Анализ транспортера серотонина с помощью сайт-специфических антител тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Павлова, Елена Владимировна

• Павлова, Елена Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Павлова, Елена Владимировна

Список использованных сокращений

I ВВЕДЕНИЕ

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Роль механизма обратного захвата нейромедиаторов в д синаптической передаче информации

2 Обнаружение процесса обратного захвата нейромедиа- 12 торов (моноаминов и аминокислот)

3 Физико-химическая характеристика процесса обратного 13 захвата нейромедиаторов (моноаминов и аминокислот)

4 Электрофизиологические исследования транспортеров 18 нейромедиаторов с помощью "пэтч-кламп" метода

5 Солюбилизация и очистка белков - транспортеров ней- 20 ромедиаторов

6 Обнаружение семейства генов SLC6 молекулярно- 21 генетическими методами

7 Транспортер серотонина

7.1. Распределение в тканях и клетках

7.2. Структурно-функциональные исследования

7.3. Пост-трансляционный процессинг СЕРТ

7.4 Регуляция СЕРТ

7.4.1 Пострансляционная регуляция

7.4.2. Регуляция экспрессии гена СЕРТ (медленная регуляция)

7.5. Роль СЕРТ в клеточных и физиологических процессах

7.5.1. Нейромедиатор серотонин

7.5.2. Р°ль СЕРТ в клеточных и физиологических процессах, протекающих с участием серотонина

Фармакологические аспекты.

Использование сайт-специфических антител для анализа СЕРТ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Рекомбинантные белки к С-концевому фрагменту 597630 транспортера серотонина крысы, использованные в работе

Получение моноклональных антител к С-концевому участку СЕРТ крысы 597

Определение антигенсвязывающей активности монокло- 47 нальных антител

Очистка моноклональных антител с помощью ионооб- 48 менной хроматографии

Получение иммуногенных конъюгатов пептидов с бычь- 48 им сывороточным альбумином

Получение кроличьих антисывороток к пептидным 49 фрагментам транспортера серотонина

Тестирование антител к пептидным фрагментам транс- 49 портера серотонина

Приготовление аффинных носителей

Аффинная очистка поликлональных кроличьих антител 51 к пептидным фрагментам белка-транспортера серотонина

Определение белка

Приготовление конъюгатов антител с пероксидазой хре- 52 на

Выделение тромбоцитов человека

Приготовление экстрактов тромбоцитов для электрофо- 53 реза

14 Приготовление экстрактов тромбоцитов для аффинной 54 хроматографии

15 Аффинная очистка экстрактов тромбоцитов.

16 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсуль- 55 фатом натрия (SDS-ПААГ)

17 Процедура иммуноблоттинга

18 Иммуноблоттинг СЕРТ в экстрактах посмертного мозга 58 человека

19 Иммуноблоттинг экстрактов ткани мозга крысы 59 IV РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Получение гибридом - продуцентов моноклональных ан- 60 тител к С-концевому фрагменту 597-630 транспортера серотонина крысы

2 Анализ специфичности антител к транспортеру серото- 61 нина

3 Очистка моноклональных антител и их характеристика

4 Оптимизация условий иммуноблоттинга СЕРТ в лизатах 68 тромбоцитов человека

4 1 Подбор эффективных концентраций меченых пероксида- 68 зой моноклональных антител для иммуноблоттинга

4 2 Оптимизация метода получения лизата тромбоцитов для иммуноблоттинга

4.3 Анализ картины иммуноблоттинга с использованием па- 74 нели моноклональных антител к С-концевому фрагменту транспортера серотонина

4.4 Иммуноблоттинг лизатов тромбоцитов, очищенных аф- 74 финно на колонках антитела-сефароза

5 Получение и характеристика кроличьих поликлональных 78 антител к синтетическим пептидам, включающим фрагменты СЕРТ человека 69-83 и 86

5.1 Получение иммуногенных конъюгатов пептидов с бычь- 78 им сывороточным альбумином

5.2 Тестирование антител к фрагментам транспортера серо- 79 тонина в иммунных сыворотках

5.3 Аффинная очистка антител к пептидным фрагментам 81 транспортера серотонина и их конъюгация с пероксидазой хрена

5.4 Доказательство специфичности поликлональных антител 83 к N-концевым фрагментам СЕРТ: иммуноблоттинг лизатов тромбоцитов, очищенных аффинно на антителах к С-концевому фрагменту

