Антагонистическая и адгезивная активность микроорганизмов родов LAСТОВАCTERIUM и BIFIDJBACTERIUM, используемых в качестве пробиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Степанов, Константин Максимович

• Степанов, Константин Максимович
• кандидат ветеринарных наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Степанов, Константин Максимович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы

1.1. Биологические свойства молочнокислых бактерий

1.2. Бифидобактерии и их роль в организме животных

1.3. Микрофлора желудочно-кишечного тракта животных, ее биологическая роль в защите организма-хозяина

1.4. Использование бактериальных пробиотиков для коррекции микрофлоры животных

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Микрофлора фекалий здоровых поросят и поросят с признаками диареи

2.2.2. Идентификация и основные биологические свойства бифидобактерий

2.2.2.1. Видовая принадлежность бифидобактерий, выделенных

от поросят

2.2.2.2. Кислотообразующие свойства бифидобактерий

2.2.2.3. Антагонистические свойства бифидобактерий

2.2.2.4. Адгезивные свойства бифидобактерий

2.2.3. Идентификация и основные биологические свойства лактобактерий

2.2.3.1. Видовая принадлежность лактобактерий выделенных

от поросят

2.2.3.2. Антагонистические свойства лактобактерий

2.2.3.3. Адгезивные свойства лактобактерий

2.2.4. Лечебно-профилактическая эффективность бифацидобактерина

при желудочно-кишечных болезнях поросят

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антагонистическая и адгезивная активность микроорганизмов родов LAСТОВАCTERIUM и BIFIDJBACTERIUM, используемых в качестве пробиотиков»

ВВЕДЕНИЕ

Согласно современным представлениям организм человека и животных находится в определенном экологическом равновесии с представителями нормальной микрофлоры и в тесной симбиотической связи с ней. Это позволяет рассматривать макроорганизм и микробов его населяющих как сбалансированную экологическую систему в которой стабильность микробных ассоциаций определяется как эубиоз (В. Ю. Пауликас, 1990; R. Kenworty, 1991; М. М. Интиза-ров, 1994;).

Важная роль в поддержании функций некоторых органов принадлежит нормальной микрофлоре, которая благодаря выраженным ферментативным свойствам, способности синтезировать витамины, является одним из факторов естественной защиты макроорганизма (В. М. Коршунов, 1995).

На микробную экологическую систему животных неблагоприятное влияние оказывает широкое нерациональное использование антибиотиков и антимикробных препаратов в ветеринарии; ограничение контактов животных с почвой, растениями и другими естественными факторами; широкая химизация отрасли; заболевания как инфекционного, так и не инфекционного характера; нерациональное кормление; старение организма. Изменения, происходящие в микробиоценозе животных, проявляются состоянием дисбактериоза, снижением содержания нормальных симбионтов - бифидо- и лактобактерий (Н. А. Аманов, Ф. Ю. Гариб, Я. А. Умаров, 1989; Г. И. Гончарова, В. Г. Дорофейчук, А.З. Смо-лянская с соавт., 1989; В. Н. Красноголовец, 1989, Т. Mitsuoka, 1988; F. Schulze, 1987;).

В настоящее время одним из перспективных направлений в области профилактики болезней животных, вызываемых условно-патогенной микрофлорой, является применение пробиотиков - биологических препаратов из полезных микроорганизмов - антагонистов - представителей нормальной кишечной микрофлоры. Эти препараты при обоснованном применении обладают антибиотическим действием, улучшают обменные процессы в организме, подавляют ус-

ловно-патогенные микроорганизмы, а бактерии, входящие в их состав, продуцируют ряд витаминов, редуцируют нитраты, оказывают стимулирующее действие на местную защиту пищеварительного тракта. (A. Chesson, 1991; В. В. Смирнов, С. Р. Резник, 1992; В. Никитенко, 1993;) Механизм действия этих препаратов основан на заселении и регулировании нормальной микрофлоры микроэкологической ниши макроорганизма.(С. Stewart, A. Chesson, 1993)

Из-за актуальности вопроса о применении пробиотиков в связи с их безвредностью, возможностью применения в любом возрасте, безопасностью для окружающей среды возникает проблема конструирования и использования экологически безопасных биопрепаратов из представителей нормальной микрофлоры животных.

В качестве одних из основных действующих начал в производстве сухих препаратов и продуктов лечебного питания как у нас в стране, так и за рубежом, широко используются представители родов Lactobacterium u Bifidobacterium.

В нашей стране при отборе и характеристике штаммов - кандидатов в пробиотики учитывают прежде всего их технологичность, спектр и уровень антагонистической активности, что явно недостаточно (Е. И. Беляев, 1988).

Проблема адгезии микробов привлекает внимание исследователей как с точки зрения ее биологического значения в механизмах, обеспечивающих приживление микроорганизмов и формирования нормальной микрофлоры организма, так и участия ее в начальных этапах развития заболевания.

Существуют различные точки зрения в отношении возможности использования штаммов бактерий, выделенных от одних видов животных для коррекции кишечного микробиоценоза у других видов.

В научной литературе имеются отдельные сообщения об эффективном использовании антагонистических и адгезивных свойств отдельных микроорганизмов против различных видов микробов с целью профилактики и лечения различных болезней, но наиболее обобщенных данных исследований этих свойств сразу на несколько микроорганизмов, используемых в качестве пробио-

тиков, нет.

Все вышеуказанное определяет целесообразность комплексных исследований биологических свойств штаммов лакто- и бифидобактерий, особенно изучение степени выраженности антагонистических свойств и адгезивной активности, для конструирования пробиотиков с известным механизмом действия.

Цель и задачи исследования. Основной целью является изучение основных биологических свойств, антагонистической и адгезивной активности лакто-бактерий и бифидобактерий, выделяемых из кишечника поросят. В соответствии с этим на разрешение поставлены следующие задачи:

■ изучить кишечный микробиоценоз у клинически здоровых поросят и поросят с желудочно-кишечной патологией, сопровождающейся диареей. Установить количество лакто- и бифидобактерий, высеваемых из фецес здоровых и больных животных;

■ выделить из фецес поросят подсосного периода содержания культуры лакто- и бифидобактерий, установить их видовую принадлежность;

■ изучить основные биологические свойства, антагонистическую и адгезивную активность бифидобактерий, выделенных из фецес поросят и штамма В. adolescentis В-1, используемого при производстве пробиотического препарата лактобифадола (бифацидобактерина);

■ изучить основные биологические свойства, антагонистическую и адгезивную активность лактобактерий, выделенных из фецес поросят и штамма L. acidophilus ЛГ-1, используемого при производстве пробиотического препарата лактобифадола (бифацидобактерина);

■ изучить лечебную и профилактическую эффективность пробиотика лактобифадол (бифацидобактерин) при диарейных заболеваниях поросят.

Научная новизна: Изучена динамика становления кишечного микробиоценоза у поросят в условиях свинокомплекса промышленного типа.

Изучен состав кишечной микрофлоры клинически здоровых поросят и его качественные и количественные изменения при желудочно-кишечной патоло-

гии, сопровождающийся дисбактериозами и диареей.

Установлены количественные изменения основных антагонистов кишечного тракта (лакто- и бифидобактерий) при желудочно-кишечной патологии у поросят.

Определена видовая принадлежность лакто- и бифидобактерий, выделенных из фецес поросят подсосного периода содержания.

Изучены основные биологические свойства, антагонистическая и адгезивная активность лакто- и бифидобактерий, выделенных из фецес поросят в сравнении с соответствующими свойствами производственных штаммов В. adoles-centis B-l u L. acidophilus ЛГ-1, используемыми при изготовлении пробиотика лактобифадол (бифацидобактерин).

Изучена лечебная и профилактическая эффективность пробиотика лактобифадол (бифацидобактерин) при желудочно-кишечной патологии у поросят.

Практическая значимость: При сравнительном изучении биологических свойств, антагонистической и адгезивной активности лактобактерий и бифидобактерий выделенных от поросят и производственных штаммов, входящих в пробиотик лактобифадол (бифацидобактерин), установлено, что последние не уступают по производственно-ценным свойствам культурам выделенным от поросят.

Установлен высокий лечебный и профилактический эффект пробиотиче-ского препарата лактобифадол (бифацидобактерин) при желудочно-кишечных болезнях поросят, сопровождающихся дисбактериозом и диареями.

Отработаны схема применения и дозы препарата при его лечебном и профилактическом назначении поросятам. Полученные данные использованы в Наставлении по применению лактобифадола (бифацидобактерина) в ветеринарии № 13-5-2/1255 от 01.06.1998 г, утвержденного департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ветеринарно-санитарного факультета Московского

Государственного университета прикладной биотехнологии в 1996, 1997, 1998 г.г., на второй Международной научно-практической конференции, июнь 1997г.

Автор считает своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность заведующему кафедрой микробиологии Московского Государственного университета прикладной биотехнологии, Заслуженному деятелю науки РФ, доктору ветеринарных наук, профессору Михаилу Анисимовичу Сидорову, доценту кафедры микробиологии, кандидату ветеринарных наук Владимиру Викторовичу Субботину и всем сотрудникам кафедры микробиологии за ценные советы и помощь, оказанные в период выполнения и оформления работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические свойства молочнокислых бактерий

Молочнокислые бактерии - это специфическая группа микроорганизмов, обуславливающих молочнокислое брожение, т. е. распад углеводов (сахаров) до молочной кислоты. Они присутствуют в почве, различных бродящих продуктах (молочнокислые продукты, силос, фрукты, фруктовые соки и др.), на растениях, в ротовой полости, пищеварительном и мочеполовом тракте различных животных и человека. Особые биологические свойства молочнокислых бактерий обуславливают их применение в медицине, в ветеринарии, (препараты-эубиотики) и в пищевой промышленности (сыроварение, виноделие, консервирование, заквашивание силоса и др.) (Е. И. Квасников и О. А. Нестеренко, 1975, Н. E.Sharpe, 1979, В. В. Смирнов, С. Р. Резник, 1995).

В соответствии с определителем Bergey (1957) молочнокислые бактерии были сгруппированы в одно семейство Lactobacillaceae, которое делилось на два триба: Streptoccaceae (сферическая или овальная форма) и Lactobacillaceae (палочковидная форма).

В последней классификации, приведенной в определителе Bergey (1984) молочнокислые бактерии отнесены к двум отдельным семействам: Streptococ-caceae u Lactobacillaceae. В соответствии с Международным стандартом по номенклатуре (1991) молочнокислые стрептококки отнесены к семейству Strepto-соссасеае , родам Lactoccus u Leuconostoc , а молочнокислые палочки - к семейству Lactobacteriacae, роду Lactobacterium (цитируется по П. П. Степаненко, 1996).

Молочнокислые стрептококки относятся к семейству Streptococcaceae, родам Lactococcus и Leuconostoc . К гомоферментативным относятся молочный (Lac. lactis) и сливочный (Lac. cremoris) стрептококки. Гетероферментативными являются ароматобразующие стрептококки, или цитроворусы, способные продуцировать ароматические вещества (диацетил, ацетоин) и усваивать соли ли-

монной кислоты - цитраты. В эту группу входят Lac. diacetylactis, Leu. cremoris, Leu. dextranicum.

Промежуточное положение между гомо и гетероферментативными стрептококками занимает термофильный стрептококк Str. termophilus, потому его иногда называют среднегетерогенным видом.

Температурные границы жизнедеятельности этих микроорганизмов довольно широки. Для мезофильных видов оптимальная температура 25 - 30°С, но имеются и термофилы, растущие при 38 - 40°С. Минимальной температурой развития для мезофильных молочнокислых бактерий является 10°С, для термофилов - 20 - 22°С. Имеются данные, что некоторые молочнокислые бактерии способны расти при очень низких плюсовых температурах (до 3°С).

К настоящему времени опубликовано много работ, посвященных энтерококкам, в которых показано, что данные бактерии, являясь одними из представителей нормофлоры человека и животных, играют важную роль в создании оптимальных условий для жизнедеятельности организма хозяина (А. П. Крупина, 1967: G. Bellomo, 1980; R. Borgetta, 1981; А. Hevenstein et. al., 1979; К. G. Schümm et. al., 1982; N. Suegaraet. al., 1981).

Энтерококки в «Руководстве по систематике бактерий Берги» (1984) входят в 12 группу и включены в род Streptococcus в составе видов S. faecalis, S. faecium, S. durans, S. equinus, S. bovis.

По антигенному составу энтерококки объединены в серогруппу Д. Род Streptococcus включает 20 видов бактерий, близких по морфологии, ряду биологических признаков, а также связанных гомологией ДНК и РЕПС. Биохимически и экологически энтерококки значительно отличаются от других стрептококков. Эти признаки, наряду с антигенным своеобразием, являются основанием для предложения о выделении энтерококков в самостоятельный род (А. П. Калина, 1965; К. Н. Schleifer et. al., 1986).

В ряде работ показано, что по фенотипическим признакам и нуклеотид-ному составу энтерококки являются гетерогенной группой бактерий, в которой

четко выделяются представители вида S. faecalis, типичные штаммы S. faecium и подвижные энтерококки. Представители вида S. faecalis однородны, генетически близки и представляют собой обособленный, четко очерченный вид, а S. faecium является гетерогенным видом. Антигенная неоднородность энтерококков не зависела от видовой принадлежности штаммов. В белковом комплексе S. faecalis, S. faecium, группы подвижных энтерококков, выявлено 12 антигенов, которые были общими для всех изучаемых штаммов энтерококков и не обнаружены у других представителей рода Streptococcus (А. В. Драбкина, 1950; В. И. Вершинина, О. Б. Исхаково, 1982; JI. Д. Гуторова, 1989).

По биохимическим свойствам в современной номенклатуре энтерококки делятся на следующие основные группы: 1. S. faecalis с разновидностями Var. Zymogenes, разжижает желатину; 2. S. faecium; 3. S. durans - биохимически малоактивный вид. К промежуточным разновидностям, атипичным формам относятся S. innominatus (В. И. Седов, 1977).

При сбраживании фекальными стрептококками галактозы образуется, кроме молочной кислоты, уксусная, муравьиная и яблочная кислоты, этанол и углекислоты. Предшественником молочной кислоты, этонола и уксусной кислоты является пируват. В присутствии кислорода энтерококки образуют перекись водорода, которая оказывает быстрое бактерицидное действие (S. Treznnetis et. al., 1970).

Подавляющее число энтерококков свертывает молоко через 12-16 часов (при температуре 37°С), редуцирует метиленовый синий, восстанавливает лакмусовое молоко (А. П. Крупина, 1967).

Энтерококки сбраживают самые различные углеводы и спирты. Но ферментативные свойства у различных штаммов не могут служить их безусловным диагностическим признаком, так как колеблются и не постоянны.

Характерной особенностью энтерококков является их устойчивость к желчи. Этот важный дифференциальный признак представляет интерес и с точки зрения проблемы значения нормальной микрофлоры для организма. Парази-

тические микробы менее устойчивы к желчи, чем сапрофитные. Совершенно естественно, что энтерококки не могли бы быть основными микробами кишечника, если бы они не обладали этим свойством.

Для обнаружения и количественного учета энтерококков предложено около 100 вариантов селективных питательных сред. Большинство из них содержит азид Na, уксуснокислый таллий, ТТХ и некоторые другие ингредиенты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры (Калина, 1972; Mead, 1985). Наряду с этим разработаны элективные среды, в основу ингибирующего действия которых положены такие препараты, как желчь, родонистый калий, красители. В других случаях ингибирующее действие достигалось высокощелочным pH 9.6 -10.2 с включением дополнительного ингибитора (В. И. Седов, 1977).

В литературе имеются указания на антибиотическую активность энтерококков в отношении некоторых видов бактерий (С. П. Сатуновская, 1950; J. Kramer and S. Brandis, 1975; Т. Sadatsune et. al., 1978). Энтерококки подавляли рост кишечных палочек, стафилококков, сарцин, протеев, микрококков, сенной палочки, синегнойной палочки, сальмонелл, шигелл и других микробов.

У стрептококков почти всех групп обнаружены бактериоцины. Наибольшее количество бактериоциногенных штаммов в процентном отношении выявлено среди стрептококков серогруппы «Д» (J. Kramer and Н. Brandis, 1975; Т. Sadatsune et. al., 1978).

Многими исследователями было установлено, что энтерококки принимают участие в создании колонизационной резистентности кишечника (J. С. Н. Lee, 1986; V. Sulgara et. al., 1981). Однако до настоящего времени остается мало изученным вопрос о применении энтерококков для коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике животных.

Согласно Berqeys Manual of Systematic Bacteriology (O.Kandler and N. Weiss, 1986; G. John, R. Noel et. al., 1997;) лактобактерии выделены в отдельный род Lactobacillus, состоящий из 44 видов, имеющих следующие основные признаки: палочковидные клетки, обычно правильной формы, 0,5-1,2 х 1,0- 10,0

мкм. Как правило, палочки длинные, но иногда кокковидные, обычно в коротких цепочках, грамположительные, спор не образуют, в редких случаях подвижные за счет перитрихиальных жгутиков, факультативные анаэробы, иногда микроаэрофилы , слабо растут на воздухе, лучше при пониженном содержании кислорода, некоторые при выделении анаэробы, колонии на агаризованных средах, диаметром 2-5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, непигмен-тированные. Хемоорганотрофы; нуждаются в богатых сложных средах. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический; по меньшей мере половина углерода конечных продуктов брожения приходится на лактат. Нитрат не восстанавливают, желатину не разжижают, каталазоотрицательные, цитохромов не содержат.

За последнее время благодаря использованию техники гомологии олиго-нуклеотидов 16 S-p РНК достигнут значительный прогресс в установлении филогенетического родства рода Lactobacillus: показано, что представители этого рода входят в так называемую ветвь Clostridium - Lactobacillus - Bacillus, состоящую из бактерий, имеющих содержание (Г+Ц) ниже 55%. К этому же кластеру микроорганизмов могут быть отнесены роды Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus ( О. Kandier andN. Weiss, 1986; E. Stackebrandt, M. Teuber, 1988).

Структура клеточной стенки лактобактерий типична для грамположи-тельных бактерий; в большинстве случаев это многослойный пептидогликан (муреин) со связывающим пептидом состава L-лизин - Д-аспартат, хотя у L plantarum этот пептидный мостик представлен meso-диаминопимелиновой кислотой, у L. fermentum - L - орнитином (J. London, 1976). В клеточную стенку входят и полисахариды, прикрепленные к пептидогликану фосфодиэфирными связями. Мембрано-связанные тейхоевые кислоты (или липотейхоевые) представлены у всех видов рода Lactobacillus, пептидогликан связанные тейхоевые кислоты -только у некоторых видов. Их наличие во многом определяет такие свойства лактобактерий, как способность к прилипанию, антигенность и имму-

ногенность (K.W. Кпох, A.J.Wicken, 1973; Н.Ф. Дмитриева с соавторами, 1982).

Некоторые готероферментативные виды в определенных условиях формируют внеклеточную слизистую капсулу. У лактобактерий на электронных микрофотографиях часто выявляются крупные мезосомы, образующиеся путем инвагинации цитоплазматической мембраны.(1. G. Tsoi, А. S. Saparov et. al. 1994).

