Антиген-индуцированные реакции иммунной системы при формировании памяти в норме и при иммунопатологических состояниях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат биологических наук Гаврилова, Елена Давидовна

• Гаврилова, Елена Давидовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гаврилова, Елена Давидовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Клеточные взаимодействия при развитии иммунного ответа.

1.1.Проникновение антигена.

1.2. Процессинг и презентация антигена.

1.2.1.Антигенраспознающие рецепторы В-лимфоцитов.

1.2.2. Антигенраспознающие рецепторы Т-лимфоцитов.

1.3. Гуморальный иммунный ответ.

1.3.1. Первичный гуморальный иммунный ответ.

1.3.2. Вторичный гуморальный иммунный ответ.

ГЛАВА 2. Иммунная память и клетки памяти.

2.1. Феномен иммунной памяти.

2.2. Клетки памяти.

2.2.1 В-клетки памяти.

2.2.2. Т-клетки памяти.

ГЛАВА 3. Регуляция гуморального иммунного ответа.

3.1. Антиген индуктор и модулятор иммунного процесса.

3.2. Цитокины - регуляторы иммунных реакций.

ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА I. Клеточный иммунный ответ.

ГЛАВА 2. Гуморальный иммунный ответ.

2.1. Динамика гуморального ответа у мышей разных линий.

2.1.1. Динамика первичного ^М- и

§С-гуморального ответа у мышей.

2.1.2. Динамика вторичного ^в-ответа у мышей разных линий.

2.2. Влияние индукции локальной реакции ГЗТ на гуморальное звено иммунного ответа.

2.3. Влияние дополнительного введения антигена на гуморальное звено иммунного ответа.

2.3.1.Первичный гуморальный ответ при дополнительном введении антигена в лог-фазу ответа.

2.3.2. Вторичный IgG-ответ при дополнительном введении антигена в лог-фазу первичного гуморального ответа.

2.4. Пролиферативная активность антителопродуцентов и ее вклад в гуморальный иммунный ответ.

2.4.1. Вклад пролиферативной активности антителопродуцентов в первичный гуморальный иммунный ответ.

2.4.2. Вклад пролиферативной активности антителопродуцентов во вторичный гуморальный иммунный ответ.

ГЛАВА 3. Определение регуляторных цитокинов при формировании гуморального иммунного ответа.

3.1. Общий уровень IgE в сыворотке крови мышей BDF1.

3.2. Уровень TNFa в сыворотке мышей BDF1 при антигенной гиперстимуляции первичного гуморального иммунного ответа.

ГЛАВА 4. Возможные механизмы регуляции гуморального ответа и формирования иммунной памяти у мышей BDF1.

4.1. TNF-связывающий белок.

4.2. Оксид азота (N0) в регуляции иммунного ответа.

4.3.11-1 в регуляции иммунного ответа.

ГЛАВА 5. Изучение формирования иммунной памяти у мышей при развитии патологии.

5.1. Изучение клеточного и гуморального звеньев иммунной системы у мышей с патологией при формировании иммунного ответа.

5.2. Оценка продукции IgE у мышей с хронической РТПХ в системе DBA/2->Fl(C57BL/6 х DBA/2) у lupus- и поп/м/?м5-реципиентов при формировании иммунной памяти.

ЧАСТЬ IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антиген-индуцированные реакции иммунной системы при формировании памяти в норме и при иммунопатологических состояниях»

Известно, что иммунный ответ обычно развивается с преобладанием либо клеточных, либо гуморальных реакций [Parish С. R., 1996; Kalia V.et al 2009]. Считается, что соотношение между выраженностью клеточного и гуморального звена иммунного ответа базируется на преимущественной активации Т-хелперных клеток 1-го или 2-го типов [Cher DJ. et Mosmann T.R., 1987; Allen J.E. et Maizels R.M., 1997; Gor D. et al., 2003]. Развитие ответа на конкретный антиген, тип иммунного реагирования, его динамика и выраженность определяется как «географией» антигена [Zinkernagel R.M et al., 1997], то есть путем поступления, дозой, продолжительностью персистирования и локализацией антигена в организме, так и особенностями самого организма, включая его текущее состояние [Gonzalez S.F. et al 2010; Pereira J.P.et al, 2010].