5.5 Анализ иммунореактивности поликлональных антител к 86 N-концевым фрагментам СЕРТ 69-83 и 86-100 в имму-ноблоттинге экстрактов тромбоцитов человека

6 Анализ СЕРТ методом иммуноблоттинга в мозге челове-

§9 ка и крысы с помощью антител к С-концу СЕРТ

V ОБСУЖДЕНИЕ

VI ВЫВОДЫ 112 VIII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГТ - глютатионтрансфераза;

ИФА - твердофазный иммуноферментный метод;

МкАТ - моноклональные антитела;

ПкАт 86-100 - поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотонина 86-100 (vdfllsvigyavdlg);

ПкАт 69-83 - поликлональные антитела к фрагменту транспортера серотонина 69 - 83 (tlvaelhqgeretwg); ПААГ - полиакриламидный гель;

Р1 - рекомбинантный белок в котором модифицированная глутатион-трансфераза (ГТ) соединена, в рамке, с фрагментом 597-630 серотониново-го транспортера;

Р2 - рекомбинантный белок в котором модифицированный тиоредоксин-6His (ТГ) присоединен, в рамке, к фрагменту 597-630 серотонинового транспортера крысы; СЕРТ - серотониновый транспортер;

SDS-ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия;

ТГ - тиоредоксин-бШБ;

ТМД - трансмембранный домен;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ транспортера серотонина с помощью сайт-специфических антител»

Актуальность проблемы. Активность серотониновой системы у человека и животных в значительной степени определяется встроенным в пресинаптическую мембрану белком - транспортером серотонина (СЕРТ), который обеспечивает обратный захват нейромедиатора из пресинаптиче-ской щели [Barker and Blakely, 1995; Rudnick and Clark, 1993]. За последнее десятилетие были клонированы гены, кодирующие СЕРТ человека, некоторых млекопитающих и Drosophila melanogaster [Blakely et al., 1991; Chang et al., 1996; Corey et al., 1994; Demchyshyn et al., 1994; Hoffman et al., 1991; Lesch et al., 1993; 1993a; Ramamoorthy et al., 1993]. Молекулярно-генетические исследования установили, что СЕРТ принадлежит к семейству Na+ и С1~- -зависимых транспортных белков, которые осуществляют перенос ряда биогенных аминов и аминокислот, являющихся нейротранс-миттерами и нейромодуляторами: серотонина (5-окситриптамина - 5-ОТ), дофамина, норадреналина, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), глицина и др. [см. обзоры: Amara and Kuhar, 1993; Chen et al., 2004; Kanner, 1994; Rudnick and Clark, 1993]. Показана значительная гомология между генами СЕРТ и белков-переносчиков других нейротрасмиттеров, а также высокая степень гомологии между генами СЕРТ разных видов. Исходя из первичной структуры клонированных генов, были предложены теоретические модели структурной организации СЕРТ и других белков этого семейства, предполагающие наличие 12 трансмембранных доменов (ТМД)1. СЕРТ представляет большой интерес не только для нейробиологии, но и для фармакологических разработок. Этот белок служит мишенью для три-циклических антидепрессантов и селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, а также для кокаина и наркотических амфетаминов.

1 Предполагаемая структура транспортеров этого семейства приведена на Рис.5.

Вместе с тем, несмотря на значительный прогресс молекулярно-генетических исследований, на белковом уровне СЕРТ изучен недостаточно. В частности, требуют дальнейшего выяснения пути посттрансляционного процессинга этого белка. Один из наиболее эффективных путей изучения СЕРТ - использование специфических антител. В настоящее время опубликовано несколько работ по анализу СЕРТ методом иммуноблоттин-га [Gulesserian et al., 2000; Inazu et al., 2001, Qian et al., 1995]. Однако, результаты этих исследований неоднозначны. Так, наблюдается большая вариабельность в величинах молекулярных масс СЕРТ-иммунореактивных полипептидов, выявляемых в разных работах. Одной из причин этих несовпадений может быть несовершенство иммунохимических методов анализа СЕРТ, которыми в настоящее время могут располагать исследователи (например, недостаточная специфичность и воспроизводимость иммуноб-лоттинга). Вместе с тем, несмотря на указанные сложности, СЕРТ был выявлен с помощью различных методов (включая, иммуноблоттинг) не только в мозге, но также во многих периферических структурах. В частности, СЕРТ локализуется на наружных мембранах тромбоцитов, где он участвует в процессах поддержания гемостаза [Launay et al., 1992; Lesch et al., 1993,а]. Молекулы СЕРТ в нейронах и на тромбоцитах синтезируются при экспрессии одного и того же гена, и, как считают, обладают идентичными фармакологическими свойствами [Lesch et al., 1993]. Таким образом, тромбоциты являются удобной экстрацеребральной моделью для изучения СЕРТ. Вместе с тем, систематических исследований по анализу СЕРТ в тромбоцитах методом иммуноблоттинга (с использованием панели антител к различным участкам молекулы) не проводилось, что затрудняет использование этой модели в фармакологических и нейробиологических исследованиях.