Основным источником энергии лактобактерий является молочнокислое брожение. На основании спектра конечных продуктов лактобактерии принято разделять натри большие группы (А. Ю. Лихачева с соавторами, 1992; О. Kandier , N. Weiss, 1986):

- облигатно-гомоферментативные бактерии, которые утилизируют один моль гексозы (глюкозу) по гликолитическому пути Эмбдена - Мейергофа, превращая ее в два моля молочной кислоты. Количество других продуктов брожения очень незначительно: при недостатке гексоз может происходить превращение пирувата в уксусную кислоту, этанол и формиат.

- факультативно-гетероферметативные лактобактерии имеют индуцибель-ную в присутствии пентоз фосфокетолазу и расщепляют их по пентозофосфат-ному пути до лактата, этанола и ацетата, а в случае наличия в среде гексоз их метаболизм происходит гликолитически до лактата.

- облигатно-гетероферметативные бактерии, у которых отсутствуют фрук-тозофосфатальдолаза и триофосфатизомераза, сбраживают пентозы по окислительному пентозмонофосфатному пути с образованием лактата, этанола, ацетата иС02.

Лактобактерии занимают промежуточное положение между облигатными анаэробами и цитохром содержащими факультативными и облигатными аэробами (Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко, 1975). Они не содержат системы ци-тохромов, осуществляющих окислительное фосфорилирование, хотя и могут переносить электроны на выступающий в качестве конечного акцептора кислород посредством цепей флавосодержащих протеинов и элиминировать образующийся супероксиданион в реакции, требующей присутствия ионов марганца. Для некоторых штаммов, в том числе входящих в микрофлору кишечника чело-

века, характерна способность продуцировать Н202 (М. JI. Горбунова, 1970). Однако каталазная и супероксид-дисмутазная активность отсутствует, что является одним из важных дифференциальных признаков молочнокислых бактерий (М. Е. Sharpe, 1979).

Антигенную структуру лактобактерий определяют прежде всего поверхностные тейхоевые кислоты и полисахариды. Выделенные при экстракции шесть антигенов, обозначенные А, В, С, D, Е , F четко соотносились с четырьмя видами лактобактерий, однако два антигена (А и Е), характерны более чем для двух видов лактобактерий. В последующем был выделен еще один антиген, названный G. Все указанные антигены охарактеризованы химически (тейхоевые или липотейхоевые кислоты), определены их антигенные детерминанты (J. London, 1976; J. Kandier, N. Weiss, 1986).

Лактобактерии в целом проявляют чувствительность к тем антибиотикам, которые активны против других грамположительных бактерий. Отмечается высокая чувствительность in vitro к пенициллину, тетрациклинам, линкомицину, и несколько меньшая к стрептомицину (W. F. Rehm , 1962), устойчивость проявляется к аминогликозидам (М. В. Тюрин, 1990; L. Morrelli et. al., 1983). Однако, в других исследованиях (Н. П. Тарабрина, 1982) наоборот отмечалась высокая чувствительность лактобактерий к аминогликозидам; по всей видимости, анти-биотикоустойчивость может различаться у разных видов и штаммов, и зависит от источника их получения. Как отмечают Козлова Е. В. с соавторами (1992), по крайней мере у 14% устойчивых к антибиотикам штаммов лактобактерий резистентность контролируется генами, гомологичными детерминантам резистентности грамотрицательных бактерий, что говорит о возможности генетического обмена между грамположительными и грамотрицательными бактериями.

Описана антагонистическая активность лактобацилл в отношении широкого круга аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных и грамположительных бактерий, кандид, облигатно-анаэробных микроорганизмов (А. Д. Амбарцумян, К. М. Дехцунян, С. Я.Атолек с соавторами, 1983; Т. Ф. Богда-

нова, В. Д Кругликов, В. И. Прометной с соавторами 1988; М. В. Тюрин, Б. А. Шендеров, Н. Г. Рахимова с соавторами, 1989; Т. Н. Грязнева, JL Я. Ставцева, 1991; A. Skarin, J. Sylwan, 1986; J. A. Mc Groarty, G. Reid, 1988; Y. Hechard, M. Dherbamer, Y. Genatiempo et. al., 1990; M. Kivanc, 1990; В. J. Juven, R. J. Mein-ersman, N. J. Stern, 1991).

Наиболее выражена антагонистическая активность у представителей видов L. acidophilus, L. plantarum, L. paracasei и в меньшей степени у L. helveticus, L. delbrueckii subsp. lactis (M. В. Тюрин, Б. Н. Шендеров, Н. Г. Рахимова с со авторами 1989).

Многими авторами описана бактериоциногения среди лактобактерий. По определению бактериоцины представляют собой белки или белковые комплексы с бактерицидной активностью, направленной против видов, близкородственным продуцирующей бактерии (J. R. Tagg, et. al., 1976). Установлено наличие бактериоцинопродукции у L. acidophilus, L. plantarum, L. helveticus, L. saki, L. bavaricus (T. Toba, et. al.,1991; S. F. Barefoot and T. R. Klaenhammer, 1984; P. M. Muriana and T. R. Klaenhammer, 1987; G. C. Upreti and K. D. Hinsdill, 1975; C. West and P. J. Warner, 1988; M. Rammelsberg and F. Radier, 1990; I. Sudirman, et.

al., 1993; A. G. Larsen, et. al., 1993). Некоторые бактериоцины очищены до гомо-

\

генности, проведен анализ их первичной структуры, клонированы и экспресси-рованы кодирующие их гены. Например, установлено, что L. acidophilus 11088 продуцирует макромолекулярный белково - липополисахаридный комплекс с молекулярной массой 180 кДа, названный авторами нативным лактоцином F идентифицирован как пептид молекулярной массой 2.5 кДа, проявляющий большую активность по сравнением с нативным комплексом (P. M. Muriana and T. R. Klaenhammer, 1991).

Известно, что за синтез бактериоцинов часто отвечают плазмидно - ассоциированные генетические детерминанты (T. R. Klaenhammer, 1988).

Однако, только для некоторых бактериоцинов лактобактерий идентифицированы кодирующие их плазмидные гены (например, для сахацина, проду-

цируемого L. Saki-Syillinge U, and F. K. Lucke, 1989); синтез же хельвенецина J определяет хромосомно ассоциированный ген L I V ( М. С. Joerger and Т. R. Klaenhammer, 1986).

Большинство описанных бактериоцинов действительно ингибируют только лактобактерии. Тем не менее, бактериоцин, продуцируемый Lactobacillus sp. выделенной из кишечника мышей ( Е. L. McCormick, D. С. Savage, 1983) проявлял активность против Enterococcus faecalis (P. М. Muriana, Т. R. Klaenhammer, 1987).

Частота присутствия бактериоцин продуцирующих штаммов среди природных изолятов для разных видов колеблется от 6 % (L. fermentum) до 63% (L. acidophilus), а частота присутствия бактериоцинчувствительных штаммов в общей популяции лактобактерии по данным В. А. Филиппова (1982) составляет 90,6 %. Эти данные говорят о возможности значения феномена бактериоциноге-нии в естественных условиях. Так, Това. et. а!. (1990), Klaenhammer Т. R. (1988) подчеркивают важность учета этого явления при создании смешанных стартер-ных культур (для приготовления молочнокислых и колбасных продуктов), заквасок для изготовления и консервирования продуктов питания.

Анализ представленных данных литературы свидетельствует о том, что молочнокислые бактерии обладают рядом полезных для макроорганизма свойств: высокой колонизирующей способностью, хорошо выраженными антимикробными свойствами, продукцией биологически активных веществ, воздействием на иммунную систему и другими важными характеристиками, которые позволяют их использовать в качестве эубиотиков. Это определяет целесообразность комплексных исследований по углубленному изучению биологических свойств существующих производственных и перспективных в качестве эубиотиков штаммов молочнокислых бактерий и подбор новых штаммов в оптимальных сочетаниях.

1.2. Бифидобактерии и их роль в организме животных.

Бифидобактерии являются доминирующей микрофлорой кишечника человека и животных и служат специфическим фактором защиты организма.

Морфологически бифидобактерии представляют собой палочки, чрезвычайно вариабельные по форме, 0,5 -1,3 х 1,5 - 8 мкм, обычно несколько изогнутые, булавовидные и часто разветвленные. Расположение клеток одиночное, парами, V- образные, иногда цепочками, полисадом или розетками. Иногда встречаются раздутые кокковидные формы. Грамположительные; окрашивание часто неравномерное. Неподвижные; неспорообразующие; некислотоустойчивые. Анаэробы. Некоторые виды могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10% С02 . Не растут при РН<4.5 или >8.5. Хемоорганотрофы; активно сбраживают углеводы с образованием в основном уксусной и молочной кислот в молярном соотношении 3:2; СОг , а также масляную и пропионовую кислоты не образуют. Каталазоотрицательные (в редких случаях положительные при росте в атмосфере воздуха с добавлением СО2). Как правило, нуждаются в различных витаминах. Оптимальная температура для роста 37 - 41°С. Обнаружены в ротовой полости и кишечнике у теплокровных позвоночных, у насекомых и в сточных водах; отмечены при инфекционных процессах у человека, однако обычно считаются не патогенными (G. John, Holt, R. Noel, Krieg et. al, 1997). От лакто-бацилл они отличаются образованием ответвленных, разделенных перегородками палочковидных форм, очень напоминающих актиномицеты и коринебакте-рии.

Если Н. Tissier в 1900 году отнес бифидобактерии к группе молочнокислых бактерий, то S. Orig - Jensen (1924) выделил их в род Bifidobacterium и назвал Bifidobacterium bifidum. JI. Г. Перетц (1955), Н. Werner, Н. Seeliger (1964) и другие считали, что надо эти бактерии назвать Bacterium bifidum.

При сравнительном изучении ультратонких срезов бактериальный клеток L. acidophilus и В. bifidum К. licfeld (1967) выявил существенные различия в

толщине клеточных стенок и морфологии бактериальных форм, что не позволяет отнести L. acidophilus и В. bifidum к одному роду Lactobacillus. В "Руководстве по систематике бактерий Берги» (1984-1989) бифидобактерии отнесены к семейству Actinomycetaceae роду Bifidobacterium. Палочки чрезвычайно вариабельные по внешнему виду, некислотоустойчивые, спор не образуют, часто окрашиваются неравномерно. (О. Kandier and N. Weiss, 1986; Е. Stackebrandt, М. Teuber, 1988).

В настоящее время доказано, что в микрофлоре кишечника большинства видов животных характерны специфичные виды этих микроорганизмов. Преобладающими видами бифидобактерии у поросят являются В. thermophilum, В. pseudolongum, В. suis, у телят и ягнят- В. pseudolongum и В. longum subsp. animalis у цыплят- В. thermophilum, в отличие от В. bifidum, В. longum, В. breve (В. parvulorum), В. adolescentis, В. infantis, (В. lactentis, В. liberorum), встречающихся у человека. (Г. И. Гончарова, 1986, И. К. Зитаре, 1986, А. М. Лянная, М. М. Интизаров, Е. Е. Донских, 1986, М. А. Тимошко, В. Г. Холмецкая, И. Ф. Бурсук, 1983, I. G. Rasic, I. V. Rurrmann, 1983, A. L. McCarthey, М. А. McConnell, 1997). Функции их в пищеварительном тракте изучались, главным образом, исследователями медицинского профиля (В. Г. Геймберг и др., 1964; В. Ф. Семенихина, 1968, 1970; Г. И. Гончарова, 1970; В. В. Сорокин, М. А. Тимошко, А. В. Николаева, 1973; М. Shuler et al., М. S. Park, К. H. Lee, 1997).

Бифидобактерии выполняют в организме животных важную физиологическую роль, обусловленную их защитной и синтетической функциями, а также участием в конечном звене пищеварительного процесса (метаболизме белков, липидов, углеводов). Бифидобактерии оказывают положительные влияния на структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность. Ферментируя сахара, они создают в кишечнике кислую среду, способствующую всасыванию в кровь кальция, железа, неорганических фосфатов, а также витамина D. ( Т. М. Эрвольдер, С. А. Гудков , 1984).

Впервые на способность бифидобактернй подавлять размножение гнилостных и патогенных микроорганизмов в кишечнике указал К. Boventer (1949). Эти микроорганизмы синтезируют различные вещества, в частности, витамины группы В, отсутствие которых приводит к авитаминозу. Витаминов группы В они образуют в два - три раза больше, чем кишечная палочка. По данным В. Ф. Семенихиной (1970), бифидобактерии синтезируют витамины в следующих количествах (мгк %): пантотеновой кислоты 0-12, рибофлавина 0-16, тиамина 1 -2.5, фолиевой кислоты 3-8, кобаламина 0.007 - 0.01.

По данным английских исследователей L. Bullen, Р. Tearle (1976), в результате кислотообразования бифидобактерий в кишечнике животных образуется ацетатный буфер, который обладает бактериостатическим действием.

В результате экспериментов, проведенных на гнотобиотических животных, доказана важная активная роль бифидобактерий в обеспечении функции иммунных систем макроорганизма.

Бифидобактерии образуют из органических азотистых соединений некоторые незаменимые аминокислоты - аланин, валин, аспарагиновую кислоту, изолейцин, что имеет важное значение для нормального течения иммунных процессов и синтеза клеточных структур ДНК и РНК. Положительная роль бифидобактерий в организме животных связана с их способностью дезактивировать токсичные продукты азотного обмена, например нитрозоамины, обладающие потенциальным канцерогенным действием, а также оказывать антиопухолевые и противовирусные действия.

При дефиците бифидобактерий у гнотобиотических животных наблюдаются резкое недоразвитие лимфатической ткани пищеварительного тракта, а также почти полное отсутствие клеток, продуцирующих иммуноглобины.

Бифидобактерии не только стимулируют развитие гуморальной и клеточной защитных систем организма, но и непосредственно подавляют развитие в кишечнике многих видов патогенных бактерий. Установлены их антагонистиче-

ские свойства по отношению к сальмонеллам, шигеллам, патогенным Е. coli, клебсиеллам, протею, гноеродным коккам, стафилококкам, CI. perfingers, а также холерным вибрионам (I. G. Risik, I. V. Rurmann, 1983). Природа антагонистического действия бифидобактерий до конца не выяснена и связана с рядом ингибиторных механизмов. Они подавляют рост попадающих в кишечник патогенных микроорганизмов путем образования органических кислот, конкуренции за участки эпителия, на которых может происходит прикрепление микроорганизмов, деконъюгации желчных кислот, образования бактериоцинов и антибиотических веществ (И. К. Зитаре, 1983, Т. М. Эрвольдер, С. А. Гудков, А. В. Гудков, Н. В. Душенин, 1984). Они превращают часть ферментируемой глюкозы в уксусную кислоту, другую часть - в молочную. Г. И. Гончарова (1979) и другие исследователи установили, что бифидобактерии продуцируют около 60 % уксусной и 40 % молочной кислот.

М. Я. Гудкова и Т. М. Эрвольдер (1986), изучая антагонистическую активность бифидобактерий, установили, что она обусловлена не только продуцированием этими микроорганизмами уксусной и молочной кислот, но и образованием специфических антибиотических веществ, оказывающих ингибирующее влияния на Е. coli. Антибиотические вещества, выделяемые бифидобактериями, накапливаются в основном в стационарной фазе роста. Исследование свойств этих веществ показало, что они проходили через мембранный фильтр и были термостабильными. После десятиминутного прогрева при 95 - 98°С фильтрат не изменял силы своего ингибирующего воздействия на Е. coli, а после раскисления до нейтральной реакции среды не утрачивал антагонистических свойств.

Бифидобактерии, наряду с улучшением перистальтики и подавлением грамотрицательной микрофлоры, препятствуют развитию гнилостных и газообразующих микробов, способствуют всасыванию кальция, железа. Таким образом, бифидобактерии повышают общую сопротивляемость организма к инфекциям (В. В. Сорокин и др., 1973, С. S. Huh, Y. J. Baek, Н. U. Kim, 1995).

В последнее время во всем мире большое внимание привлекает использование бифидобактерий в производстве бактериальных препаратов , доказана наиболее высокая эффективность их применения для нормализации и регулирования кишечной микрофлоры. Положительные результаты по профилактике и лечению кишечных заболеваний телят и поросят показали такие отечественные медицинские сухие сублимированные препараты, как "Бифидумбактерин " и " Бификол " (И. К. Зитаре , 1986).

Положительные данные об эффективности использования бифидобактерий подтверждаются исследованиями, проведенными за рубежом. Во Франции разработаны пробиотические препараты "Лио - бифидус" и "Бифидоген", содержащие бифидобактерии; в Австралии - "Еулаган", Венгрии - "Лактомикс", Германии - "Омнифлора", представляющие собой смесь чистых культур бифидобактерий, ацидофильной и кишечной палочек (В. Г. Зароза, 1985).

Экспериментальное изучение совместного культивирования бифидобактерий с молочнокислыми микроорганизмами показало стимулирующее влияние на развитие бифидобактерий в совместных культурах мезофильных молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек вида L. acidophilus (А. В. Гудков, Т. М. Эрвольдер, М. Я. Гудкова, Л. Г. Семенова, Г. И. Гончарова, 1986). По -видимому, молочнокислые бактерии могут синтезировать необходимые факторы роста бифидобактерий.

Таким образом, анализируя данные многих авторов, можно сделать заключение, что бифидобактерии выполняют важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности организма животных, формировании его неспецифического иммунитета, что определяет эффективность их применения для профилактики и лечения кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных, а также для стимуляции его роста. Доминирующее положение бифидобактерий у здоровых животных, наличие у них антагонистических, витамино-синтезирующих и других полезных свойств позволяет сделать вывод, что сни-

жение этих микроорганизмов в составе кишечной микрофлоры является одним из патологических проявлений, признаком, определяющим состояние дисбакте-риоза. Поскольку одним из эффективных способов восстановления микробиоценоза является применение препаратов из живых клеток бифидобактерий, возникает необходимость совершенствовать существующие бактериальные препараты из бифидобактерий.

1.3. Микрофлора желудочно - кишечного тракта животных, ее биологическая роль в защите организма - хозяина

В процессе филогенетического развития в пищеварительном канале животных сформировалась микроэкологическая система, характерная как для каждого вида животных, так и для различных отделов желудочно-кишечного тракта.

В настоящее время является общепринятым тот факт, что нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта вносит существенный вклад в поддержание состояния здоровья животного.

Луи Пастер еще в 1885 году утверждал, что «нормальная флора необходима для жизни». Он же выдвинул и конкретные пути доказательства этого утверждения: применение безмикробных животных для получения «чистых культур» «хорошо идентифицированных микроорганизмов» in vivo. И. И. Мечников считал вполне возможным нормальное существование безмикробных животных и, более того, такая ситуация, по его мнению, должна быть более благоприятной: в кишечнике существуют такие микробы, которые являются антагонистами хозяину в борьбе за факторы необходимые для жизни (И. Мечников, 1901). В его лаборатории уже 1912-13 г. г. были получены безмикробные цыплята, головастики лягушки и мухи. Однако, только в экспериментах J. Reyniers et. al. (1949), которые впервые получили естественно размножающиеся популяции безмикробных цыплят и крыс, была полностью подтверждена возможность безмикробной жизни. В дальнейшем с помощью таких гнотобиотических моде-

лей была успешно показана та значительная роль в жизни макроорганизма, которую играет нормальная микрофлора.