Развитие иммунного ответа не заканчивается образованием Т-эффекторов или синтезом антител, но и вызывает формирование иммунной памяти [Vitetta

E.S. et al, 1991; Batista F.D.et al, 2009; Obar J.J.et Lefrançois L., 2010; Marelli-Berg

F.M. 2010], характер которой зачастую трудно связать с особенностями иммунного ответа на первое введение антигена. Ещё меньше известно о взаимосвязи клеточных и гуморальных реакций при вторичной встрече с антигеном [Gusev E.Yu. et al, 1994]. Наблюдаемые при вторичном ответе реакции, как правило, не удается предсказать, исходя из предполагаемых в соответствии с известными закономерностями событий. Так, например, установлено [Swain S.L. et al., 2006], что выраженный гуморальный вторичный ответ часто наблюдается при первичной иммунизации низкими дозами антигена, а увеличение дозы приводит к парадоксальному снижению анамнестической реакции. Несмотря на огромные успехи в понимании тонких молекулярно-генетических механизмов регуляции синтеза антител и переключения классов и подклассов иммуноглобулинов в процессе развития гуморального ответа [Ada G.L. et Blanden R.V.1994; Dooms H.et Abbas A., 2006; Fearon D.T et al, 2006], выделении и характеристике многочисленных отдельных субпопуляций клеток памяти среди основных участников специфического иммунного ответа (Т-лимфоцитов: CD8+-, CD4+- и Влимфоцитов) [Ада Г., Рамсей А. 2002; Lefrancois L., 2006; Caíame К., 2006, Jameson S.C. et Masopust D., 2009], их роль и закономерности регуляции, а также взаимоотношения первичного и вторичного гуморального иммунного ответа и баланс клеточного и гуморального звеньев при вторичном ответе на уровне целостного организма в настоящее время ещё далеки от разрешения [Ahmed R. et Rouse В.Т., 2006, Blanchard-Rohner G. et al, 2009].

Представляется вероятным, что формирование иммунной памяти при различных иммунопатологических состояниях отличается от этих процессов в норме. Известно, что индукция хронической РТПХ приводит к развитию аутоиммунной патологии, которая по клиническим и патоморфологическим признакам аналогична СКВ человека [Via С. S. et al. 1988, Kuzmina Z. et al, 2011]. Поэтому в данной работе в качестве модели аутоиммунной патологии была использована модель развития иммунокомплексного гломерулонефрита при индукции хронической реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Обнаруженная при этом супрессия первичного гуморального ответа [Козлов В.А. и др., 2002] , делает актуальным выявление особенностей формирования иммунной памяти при указанной патологии.

Понимание механизмов формирования иммунной памяти необходимо для успешной вакцинопрофилактики [Plotkin S.А.,2010], особенно учитывая случаи неудачной вакцинации отдельных индивидуумов, небольшую эффективность вакцин для создания клеточного анамнестического ответа, а также возникновение в последнее время новых, не встречаемых ранее инфекционных заболеваний. Кроме того, заболевания, в патогенезе которых лежат нарушения нормального функционирования иммунной системы (болезни с аутоиммунным компонентом, аллергии), по-видимому, развиваются по законам анамнестического иммунного ответа.

Целью данной работы является изучение клеточных и гуморальных реакций при антиген-индуцированных воздействиях и выявление регуляторных механизмов иммунных реакций, участвующих в процессе формирования иммунной памяти в норме и при патологии.

В работе планируется решение следующих задач:

1. Изучить сопряжённую динамику первичного и вторичного клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей на разные дозы антигена.

2. Изучить влияние повторного введения антигена в ранние сроки формирования первичного иммунного ответа на выраженность первичного и вторичного ответа.

3. Исследовать связь пролиферативной активности антителопродуцентов с интенсивностью вторичного иммунного ответа.

4. Изучить формирование иммунной памяти при хронической РТПХ как модели преимущественно ТЫ- или ТЬ2-зависимых иммунопатологических состояний.

5. Оценить уровень ТЫИ-а и ^Е в процессе формирования иммунной памяти в норме и при иммунопатологических состояниях, индуцированных хронической РТПХ.

6. Изучить возможную роль Т№-связывающего белка, препаратов регулирующих синтез N0 в организме и рекомбинантного И-1Р в регуляции гуморального ответа и формирования иммунной памяти.

Научная новизна:

Получены новые данные о закономерностях формирования иммунной памяти в норме и при иммунопатологических состояниях.

Показано снижение вторичного иммунного ответа, вызванное предшествующей гиперстимуляцией первичного ^М- и ^в-ответа на фоне повторного введения антигена в позднюю лог-фазу первичного ^М-гуморального ответа. Этот эффект дозозависим и наблюдается только при первичной иммунизации субоптимальной дозой этого же антигена.

