupp, E. W. Cupp // Journal of Medical Entomology.- 1992.- V. 29, №3.- P.457-466.

106. Margolin L. Assessment of the antimicrobial properties of maggots / L. Margolin, P. Gialanella // Int. Wound J.- 2010.- Y.7.- P. 202-204.

107. Matsuyama K. Purification of three antibacterial proteins from the cuture medium of NIH-Sape-4, an embryonic cell line of Sarcophaga peregrine / K. Matsuyama, S. Natori // J. Biol. Chem.- 1988. - V.263.- P. 17112- 17116.

108. Medzhitov R. The Toll receptor family and microbial recognition / R. Medzhitov, C. J. Janeway // Trends in Micribiology.- 2000,- V.8, №10.- P. 452-456.

109. Meylaers K. Antimicrobial compounds of low molecular mass are constitutively present in insects: characterisation of p-Alanyl-Tyrosine / K. Meylaers, A. Cerstiaens, E. Vierstraete,

G. Baggerman, C. W. Michiels, A. De Loof, L. Schoofs // Current Pharmaceutical Design.-2003,-№9,- P. 159-174.

110. Meylaers K. Identification of 1-lysophosphatidylethanolamine (C16:l) as an antimicrobial compound in the housefly, Musca domestica / K. Meylaers, E. Clynen, D. Daloze, A. De Loof, L. Schoofs // Insect Biochem. Mol. Biol.-2004.- V.34.- P.43^19.

111. Minnick M. F. A bacterial-induced lectin which triggers hemocyte coagulation in Manduca sexta / M. F. Minnick, R. A. Rupp, K. D. Spence // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1986,-V. 137.- P.729-735.

112. Moore A. J. Antimicrobial activity of cecropins / A. J. Moore, W. D. Beazley, M. C. Bibby, D. A. Devine // Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 1996.- V.37.- P.1077-1089.

113. Mumcuoglu K. Destruction of bacteria in the digestive tract of the maggot of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) / K. Mumcuoglu, J. Miller, M. Mumcuoglu, F. Friger, M. Tarshis // J. Med. Entomol.- 2001.- V.38.- P. 161-166.

114. Munks R.J.L. Regulation of midgut defensin production in the blood-sucking insect Stomoxys calcitrans / R. J. L. Munks, J. V. Hamilton, S. M. Lehane, M. J. Lehane // Insect Molecular Biology.- 2001.- V.10, №6,- P. 561-571.

115. Nagai T. A link between blood coagulation and prophenol oxidase activation in arthropod host defense / T. Nagai, S. Kawabata // J. Biol. Chem.- 2000.- V.275, №38,- P. 2926429267.

116. Nappi A. J. Melanogenesis and associated cytotoxic reactions: Applications to insect innate immunity / A. J. Nappi, B. M. Christensen // Insect Biochemistry and Molecular Biology.-2005.-V.35.- P. 443-459.

117. Nigam Y. Maggot therapy: the science and implication for CAM Part I - history and bacterial resistance / Y. Nigam, A. Bexfield, S. Thomas, N. A. Ratcliffe // eCAM.-2006(a).- V.3, №2.- P. 223-227.

118. Nigam Y. Maggot therapy: the science and implication for CAM Part II - maggots combat infection / Y. Nigam, A. Bexfield, S. Thomas, N. A. Ratcliffe // eCAM.- 2006(b).- V.3, №3,- P. 303-308.

119. Oren Z. Mode of action of linear amphipathic a helical antimicrobial peptides / Z. Oren, Y. Shai // Biopolymers.-1998,- V.47.- P. 451-463.

120. Ouellette A.J. Paneth cell a-defensins: peptide mediators of innate immunity in the small intestine / A. J. Ouellette // Semin. Immun.- 2005.- V.27.- P. 133-146.

121. Palosova, Z., Takac, P. and Srobarova, A. (2008). Antifungal activity of blow fly (Lucilia sericata) saliva at the Fusarium sp. control / Z. Palosova, P. Takac, A. Srobarova//

Proceedings of the 3rd International Symposium on Fusarium Head Blight, Szeged, Hungary, P. 715-718.

122. Paraluppi N. D. Calliphoridae (Diptera) in Manaus: IV. Bacteria isolated from blowflies collected in street markets / N. D. Paraluppi, J. C. Vasconcelos, J. S. Aquino, E. G. Castellón, M. do S. B. da Silva // Acta Amazónica.- 1996,- V. 26, №1-2,- P. 93-96.

123. Paul A.G. Maggot debridement therapy with Lucilia cuprina: a comparison with conventional debridement in diabetic foot ulcers / A. G. Paul, N. W. Ahmad, H. L. Lee, A. M. Ariff, M. Saranum, A. S. Naicker, Z. Osman // International Wound Journal, 2009.- V. 6, № 1,- P. 39-46.

124. Pavillard E. R. An antibiotic from maggots / E. R. Pavillard, E. A. Whright // Nature, 1957,- V. 160, №4592,- P. 916-917.