Совокупность этих исследований позволила разделить всю микрофлору, присутствующую в организме-хозяине на индигенную (аутохтонную) и транзи-торную (аллохтонную). Наиболее важную роль для макроорганизма играет именно индигенная часть микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Нормальная микрофлора представляет собой открытую саморегулирующуюся систему, которая находится в динамическом равновесии с окружающей средой и макроорганизмом. Это состояние данной трехзвенной экологической системы принято называть «эубиотическим» или «эубиозом». Несмотря на относительную стабильность эубиотического равновесия, оно может быть смещено или нарушено как под действием факторов окружающей среды, к которым относят прием антибиотиков и некоторых других лекарственных средств, ионизирующее облучение, изменение диеты, голодание, психо-эмоциональные перегрузки, время года, так и при физиологических и патологических изменениях в макроорганизме: старении, при острых и хронических болезнях инфекционной и неинфекционной природы желудочно-кишечного тракта, опухолях, оперативных вмешательствах, иммунодефицитах (Б. В. Пинегин с соавт., 1984; В. Н. Красноголовец, 1989; Г. И. Гончарова с соавт., 1989; И. Б. Куваева, К. С. Падо-до, 1991; Л. И. Кадарская с соавторами, 1992; А. В. Леванов с соавт., 1993; Б. А. Ефимов, 1993; Д. Ван Дер Ваай 1992; Б. М. Бии^оМ «Л. а1., 1983, 1986; Т. Мй-эиока, 1989; А. ШЬеск е! а! 1991;).

Одной из основных функций, связанной с защитой макроорганизма от проникновения и колонизации чужеродными микроорганизмами является создание индигенной микрофлорой так называемой колонизационной резистентности желудочно-кишечного тракта, определяемой способностью некоторых представителей нормальной микрофлоры адгезироваться на мукозном эпителии, образуя на нем «анаэробный пристеночный слой» (Б.Уап с1ег \Vaar, 1987). Тесно связанной с колонизационной резистентностью является способность индиген-

ных микроорганизмов нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта к стимуляции иммунитета макроорганизма (Б. В. Пинегин с соавторами, 1984).

Нормальная микрофлора пищеварительного тракта играет важную роль в общем метаболизме животных. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта благодаря своим ферментативным свойствам перерабатывают значительное количество органических веществ, синтезируют высокоценный белок, аминокислоты, витамины, антибиотические вещества и другие ценные метаболиты.

Установлена выработка микроорганизмами желудочно-кишечного тракта некоторых витаминов, участие в процессах пищеварения (регуляция перистальтики; выработка энзимов метаболизма белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот) и водно-солевом обмене, метаболизме желчных кислот, холестерина, стероидов; детоксикация эндогенных и экзогенных токсинов и ксенобион-тов, антимутагенная роль (Б. А. Шендеров и М. А. Манвелова, 1992; P. А Маск-owiak, 1982; D. J. Hentges, 1983).

Данные литературы свидетельствуют о том, что в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных входят бифи-добактерии, молочнокислые бактерии, энтерококки, эшерихии, стафилококки и спороносные анаэробные микроорганизмы типа клостридий (М. Shapiro et. al. , 1949; В. Г. Геймберг, 1957; А. Лизько, 1969; Т. Mitsuoka , 1969; Е. Morishita et. al. , 1971; В. С. Шилов с соавторами, 1972; В. В. Сорокин, М. А. Тимошко, А. В. Николаева, 1973; I. Drown, М. Warhurst, J. Areot, 1997;).

По данным В. Г. Геймберга с соавторами (1964), нормальная микрофлора кишечника человека состоит из облигатно-анаэробных бактерий (0,1-12 млрд), ацидофильных бактерий (10 тыс-1 млрд), кишечной палочки (1тыс-1 млрд), и стрептококков (0-800 млн) в 1 г фецес. У животных (собаки, кролики, белые крысы) кишечная флора качественно различается, но имеет ряд сходных черт с таковой у человека. У белых крыс и мышей в кишечнике преобладают ацидофильные бактерии, которые составляют миллиарды и сотни миллиардов микробных клеток в 1 г фецес. В большом количестве содержаться стрептококки и

спороносные анаэробные бактерии, а бифидобактерии - в меньшем количестве (Silva de Ruis, Lopes de Bocanera et. al., 1996).

Состав микрофлоры кишечника собак отличается более высоким содержанием стрептококков и спороносных анаэробных бактерий, которые встречаются постоянно и иногда в очень больших количествах. Группа анаэробных бесспоровых бактерий также представлена довольно обильно, но не с таким выраженным преобладанием, как у человека. Количество молочнокислых и кишечных палочек находится на том же уровне, что и у человека.

Отечественные и зарубежные исследователи к строго облигатной микрофлоре желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота относят микроорганизмы родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, Bacteroides и другие. Имеется информация о микрофлоре фекалий телят (И. К. Зитаре, 1983;). По мнению автора, пищеварительный тракт телят в условиях благополучного по желудочно-кишечным заболеванием хозяйстве в течении 12 часов после их рождения свободен от микроорганизмов, а через 13-18 часов у 90,8 % животных в 1 г фекалий обнаруживается 106 микробных клеток. У 81,8 % исследованных телят суточного возраста содержится более 10 млн эшерихий. Бифидобактерии, стафилококки, протеи не обнаружены. У 47,1 % телят суточного возраста высеваются лактобациллы порядка 1 млрд.

Нормальная микрофлора кишечника поросят изучена недостаточно. В литературе имеются лишь единичные, разрозненные сообщения о содержании в их пищеварительном тракте отдельных видов микроорганизмов.

Так, Ф. X. Ахметзянов (1966), считая, что биоценоз кишечника поросят состоит из молочнокислых бактерий, кишечных палочек, энтерококков, бацилл перфингренс и дрожжеподобных грибов, не указывает видовой состав изучаемой микрофлоры.

Японские исследователи Т. Mitsuoka (1969), J. Marishita et. al. (1971) сообщили о выделении из содержимого кишечника поросят бифидо- и молочно-

кислых бактерий. При этом к резидентной микрофлоре кишечника свиней отнесены L. acidophilus, L. salivarius, L. fermenti.

M. С. Полонская и другие (1971) обратили внимание на наличие в кишечнике поросят L. acidophilus.

V. Landaeta et. al. (1966), исследуя 240 образцов кишечного содержимого, выделили 595 штаммов микроорганизмов, среди которых анаэробные бактерии составили 82,12%; молочнокислые -7,56%; дрожжи -7,06% и клостридии -3,19%.

P. Mateuti et. al. (1971) выделили от поросят 2-6 недельного возраста би-фидобактерии, которые отнесены к В. suis (76,9%), В. thermophilum, В. globosum (21 %) и В. pseudolongum (7,7 %).

М. А. Тимошко и другие (1971) установили, что бактериоценоз пищеварительного тракта поросят включает микроорганизмы родов Bifidobacterium, Вас-teroides, Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus.

При определении видовой принадлежности выделенных культур микроорганизмов М. А. Тимошко (1983) установила что бифидофлора кишечника поросят раннего возраста состоит из двух видов Bifidobacterium thermophilum, В. pseudolongum; молочнокислая из четырех: L. acidophilus, L. salivarius, L. fermenti, L. plantarum; стрептококковая из пяти: Streptococcus faecalis, Str. faecium, Str. lactis, Str. salivarius, Str. bovis; эшерихии - E. Coli, бактероиды - Bacteroides raminicola и протей Proteus mirabilis, Pr. vulgaris.

Одним из облигатных представителей нормальной микрофлоры животных со строгими неспорообразующими анаэробами (бифидобактериями, про-пионобактериями, бактероидами) являются молочнокислые бактерии, которые присутствуют в различных отделах пищеварительного тракта и мочеполовой системы (И. А. Бочкова, Н. А. Семина, А. А. Демина, 1995).

Лактобактерии являются пристеночными микроорганизмами и входят в состав так называемой мукозной или М-флоры (Б. В. Пинегин с соавторами, 1984). Именно это специфическая экологическая ниша лактобактерий в кишеч-

нике, связанная с наличием у них выраженной способности к адгезии на мукоз-ном слое слизистой оболочки и определяет роль этих микроорганизмов в поддержании постоянства микробиоценоза кишечника и его колонизационной резистентности (Е. М. Горская, 1988).

Способность адгезироваться на сквамозном эпителии является не общим свойством представителей рода Lactobacillus, а лишь потенциальным признаком, проявляющимися в определенных условиях и закрепляющимся путем отбора. Многими исследователями установлена видовая специфичность процесса адгезии лактобактерий; некоторые из высокоадгезивных лактобактерий хорошо фиксируются на эпителии одних видов животных и не взаимодействуют с аналогичными клетками, полученными от других животных (R. Fuller, 1981).Показано, что за связывание с эпителиоцитом ответственны белково-полисахаридные комплексы ресничек в поверхностном субслое микрокапсулы лактобактерий. М. В. Далин и Н. Г. Фиш, (1985); Е. С. Kleeman and Т. R. Klaen-hammer, (1982) установили, что лактобактерии могут нести как минимум два вида адгезинов. Со стороны эпителиоцитов взаимодействующей структурой выступают, по видимому, кислые полисахариды (R. Fuller, 1981). Процесс адгезии лактобактерий включает в себя и неспецифические компоненты (электростатические, гидрофобные взаимодействия, образование водородных связей и другие). Е. М. Горская, (1988); В. И. Брилис, (1983); R. Fuller,(1975) отмечают, что адгезинактивные штаммы лактобактерий имеют преимущество при колонизации пищеварительного тракта тем не менее, не только способность микроорганизма к адгезии на клетках макроорганизма in vitro определяет его способность колонизировать кишечник животного. Дополнительными, действующими на прилипание in vivo факторами, которые могут воспрепятствовать адгезии являются секреторные иммуноглобулины, аналоги рецепторов эпителиоцитов, разнообразные ингибиторы бактериального размножения, ионный состав, редокспотенциал среды (P. A. Mackowiak, 1982), а также конкурентные

взаимоотношения с другими лактобактериями на этапе колонизации (P. G. Sarra et. al., 1987).

Эти факторы могут в большей или меньшей степени иметь место как у животных с обычной флорой, так и у безмикробных животных. Согласно Du-clureu R. (1984) только для некоторых штаммов лактобактерий наблюдается не-

7 ft О

сколько пониженное (10 по сравнению с 10 - 10 КОЕ (г)) приживление в кишечнике животных - гнотобионтов. В случае же конвенциональных животных решающим фактором при колонизации кишечника экзогенными бактериями является конкурентная борьба с резидентной флорой по разнообразным механизмам. Freter R. (1983), на основании построенной им математической модели утверждает, что постоянность и стабильность микробной популяции резидентных штаммов кишечника определяется в первую очередь их адгезией на стенке кишечника, это же делает весьма ограниченными возможности для приживления постороннего микроорганизма. Действительно, экзогенные лактобактерии, практически не обладают способностью колонизировать тонкий кишечник и имеют изначально низкую способность взаимодействовать со слизистой толстого кишечника конвенциональных мышей (Н. П. Тарабрина, Б. В. Пинегин, 1979; Н. П. Тарабрина, 1980).

В способность лактобактерий поддерживать колонизационную резистентность кишечника, наряду с адгезивными свойствами, вносит свои вклад и их антагонистическая активность, продемонстрированная во многих экспериментах in vitro против различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: представителей семейства Enterobacteriaceae (родов Escherichia, Proteus, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Shigella), псевдоманад, стафилококков, стрептококков, холерных вибрионов, листерий, кампилобактеров, некоторых грибов (Б. В. Пинегин с соавторами 1984; О. В. Чахава с соавт. 1982; S. J. Bhatia, 1989; A. Coghlan, 1990; I. Suzuki et. al., 1991). Действующим началом феномена антагонизма лактобактерий in vitro чаще всего служат вырабатываемые ими молочная и уксусная кислоты, перекись водорода, лизоцим, бактериоцины (Е. И. Квасников и О.

А. Нестеренко, 1975; М. В. Тюрин с соавторами, 1991; S. Mitic, 1973; Т. R. Klaenhammer, 1990).

Однако, в системе in vivo вступают в действие такие мощные факторы, оказывающие влияния на исход межмикробного взаимодействия, как выработка секреторных антител, стимуляция процессов фагоцитоза, клиренс, конкуренция за лимитирующие питательные вещества и за сайты прикрепления к кишечной стенке, расщепление и нейтрализация ингибирующих веществ, синтез лизоцима и интерферона, и образование таких ингибиторов, которые не присутствуют при исследованиях in vitro, например летучих жирных кислот (D. С. Savage, 1980, Р. A. Mackowiak, 1982). Другими словами, для проявления антагонистической активности in vivo в кишечнике человека или животных, лактобактерии должны не только успешно колонизировать кишечный тракт (что включает в себя и первоначальную адгезию и последующее выживание), но и обладать такими свойствами, которые позволяли бы им получить преимущество в конкуренции с другими микроорганизмами. Только применение гнотобиотической модели безмикробных животных позволило более корректно изучить именно то взаимодействие, которое интересует исследователя (R. Duclureau, 1984, V. Kmet, М. Kmetova et. al., 1995).

В одном из таких экспериментов безмикробных морских свинок перо-рально заражали патогенным штаммом Е. coli, который вызывает диарею и гибель в течении двух недель, после чего животные получали культуру лактобактерии: в течении первой недели эксперимента оба микроорганизма достигали в кишечнике концентраций порядка 109, но затем концентрация Е. coli уменьшалась на два порядка, тогда как лактобактерии сохраняли популяцию и свинки не погибали (Т. D. Luckey, 1979). Однако, лактобактерии в системе in vivo не всегда проявляют антагонистический эффект по отношению к патогенным и условно - патогенным микроорганизмам даже если наблюдается активность in vitro. Так, введение крысам, предварительно зараженным V. cholerae лактобакте-рий L. plantaran и L. fermentum, которые in vitro подавляли развитие вибрионов

не приводило к элиминации последних из кишечника (О. В. Бароян с соавт., 1978). С. Н. Барзашка - Попова (1990) установила, что профилактическое введение тотально - деконтамированным мышам, содержащимся в условиях ОГБИ, живых L. acidophilus «Soleo» 11, являвшихся эффективными антагонистами сальмонелл, протеев, эшерихий, стафилококков in vitro, приводило к выраженной ингибиции ростов данных условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике безмикробных животных: однако, полного соответствия между экспериментами in vitro и in vivo не наблюдалось. Заслуживают внимания результаты эксперимента по вытеснению Bacillus subtilis из кишечника монокантамирован-ных крыс-гнотобионтов: лактобактерии, приживляясь в дистальном отделе тонкой кишки, приводили к снижению количества В. subtilis в кишечном содержимом, но не на стенке кишечника (А. А. Ленцнер с соавт., 1980).

По всей видимости, в каждом конкретном случае комбинация факторов, обуславливающих антагонистическую активность лактобактерий in vivo может быть различна. Freier R. (1983), основываясь на результатах математического моделирования, отрицает роль прямых ингибиторов бактериального деления, таких, например, как молочная кислота или бактериоцины, в физиологической регуляции состава кишечного микробиоценоза. Согласно его выводам, сосуществование стабильных уровней бактериоцин - продуцента и бактериоцин - чувствительного штаммов возможно только при постоянной концентрации бакте-риоцина, что не выполнимо в естественной микроэкологической системе кишечника. Однако, даже в случае принятия этой точки зрения нельзя, по видимому, полностью отбросить возможную роль бактериоцинов как в создании колонизационной резистентности кишечника, так и в конкурентном вытеснении одного микроорганизма другим из кишечника. Поэтому, значение бактериоци-нопродукции как в изолированной стабильной экосистеме микрофлоры кишечника в норме, так и при вторжении в нее посторонних микроорганизмов до сих пор является предметом дискуссии.

С одной стороны, на различных экспериментальных моделях инфекционной патологии действительно было отмечено присутствие корреляции между способностью Е. coli и стрептококков продуцировать бактериоцины in vitro и их ингибирующим действием in vivo (S. Р. Haibert, 1948; D. R. Friedman, S. P. Halben, 1960; A. I. Brant, J. C. Siemienski, 1965; L. B. Guze et. al., 1969; H. W. Smith, V. D. Huggins, 1976) в других же работах, в том числе и в проведенном I. Kari et. al. (1969) прямом исследовании взаимодействие колициногенных и колицинчув-ствительных штаммов в кишечнике мышей-гнотобионтов, такой связи выявлено не было (Н. J. Sears et. al., 1949; А. I. Steelman et. al., 1970).

Некоторые бактериоцины лактобактерий обладают достаточно широким

nc/тс ¡>г я я мл j

спектром ингибирующей активности, включающим в себя /Условно-патогенных представителей листерий, клостридий, стрептококков (Е. L. McCormick and D. С. Savage, 1983; Т. R. Klaenhammer, 1990), что может представлять определенный интерес при создании бактерийных препаратов-эубиотиков.

В последнее время работами ряда исследователей установлена иммуномо-дулирующая активность лактобактерий. Иммуностимулирующий эффект нормальной микрофлоры четко выявляется при изучении состояния иммунной системы животных-гнотобионтов, которые лишены контакта с микроорганизмами кишечника. В целом можно говорить об относительном иммунологическом дефиците у таких животных (О. В. Чахава, 1982; Б. А. Шендеров, 1987; Р. А.

(

MacCowiak ,1982). Эти нарушения быстро исчезают при контаминации безмикробных животных представителями нормальной микрофлоры (конвенциализации) (Н. A. London and Pestih., 1971). Иммунотропное действие оказывают многие бактерии -представители нормальной микрофлоры; нормальные эшерихии, бифидобактерии, бактероиды, пропионобактерии, фузобактерии, лактобактерии, стрептококки и другие (Б. В. Пинегин с соавт., 1984; Н. Н. Мальцева с соавт., 1992; V. Rusch, 1987), но механизм и результаты его воздействия во многих случаях различные: это и прямая антигенная стимуляция, и опосредованное компонентами микробной клетки иммуномодуляция, причем

различные микроорганизмы могут оказывать как иммуностимулирующие, так и иммунодепрессивные действия (Я. С. Шварцман и Л. Б. Хаденсон, 1978; Б. В. Пинегин с соавт., 1987; R. D. Berg andD. С. Savage, 1975; Т. Hofstudt, 1980;).