Выявлено, что введение ингибитора синтеза ДНК ослабляет подъём количества ^М-антителопродуцентов, но не влияет на выраженность первичного и вторичного ^С-ответа.

Получены данные об участии Т№а в регуляции физиологического баланса процессов дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти, проявляющемся в основном в момент активного образования ^М-антителопродуцентов.

Обнаружена сопряженность между уровнем И-113 и выраженностью гуморального ответа: повышенное содержание этой формы цитокина в момент иммунизации (Осутки), достоверно снижает первичный и стимулирует вторичный ^С-гуморальный ответ, что свидетельствует об участии 11-1 в регуляции В-клеточной дифференцировки в индуктивную фазу гуморального ответа.

Установлено, несмотря на глубокую депрессию первичного ответа при аутоиммунных процессах, индуцированных хронической РТПХ, вторичный ответ у таких мышей более сохранен: причем /ирш'-реципиенты способны к формированию иммунной памяти, тогда как поп1ирш-реципиенты отвечают на повторное введение антигена сдвигом в сторону клеточно-опосредованных реакций.

Теоретическая и практическая значимость: Полученные данные позволяют направленно изменять высоту иммунного ответа и баланс между клеточными и гуморальными реакциями при формировании иммунной памяти. Выявленные закономерности первичного и вторичного ответа расширяют имеющиеся представления о регуляции иммунного ответа. Экспериментально подтвержденный стимулирующий эффект дополнительного введения антигена обосновывает создание новых схем вакцинаций: выбор оптимальных доз и способов введения антигенов. К тому же станет возможным, учитывая результаты исследования, внести существенные положительные коррективы в технологический процесс получения специфических антител. Полученные результаты можно учитывать при разработке новых подходов к регуляции иммунных реакций при некоторых формах аутоиммунных заболеваний и аллергических состояний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антиген является фактором, модулирующим иммунный ответ: при его дополнительном введении отмечается усиление первичного и подавление вторичного ответа.

2. Формирование иммунной памяти к чужеродному антигену протекает независимо от аутоиммунных процессов, индуцированных хронической РТПХ.

3. Уровень первичной реакции на антиген не является предопределяющим для формирования иммунной памяти благодаря существованию дискордантных взаимоотношений между развитием первичного и вторичного иммунного ответа.

Личный вклад автора в проведении исследования. Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы: Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Фундаментальная наука - медицине» (г. Новосибирск, 2007г.) и на конференции «Дни иммунологии в Сибири-2007» (г. Омск), а также доложены на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (г.Новосибирск, 2010г.), на международной конференции «Дни иммунологии в Сибири-2011» (г.Абакан) и на 8-й отчетной конференции НИИ КИ СО РАМН ( г. Новосибирск, 2011).

Публикации: По теме диссертационной работы опубликовано 20 работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы: Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования в 5 главах, их обсуждения и выводов. Материалы диссертации изложены на 121 страницах машинописного текста, результаты собственных исследований содержат 27 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 197 источников, из них 18 на русском языке.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Гаврилова, Елена Давидовна

ВЫВОДЫ:

1. Повторное введение антигена в позднюю лог-фазу первичного ответа приводит к резкому увеличению количества как ^М-, так и антителопродуцентов на пике первичного ответа и в тоже время снижает уровень вторичного ^О-ответа, что свидетельствует о модулирующем действии антигена. Эффект на первичный ответ дозозависим и наблюдается только при субоптимальной иммунизации мышей.

2. При введении антигена в позднюю лог-фазу первичного ответа как подкожно (под апоневроз), так и при внутривенном введении наблюдается подавление анамнестического ответа. Это указывает на то, что фактором, супресси-рующим формирование иммунной памяти, являются системные реакции, вызванные дополнительным введением антигена, а не локально развивающееся воспаление в месте его поступления в организм.

3. Введение гидроксимочевины - ингибитора синтеза ДНК - одновременно с дополнительным введением антигена во время лог-фазы первичного ^М-ответа снижает подъём ^М-АОК, но не отменяет стимуляцию образования количества первичных и вторичных ^в-АОК, что указывает на важную роль в стимуляции ^М-ответа, вызванной повторным введением антигена, пролиферативных процессов.

4. При стимуляции ответа наблюдается подъём уровня ТЫРа, пик которого приходится на период активного образования ^М-антителопродуцентов. Связывание ТКРа, введением ТМР-связывающего белка вируса натуральной оспы в момент дополнительного поступления антигена, подавляет стимуляцию первичного и отменяет подавление вторичного ответа, что позволяет говорить о важной роли ТМРа в дифференцировке В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти.