125. Peters W. Evidence for a sugar receptor (lectin) in the peritrophic membrane of the blowfly larva, Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera) / W. Peters, H. Kolb, V. Kolb/Bachofen // J. Insect Physiol.- 1983,- V.29.- P.275-280.

126. Price C. D. A reappraisal of insect haemocytes classification by examination of blood from fifteen insect orders / C. D. Price, N. A. Ratcliffe // Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat.- 1974,-V.147.- P.537-549.

127. Ratcliffe N. A. Insecta / N. A. Ratcliffe, A. F. Rowley // Invertebrate blood cells.- London: Acad. Press, 1981,- P. 421-488 (V.2).

128. Ribeiro C. Insect haemocytes - What type of cell is that? / C. Ribeiro, M. Brehelin // Journal of Insect Physiology.- 2006,- V.52.- P. 417-429.

129. Rigotti A. The class B scavenger receptors SR-BI and CD36 are receptors for anionic phospholipids / A. Rigotti, S.L. Acton, M. Krieger // J. Biol. Chem.- 1995,- V.270.-P.16221-16224.

130. Reddy K. V. R. Antimicrobial peptides: premises and promises / K. V. R. Reddy, R. D. Yedery, C. Aranha // Internal J. of Antimicr. Agents.-2004.- V.24.- P. 536-547.

131. Robinson W. Stimulation of healing in non-healing wounds by allantoin in maggot secretions and of wide biological distribution / W. Robinson // J. Bone Joint Surg.- 1935,-V.17.- P.267-271.

132. Robinson W. Ammonium bicarbonate secreted by surgical maggots stimulates healing in purulent wounds / W. Robinson // Am. J. Surg.- 1940,- V.47.- P. 111-115.

133. Robinson W. Destruction of pyogenic bacteria in the alimentary tract of surgical maggots implanted in infected wounds / W. Robinson, V. H. Norwood // J. Lab. Clin. Med.- 1934.-P.581-586.

134. Rohrich C. R. Harmonine, a defence compound from the harlequin ladybird inhibits mycobacterial growth and demonstrates multi-stage antimalarial activity / C. R. Rohrich, C. J. Ngwa, J. Wiesner, H. Schmidtberg, T. Degenkolb, C. Kollewe, R. Fischer, G. Pradel, A. Vilcinskas // Biol. Lett.- 2012.- V. 8,- P. 308-311.

135. Saul S.J. The majority of prophenoloxidase in the hemolymph of Manduca sexta is present in the plasma and not in the hemocytes / S. J. Saul, L. Bin, M. Sugumaran // Develop, and Comp. Immunol.-1987,- V.ll.- P. 479-485.

136. Scherfer C. The Toll immune-regulated Drosophila protein Fondue is involved in hemolymph clotting and puparium formation / C. Scherfer, M. R. Qazi, K. Takahashi, R. Ueda, M. S. Dushay, U. Theopold, B. Lemaitre // Dev. Biol.- 2006.- V.295.- P.156-163.

137. Schmidt O. Innate immunity and evasion by insect parasitoids / O. Schmidt, U. Theopold, M. R. Strand // BioEssays.- 2001.- V.23.- P.344-351

138. Schultz G.S. Wound bed preparation: a systematic approach to wound management / G. S. Schultz, R. G. Sibbald, V. Falanga, E. A. Ayello, C. Dowsett, K. Harding // Wound Repair Regen.- 2003,- V.ll.- P. 1-28.

139. Seigler D. Plant secondary metabolism / D. Seigler.- Norwell: Springer, 1999.- 759 p.

140. Selitrennikoff C.P. Antifungal Proteins / C.P. Selitrennikoff // Applied and Enviromental Microbiology.- 2001.- V.67, №7,- P. 2883-2894.

141. Selsted M. E. Lysozyme: primary bactericidin in human plasma serum active against Bacillus subtilis / M. E. Selsted, R. J. Martinez // Infection and Immunity.- 1978.- V.20.-P.782-791.

142. Selsted M. E. Enteric defensins: antibiotic peptide components of intestinal host defense / M. E. Selsted, S. I. Miller, A. H. Henschen, A. J. Ouellettell // The Journal of Cell Biology.- 1992,- V.l 18, № 4,- P. 929-936.

143. Sharon G. Commensal bacteria play a role in mating preference of Drosophila melanogaster / G. Sharon, D. Segal, J. M. Ringo, A. Hefetz, I. Zilber-Rosenberg, E. Rosenberg//PNAS.-2010,-V. 107, №46.-P. 20051-20056.

144. Sherman R. A. Maggot therapy: a review of the therapeutic applications of fly larvae in human medicine, especially for treating osteomyelitis / R. A. Sherman, E. A. Pechter // Med. Vet. Entomol.- 1988,- V.2.- P.225-230.

145. Simmons S. W. The bactericidal properties of excretions of the maggot of Lucilia sericata / S. W. Simmons//Bull. Entomol. Res.- 1935,- V.26.- P.559-563.

146. Smith R. J. Toxic components on the larval surface of the corn earworm (Heliothis zea) and their effects on germination and growth of Beauveria bassiana / R. J. Smith, E. A. Grula //J. Invert. Pathol.- 1982.- V. 39.- P. 15-22.