Как индигенные, так и неиндигенные для данного макроорганизма лакто-бактерии проявляют очень слабую иммуногенность, более того, наблюдается явление «приобретенной иммунологической толерантности» (R. D. Berg, 1983) иммунотропные же свойства лактобактерий, опосредуются неспецифическими механизмами. В связи с тем, что лактобактерии существуют в кишечнике в тесном контакте со слизистой, в первую очередь их влиянию подвержены компоненты мукоз-ассоциированной лимфоидной системы, а именно ассоциированная с кишечником лимфоидная ткань - GALT (gut accosiated lymphoid tissue). К ней относят организованные элементы (пейеровы бляшки тонкого кишечника, соли-тарные фолликулы, мезентериальные лимфатические узлы) и рассеянные элементы - Т и В лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, располагающиеся в lamina propria слизистой оболочки кишечника которые могут служить клетками-предшествинниками для lg-A иммуноцитов (Н. Kawamishi et. al 1983, J. R. Mcghee and J. Mestecku, 1983, P. Branjtzaeg and B. K. Jorbe, 1987).

Стимуляция образования lg-продуцентов в стенке кишечника под действием лактобактерий приводит к усилению выработки секреторных lg А, защитное действие которых состоит в ингибиции адгезии неиндигенных микроорганизмов, нейтрализации вирусов и элиминации растворимых антигенов, предотвращении их адсорбции на поверхности слизистой ( P. S. Mcnabb and Т. В. Tomasi 1981). Установлена активация перитонеальных макрофагов при перо-ральном введении лактобактерий (G. Perdigón 1986; V.M. Korschunov et. al., 1990;) Лактобактерии проявляют адьюватный эффект, приводя к усилению реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), стимулируют миграцию моноцитов, активируют нейтрофилы крови ( А. А. Ленцнер 1987).

Действие лактобактерий на иммунную систему связывают в первую очередь с производными их клеточной стенки компонентами пептидогликана, а также тейхоевыми кислотами и внутриклеточными составляющими (РНК) (Н. Н. Мальцева, 1988). Иммунотропный и адьюватный эффект компонентов пептидогликана относят к наименьшему адьюватно-активному соединению - мура-мил-дипептиду (Ы ацетилмурамил Ь - аланин Д -изоглутамин) и его производным (Н. Н. Мальцева с соавт., 1992; Б. Е. Б Stewart-Tull, 1980), которые могут образовываться в физиологических условиях при воздействии на нормальную микрофлору лизоцима (в. ЫашЬае! а1. ,1981).

Иммуномодулирующей активностью обладают полисахариды и комплексы полисахарид-пептидогликан, выделенные из клеточной стенки лактобактерий. К. Йотою, (1989); I ВеиЛ е! а1.,( 1990); I. а Т8о1, А. Б. Барагоу е1 а1., (1994;) показали, что лактобактерии способны к высвобождению низкомолекулярных соединений пептидной природы, обладающих иммуномодулирующими свойствами.

Таким образом, данные литературы свидетельствуют о наличии большой физиологической значимости нормальной микрофлоры человека и животных, ее способности неспецифически стимулировать иммунологические параметры макроорганизма. Это свойство, во многом обуславливающее защитную роль нормальной микрофлоры для организма-хозяина, может, по всей вероятности, иметь различную выраженность у разных штаммов бактерий, что необходимо учитывать при создании бактериальных препаратов-эубиотиков на основе полезных микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры.

1.4. Использование бактериальных пробиотиков для коррекции

микрофлоры животных.

Для животноводства весьма актуальна проблема профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний. Кишечная микрофлора - чуткий индикатор, реагирующий на многие факторы, в том числе высокую концентрацию животных, стресс, вакцинацию, частую смену корма.

Перевод животноводства на промышленную технологию содержания и кормления, ограничения контактов животных с почвой, растениями и другими естественными факторами, а также широкая химизация отрасли и нерациональное применение антимикробных средств способствовали нарушению микробных экологических систем в пищеварительном тракте и возникновению дисбак-териозов. В свою очередь, это вызвало нарушение процессов пищеварения, обмена веществ, снижение резистентности и продуктивности животных, широкое распространение желудочно-кишечных болезней особенно у молодняка. Установлено, что в условиях свиноводческих промышленных комплексов нарушение нормального состава микрофлоры весьма значительно и происходит оно за счет резкого уменьшения симбионтных микроорганизмов. (F. Schulze, 1977 ).

Поэтому в течение последних двух десятилетий в мире резко возрос интерес к симбионтным микроорганизмам и пробиотическим препаратам на их основе. Этому способствовало также бурное развитие биотехнологии и лиофили-зационной техники.

Пробиотики - биологические препараты, представляющие собой стабилизированные культуры симбионтных микроорганизмов или продукты их ферментации , которые способствуют росту последних. ( R. Freter, 1974 ). Они обладают разносторонним фармакологическим действием. Положительный эффект пробиотиков обусловлен их участием в процессах пищеварения и метаболизма организма-хозяина, биосинтезом и усвоением белка и многих других биологически активных веществ, обеспечением резистентности микроорганизмов. Нормальная деятельность многих систем и органов животных в значительной степени зависит от видового состава и межвидового соотношения микроорганизмов, заселяющих их с момента рождения.( S. Cerguiglini, 1974).

Участие симбионтных микроорганизмов в азотистом ( белковом) питании является одной из основных их функций. В результате сложных биохимических процессов, протекающих в желудочно-кишечном тракте хозяина, микроорганизмы, усваивая поступающие питательные вещества, размножаются растут и

быстро увеличивают свою биомассу. Отмирая, они перевариваются и усваиваются организмом, являясь источником белка. ( Р.В. Веселухин, 1971, И. Жукова 1966 ).

Благодаря ферментационной активности ( амилолитической, протеолити-ческой, целлолюзолитической и др. ) симбионтная флора способна синтезировать многие биологически активные вещества; органические кислоты, спирты, липиды, витамины, особенно группы В, соединение тетрапирольной структуры и др. Всасываясь в кровеносное русло, многие из них активно участвуют в энергетическом и витаминном обменах, играя важную роль в жизнеобеспечении организма хозяина ( Г. Готшалк, 1982, К. С. Петровский, 1961, В. С. Сивер и со-авт. 1975, G. Rychen, С. S. Nunes, 1995). Органические кислоты усиливают перистальтику и секрецию кишечника, чем способствуют перевариванию корма и повышают резорбцию кальция и железа (R. Schuler, et. al, 1968 ). Полифосфаты бактерий принимают участие в переносе Сахаров в клетку, выполняя функцию гексокиназ. (D. D. Gallaher, W. Н. Stallings et. al. 1996 ).

В отличие от антибиотиков и химиопрепаратов бактерии-пробионты абсолютно безвредны, не вызывают привыкания со стороны патогенной микрофлоры, безопасны для окружающей среды. Но главное - обладают выраженной антагонистической активностью к некоторым представителям патогенной и условно-патогенной микрофлоры, что впервые установлено еще И. И. Мечниковым в 1908 г. К бактериям-пробионтам относят лактобациллы, молочнокислые стрептококки, бифидобактерии, пропионовокислые бактерии и дрожжи.

Пробиотический препарат может состоять из одного или нескольких видов бактерий - пробионтов - ацидофильных бактерий, пропионовокислых и молочнокислых микроорганизмов, бифидобактерий. Физиологическая роль последних исключительно высока, они важнейшие симбионты человека и животных, доминирующие в микрофлоре здорового кишечника как новорожденных, так и взрослых особей. В определенной связи с бифидобактериями находятся и другие виды молочнокислых бактерий, их объединяет способность к интенсив-

ному кислотообразованию и приспособленность к существованию в кислой среде. Поэтому часто дефицит бифидобактерий сочетается с низким содержанием других видов молочнокислых бактерий, и наоборот, активная жизнедеятельность последних создает благоприятную среду для развития бифидофлоры. Оба эти вида бактерий могут служить индикаторами микроэкологического статуса организма, тем более что выявлена зависимость между их содержанием в ау-тофлоре и резистентностью макроорганизма. ( F. Canganella, S. Paganini, М. Ovili, 1997).

Основные критерии оценки производственных штаммов: высокая энергия роста, устойчивость к кислотам и желчи, высокая адгезивная активность - гарантируют эффективную колонизацию слизистой кишечника и синтез антимикробных веществ, обеспечивающих конкурентную способность в экологическом микробиоценозе кишечника. Кроме того, чрезвычайно важна видовая принадлежность хозяина. (А. Панин, Н. Серых, Е. Малик, 1992?, F. Abe, N. Ishibashi, S. Shimamura, 1995).

Пробиотики выпускают в виде жидких и сухих препаратов лиофильно высушенных микроорганизмов в чистом виде или в технической форме с питательной средой. В качестве наполнителей для первых используют сухое молоко, сахарозу, а для технической формы - кукурузную, рыбную или другую муку. Последние более удобны при групповом назначении животным с кормом. Многокомпонентный состав ( аминокислоты, витамины, ферменты, другие биологически активные вещества ) и разностороннее фармакологическое действие позволяют применять пробиотики с высоким эффектом для профилактики и лечения желудочно- кишечных болезней и дисбактериозов, нарушений обмена веществ ( гиповитаминозы, анемии и др.) регуляции постстрессовых состояний, особенно в период технологически обязательных мероприятий, корригирования антимикробной терапии, предупреждения рецидивов болезней, повышения продуктивности и стимуляции роста животных (G. Perligon, S. Alvares, 1995 ).

За рубежом в животноводстве и ветеринарии применяют пробиотики лак-тиферм, лактомикс, пробиоз, лигфекс, лако, ферлак, галако и др.

Лактиферм разработан фирмой " Медифарм " (Швеция), он представляет собой культуру фекального стрептококка М-74. Его используют при лечении и профилактике гастроэнтеритов и колиэнтеротоксемий, а также корригирования антимикробной терапии и стимуляции роста. Предварительное скармливание этой культуры снизило тяжесть диареи у поросят, зараженных энтеропатоген-ными штаммами кишечной палочки, вело к более быстрому выздоровлению и лучшему росту подопытного молодняка. В опытной группе выздоровели все животные, а в контрольной из 8 погибло 5. У подопытных поросят выявлена большая колонизация кишечника Str. faecium. Установлено, что микроорганизм снижает токсическое действие кишечной палочки, предотвращает генерализованную инфекцию и гибель поросят. Назначение его новорожденным поросятам снижает гибель от колибактериоза на 53% . При применении его с профилактической целью при диарее телят в опытах в Югославии заболевания у животных не регистрировали. При сравнении его терапевтической эффективности с антибиотиками он оказал более выраженное лечебное действие (D. Radulovie et. al; 1976).

На основе мутантного штамма ацидофильных бактерий, устойчивого к ряду антимикробных препаратов, в Швеции разработан также препарат лигфекс, наиболее эффективный для свиней и овец. Его рекомендуют в основном в отъемный период для снижения заболеваемости, а также при смене рациона, помещений и транспортировке животных. Назначают его с кормом в течение 10 суток. Препарат способствует снижению смертности поросят с 5 до 1,5 %, их лучшему росту. В итоге животные достигают товарной массы на 10-15 суток быстрее по сравнению с контролем (W. В. Wren, 1987).

Хороший лечебно-профилактический эффект при болезнях пищеварительной системы был получен при применении бактериального препарата на

основе ацидофильной палочки ( С. Недляков и соавт., 1967 ). При этом сокращаются случаи диареи и снижается тяжесть течения болезни (W. В. Wren, 1976 ) В опытах на поросятах отьемышах установлено, что добавка в корм препарата этих молочнокислых бактерий, содержащего до 100 млн. живых бактерий в 1 г, значительно улучшает прирост массы тела поросят по сравнению с мекадоксом. (J. Stekar et. al., 1997). Так, при назначении поросятам культуры энтерококков значительно снижается размножение энтеропатогенных штаммов колибактерий, заболеваемость и гибель животных ( с 16,3 до 6,9% ) ( F. Schulze, 1977, F. Abe , N. Ishibashi, 1995 ).

В опытах в Италии при назначении культур молочнокислого стрептококка в дозе 750 млн. клеток отмечено повышение массы тела телят (в среднем 26.61 против 25.28 кг в контроле ) и оплаты корма ( с 66.74 до 70.22% ). У животных уменьшалась частота возникновения диареи и понижалась гибель. У поросят, кроме того, отмечалось увеличение содержания глобулинов и повышение устойчивости к кишечным болезням (W. В. Wren, 1979 ).

В борьбе с дисбактериозами при нормализации микрофлоры ж. к. т., формировании биоценозов в его содержимом перспективно обогащение кишечной микрофлоры не одной культурой, а комплексом подобранных штаммов, способных легко приспособиться и прижиться в данной среде обитания. Во Франции для этих целей предложен препарат, в который входят антибиотикоустойчивые штаммы молочнокислых бактерий, ацидофильной и болгарской палочек и молочнокислого стрептококка. Кроме того, в стране используют препараты лио -бифидус и бифидоген, в Австралии - еугалан, в Германии - омнифлора, представляющие собой смесь чистых лиофилизированных культур бифидобактерий, ацидофильной и кишечной палочек (W. Camarer, 1961).

При введении новорожденным телятам культур энтерококков и лактоба-цилл - антагонистов кишечной палочки число больных энтеритами уменьшается от 60.2 до 23.5 %, а падеж соответственно от 3.8 до 0.4 % . Подопытные телята растут лучше (J. Tournut et. al., 1976).

В Венгрии для борьбы с дизентерией применяют бактериальный препарат лактозоникс: внутрь с 1-го по 8-й день жизни ежедневно, что позволяет снизить заболеваемость молодняка от 12.1 до 2.4 % (I. Мезгагоэ, 1978 ).

В Болгарии при даче смеси ацидофильной палочки с пропионокислыми бактериями телятам и ягнятам для нормализации микрофлоры кишечника и стимуляции роста получены положительные результаты. На этом основании И. Владимиров и соавт. ( 1972 ) рекомендуют заменить применение антибиотиков пробиотиками, поскольку они отрицательно не влияют на другую симбионтную микрофлору. Симбионтные микроорганизмы ингибируют рост бактерий, вызывающих мастит. Поэтому пробиотические препараты предлагают и при лечении гинекологических болезней. В частности , бактериальный бифидо-ацидо-стрептококковый препарат рекомендуют для профилактики синдрома метрит-мастит-агалактия свиноматок (К. КотолУБк!, 1983 ).

В нашей стране в начале 60-х годов в животноводстве широко применяли жидкие препараты из симбионтных микроорганизмов: АБК и ПАБК, которые изготовляли во многих хозяйствах и ветеринарных лабораториях. Они положительно зарекомендовали себя при желудочно-кишечных болезнях и гиповига-минозах группы В ( Т. И. Малахова, И. Е. Мозгов, 1974 г. , И. С. Орехов, 1958 г. , П. В. Перова, 1954 г. ), для повышения роста цыплят, поросят, ягнят, телят ( А. В. Архипов, 1963 г., А. Т. Малявин, 1960 г. , Сергеев Т. с соавт. 1959 г. ), резистентности организма (И. Е. Мозгов, 1964 г), для улучшения развития плодов (И. Е. Мозгов, 1971). Однако такие недостатки указанных препаратов, как нестандартность продукции, неудобства хранения и транспортировки, быстрая потеря активности способствовали сокращению их выпуска и применения.

Развитие лиофилизационной техники позволило разрешить эти проблемы и выпускать пробиотики в виде сухих и стандартных белково-витаминных препаратов.

Разработка технологии промышленного производства пробиотиков до последнего времени была сконцентрирована в основном в лаборатории бактери-

альных препаратов для животноводства ВНИИ биотехнологии, где были разработаны сухие ацидофилин, пропиовит, пропиацид, СБА, азотацид и др.

Пропиовит - бактериально-витаминный препарат на основе пропионово-кислых бактерий, обладает разносторонним фармакологическим действием, малотоксичен, повышает рост и продуктивность птицы, поросят, телят на 2 - 12 % по сравнению с другими препаратами витамина В12. Он повышает устойчивость к различного рода стрессовым воздействием, облегчает и ускоряет адаптацию животных и птиц. Вместе с тем он эффективен для профилактики желу-дочно - кишечных болезней телят, поросят, цыплят, для коррегирования антимикробной терапии, предупреждения рецидивов инфекционных болезней.

Другим препаратом этого ряда является пропиацид, состоящий из про-пионовокислых и ацидофильных микроорганизмов. Такое сочетание способствует повышению лечебно-профилактической эффективности при желудочно -кишечных болезнях птиц, лучшей приживаемости в желудочно-кишечном тракте обоих микроорганизмов ( В. А. Антипов, 1993 ).

Значительный интерес представляет препарат СБА - комбинированный препарат бифидобактерий, фекального стрептококка и ацидофильной палочки. Препарат эффективен для предупреждения и лечения болезней желудочно - кишечного тракта поросят, особенно в условиях крупных промышленных комплексов. Он улучшает белковый, витаминный и минеральный обмены, в связи с чем может быть использован при их нарушении, ускоряет рост животных.

На основании результатов, полученных ВГНКИ совместно с Институтом прикладной биотехнологии, начат промышленный выпуск сухого бифидумбак-терина из штамма бифидобактерий, выделенного от поросят и сухого пробиоти-ка стрептобифида. При их испытании в хозяйствах были получены положительные результаты (А. Панин, Н. Серых, Е. Малик, 1998 )■

Вышеизложенное подтверждает, что оптимизировать состав микрофлоры пищеварительного тракта и осуществлять коррекцию микробиологического статуса использованием лишь лекарственных препаратов сложно. Существенно

воздействовать на адаптативные и продуктивные способности организма возможно с помощью микрофлоры - биологических препаратов, в состав которых входят активные микроорганизмы - представители облигатной микрофлоры пищеварительного тракта, и которые оцениваются как существенный фактор неспецифической защиты организма. Бактериальные пробиотики экологически чисты, физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения.

Обобщая изложенное, можно сделать заключение о том, что в последнее время возрос интерес к пробиотическим препаратам, но тем не менее исследования основных биологических свойств используемых штаммов микроорганизмов в нашей стране в основном проводятся в области медицины, а для ветеринарии - крайне мало. Поэтому необходимо постоянное совершенствования изучения биологических свойств штаммов молочнокислых бактерий и бифидобак-терий для подбора и создании коллекции штаммов используемых в качестве пробиотиков для животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микробиологические исследования выполнены в лаборатории кафедры микробиологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии, опыты на животных проведены в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и ТОО Вилюйского улуса Республики Саха (Якутия) в период с 1996 по 1998 г. г.. 2. 1. Материалы и методы

В своих исследованиях мы использовали 32 штамма микроорганизмов семейства Lactobacillaceae и Actinomycetaceae:

Bifidobacterium globosum БС-3, БС-7, БС-11, БС-13, Bifidobacterium adolescentis БС-5, БС-9, БС-10 Bifidobacterium suis БС-1, БС-12 Bifidobacterium pseudolongum БС-4 Bifidobacterium thermophilum БС-2 Не типированные штаммы бифидобактерий БС-6, БС-8 Lactobacterium acidophilum ЛС-1, ЛС-4, ЛС-5, ЛС-7, ЛС-10, ЛС-11, ЛС-13,

ЛС-14, ЛС-17

Lactobacterium plantarum ЛС-3, ЛС-6, ЛС-8, ЛС-9, ЛС-16 Lactobacterium rhamnosus (casei) ЛС-12, ЛС-15

Lactobacterium brevis ЛС-2 - выделены нами совместно с к.в.н. доцентом В. В. Субботиным из фецес поросят.