5. Введение 11-1(3 в момент иммунизации, но не в позднюю лог-фазу развивающегося ^М-ответа, достоверно снижает первичный и стимулирует вторичный ^в-гуморальный ответ, что свидетельствует об участии II-1 (3 в регуляции гуморальных иммунных реакций в индуктивную фазу первичного ответа на антиген.

6. Глубокая депрессия первичного ответа в экспериментальных моделях, индуцированных хронической РТПХ, не сопровождается подавлением в такой же степени анамнестической реакции. Эффект проявляется более выражено у /и/шя-реципиентов при первичной иммунизации оптимальной дозой антигена. Это свидетельствует о более жёстко закреплённых процессах формирования иммунной памяти, устойчивых к действию факторов, регулирующих высоту первичного ответа, у мышей при развитии аутоиммунных патологических состояний.

7. Дискордантные изменения первичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген и последующей анамнестической реакции, наблюдаемые при физиологических и иммунопатологических состояниях, в частности, при дополнительном поступлении этого же антигена в организм или действии других регулирующих факторов, таких как ТИБа и 11-1(3, свидетельствуют о том, что уровень первичной реакции на антиген не является предопределяющим для формирования иммунной памяти.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. I

Подводя итог проделанной работы, можно говорить о том, что дополнительное введение антигена в конце лог-фазы первичного ^М-ответа дает эффект гиперстимуляции как на ^М-, так и на первичный ^в-гуморальный ответ, и приводит к последующей супрессии анамнестической реакции у мышей разного генотипа. Торможение процессов пролиферации на фоне стимуляции первичного ответа (введение гидроксимочевины одновременно с введением антигена во время лог-фазы первичного ^М-ответа) снижает подъём ^М-АОК, но не отменяет стимуляцию образования ^в-АОК, что предполагает участие в последнем случае клеток, не входящих в пул активно пролифери-рующих в этот период антителопродуцентов. Элиминация пролиферирующей активности гидроксимочевиной не оказывает влияния на вторичный гуморальный ответ, что вероятно говорит о значимой, но не определяющей роли активноделящихся в конце лог-фазы В-клеток на формирование иммунной памяти. Скорее всего, стимуляция пролиферативных процессов В-лимфоцитов, дифференцирующихся в антителопродуценты существенно сокращает пул клеток памяти и, как следствие, супрессирует вторичный иммунный ответ.

Резкая стимуляция образования антителопродуцентов дополнительным поступлением антигена в конце лог-фазы первичного ^М-ответа может вызывать дополнительную секрецию цитокинов, которые играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа.

Полученные результаты свидетельствуют об участии ТЫРа в регуляции физиологического баланса процессов дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти, проявляющемся в основном в момент активного образования ^М-антителопродуцентов. Видимо, резкая гиперстимуляция ответа обусловлена взаимосвязанными процессами активации В-клеток и продукции ими Т№а, которые начинают поддерживать друг друга по принципу положительной обратной связи, что может приводить к избыточному образованию антителопродуцентов при первичном ответе в ущерб формированию клеток памяти и, как следствие, к снижению выраженности анамнестической реакции.

Одним из цитокинов, сдвигающих баланс Thl/Th2 в сторону Th2, а это в свою очередь вызывает и поддерживает активную пролиферацию В-клеток и продукцию антител и таким образом способствует защитному гуморальному иммунному ответу, является 11-1. В нашей работе, подтверждено его влияние, но только при его введении в момент иммунизации, а не в позднюю лог-фазу IgM-ответа, что согласуется с литературными данными действия 11-1 на В-клетки в первые двое суток. Причем эти, казалось бы, однонаправленные ци-токины, проявляют в наших экспериментах различный эффект: введение 11-1(3 стимулирует, a TNFa подавляет анамнестический ответ. Возможно, это связано с временными рамками действия цитокинов и изменением пролифератив-ных процессов в разные фазы ответа: один изменяет выраженность IgG-ответа, другой - силу IgM-ответа.

Сопоставление величины специфического IgM- и IgG-ответа с уровнем общего IgE в наших опытах не обнаруживает тесной корреляции между этими параметрами. Перенося закономерности изменения содержания IgE на продукцию 11-4, можно высказать предположение, что хотя 11-4 и необходим для осуществления гуморального иммунного ответа, видимо его влияние не является критичным как при первичном ответе, так и при формировании иммунной памяти. По-видимому, его количество в норме находится на достаточно высоком уровне и не лимитирует активацию и пролиферацию антигенспеци-фических В-лимфоцитов.