147. Soderhall K. The proPO-system and associated proteins; role in cellular communication in arthropods / K. Soderhall, A. Aspan, D. Duvic // J. Research in immunology.- 1990.-V.141, №.9.- P.896-946.

148. Steenvoorde P. The antimicrobial activity of maggots: in-vivo results / P. Steenvoorde, G.N. Jukema // J Tissue Viability.- 2004.- V.14, №.3.- P. 97-101.

149. Steiner H. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity / H. Steiner, D. Hultmark, A. Engstrom, H. Bennich, H. G. Boman // Nature .1981.- V.292.- P. 246-248

150. Telford G. Wound debridement potential of glycosidases of the wound-healing maggot Lucilia sericata / G. Telford, A.P. Brown, A. Rich, S.C. English, D.I. Pritchard // Medical and Veterinary Entomology.- 2012.- P. 1-9.

151. Theopold U. Helix pomatia lectin and annexin V, two molecular probes for insect microparticles: possible involvement in hemolymph coagulation / U. Theopold, O. Schmidt // J. Insect Physiol.- 1997.- V.43.- P.667-674.

152. Theopold U. The coagulation of insect hemolymph / U. Theopold, D. Li, M. Fabbri, C. Scherfer, O. Schmidt // Cell. Mol. Life Sci.- 2002,- V.59.- P.363-372.

153. Thomas S.The anti-microbial activity of maggot secretions: results of a preliminary study / S. Thomas, A. Andrews, P. Hay, S. Bourgoise // J Tissue Viability.- 1999,- V.9.- P. 127132.

154. Tomie T. Scarabaecin, a novel cysteine-containing antifungal peptide from the rhinoceros beetle, Oryctes rhinoceros / T. Tomie, J. Ishibashi, S. Furukawa, S. Kobayashi, R. Sawahata, A. Asaoka, M. Tagawa, M. Yamakawa // Biochemical and Biophysical Research Communications.- 2003,- V.307.- P.261-266.

155. Thomma B. Tissue-specific expression of plant defensin genes PDF2.1 and PDF2.2 in Arabidopsis thaliana / Thomma B., Broekaert W. // Plant Physiol. Biochem.- 1998.- V.36.-P.533-537.

156. Trenszec T. Synthesis of immune proteins in primary cultures of fat body from Hyalophora cecropia / T. Trenszec, I. Faye // J Insect Biochem.- 1988,- V.18.- P.299-312.

157. Tzou P. Tissue-specific inducible expression of antimicrobial peptide genes in Drosophila surface epithelia / Tzou P., Ohresser S., Ferrandon D., Capovilla M., Reichhart J.-M., Lemaitre B., Hoffmann J.A., J.-L. Imler // Immunity.- 2000,- №13,- P. 737-748.

158. Van der Plas M.J.A. Maggot excretions/secretions inhibit multiple neutrophil proinflammatory responses / M.J.A van der Plas, A.M. van der Does, M. Baldry, H.C.M. Dogterom-Ballering, C. van Gulpen, J.T. van Dissel, P.H. Nibbering, G.N. Jukema // Microbes and Infection.-2007.- №9,- P. 507-514.

159. Van der Plas M.J.A Maggot excretions or secretions are differentially effective against Biofilms of S. aureus and P. aerugenosa / M.J.A van der Plas, G.N. Jukema, S.-W. Wai, H.C.M. Dogterom-Ballering, E.L. Lagendijk, C. van Gulpen, G.V. Bloemberg, P.H. Nibbering // Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 2008,- V.61, №1.- P. 117-122.

160. Vilcinscas A. Parasitic fungi and their interactions with the insect immune system / A. Vilcinscas, Gotz P. // Advances in parasitology.- 1999.- V.43.- P.267-313.

161. Wah J. Antimicrobial peptides are present in immune and host defense cells of the human respiratory and gastroinstestinal tracts / J. Wah // Cell Tissue Res.- 2006.- V.324.- P.449-456.

162. Weinbergl A. Epithelial antimicrobial peptides: review and significance for oral application / A. Weinbergl, S. Krisanaprakornkit, B. A. Dale // Crit Rev Oral Biol Med.- 1998,- V.9, №4,- P. 399-414.

163. Whitaker I.S. Larval therapy from antiquity to present day: mechanisms of action, clinical application and future potential / I.S. Whitaker, C. Twine, M.J. Whitaker, M. Welck, C.S. Brown, A. Shandall // Postgrad Med J.- 2007.- V. 83,- P. 409-413.

164. Wollina U. Biosurgery in wound healing - the renaissance of maggot therapy / U. Wollina, K. Karte, C. Herold, A. Looks // JEADV.- 2000,- V.14.- P. 285-289.

165. Zachary D. The haemocytes of Calliphora erythrocephala (Meig.) (Diptera) / D. Zachary, J. A. Hoffmann // Z. Zellforsch.- 1973,- V. 141.- P. 55-73.

166. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms / M. Zasloff // Nature.-2002,- V.415, №24.-P.389-395.