Штаммы Bifidobacterium adolescentis В-1 и Lactobacterium acidophilus ЛГ-1 - получены из коллекции кафедры микробиологии Московского Государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ);

Для оценки микробной колонизации кишечника проводили микробиологические исследования фекалий . Фекалии собирали в стерильные пробирки. Интервал времени, от момента забора фекалий у обследуемых поросят, до посева на питательные среды составлял 3-4 часа.

В лаборатории из фекалий готовили десятикратные последовательные

разведения в стерильном физиологическом растворе до разведения 109 . Подготовленные таким образом пробы фекалий исследовали. Всего исследовано 142 пробы фекалий поросят.

Выделение бактерий различных групп:

Для выделения и количественного учета молочнокислых бактерий засевали по 1 мл исследуемой суспензии ( 7, 8, 9 разведения) в следующие среды: стерильное обезжиренное молоко, гидролизованное молоко, среду Рогоза, агар с гидролизованным молоком и мелом. Всего выделено 17 штаммов лактобактерий и все идентифицированы.

Посевы культур на агар с гидролизованным молоком и мелом позволяли идентифицировать молочнокислые бактерии по зонам просветления вокруг колоний, которые образуются в результате растворения мела молочной кислотой.

Для выделения, культивирования и количественного учета бифидобакте-рий использовали модифицированную Г. И. Гончаровой (1968) печеночно-цистеиновую среду (среда Блаурокка). В подготовленные пробирки с расплавленной средой засевали по 1 мл исследуемой суспензии (8 и 9 разведения). Содержимое пипетки не выдували до конца, чтобы воздух не попал в среду. Пробирки с посевами помещали в термостат с температурой 37+1°С и выдерживали 48-72 часа. Всего выделено 13 штаммов бифидобактерий, идентифицировано 11 штаммов. Из-за широкой вариабельности ферментативных свойств видовую принадлежность 2 штаммов установить не удалось.

Микроорганизмы семейства энтеробактерий выделяли путем посева материала из второго разведения на среду Кесслер. Для подтверждения наличия эшерихий проводили пересев из пробирок, в которых обнаружено газообразование, на среду Эндо в чашки Петри по Дригальскому. Субкультуры изолировали из 1..2 наиболее типичных колоний.

Для выделения бактерий рода Протеус 1 мл суспензии из второго разведения вносили в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара (по методу Шукевича). Засеянные пробирки с мясопептонным агаром ста-

вили в термостат при 37°С. Через 48 часов протей обнаруживали в виде тонкой ваулеобразной пленки на поверхности агара.

Для выделения энтерококков использовали элективную среду по прописи Л. Е. Моисеевой (1967). Из разведений 5, 6, 7 брали по 1 мл и высевали на подсушенную поверхность питательной среды. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течении 48 часов. Типичные колонии энтерококков имели округлую форму с ровными краями, блестящей поверхностью.

Для обнаружения стафилококков посевной материал из 3 и 4 разведений вносили по 0.1 мл в пустые стерильные чашки Петри. Заранее расплавленный и охлажденный до 45°С глюкозо-солевой агар выливали в чашки Петри и тщательно перемешивали с ранее внесенным посевным материалом. Чашки с посевами термостатировали при 37°С в течение 48 часов.

Для определения спорообразующих аэробных бацилл 0.1 мл суспензии из 3 и 4 разведений высевали на МПА рН 7.4 после прогрева, при 80°С 20 минут.

Для количественного учета дрожжей и плесеней 1 мл суспензии из разведений 3 и 4 вносили пипеткой в чашки Петри и заливали расплавленной и охлажденной до 45°С средой Сабуро. Немедленно смешивали посевной материал с питательной средой. После застывания питательной среды чашки переворачивали вверх дном и инкубировали в термостате при 25°С двое суток. Грибы рода Кандида выявляли по наличию белых матовых колоний на чашках и по окраске: грамположительные, крупные, округлые, несколько удлиненные по форме клетки. Подсчитывали отдельно колонии дрожжей и колонии плесневых грибов. Затем умножали на разведение и получали количество тех или других в 1 мл.

Для определения соотношения лактозопозитивных, лактозонегативных энтеробактерий производили посев 0,1 мл из разведении (1 : 100) на среду Эндо,

Методика приготовления питательных сред:

Гидролизованное молоко: обезжиренное молоко стерилизовали при 120°С

в течение 10 мин, охлаждали до 45°С и устанавливали рН 7,6 - 7,8. К одному литру молока добавляли 0,5-1 г панкреатина, 5 мл хлороформа, плотно укупоривали и ставили в термостат при температуре 40°С на 72 часа. Через 72 ч полученную прозрачную жидкость фильтровали через бумажный фильтр, разводили водой в 2 раза, устанавливали рН 7,0 - 7,2, разливали в колбы и пробирки и стерилизовали при 120°С в течение 20 мин (Л. А.. Банникова, 1987).

Агар с гидролизованным молоком и мелом: 2% мела добавляли в виде тонкого порошка к 2%-ному агару, приготовленному на гидролизованном молоке, стерилизовали при 121°С в течение 15 мин.

Модифицированная Г. И. Гончаровой (1968) печеночно-цистеиновая среда (среда Блаурокка) (В1аигоск J., 1937): 500 г говяжьей печени, освобожденной от фасций, пропускали через мясорубку, заливали двойным количеством воды и кипятили в течение 2 часов. Затем раствор фильтровали, фильтрат доводили дистиллированной водой до 1л и вносили 10 г пептона, 10 г лактозы, 100 мг цистеина солянокислого, 5 г поваренной соли, 10 г агара, рН среды доводили до 6,8 - 7,0 (Л. А. Банникова, 1987). Использование солянокислого цистеина и глюкозы как редуцирующих веществ, поддерживающих низкий окислительно-восстановительный потенциал в среде, позволило культивировать бифидобакте-рии в высоком столбике полужидкой питательной среды. Перед посевом пробирки с высоким столбиком питательной среды предварительно расплавляли на водяной бане, затем быстро охлаждали до 45°С.

Элективная среда по прописи Л. Е . Моисеевой (1967): к одному литру мясной воды добавили 15 г пептона, 7,5 г глюкозы, 7,5 г хлористого натрия, 0,2 г азида натрия и 12,5 г агара. Среду подщелачивали гидроокисью натрия до значения рН 7,2 и стерилизовали при 120°С в течение 15 минут. Отдельно готовили 1 %-ный раствор хлористого трифенилтитраезолия, который стерилизовали при тех же условиях. Перед посевом к 100 мл расплавленной среды добавляли 1 мл этого раствора.

Среда Сабуро: к 1 л дистиллированной воды добавляли 18 г агара и ос-

тавляли на 30 мин для его набухания, затем добавляли 40 г глюкозы и 10 г пептона и плавили среду, поднимая температуру до 120°С (без выдержки). Расплавленную среду фильтровали через ватно-марлевый фильтр, разливали, стерилизовали при 115°С в течение 20 минут.

Среда Кесслер: к 1 л водопроводной воды добавляли 10 г пептона и 50 мл желчи, кипятили смесь в течение 15...20 мин на водяной бане, фильтровали через вату, добавляли 2,5 г глюкозы, устанавливали рН до 7,4...7,6. Затем добавляли 2 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливали в пробирки с поплавками. Стерилизовали при 121°С в течение 15 минут. Готовая среда имела темно-фиолетовый цвет.

Среда Эндо: 5 г сухой среды растворяли в 100 мл дистиллированной воды при подогревании и помешивании, кипятили 5 мин, разливали в стерильные чашки Петри. После уплотнения агара для подсушивания его помещали в термостат.

Глюкозо-солевой агар: к 100 мл дистиллированной воды добавляли 3% агара, 8% хлорида натрия, 2% глюкозы, рН среды доводили до 7.1-7.2. Стерилизовали при 115°С в течение 30 минут.

Среда Рогоза : Пептон -10 г, Лаб-лемко -8.0 г, дрожжевой экстракт -4.0 г, глюкоза -20.0 г, Твин 80-1 мл, К2 НР04 -2.0 г, М§804-0.2 г, Мп804-0.05 г, лимоннокислый аммоний-2.0 г. Навеску питательной среды растворяли в 1.0 л дистиллированной воды, рН среды устанавливали на уровне 6.2-6.6. Добавляли Твин-80 из расчета 1 мл на 1 литр. Стерилизовали при 111°С в течение 30 минут.

Идентификацию бифидобактерий и лактобацилл производили в соответствии с Руководством Берги по систематике бактерий (1986, Т. 2, стр. 1418).

К бифидобактериям относили чистые культуры, которые представляет собой неспорообразующие, грамположительные палочки, слегка изогнутой и разветвленной с бифуркациями формой, каталазоотрицательные, не разжижающие желатин, не образующие газа, не восстанавливающие нитраты в нитриты,

не выделяющие сероводород. Видовую идентификацию бифидобактерий осуществляли по совокупности культуральных, морфологических и ферментативных свойств.

К лактобактериям относили чистые культуры, которые положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны, не образуют каталазы, нуждаются в ростовых веществах, не вызывают видимого разложения белков молока , не разжижают желатину. Видовую идентификацию лактобактерий осуществляли на основании изучения их культуральных, морфологических свойств, энергии кислотообразования, способности расти на питательных средах в присутствии ЫаС1, фенола, при щелочной реакции среды, а так же с учетом их ферментативных свойств.

Кислотообразующие свойства бактерий определяли по времени образования сгустка (кислотность около 58-60 °Т) при условии посева молодой (12-20 часовой) культуры в стерильное обезжиренное молоко в количестве одна капля (одна петля) на 10 мл молока или 3% культуры по отношению к объему молока и термостатирования при оптимальной для данного вида температуры. Для изучения кислотообразующих свойств бифидобактерий высевали их на стерильное обезжиренное молоко с добавлением и без добавления кукурузного экстракта.

Реакция среды оказывает влияние на жизнедеятельность микроорганизмов. Мы изучали возможность роста каждого штамма лактобактерий в гидролизованном молоке при значении рН среды 8.3. Наличие роста определяли визуально по помутнению среды и контролировали микроскопированием окрашенных мазков.

Устойчивость к натрия хлориду определяли по наличию роста микроорганизмов в гидролизованном молоке (рН 7.0), содержащем 2; 4; 6 % натрия хлорида.

Устойчивость к желчи определяли по способности роста в гидролизованном молоке (рН 7.0) с содержанием 20; 30; 40% желчи.

Устойчивость к фенолу определяли по следующей методике: к 10 мл стерильного обезжиренного молока добавляли 1 мл 4%-ного водного раствора фенола, в среду вносили 2-3 петли исследуемого штамма и термостатировали. Штаммы, которые свертывали молоко за 24 часа считали высокоустойчивыми к фенолу, за 48 часов - устойчивыми, а не свертывающие молоко в течение 48 часов - неустойчивыми к фенолу.

Сохранение культур. Штаммы молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в стерильное обезжиренное молоко каждые 10 дней. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при +4 - +8°С.

Более удобным методом хранения молочнокислых микроорганизмов является их хранение в пробирках с гидролизованным молоком (рН 7,2) при температуре 2 - 4°С. В таких условиях все исследуемые культуры хранились в течение двух месяцев, практически не изменяя свои свойства.

Изучение адгезивных свойств микроорганизмов проводили по экспрессному методу (В. И. Брилис). В качестве буфера использовали 1,1 М раствор фосфата натрия приготовленный на изотоническом растворе хлорида натрия (рН 7.2-7.3).

Микроорганизмы выращивали в течение 1-2 суток в оптимальной для них жидкой питательной среде.

Клеточным субстратом служили формалинизированные эритроциты поросят, предварительно дважды отмытые буферным раствором путем центрифугирования (1000-3000 об/мин)

На указанном буфере готовили взвесь эритроцитов концентрацией 100 млн/мл.

Для постановки опыта на предметное стекло наносили 1 каплю буферного раствора, в котором суспендировали по 1 капле (посевной петле) взвеси эритроцитов и микроорганизмов прямо из питательной среды.

Предметное стекло с эритроцитами и микробами помещали во влажную

камеру на 30 мин при 37°С, затем препарат высушивали при той же температуре, фиксировали над пламенем горелки и окрашивали общепринятыми методами окраски. Изучение адгезии вели под световым микроскопом. Адгезивные свойства оценивали с помощью среднего показателя адгезии (СПА). Под ним понимается среднее количество микробов, прикрепляющихся к 1 эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения.

Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1.0, низкой- при СПА от 1.01 до 2.0, средней - от 2.01 до 4.0, высокой - свыше 4.0.

Адгезивные свойства бактерий изучали также методом, основанным на способности микроорганизмов прилипать к соматическим клеткам (D. G. Evans, D. J. Evans, 1983). В своих опытах мы использовали энтероциты тонкого отдела кишечника поросят. От убитых поросят 20-30 дневного возраста отбирали кусочки тонкого кишечника длиной до 30 см, вымывали содержимое холодным физиологическим раствором до получения прозрачной сливной жидкости. Последний раз отрезок кишечника промывали фосфатно-солевым буфером и перевязывали с обоих сторон ниткой, предварительно залив в него фосфатно-солевой буфер так, чтобы заполнить половину объема отрезка. После этого пропускали отрезок кишечника между деревянными валиками в течение 5 минут, жидкость центрифугировали и энтероциты отмывали буферным раствором 3 раза. Отмытый осадок энтероцитов ресуспендировали до начального объема буфером и фильтровали через несколько слоев тканевого фильтра для отделения слизи от эпителиальных клеток.

Суспензии исследуемых бактериальных культур готовили следующим образом. Культуры высевали на гидролизованный агар, культивировали в термостате при оптимальной температуре в течение 72 часов, затем смывали бактериальную массу фосфатно-солевым буфером и с помощью оптического бактерийного стандарта доводили концентрацию до 1 млрд клеток в 1 мл.

Смешивали в равных объемах (по 1 мл) суспензии исследуемых микроор-

ганизмов и кишечных клеток и инкубировали при температуре 4°С в течение 40 минут. Затем суспензию концентрировали путем центрифугирования до половины начального объема.

Каплю суспензии наносили на предметное стекло, готовили мазок, высушивали, фиксировали над пламенем горелки, окрашивали краской Муромцева и просматривали под микроскопом. При микроскопировании подсчитывали количество бактерий, которое прикрепилось к поверхности одной эпителиальной клетки.

Для определения антагонистической активности бактериальных штаммов нами использованы методы совместного культивирования и метод штриховых посевов.

При определении антагонистической активности методом совместного культивирования изучаемые микроорганизмы высевали на жидкие среды с тест-штаммами с последующим высевом на плотные среды. В качестве тест- штаммов использовали Е. coli, S. cholerae suis. Тест-штаммы выращивали на скошенном мясопептонном агаре в течение 18-20 часов, затем смывали стерильным физиологическим раствором и по оптическому стандарту мутности готовили микробную взвесь, соответствующую 10 ед по стандарту мутности. Из 16-24-часовой культуры штаммов, выращенной на жидкой среде, готовили такую же взвесь.

Приготовленные стандартные взвеси каждого штамма и тест-культур вносили по 1 мл в пробирки с питательной средой, разлитой по 9 мл. Контролем служило то же количество микробной взвеси каждого тест-штамма, внесенного в жидкие среды. Посевы инкубировали при 37°С в течение 144 часа.

Для оценки степени антагонистического действия штаммов на тест-штаммы подсчитывали колонии тест микробов, выросших на плотных питательных средах после совместного культивирования со штаммами и в монокультуре.

Метод штриховых посевов на плотной питательной среде. Изучаемые

культуры лактобактерий и бифидобактерий выращивали на плотной среде 24 часа. Готовили взвеси бактерий концентрацией 10 ЕМ. Приготовленные суспензии наносили штрихом по диаметру чашки Петри с плотной средой . Посевы инкубировали в анаэростате в течение 72 часов при 37°С.

К этому времени готовили суспензии тест микробов (10 единиц мутности) из 24-часовых агаровых культур.

Отбирали чашки с ровным ростом лактобактерий и бифидобактерий по всему диаметру (штриху) и по обеим сторонам от него наносили перпендикулярные штрихи тест-микробов. Посевы инкубировали при 37°С в течение 48 часов, после чего измеряли зоны задержки роста тест-культур.

Лечебное и профилактическое действие бифацидобактерина изучали в двух опытах на поросятах.

Препарат «Бифацидобактерин» ТУ-10-07-63-92, разрешен к применению Главным управлением ветеринарии Минсельхозпрода России № 22-5/99 от 02. 10. 92 г. Изготовлен из живых ацидофильных и бифидобактерий, смешанных с кормовым (мука) наполнителем и высушенных контактно-сорбционным способом. По внешнему виду препарат представляет собой однородный сыпучий порошок серо-белого или светло-коричневого цвета. В 1 г содержится не менее 80 млн живых клеток каждого вида микроорганизмов.

«Бифацидобактерин» предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных и домашних животных.

Первый опыт проводили в ЗАО «Кузнецовский комбинат» Наро-Фоминского района Московской области, а второй в ТОО Вилюйского улуса Республики Саха.

В первом опыте с этой целью на участке опороса свинокомплекса глубокосупоросными свиноматками было укомплектовано 6 секторов по 30 свиноматок в каждом. Поросята полученные от свиноматок в секторах № 2. 5. 4, № 2. 5. 2, № 2. 4. 8 составили опытную группу (всего 918 голов), а в секторах №

2. 5. 3, № 2. 5. 1, № 2. 4. 7 - контрольную (всего 995 голов) т.е. сектора подобрали таким образом, чтобы каждый из 3-х операторов обслуживал один опытный и один контрольный сектор.

Поросята опытных секторов получали бифацидобактерин в первые сутки жизни (в момент скалывания клыков), на третьи сутки жизни (при обработке ферроглюкином) индивидуально в виде жидкой суспензии препарата, а также с 15 по 20 день и с 35 по 42 день вместе с комбикормом в дозе 0.2 г на 1 кг живой массы. Поросята контрольных секторов бифацидобактерин не получали.

За животными наблюдали до отъема их от свиноматок и передачи на участок доращивания в 42-дневном возрасте. При этом отмечали количество, заболевших, павших поросят, иные изменения поголовья в группах. При отъеме от свиноматок всех поросят взвешивали. В возрасте 1,5, 10, 15, 20, 25 дней отбирали по 10 проб фекалий от поросят обеих групп для бактериологических исследований. Второй опыт провели по аналогичной схеме. В двух опытах было использовано 2173 поросенка.

Для изучения влияния препарата на биохимические свойства крови у поросят из каждой группы брали на исследование кровь. Кровь брали из ушной вены. Для предупреждения свертывания крови добавляли 30 мг цитрата натрия на 10 мл крови. Чтобы получить сыворотку, кровь собирали в пробирки без антикоагулянта.

В крови определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина по общепринятым методикам.