Несмотря на важную сигнальную роль оксида азота в позитивной и негативной регуляции иммунного ответа и воспалении, в наших экспериментах in vivo не было выявлено четкой закономерности изменения первичного и вторичного ответа при добавлении препаратов регулирующих синтез N0 в организме.

Мыши при патологических состояниях показывает другие закономерности ответа на Т-зависимый антиген. Так у мышей с хронической РТПХ на фоне угнетенного первичного ^С-ответа, вторичный ответ демонстрирует большую сохранность. Угнетение гуморального ответа может быть вызвано текущей гиперактивацией В-лимфоцитов, которая коррелирует с развитием аутоиммунной патологии, тогда как в наших опытах иммунодепрессия была существенней у яоп/ири.у-реципиентов. По- видимому, в данном случае играет роль также баланс ТЬ1/ТЬ2-клеток, который смещён у пои/ирия-реципиентов в сторону ТЫ-клеток, что не способствует образованию антителопродуцентов, а направляет развитие ответа в сторону клеточно-опосредованных реакций. Глубокая депрессия первичного ответа не сопровождается подавлением в такой же степени вторичного иммунного ответа у /и/?и£-реципиентов. Возможно, это свидетельствует о более жёстко закреплённых процессах формирования иммунной памяти, устойчивых к действию факторов, регулирующих высоту первичного ответа. Выяснение причин дискорданса между уровнем первичного и вторичного ответа при хронической РТПХ требует дальнейшего исследования.

Несмотря на то, что характер формирования иммунной памяти трудно связать с особенностями иммунного ответа на первое введение антигена, в данном исследовании показана обратная зависимость между уровнями первичного и вторичного ответа на антиген, которая демонстрирует закономерности, благодаря которым можно прогнозировать интенсивность анамнестической реакции, зная величину первичного ^М и ^в-ответа, а это в свою очередь способствует разработке схем введения антигена и созданию наиболее эффективных вакцин.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гаврилова, Елена Давидовна, 2011 год

1. Гойман Е.В., Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Уровень IgE в динамике развития разных вариантов хронической реакции трансплантат против хозяина.// Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. - №2/1(24). - С.27-28.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры тканей в гематологии.// Томск. 1992. - 272с.

3. Гольдберг И.Д., Машная Н.В., Шурин A.A. Иммунные параметры мышей различных линий.// Бюл. Эксп. Биол. Мед. 2005. - №2. - С.219-221.

4. Гублер Е.В., Генкин A.A. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях.//!!. 1973.

5. Гурвич А.Г. Динамика антителообразования // В кн.: Иммуногенез и клеточная диффе-ренцировка. Москва. Наука. 1978. - С.128-158.

6. Гусев Е.Ю., Поносов B.J1., Кеворков H.H. Взаимосвязь клеточного и гуморального иммунного ответа на различные дозы эритроцитов у мышей // Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1991. -№9. -С.271-273.

7. Воробьев А., Быков А., Караулов А. Иммунология и Аллергология. Москва. «Практическая медицина» 2006.- 282с.

8. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьёв A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. // Санкт-Петербург, «Гиппократ» 1992. - 264с.

9. Корукова A.A., Григорьева О.С., Гурвич А.Е. Использование белково-целлюлозного комплекса для индукции у мышей антенсивного антителообразования // Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1985. - Т. 100. - №7. - С.44-46.

10. Медуницын Н.В. Повышенная чувствительность замедленного типа. // Москва. Медицина - 1983. - 160с.

11. Меньшикова Е.Б.,Зенкова Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. -2000. Т.65.-Вып.4. - С.485-503.

12. Козлов В.А., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. и др. ТЫ- и ТЪ2-зависимые варианты хронической реакции трансплантат против хозяина // Иммунология. 2002. - N.3. - С. 143146.

13. Кудаева О.Т., Гойман Е.В., Лыков А.П. и др. Влияние препаратов, изменяющих соотношение Thl/Th2, на частоту развития клинических вариантов хронической реакции трансплантат против хозяина // БЭБиМ. 2005. - №9(140). - С. 325-327.

14. Сидорова Е.В. Что нам известно сегодня о В-клетках? // Успехи Совр. Биологии. 2006. -Т. 126. - №3. - С. 227-241.15.