Активность фагоцитирующих клеток крови изучали следующим образом: к 1 мл крови добавляли 1 мл суспензии, содержащей 1 млрд бактериальных клеток суточной культуры Е. coli, выдерживали в течение 30 мин, готовили мазок и окрашивали по Романовскому-Гимза. При микроскопировании определяли процентное соотношение фагоцитирующих лейкоцитов к общему количеству лейкоцитов. Интенсивность фагоцитоза определяли по среднему количеству бактериальных клеток Е. coli, поглощенных одним фагоцитом.

В сыворотке крови поросят определяли содержания белка и белковых фракций, неорганического кальция и фосфора.

Изучение белковых фракций сыворотки крови поросят проводили аналитическим методом дискового электрофореза, разработанный Ornstein и Davis (1964) на импортном аппарате фирмы Reanal для электрофореза в полиакрила-мидном геле.

При этом использовали следующие растворы и вещества:

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Степанов, Константин Максимович

ВЫВОДЫ

1. Кишечный биоценоз у клинически здоровых поросят характеризуется преобладанием бифидо- и лактобактерий, которые составляют 23.15%. У поросят с признаками диареи уменьшается содержания этих микроорганизмов в 1.39 раз, кроме того у 80% больных поросят преобладающей микрофлорой становятся эшерихии. У клинически здоровых поросят в толстом отделе кишечника преобладают два основных вида бифидобактерий: В. §1оЬо8шп (37%) и В. ас1о1е8-сепНБ (27%), причем штаммы В. асЫезсепЦэ в отличие от других видов обладают широким спектром биохимической активности, высокими адгезивными и выраженными антагонистическими свойствами. Эти данные свидетельствуют о целесообразности включения этого вида в состав пробиотического препарата.

2. Антагонистические свойства бифидо- и лактобактерий не имеют прямой корреляции с интенсивностью кислотообразования. Поэтому признак кислото-образования не может являться решающим при отборе штаммов для изготовления пробиотиков.

3. При отборе штаммов по антагонистическим свойствам необходимо в каждом отдельном случае проводить их изучение методом совместного культивирования при коррекции рН среды до нейтральных значений. В этих условиях возможно обнаружение штаммов, чей антагонизм в большей степени обусловлен образованием активных веществ антибактериальной направленности.

4. Адгезивные свойства бифидо- и лактобактерий наиболее интенсивно проявляются в кислой среде. Для характеристики адгезивных свойств бифидо- и лактобактерий целесообразно использовать формалинизированные эритроциты, как более простую и обеспечивающую достоверные результаты модель.

5. При сравнительном изучении свежевыделенных штаммов бифидо- и лактобактерий и производственных штаммов В. аскЯезсепЦ'з В-1 и Ь. ас1ск)рЫ1ит ЛГ-1 установлено что, производственные штаммы имеют преимущество перед свежевыделенными, т.к. они обладают высокой адгезивной и антагонистической активностью, широким спектром биохимической активности, устойчивостью к поваренной соли, желчи, а также к основным антибиотикам. Вследствие этого использование штаммов В. асЫезсепйз В-1 и Ь. аа<1орЫ1ит ЛГ-1 в качестве пробиотика ветеринарного назначе1шя оправдано и обусловлено их специфическими биологическими свойствами.

6. Пробиотик лактобифадол (бифацидобактерин), изготовленный на основе штаммов В. аскЯеБсепйз В-1 и Ь. аЫс!орЫ1ит ЛГ-1, обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Применение пробиотика в дозе 0.2 г на 1 кг живой массы в первый и третий дни жизни, а также с 15 по 20 день в неблагополучных по колибактериозу хозяйствах обеспечивало снижение заболеваемости на 22-24%, снижение падежа на 9-11%. В результате снижения уровня заболеваемости в опытных группах средняя живая масса одного 42-45-дневного поросенка была выше на 0.8-1.0 кг по сравнению с контрольными поросятами не получившими пробиотик.

7. Лактобифадол (бифацидобактерин) по отработанной схеме и дозах рекомендуется использовать в свиноводческих хозяйствах промышленного типа для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний поросят.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Биологическая характеристика штаммов В. аскЯезсегШБ В-1 иЬ. аЫёорЫ-1ит ЛГ-1 использованы при паспортизации производственных штаммов и в инструкции по изготовлению и контролю препарата лактобифадол для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных. Дозы и схема применения препарата для поросят использованы в Наставлении по применению препарата лактобифадол в ветеринарии, утвержденном департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 01. 06. 1998 г № 5-2/1255.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Степанов, Константин Максимович, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Айзенман В.Е. Антибиотические свойства бактерий. К, : Наукова думка, 1973. - 232с.

2. Амбармуцян А. Д., Дехцунян К. М., Атолек С. Я., Ерзинкян Л. А. Изучение антагонизма между госпитальными штаммами St. aureus и молочнокислыми бактериями и использование последних в качестве санирующего средства // Микробиология- 1983, № 8, с 36-38.

3. Антипов В.А. Биологические препараты симбионтных микроорганизмов и их применение в ветеринарии// Сельское хозяйство за рубежом. 1981. №2. С. 4347.

4. Антипов В.А. Симбионтные микроорганизмы пищеварительного тракта, их роль и состав // Сельское хозяйство за рубежом. 1989. № 12. с. 40-45.

5. Ахметзянов Ф. X. Микрофлора желудочно-кишечного тракта свиней в норме и при некоторых заболеваниях. Казань, 1966.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Медицина, 1962, 160 с.

7. Банникова Л.А. Микробиологические основы молочного производства. - М.: Агропромиздат, 1987.

8. Банникова Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной прмышленности. - М. : Пищевая промышленность, 1975.

9. Барзашка-Попова С.Н. Коррекция микрофлоры и местного иммунитета кишечника при дисбактериозах с помощью лактобацилл. Автореф... канд. мед. наук, М., 1990, 24 с.

Ю.Бароян О. В., Абрикосова Н. Ю., Гайлонская И. Н. Роль нормальной микрофлоры в санации вибриононосигельства у крыс-гнотобионтов. Бюл. Экспер. Биол., 1978, №6, с. 712-715.

11.Биологическая активность бифидобактерий в молоке / Гудков A.B., Эрноль-дер Т.М., Свириденко Г.М., Гудкова М.Я. // Молочная промышленность. 1984. № 1.С. 21-23.

12.Блохина И.Н., Ливанова Г.Ф., Лихачева А.Ю. Подходы классификации би-фидобактерий на основе данных о структуре их ДНК - Ж. Молекулярная генетика, Микробиология и вирусология, 1995, № 4, с. 28-34.

13.Богданова Е. А., Богданова Р. И. Производство цельномолочных продуктов -М; Легкая и пищевая промышленность, 1982- 200с.

14.Бочкова И. А., Семина А., Демина А. К., Микробная колонизация и сукцессия в толстой кишке у новорожденных детей при совместном с матерью пребывании в родильном доме. //Антибиотики и химиотерапия. 1995, т. 32, № 12.

15.Брилис В.И., Брилине Т.А., Левков Л.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. Методические возможности изучения роли адгезии в колонизирующей способности микроорганизмов. В сб. Теоретические и практические проблемы гното-биологии, под ред. Шишкова В.П. и Исакова Ю.Ф., Москва, Агропромиздат, 1986, с. 206-212.

16.Бузлама B.C., Антипов В.А., Долгополов В.Н. Бактериально - витаминный препарат "пропиовит" для молодняка сельскохозяйственных животных // Материалы в помощь сельскохозяйственному производству. - Воронеж. - 1978, вып. 5, ч. 3. - с. 50 - 51.

17.Буряко И.А.. Шибеко Е.А., Стефанович Л.И., Беликова В.Л. Выделение бактерий рода lactobacillus - активных кислотообразователей - из растительных источников // Ж. Микробиология, 1997, том 66, № 4, с. 527-531.

18.Ван-дер-Ваай Д. Пищеварительный тракт как главный источник бактериальных и грибковых инфекций. Важность поддержания колонизационной ре-зистентости.// Антибиотики и химиотерапия, 1992, № 6 , с. 36-41.

19.Вершинина В. И. Исханова С. X. Белковые комплексы энтерококков: антигенный спектр и вопросы таксономии.// Микробиология, 1988, № 2, с. 51-54.

20.Веселухин Р. В. В сб.: Физиологические и биохимические основы повышения продуктивности с.-х. животных. - М.: Колос, 1971.

21.Виестур У.Э,. Кристапсонс М.Х., Былинкина B.C. Культивирование микроорганизмов. - М. : Пищевая промышленность. - 1980.

22.Владимиров И. и соавт. Животноводни науки, 1972, 96, № 7.

23.Ворошилина H.H., Халенева М.П., Лагода И.В., Абрамова - Оболенская Н.И. Зывина Т.М., Александрова Т.Н. Экспериментально - клинические данные к использованию. L. acidophilus в системе средств восстановительной бактериальной терапии. В сб. : Колонизационная резистентность и химиотерапевти-ческие антибактериальные препараты, М., 1988, ч. 2, с. 270 - 271

24.Ганина В. И. Выживаемость бифидобактерий и ацидофильных палочек при сушке способом распыления./ Тезисы докладов Всесоюзной научно - технической конференции. М.: 1985, С.254 - 256.

25.Геймберг В.Г., Михлин С.Я., Петрушина Л.И. Состав нормальной микрофлоры кишечника и влияние на нее некоторых антибактериальных препаратов // Тр. ЦПУ врачей.- 1964, т. 60.- с. 90 - 108.

26.ГончароваГ.И., Дрофейчук В.Г., Смолянская А.З., Соколова К.Я. Микробная экология кишечника в норме и патологии. Антибиотики и химиотерапия, 1989, № 6, с. 462 - 466.

27.Гончарова Г.И., Дьякова Е.И., Семенова Л.П., Козлова Э.П., Лянная A.M., Зацепин Ю.К., Курносова Н.Л. Новый отечественный препарат "сухой бифи-думбактерин" и его эффективность при кишечных заболеваниях детей и взрослых людей // Тез. докл. 3 Всеросс. съезда эпид., микроб., инфекц.. - Казань, 1972. - С. 37.

28.Гончарова Г.И., Козлова Э.П., Чистякова В.И. Бифидофлора и ее нормализирующая роль в организме человека // Научн. тр. Моск. НИИ эпид. и микро-биол..- 1979, 22.-с. 181-189.

29.Горбунова М. Л. Бактерии продуценты Н^(^обитающие в организме человека. Автор, док. дисс., Днепропетровск, 1970.

30.Горская Е.М. Адгезия микробов к эпителиальным клеткам кишечника. В сб. Антибиотики и микроэкология человека и животных, М., ВНИИ Антибиотиков, 1988, с. 79 - 82.

31.Горская Е.М., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г. Горелов A.B. Адгезивные свойства бактерий кишечного происхождения. ЖМЭИ, 1991, №10, с. 5-8.

32.Горская Е.М., Лизько H.H., Ленцнер A.A., Бондаренко В.М., Соколова К.Я., Лихачева А.Ю. Биологическая характеристика штаммов лактобацюш, перспективных в качестве эубиотиков. ЖМЭИ, 1992, №3, с. 17 - 20.

33.Горская Е.М., Чахава О.В., Шустрова Н.М., Прохоров В.Я., Ленцнер A.A. Естественная клеточная чувствительность к лактобациллам у интактных животных, ЖМЭИ, 1981, № 5, с. 62-65.

34.Готшалк Г. Метаболизм бактерий. - М.: Мир, 1982.

35.ГрязневаТ.Н., Ставцева Л.Я. Антагонистическая активность бифидо - и лак-тобактерий в отношении энтеробактерий. - Ж. Ветеринария, 1991, № 6, с. 2122.

36.Гуторова Л.Д. Аэробная микрофлора кишечника детей в норме и патологии./ Антибиотики и химиотерапия, 1989 №3. с. 462 - 466.

37.Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов. В сб. Итоги науки и техники, серия Микробиология, 1985, том 16, с. 6-22.

38.Дмитриева Н. Ф., Кудрина Е. С., Петров Г. И. Биологические свойства тей-хоевых кислот бактерий. ЖМЭИ, 1982, № 2, с 12-18.

39.Добровольская В.В., Васильева Е.Е. Применение колибактерина для лечения дисбактериозов, ЖМЭИ, 1964, №8, с. 29-30.

40.Драбкина A.B. Морфология и культурно-биохимические свойства энтерококков. Микробиология. 1988, №2, с. 51-54.

41.Евлашкина В.Ф. Препараты из лактобацилл и их роль в коррекции нормфло-ры организма человека.- М., 1992.

42.Егоров Н.С. Микробы - антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности - Ереван: 1971.

43.Ефимов Б.А., Коршунов В.М. Использование тотально - деконтаминирован-ных мышей в условиях общей гнотобиологической изоляции для получения высокоадгезивных штаммов Streptococcus faecium. ЖМЭИ, 1992, № 5-6, с. 911.

44.Ефимов Б.А., Коршунов В.М., Кафарская Л.И., Тарабрина Н.П., Гладько И.А., Смирнов Ю.И., Фонская Р.Д. Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника. Методические рекомендации, М., 1991, 15 с.

45.Жукова И. К вопросу об азотистом обмене в рубце жвачных животных при различных рационах кормления. Автореф. дис. канд. биол. наук. - М., 1966.

46.3ароза В.Г., Николаев A.C. Ускоренные методы определения иммуноглобулинов в крови телят и молозиве коров // Сельскохозяйственная наука и производство. - 1985, серия 2, № 2. - с. 37 -45.

47.3итаре И.К. Изучение влияния бифидумбактерина на микрофлору кишечника телят, больных колибактериозом. В кн.: "Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве ( Сб. науч. трудов ) - М. Московский НИИ эпидемиология и микробиологии. 1986. С. 172-177.

48.3итаре И.К. Об эффективности применения анаэробных бактериальных культур для лечения диспепсии телят // Маститы и болезни обмена веществ сельскохозяйственных животных. - Рига, 1983, с. 76 - 89.

49.Интизаров М.М. Бифидумбактерин при желудочно - кишечных болезнях телят // Ветеринария. - 1979, № 10. - с. 82.

50.Интизаров М.М. Возможности гнотобиологического эксперимента при изучении механизмов бактериального антагонизма и симбиоза // Теоретические и практические проблемы гнотобиологии. - М., 1986. - с. 22 -29.

51.Интизаров М.М. Возможности гнотобиологического эксперимента при изучении механизмов бактериального антагонизма и симбиоза. В кн.: Теоретиче-

ские и практические проблемы гнотобиологии, под редакцией Шишкова В.П. и Исакова Ю.Ф., Москва, Агропромиздат, 1986, с. 22 - 29.

52.Интизаров М.М. Микрофлора тела животных // Лекция. - М., 1989.

53.Использование бифидобактерий в животноводстве / Гудков С.А., Скобелев В.И., Кравченко Э.Ф. и др. В кн.: "Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве ( Сб. науч. тр.) - М.: Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии. 1986. С. 167- 172.

54.Использование бифидобактерий для борьбы с желудочно - кишечными заболеваниями поросят и цыплят / Эрвольдер Т.М., Гудков A.B., Гудков С.А., ДушенинН.В. //Молочная промышленность. 1984. №8, с. 18 - 20.

55.Калина А.П. О положении энтерококков в системе микроорганизмов. Микробиология. 1970, № 6, с. 20 -21.

56.Калина Г.П. Идентификация энтерококков с использованием комбинированных питательных сред. Лабораторное дело, 1972, № 11, с. 691 -93.

57.Карни Т.В., Ленупер Х.П. Количественный состав лактофлоры и методика его определения - ЖМЭИ, 1994, № 4, с. 28-34.

58.Кафарская Л. И., Гладько И. А., Ефимов Б. А., ТарабринаН. П., Скворцов В. М., Коршунов В. М. Изучение влияния кисломолочного бифидумбактерина на микрофлору кишечника у летчиков-испытателей. ЖМЭИ, 1992, № 4, с. 1214.

59.Квасников Е.И., Нестеренко O.A. Молочнокислые бактерии и пути их использования, Москва, Наука, 1975, с. 389.

60.Квасникова Л.В., Салахова И.В., Шаробайко В.И., Эрвольдер Т.М. Бифидобактерии и использование их в молочной промышленности : Обзорная информация. М: АгроНИИТЭУММП., 1991, с. 1-32.

61.Козлова Е.В., Пивоваренко Т.В., Малиновская И.В., Аминов Р.И., Коваленко Н.К., Бородин A.M. Устойчивость к антибиотикам штаммов лактобацилл. Антибиотики и химиотерапия, 1992, Т. 37, № 6, с. 12-15.

62.Коняев М.Т., Кузнецов Н.И., Наветный А.И., Гончарова Г.И., Козлова Э.П., Лянная A.M. Бифидумбактерин для профилактики и лечения диспепсии телят // Ветеринария, 1974, № 3. - с. 83 - 84.

63.Коршунов В.М, Синицина H.A., Гинодман Г.А., Пинегин Б.В. Коррекция микрофлоры кишечника при химиотерапевтических дисбактериозах с помощью аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий. ЖМЭИ, 1985, № 9, с. 20 - 25.

64.Коршунов В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника - // Ж. Микробиология, 1995, № 3, с. 48-55.

65.Коршунов В.М., Киссина Е. В., Иконникова Т.Б., Мальцев В.Н., Гончарова Г.И., Лянная A.M., Пинегин Б.В. Влияние препаратов из лактобацилл и бифидобактерий на микрофлору кишечника мышей, облученных гамма - квантами. ЖМЭИ, 1981, № 11, с. 36 - 40.

66.Красноголовцев В.Н. Дисбактериозы кишечника. Москва, Медицина, 1989, 206 с.

67.Куваева И. Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора. - М.: Медицина, 1976.

68.Куваева И. Б., Ладодо К. С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. Москва, Медицина, 1991, с. 241.

69.Леванов A.B., Busch W., Шуркалин Б.К., Кригер А.Г., Чугунов А.О., Коршунов В.М. Влияние различных антимикробных препаратов на нормализацию микрофлоры кишечника у больных с распространенным перитонитом. ЖМЭИ, 1983, с. 32 - 38.

70.Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э., Тюри М.Э., Брилине Т.А., Брилис В.И., Левков Л.А. Лактофлора и колонизационная резистентность. Антибиотики и медицинская биотехнология, 1987, № 3, с. 173 - 179.

71. Ленченко Е. М., Павлова И. Б. Электронно-микроскопическое исследование антагонизма бактерий // ж. Ветеринария, 1998, № 7, с. 24-28.

72.Лизько Н. Н. Дисбактериозы экстремальных состояний. // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987, т. 32, № 3.

73.Лихачева А.Ю., Бондаренко В.М., Соколова К.Я. Современное состояние таксономии рода Lactobacillus. ЖМЭИ, № 9 - 10, 1992, с. 74 - 781.

74.Лянная A.M., Интизаров М.М., Донских Е.Е. Биологические и экологические особенности микробов рода Bifidobacterium. В кн. : "Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве" ( Сб. науч. тр.) - М. : Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии. 1986. С. 32 - 38.

75.Малахова Т. И., Мозгов И. Е. В сб.: Фармакологические основы использования лекарственных веществ в животноводстве. -М., 1974, т. 74.

76.Мальцева H.H. Стимуляция местного иммунитета с помощью микробов -представителей нормальной микрофлоры и их компонентов. Автореф. дисс... канд. мед. наук, Москва, 1987, 25 с.

77.Мальцева H.H., Шкарупета М.М., Пинегин Б.В., Коршунов В.М. Иммуномо-дулирующие свойства некоторых микробов - представителей нормальной микрофлоры. Антибиотики и химиотерапия, 1992, № 12, с. 41 - 43.

78.Малявин А. Т. Ветеринария, 1960, № 1.

79.Мартынов А.И., Пинегин Б.В., Коршунов В.М. Принципы деконтоминации тонкого кишечника бактериальными препаратами при антибиотиковом дис-бактериозе в эксперименте. - Жур. микробиол., 1982, № 4, с. 50 - 96.

80.Мечников И.И. - Кишечные микробы / Акад. собр. соч.. - М. : 1962. - Т. 15, -С. 98 - 106.

81.Мечников И.И. Развитие кишечной флоры у человека. В кн : И.И. Мечников. Акад. собр. соч., М., 1956, т. 12, с. 149 - 164.

82.Мозгов И. Е. -Ветеринария 1973, № 9, с. 90-92.

83.Мозгов И. Е. Фармакологические стимуляторы в животноводстве- М.: 1964.

84.Недялков С. и соавт. Ветеринарна сбирка, 1967, № 2.

85.Неменова Ю.М. Методы лабораторных клинических исследований. - М. : Медицина. - 1972.

86.Никитенко В.М. Вместо лекарств бактерии - Ж. Наука в СССР, 1991, №4, с. 14-18.

87.Новик Г.И. Исследование структурно-функциональной организации бифидо-бактерий - Ж. Микробиология, 1998. том 67, № 3, с. 376-383.

88.Орехов И. С. Ветеринария, 1958, № 8.

89.Панин А., Серых Н., МаликШробиотические препараты в ветеринарии // Ве-тинформ. - 2. - 1993. - с. 1 - 8.

90.Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофора - М. ИК "Родник", 1998, с. 5-37.

91.Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М. Медгиз, 1955, с. 436, с. 250.

92.Перетц Л.Г. Сухой колибактерин. В кн. : Новые методы диагностики, лечения и профилактики важнейших заболеваний. Тезисы докладов, М., 1961, с. 62.

93.Перетц Л.Г., Грязнов Н.И., Агибалова Г.И. Витаминообразующая функция микробов нормальной кишечной микрофлоры // ЖМЭИ, 1948, - № 6, -с. 79.

94.Перова П. В. Опыты применения ацидофильной бульонной культуры для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка с.-х. животных. Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 1954.

95.Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. -М.: Медицина, 1976.

96.Пинегин Б.В. Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. 1984, Москва, Медицина, 143 с.

97.Пинегин Б.В., Коршунов В.М., Иконникова Т.Б., Киссина Е.В. Роль условно патогенных бактерий в формировании пострадиационного дисбактериоза. Тез. докл. Всес. симп. "Препараты для специальной диагностики, профилак-

тики и терапии заболеваний, вызванных условнопатогенными бактериями, Москва, 1978, с. 136- 138.

98.Пинегин Б.В., Коршунов В.М., Шкарупета М.Н., Мальцева Н.Н. Индигенные микроорганизмы как иммуномодуляторы, Москва, 1987, с. 148 - 156.

99.Поликарпов Н.А., Бевз Н.И., Викторов А.И., Лянная A.M., Киселева И.А. О некоторых биологических свойствах бифидобактерий // ЖМЭИ - 1992, № 4, с. 6-8.

ЮО.Полонская М.С., Леонович В.В., Бибердиева М.П. Антибиотические вещества ацвдофильных бактерий // Бюллет. НТИ по сельскохозяйственной микробиологии. - 1956. - т. 1. с. 27 - 29.

101.Попова - Барзашка С.Н., Коршунов В.М., Тарабрина Н.П., Боссарт В. Определение антагонистической активности лактобактерий СОЛКО ( Lactobacillus acidophilus LAT 11 / 83 ) при использовании гнотобиологической технологии. ЖМЭИ, 1990, № 9, с. 3 - 6.

102.Поспелова В.В., Шабанская М.А., Морозова Л.В. Биологическая характеристика некоторых производственных и свежевыделенных штаммов лактоба-цилл // Сб. Медиц. аспекты микробной экологии - 1992, Вып. 6, с. 54-57.

ЮЗ.Сатуновская С.П. Антагонистические и антибиотические свойства энтерококков. Микробиология. 1950, № 1, стр. 48-51.

104.Седов В.И. Дифференциальная диагностика энтерококков. Микробиология. 1977, №12, с. 52-55.

105.Семенихина В.Ф. Биология бифидобактерий // Тр. Всесоэзн. НИИ молочной промышленности. - 1968, - № 26. - с. 69 - 78.

Юб.Семенихина В.Ф. Кислотообразующая антибиотическая активность бифидобактерий // Молочная промышленность. - 1967. - № 3. - С. 17-20.

Ю7.Семенихина В.Ф. Типы бифидобактерий, их биологические и биохимические свойства // Тр. Всесоюзн. НИИ молочной промышленности. - 1970. - т. 27. с. 72 - 78.

108.Сергеева Т. и соавт. Ветеринария, 1959, № 5.

109.Сивер В. С. И соавт. - В кн.: Труды IV съезда микробиологов Украины. -Киев, 1975.

1 Ю.Сидоров М. А., Субботин В. В. Основы профилактики желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных // Ж. Ветеринария 1998, № 1, с 24-27.

Ш.Сизова A.B. Значение микрофлоры желудочно - кишечного тракта животных и использование бактерий - симбионтов в животноводстве. - М., 1974.

112.Смирнов В. В., Рева О. Н., Въюницкая В. А. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при конструировании пробиотиков. - Микробиология, 1995, том 64, № 5, с 661667.

113.Совместное развитие бифидобактерий и молочнокислых микроорганизмов в молоке / Эрвольдер Т.М., Гудкова М.Я., Семенова Л.П., Гончарова Г.И. - Сб. научн. тр. ВНИИМС. - Углич. 1986. с. 87 - 91.

114.Сорокин В.В., Тимошко М.А., Николаева A.B. Микрофлора кишечника животных. - Кишинев, 1973.

115.Сорокулова И.Б., Белявская В.А., Масичева В.А., Смирнов В.В. Рекомби-нантные пробиотики: проблемы и перспективы использования в медицине и ветеринарии // Вестник РАМН. - 1997, № 3, с.46-49.

Пб.Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов - М; Колос, 1996, с. 86-95.

117.Субботин В.В., Сидоров М.А. Биотехнология пробиотиков ветеринарного назначения - Ж. Аграрная наука, 1998, № 3, с. 20-21.

И 8.Сычева З.П. Серологическая идентификация производственных штаммов ацидофильной палочки // Пищевая промышленность. - 1964. - № 4 с. 12 - 13.

И9.Тарабрина Н.П. Взаимодействие лактобацилл со слизистой оболочкой кишечника. ЖМЭИ, 1980, № 2, с. 89 - 93.

120.Тарабрина Н.П., Пинегин Б.В. Изучение биологических свойств антибиоти-коустойчивых штаммов молочнокислых бактерий. ЖМЭИ, 1979, № 7, с. 88 -92.

121.Тараканов Б.В. Использование микробных препаратов и продуктов микробиологического синтеза в животноводстве. - М., 1987.

122.Тарасова Н.Б., Соколова К.Я. Новый препарат лактобактерин для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. В кн. : " Материалы XI Всесоюзного съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, Тбилиси, 1970, с. 40.

123.Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных._ Кишинев: Штиинца. - 1990.

124.Тимошко М.А., Вилыпанская Ф.Л., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г. Приживление бифидобактерий в пищеварительном тракте цыплят-гнотобионтов. // Микробиологический журнал. 1960. Т. 42 № 4, с. 487 - 489.

125.Тимошко М.А., Холмецкая В.Г., Бурсум И.Ф. Бактериоценоз пищеварительного тракта поросят - Кишинев. " Штиинца ". 1983 с. 60.

126.Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл Автореф. канд. дисс., Москва, 1990.

127.Тюрин М.В., Шендеров Б.А. Влияние химиопрепаратов на биологические свойства кишечных лактобацилл экспериментальных животных. ЖМЭИ, 1991, №6, с. 6-9.

128.Филиппов В.А. Чувствительность к бактериоцинам как дополнительный таксономический признак принадлежности бактерий к роду Lactobacillus. Антибиотики, 1982, № 8, с. 47 - 51.

129.Фурудуй Ф. И., Федоряка В. П., Хайдарлиу С. X. И др. Стратегия создания адаптивной системы промышленного животноводства. Кишинев, 1987.

130.Хоул Д., Крита Н., Снита П., Стейли Д., Уиллиамса С. Определитель бактерий Берджи - М; Мир - 1997, том 2, с. 538-574, с. 567-582.

131.Хундаков Л.Е., Жамбалов Д.Ж., Дугырова Б.В. Бифидобактерин при диспепсии телят // Ветеринария. - 1976. - № 3. - с. 95 - 96.

132.Чахава О. В. Гнотобиология. - М.: Медицина, 1972.

133.Чахава О. В., Горская Е. М., Рубан С. 3. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии. 1982, Москва, Медицина, с. 5-7.

134.ШварцманЯ.С., Хазенсон Л.Б. Местный иммунитет. Ленинград, Медицина, 1978, 223 с.

135.Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание - М: Гранть, 1998 - 288 с.

136.Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора человека и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии. Антибиотики и медицинская биотехнология, 1987, № 3 с. 164 - 170.

137.Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Микробная экология человека и метаболизм холестерина. 1 . Доказательства и механизмы участия микрофлоры хозяина. Антибиотики и химиотерапия, 1992, т. 37. № 11, с. 46 - 53.

138.Шендеров Б.А., Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Э. Пробиотики и функциональное питание // Ж. Антибиотики и химиотерапия - 1997, том 42, № 7, С. 30-35.

139.Шишков В.П., Исакова Ю.Ф. Теоретические и практические проблемы гнотобиологии - М: Агропромиздат - 1986, с. 158-169.

140.Эпштейн - Литвак Р.В., Вилыпанская Ф.Л. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника, -М. 1969.

141.Эрвольдер Т.М., Гудков A.B. Сухой концентрат бифидобактерий: Материалы XXI Международного молочного конгресса. - М. : 1982, Т 1, Кн. 2, С. 214 -215.

142. Abe F., Ishibashi N., Shimamura S. Effect of administration of bifidobacteria and lactic acid bacteria to newborn calves and pigles.- J. Dairy science, 1995, V. 78 ( 12 ), P. 2838-2846.

143.Bellomo G., Mangiagly A., Nicastro H., Frigeiro G. A controlled double-blind study of SF 68 stain as a new biologicae preparation for the treatment of diarrhoea in pediatrics // Cur. Ther. Res. - 1980.

144.Berg R.D. and Savage D.C. Immune Response of Specificic Pathogen Free and Gnotobionic Mice to Antigens of Indngenous and Nonindgenous Microorgfnisms.// Infect. Immun., 1975, vol. 11, p.320 - 383.

145.Berg R.D. Host Immune Response to Fntigens of the Indigenous Intestinal Flora. In: Human Intestinal Microflora in Health and Disease, ed. David J. Hentger, 1983, Acadtmic Press, New York, p. 101-119.

146.Bergey's Manual of Determinative bacteriology. Edited by R.E. Buchanan and N.E. Gibbons. Baltimore: The Williams and Wilkins Co, 1974.

147.Bergey's Manual of Sistematic Bacteriology. - Vol. 1. John G. Hoed ed. - in -chief. Baltimore: The Williams and Wilkins Co. 1984.

148.Bessler B.G., Biological activity of bacterial surface components: bacterial extracts and defined bacterial cell wall components as immunomodulators. Lung, 1990, vol. 168, p. 707-715.

149.Beuth J., Hong Lioe Ko, Roszowsky W. and Pulverer G. Bacteria of physiological microflora liberate immunomodulating peptides. Microecology and Therapy, 1990, vol. 20, p. 175- 183.

150. Bhatia S. J. L.acidophilus inhibits growth of Campylobacter pylory in vitro. J. Clin. Microbiol., 1989, vol. 27,p. 2328-2330.

151.Boaidson G., Hoimdahi A., Kagar L., Nord S. The normal human Anaerobic Microflora. // Scand. I. And Infect. Dis. Suppl. 1982. N 35. P. 9-15.

152.Borgetta R., Quirino T., Ortisi G. Privitera G. Et. al. The colonization of S. Fae-cium in human intestinal tract after oral administration. // Boll. 1st. Sieroter. Milanese, 1981, 60, 5, 381-385.

153.Bottazzi V. Probiotici develorment usina Cultured wilks - J. Industialed - haltl, 1993, v. 29, p. 3-4. p. 67-73.

154.Boventer K. Bacterium bifidum und seine Bedeuting. - Ergenbisse der bacteriologies 1949.-26.-P. 193 -324.

155.Brandzaeg P., Bjorbe K., Production and secretion of immunoglobulins in the gastrointestinal tract. Ann. Allerg., 1987,vol. 59, N 5, Pt. 2, p.21-39.

156.Brant A. I. and Siemienski J. S. The influence of bacteriocins on resistance to infection by gram-negative bacteria. Intern. J.Clin.lnv., 1965, vol. 44, p. 849-859.

157.Broudiscou H., Jounau J.P. Reassessing the manipulation of protein synthesis by rumen microbes - 1995, 35 (5), p. 517-535.

158.Brown I, Warhurst M, Arcot J, Playne M. Toppina D.H. Fecal numbers of bifidobacteria are higher in pigs fed bifidobacterium longum with a high amilose cornstarch//J. Nutr. 1997, 127 (9), p. 1822-1837.

159.Bullen C., Tearle P. Bifidobacteria in nhe intesnial tract of infast: on in - vitro study. - J. Med. Microbiology, 1976. - 9, 3, - P. 325 - 333.

160.Barefoot S. F. and Klaenhammer T.R. Purification and characterization of the Lactobacillus acidofillus Bacteriocin Lactacin B.//Antimicrobiol. Agents Chemother., 1984, vol. 26, p. 328 - 334.

161.Camarer W. Mchm. med. Wchr., 1961, 41.

162.Canganella F., Paganini S., Ovidi M., Vettraino A., Massa S. A microbiology investigation on probiotic pharmaceutical products used for human health // Microbial. Res. 1997, 152 (2), p. 171-209.

163.Cerguiglini S. Rass. clin. sci., 1974, 50, 4-5.

164.Chateau N., Castellanos 1., Deschamps A. M. Distribution of Pathogen Inhibition in the Lactobacillus Isolates of Commercial Probiotic Consortium.J.Appl. Bacterid., 1993, vol, p.36-41.

165.Chesson A. Use bacteria in disease control and growth promotion in pigs and pouetry - J. Pigs, 1991, v. 7, p. 21-32.

166.Coconner M.N., Hievin V., Berned-Camard M.F., Hudault S., Servin A.H. Antibacterial effect of the adhesing human lactobacillus acidophilus strain lb // Antimi-crob. Agents. Chemother., 1997, 41 ( 5 ), p. 1045-1052.

167.Coghlan A. 'Killer cheeses' primed to fight listeria. - New Sci., 1990, vol. 128, p. 26.

168.Davis, J.T. The lactobacilli-I. In: 'Progress in industrial microbiology' , London, Heywood & Co., 1960.

169.Ducluzeau R. Microbial interaction in digestive tract. In: The Germ-Free Animal in biomedical Research, eds. M.E. Coates and Gustafsson, London: Laboratory Animals LTD, 1984, p. 413-433.

170.Ducluzeau R., Bellier M. And Raibaud P. Effet antagoniste d'une souche de Lactobacillus salivarius sur une souche de Ristella sp. dans le tube digestif de souris «gnotoxeniques» absorbant du lactose. - Annal. Inst. Pasteur, 1971, p. 777-794.

171.Duguid J., Old D. Adhesive properties of enterobacteriaceae// Receptors and recognition.- 1980,- v. 6. - p. 185-217.

172.Eduwards P. Identieications of enterobacteriaceae. - Minneapolis, 1955.

173.Eng R.H.K., Smith S.M., Buccini F.J. Development of resistance to guinologe antibiotics by the gram-positive. Cocci// Abst. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1986, 29.

174.Femandes C.F., Shanhani K. M., Amer M.A. Control of diarrhea by lactobacilli -J. Appl. Nutr., 1998, V. 40 ( 1 ), P. 32-43.

175.Finegold S.M. Normal Human Intestinal Microflora. // Ann. Inst. Super. Sanita, 1986, vol. 22, p. 731-734.

176.Finegold S.V., Sutter Y.L. and Mathishen G.E. Normal Indigenous Intestinal Flora. In: Human Microflora in Health and Disease. Ed. Hentgens D.J., 1983, Academic Press, New York, p. 3-29.

177.Freter R. Interdependence of mechanism that control bacterial colonization of the mucosal surfaces of the large intestine. Microecology and Therapy, 1984, vol. 14, p. 87-89.

178.Freter R. Mechanism of bacterial colonization of Bacterial Pathogenesis. 1988, W. A. DC. 255p.

179.Freter R. Mechanism That control the microflora in the large intestine. In: Human Intestinal Microflora in Health and Disease, ed. David J. Hentgens, 1983, Academic Press, New York, p. 33-50.

180.Friedman D.R. and Halberg S.P. Mixed bacterial infections in relation to antibiotic activitias. //J. Immonol., 1960, vol. 84, p. 11-19.

181.Fuller R. Epitelial Attachment as a Factor Controlling Bacterial Colonization of the Gastrointestinal Tract. In: Recent Advances in Germfree Research, S. sasaki et al. (eds.), 1981, p. 143-147.

182.Fuller R. Probiotics - J. of applied bacteriolog. 1986, V. 62, p. 232-236.

183.Fuller R. Probiotics in man and animals - J. Appl. Bact. 1989, V. 66, p. 365-378.

184.Fuller R.J. Nature of determinant responsible for the adhesion of lactobacilli to chiken crop epitelian cells. // Gep. Microbiol., 1975, vol. 87. p. 245-250.

185.Funada H., Teshima H., Hattorii K. Recostitution of fecal flora after intestinal decontamination. In: Recent advanced in germ-free research, Eds: S. Sasaki, A. Ozawa, K. Hashimoto, Japan, 1981, p. 179-184.

186.Gallaher D.D., Stallings W.N., Blessing L.L., Busta F.F., Brady L.J. Probities, cecal microflora, and aberrant crypts in the rat colon - 1996, 126 ( 5 ), P. 13621371.

187.Galver A., Valdina E., Maquela M., Monteda E. Production of bacteriocine-like substances by group D streptococcui of human origin// Microbios, 1985, 43, N 176, P. 223-232.

188.Gasser F. J. Electrophoretic characterization of lactic dehydrogenases in the genus Lactobacillaceae. //J. Gen. Microbiol., 1970, vol. 62, p. 223-239.

189.Gorbach S.L. Lactic acid bacteria and human health - J. Ann med. 1990, V. 22, P. 37-41.

190.Gordon H.A., Pesti L. The gnotobiotic animals as a tool in the study of host microbial relationship. //Bacteriol.ev., 1971, vol. 35, p. 390-429.

191.Guse L.B., Hubert E.G. and Kalmanson G.M. Microbial interference in Streptococcal infections in the rat kidney. // J. Labor. Clin. Med., 1969, Vol. 74, p. 247287.

192.Haenel H., Bendig J. Gastrointestinal flora in the health and disease. // Microecol-ogy and Therapy, 1980, vol. 10, p. 41-86.

193.Halberg S.P. The relation of antagonostic coliform organism to Shigella Infection. II. Observation in acute infections. //J. Immunol., 1948, vol.. 60., p. 359-381.

194.Hamilton-Miller J.M., Purves D. Enterococci and antigolate antibiotics.// Eur. J. Clin. Microbiol., 1986, 5, N 4, P. 391-394.

195.Harrison A., Hansen P. The bacterial flora of the cecal feces of healthy turkeys// J. Bacter.. - 1950, 59,- P. 197-210.

196.Hentgens D.J. Human instentinal Microflora in health and Disease. // Academic Press, New York, 1983, p. 129-305.

197.Hofstadt T., LPS from gram-negative anaerobic bacteria in ortogeny of gut immunity. // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 1980, vol. 58, 296-299.

198.1keda D.P., Barry A.H., Anderssen S.C. Emergence of streptococcus faccalis isola tes with highlevel aminoglicosides. // Diagn. Microbiol. Infec. Disease, 1984, 2, N 3, 171-177.

199.Jayne-Williams D.J. The application of maniatirured methods for the characterizations of various organisms isolated from the animal qut.- J. Appl. Bact., 1976, vol. 40, N2, P. 189-200.

200.Joerger M.C. and Klaenhammer T.R. Characterization and purification of Hel-veticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481, J. Bacteriol., vol. 167, 439-446.

201.Juven B.J., Meinersmann R.J. and Stern N.J. Antagonostic effects of Lactobacilli and Pediococci to control intestinal colonization by human enteropathogens in live poultry. // J. Appl. Bacteriol., 1991, vol. 70, p. 95-103.

202.Kandler O. and Weiss N. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Vol. 2, Baltimore, Williams and Wilkins, 1986, p. 1209-1234.

203.Kawamishi H., Saltzman L., Strober W., Mechanism regulating Iga class-specific Ig production in murine gut associated lymphoid tissues, // J. Exp. Med, 1983, vol. 158, N 3, p. 649-669.

204.Keen A. Growth studies on yhe Lactic streptococci// J. Dairy Res., - 1972. 39- p. 133-150.

205.Kent T.H., Osborne J.W., Wende C.M. Intestinal microflora in whole body and intestinal irrsdiated rats. //Radiat. Res., 1968, vol. 35, p. 635-651.

206.Kenworthy R. Intestinal microbial flora of the pig - J. Vet. Med. - 1990, V. 38, # 6, P. 31-51.

207.Kimura K., McCartney A.L., McConnel M.A., Tannok G.W. Analysis of fecal populations of bifidobacteria and lactobacilli and investigation of the immunological responses of their human hosts to the predominant strains - Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63 ( 9 ), p. 3394-33998.

208.Klaenhammer T.R. Antimicrobial and bactericin interactions of the lactic acid bacteria. Proceedings 6th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Strabourg, 12-18 August. 1990, vol. 1, p. 433-445.

209.Klaenhammer T.R. Bacteriocins of lactic acid bacteria. // Biochime, 1988, vol. 70, p. 337-349.

210.Kleeman E.C., Klaenhammer T.R. Adherence of Lactobacillus species to humans fetal intesyinal cells. //J. Dairy Sci., 1982, vol. 65, p. 2063-2069.

211.Kmet V., Kmetova M., Contrepois M., Ribot Y. Bifidobacteria and E. coli translocation in gnotobiotic mice.// Adv. Exp. Med. Boil. 1995, v 371 A, p 479-482.

212.Knox, K.W., Wicken, A.J. Immunological properties of teichois acids. // Bacte-riol. Rev., vol. 37, 1973, p. 215-257.

213.Korschunov V.M., Bossart W., Maltseva N.N. Gladjko I.A., Schkarupeta M.M. The study of immunomodulating activity of L.acidophilus «Solco» on the model of immunocompromiced mice. // 4th Felasa Symposium, 1990, Lyon, France, p. 136.

214.Kotowski K. Med. Weter, 1983, 39, 4.

215.Kramer J., Brandis H. Purification and characterization of two bacteriocins from streptococcus faecium.//J. Gen. Microbiol. 1975, 88, P. 93-110.

216.Larsen A.G., Vogensen F.K., Josephsen J., Antimicrobial activity of lactic acid bacteria from sour doughs-purifications and characterization of Bavaricin-A, bacte-riocin produced by Lactobacillus bavaricus M1401. // J. Appl. Bacteriol., 1993, vol. 59, N2, p. 159-164.

217.Lee John C.H. The enterococci colonizers or pathogens. //Abstr. Ann. Mut. Amer. Soc. Microbiol., 1986, № 10, p 23.

218.Lidbeck A., Allinger U.G., Orhage K.M., Ottova L., Brismar B., J.-A. Gus-tafsson, J. J. Rafter, Nord C.E. Impact of lactobacillus acidophilus Supplements on the Faecal Microflora and Soluble Faecal Bile acids in Colon Cancer Patients. // Microflora Ecology in Health and Disease, 1991, vol. 4, N 2, p. 81-89.

219.Lim K. S., Huh C. S., Baek Y. J., Kim H. U. A selective enumeration medium for bifidobacteria in fermented dairy products. // J. Dairy. Sci., 1995, v 78(10),p 21082112.

220.London J. The ecology and taxominic status of the lactobacilli.// Ann. Rev. Microbiol., vol. 30, 1976, p. 279-301.

221.Luckey T.D. Survey of intestinal microecology. // Microecologi and Therapy, 1979, vol. 9, p. 39-56.

222.Mackowiak P.A. The normal microbial flora. // The New England J. Med., 1982, vol. 307, p. 83-93.

223.McCormick E.L. and Savage D C., Characterization of Lactobacillus sp. strain 100-37 from the murine gastrointestinal tract: Ecology, plasmid content, and an-tagonostic activity toward Clostridium ramosum HI, // Appl. Environ. Microbiol., 1983, vol. 46, 1103-1112.

224.McGhee J.R. and Mestecky J., Secretory immune system, // Ann. Nat. Acad. Sci., 1983, vol. 409, N 6, p. 17896-17916.

225.McNabb P.C. and Tomasi T.B. Host Defence Mechanisms at Mucosals Surfaces. // Ann. Rev. Microbiol., 1981, vol. 35, p. 477-496.

226.Mead G.C. Isolation media for group D streptococci// Int. J. Food Microbiol., 1985, N 1-2, 115-117.

227.Meszaros I. Wiener Tierarzflishe Monatsschrift, 1978, 65, 1.

228.Metchnicov E., In: The prolongation of life., 1908, New York, g.p. Putnam's Sons, p. 161-183.

229.Mitic S., Otenhajmer I., Obradjvic D.A., A study of bacterial antagonism of strains of Lactobacillus acidophilus towards some test-organisms. // Acta Vet. (FRI), 1973, vol. 23, N 3, p. 141-147.

230.Mitsuoka T. Intestinal flora and host. // Asian Med. J., Japan, 1989, vol. 31, p. 400-409.

231 .Mitsuoka T. Resent trends in Research on intestinal flora// Bifidobact. And Microflora. - 1982. - vol. 1, N 1. - P.3-24.

232.Moon H.W. Pathogeneuesis of enteric diseases caused by E. coli// Adv. Vet. Soi. CompMed.. - 1974, 18. - P. 179-211.

233.Morichita Y, Mitsioka T., Kaneuchi C. et. al. Specific establishment of lactoba-cilli in the digestive tract of germ-free chickens // Japan J. Microbiol., 1971, voi. 15.-p. 531.

234.Muriana P.M. and Klaenhammer T.R. Conjugal Transfer of Plasmid-Encoded Determinants for Bacteriocin Production and Immunity in Lactobacillus acidophilus 88, // Appl. Environ. Microbiol., 1987, vol. 53, p. 553-560.

235.Namba G., Hidaka G. And Taki K., Effect of oral administration of lisozime of digested bacterial cell walls on immunostimulation of gulenea pigs. // Infect. Immun., 1981, vol. 31, N 2, p. 580-583.

236.Nomoto K. Augmentation of resistance of mice to bacterial infection by a poly-saccharide-peptidoglycan complex (PS PG) extracted from L. casei. // Biotherapy, 1989, vol. 1, N 3, p. 169-177.

237.Nomoto K., T. Yokokura, K. Tsuenoka, M. Shikita. Radioprotection of mice by a single subcutaneous injection of heat-killed Lactobacillus casei after irradiation. // Rad. Res., vol. 125, p. 293-298.

238.Park M. S., Lee K. H., Ji G. E. Isolation and characterization of two plasmids from Bifidobacterium Longum. //Lett. Appl. Microbiol., 1997; 25(1), p 5-7.

239.Peach S. Intestinal bacterial flora in normal adults// Ann. Inst. Sup. Sanit.. -1919.- v. 15, N1,-P. 9-18.

240.Perdigon G. Effect of perorrally administrired lactobacilli on m-activation in mice. // Infect. Immun., 1986, vol. 53, p. 404-410.

241.Perdigon G., Alvarez S., Nader de Macias M.E., Savoy de Giori G., Medici M., Nunez de Macias M.E. Behaviour of natural and heated yougurt in the immune system and preventive on enteric infections. // Milchwissenshaft, 1991, vol. 46, N 7, p. 411-416.

242.Perdition G.., Alvarez S., Rachid M., Aguero G., Gobbato N. Immune system simulation by probiotics - J. Dairy science, 1995, 78 ( 7 ), P. 1597-1606.

243.Rada V. Effect of Kluyveromyces marxianus on the growyh and surviral of bifidobacteria in milk // Folia. Microbial. Praha. 1997, 42 (2), P. 145-208.

244.Radulovic D. et. al. Veter. Glasnic, 1976, 30, 11.

245.Rammelsberg M. And Radler F. Antimicrobial polypeptides of Lactobacillus species. - J. Appl. Bacteriol., 1990, vol. 69, p. 177-184.

246.Rasic I.G., Rurmann I.U. Bifidobacteria and their role. Basel-Boston-Stuttgart. Birkhauser Verlag. 1983. P. 278.

247.Raynard M., Levesque G., Janet L. Research on diets inoreasing Lactobacillus bifidus//Arch. Ranc. Pediatr.. - 1960, 17. - P. 533-540.

248.Rehm, W. F., Zur frage des nachweises sog-hemmstaffer in der milk. 16 Intern. // Dairy Conf., 1962, vol. C, S. VIII: 2, 487.

249.Reid G. Probities: low microorganisms compete. - Jama., 1996, 276 ( 1 ), P. 2930.

250.Reyniers J.A., Wagner N., Trexler P.S., Luckey T.D., Ervin R.F., Gordon H.A. A complete life-sycle in the «germ-free» Baham chicken. // Nature, 1949, vol. 163, p. 67-68.

251.Robbins S. Probiotic. A. European perspective. Feed compounder. 1987. N 6. P. 24-28.

252.Rogosa M., Sharpe M. An approach to the classification of the Lactobacilli // Appl. Bacter.. - 1959. - v. 22, N 3. - P. 329-340.

253.Rusch V. Modulation der microflora durch micobielle agenzien. In: Abstracts Int. Symp. Current Problems of medical Gnotobiology and Orogastrointestinal Microflora, Rostock, Germany, 1990, p. 30-31.

254.Rychen G., Nunes C. S. Effects of three microbial probiotics on postprandial porto-arterial consentration differences of glucose, galactose and amino-nitrogen in the young pig. // Br. J. Nutr. 1995, v 74 (1), p 19-26.

255.Sadatsune T., Kuwalaka M., Watakabe T., Matsuo J. Bacteriocin typing Entero-cocci// Hirosime Jour of Med. Sei., 1978, vol. 27, N 4, P. 27-33.

256.Savage D. Microbiologicae ecology of the gastrointestinal tract// Ann. Rev. Microbiol.. - 1977. - v. 31. - P. 107-133.

257.Savage D.C. Colonization by and surviral of pathogenic bacteria in intestinal mucosal surfaces. In Britton G., Marschall K.C., eds. Adsorption of microorganisms to surfaces. // New York, John Willey, 1980, p. 175-206.

258.Savage D.C. Overview of the association of microbes with epitelial surfaces. // Microecology and Therapy, 1984, vol. 14. P. 169-183.

259.Schleiter K.H., Kilpper-Bals R., Kraus J., Hudwing W., Dvorak C., Stackebraund E. Classification of streptococci// Abl. Bacteriol., Microbiol. Und Hug., 1986, A 262, W 2, P 275.

260.Schuler R. et. al. Milchwissenshaft, 1968, 23, 9.

261.Schulze F. Arch, exper. Veter-Med., 1977, 31, 2.

262.Sears H.J., Brownlee I. And Ushigama J.K. Persistence of individual strains of E. coli of the intestinal tract of man. // J. Bacteriol., 1949, p. 293-301.

263.Seo Genichiro., Shimuzu Kazuo., Satatsu Masaroni., Konomeguni. Inchibition of growth of some enteropathogenic Strains in Mixed culturies of Streptococcus fae-

calis and Clostridium butyricum. Microbios hett.- 1989, N 40 P. 159-160. C. 151160.

264.Shahani K.M., Friend B.O., Baileu P.U. Antitumor activity of fermentation colostrum and milk. // J. Food Protection. 1983. N 385-386.

265.Sharpe M. Taxominy of lactobacilli// Dairy Sei. Abstr.. - 1962. - v. 24, N 3, - P. 109-118.

266.Sharpe M.E. Identification of lactic acid bacteria. In: Identification Methods for Microbiologists, Eds.: Skinner F.A. and Lovelock D.W., // Academic Press, London, 1979, p. 233-259.

267.Sierra T. and Moreau M.C. Role of digestive microflora in the regulation of humoral immune response of thymus-independed antigents. // Microecology and Therapy, 1990, vol. 20, p. 325-329.

268.Silva de Ruis C. Effect of lactobacilli and antibiotics on E. coli urinary infections in mice. //Biol. Pharm. Bull. 19, 1996, p 88-93.

269.Simon G.L., Gorbach S.L. Intestinal microflora. // Med. Clin. North Amer. 1982. N 66. P. 557-574.

270. Smith H. The bacteriology of the alimentary tract of domestic animals suffering from Escherichia coliinfection//Ann. N.J. Acad. Sei.. - 1971, 176,-P. 110-125.

271. Smith H.W. and Higgins M.B. Further observation on the association of the colicine V plasmid of E. coli with pathogeneticy and with surviral in the alimentary tract. // J. Gen. Microbiol., 1976, vol. 92, p. 335-350.

272.Smith H.W. The development of the flora of the alimentary tract in young animals//J. Pathol. Bacteriol..- 1965,- v. 90. - P. 495-513.

273.Spiegel C.A. Laboratory detection of high-level aminocyclitol resistance in en-terococcus spp.// J. Clin. Microbiol., 1988, 26, N 11, P. 2270-2274.

274. Stackebrandt E. and Teuber M. Molecular taxominy and philogenetic position of lactic acid bacteria. // Biochimie, 1988, vol. 70, p. 317-324.

275.Steelman A.I., Snider I.S., Six E.V. Modifying effect of colicin on experimental Shigella keratoconjuctivitus. Infect. Immun., 1970, vol. 2, p. 311-340.

276.Stekar J. et. al. Krmiva, 1977, 19, 10.

277.Stewart C.S., Chesson A. Making sence of probiotics - J. Pig Veterinary, 1993, V. 31, № 12, P. 126-142.

278.Stewart-Tull D.E.S. The immunological activities of bacterial peptidoglicans. Ann. Rev. Microbiol., 1980, vol. 34, p. 311-340.

279.Sudirman I., Mathien F., Michel M., Leferbure G., Detection and properties of Curvaticin-13, a bacteriocin-like substante, produced by L. curvatis SB 13. Current Microbiology, 1993, vol. 27, № 1, p. 35-41.

280.Suegara N., Watanabe T., Scimonashi H. Et. al. Colonization of Streptococci in the gastrointestinal tracts. Adhesion to epithelial cells as a colonization factor. In: Recent advanced in germ-free research. Eds: S. Sasaki., A. Ozawa., K. Hashimoto. Japan, 1981, P. 165-172.

281.Suzuki I., Nomura M., Morichi T. Isolation of lactic acid bacteria which suppres mold growth and slow antifungal action. // Milchwisseschraft, 1991, vol. 46, p. 635-639.

282.Tagg J.R. and McGiven A.R. Assay system for bacteriocins. // Appl. Microbiol., 1971, vol. 21, p. 943.

283.Tagg J.R., Dajani A.S. and Wannamaker L.W. Bacteriocins of Gram-positive Bacteria. //J. Bacteriol. Rev., 1976, vol. 40, p. 422-756.

284.Tannok G.W. and Savage D.C. Influence of dietary and environmental stress on microbial populations in the murine gastrointestinal tract. // Infect. Immun., 1974, vol. 9, p. 591-598.

285.Tannok G.W. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for fU-damental R andD. - Department of Microbiology., 1997, 15 (7), P. 270-274.

286.Tissler H. Recherches sur la flora intestinale. - Carre, Paris, 1900.

287.Toba T., Yoshioka E. and Itoh T., Lactacin, a bacteriocin produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. //Lactis. Letters Appl. Microbiol., 1991, vol. 12, p. 43-45.

288.Tournut J. L'eleveur pore., 1977, 78.

289.Treznnetis S., Leonardopoulos J., Papavassiliou J. Enterocinogeny and eysogeny in enterococci// J. Appl. Bacteriol., 1970, V.33, P. 350-362.

290.Underdahe N.R. Activity of Streptococcus faecium (SF 68) in experimental enteritis due of E. coli in gnotobiotic pigs ability to colonize at different bowel sites// Microbios., 1988, 41, 119, 201-206.

291.Upreti G.C. and Hindsill R.D. Production and mode of action of lactocin 27: bacteriocin from a homofermantative Lactobacillus. // Antimicrobial Agents Chemother., 12-975, vol. 7, 139-145.

292. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract as a major lead in the selection if antibiotics for the therapy. Eds: Van der Waaij. J. Verhoef, 1979, Amsterdam, p. 271-282.

293. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract-mechanism and clinical consequences. //Die Nahrung, 1987, vol. 31, p. 507-517.

294.Weiss I., Retger L. Lactobacillus bifidum// J. Bact..- 1934,- 28, 1,- P. 501-526.

295.Werner H. Zum Vorcommen von Bifiolusbakterien und morphologisch ahnlichen Keimen in der Mundhohle Erwachsenez // Zbl. bact. - Orig. 1. - 1964. - 193. - P. 381-432.

296.West C. and Warner P.J., Plantacin B, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum NCDO 1193. // FEMS Microbiology Letters, 1988, vol. 49, p. 163-165.