Таким образом, для дальнейшего изучения структуры и функции СЕРТ, так же как для развития фармакологических разработок, весьма актуальным является: а) получение новых сайт-специфических антител, распознающих различные участки первичной структуры СЕРТ; б) создание на их основе более эффективных и воспроизводимых тест-систем для имму-нохимического анализа СЕРТ (в том числе усовершенствованных вариантов иммуноблоттинга СЕРТ); с) использование этих методов для более детальной характеристики продуктов экспрессии гена СЕРТ в различных тканях и клетках.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - анализ структурной организации молекулы СЕРТ в тканях крысы и человека с помощью сайт-специфических антител.

В задачи работы входило:

1) получение моноклональных антител (МкАТ) к С-концевому фрагменту 597-630 СЕРТ крысы и человека;

2) получение поликлональных антител (ПкАТ) к фрагменту 69-83 в N-концевой части молекулы СЕРТ человека;

3) получение ПкАТ к фрагменту 86-100 в ТМДI молекулы СЕРТ человека;

4) анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ и ПкАТ в экстрактах тромбоцитов человека;

5) анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ в экстрактах мозга крысы и мозга человека.

Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. Результаты нашей работы позволили высказать предположение, что молекула СЕРТ подвергается в тромбоцитах и клетках мозга эндопротео-лизу с образованием нескольких полипептидов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Павлова, Елена Владимировна

VI. выводы

1) Получены МкАТ к С-концевому фрагменту СЕРТ 597-630, При использовании МкАТ к фрагменту СЕРТ 597-630 разработан оптимизированный вариант иммуноблоттинга СЕРТ, позволяющий проводить анализ СЕРТ в клеточных экстрактах.

2) Выяснены условия, обеспечивающие высокую эффективность анализа СЕРТ методом иммуноблоттинга. Во-первых, целесообразно использовать для выявления иммунореактивных белков меченые пероксидазой аффинноочищенные СЕРТ-специфические антитела. Этот подход позволяет элиминировать неспецифическое окрашивание, наблюдаемое при использовании меченых пероксидазой вторых (антивидовых) антител. Во-вторых, ввиду чувствительности СЕРТ к неспецифическому протеолизу, экстракты для анализа необходимо готовить в жестких условиях, препятствующих неспецифический деградации белков.

3) Получены кроличьи ПкАТ к N- концевому участку 69-83 СЕРТ и фрагменту 86-100 в начале ТМД1, эффективные в иммуноблоттинге.

4) С помощью С-концевых анти-СЕРТ МкАТ в экстрактах тромбоцитов человека, в препятствующих неспецифической деградации белков, методом иммуноблоттинга обнаружено 5 иммунореактивных белков с мол. массами 35, 37, 56 и 68 кДа, а также белки с мол. массой 150-200 кДа, по-видимому, являющиеся агрегатами молекул СЕРТ.

5) С помощью ПкАТ к N-концевому фрагменту 69-83 СЕРТ и ПкАТ к фрагменту 86-100 в ТМД1 СЕРТ в экстрактах тромбоцитов человека, в условиях, препятствующих неспецифической деградации белков, обнаружены полипептиды с мол. массами 14, 22, 32, 56 и 68. Белки с мол. массой 35 и 37 кДа этими антителами не выявлялись, что может указывать на утрату N-концевой части молекулы СЕРТ в этих полипептидах.

6) В мозге крысы и человека методом иммуноблоттинга с помощью МкАТ к С-концу СЕРТ обнаружены полипептиды с мол. массой 35, 37, 56 и 68 кДа.

7) Белок с мол. массой 68 кДа обнаруживался в экстрактах тромбоцитов, очищенных аффинно на МкАТ к С-концу СЕРТ, как с помощью С-концевых МкАТ, так и с помощью ПкАТ к N-концу СЕРТ, что позволяет заключить, что этот белок, по всей видимости, является полноразмерной молекулой СЕРТ.

8) Предложена гипотеза о протеолитическом процессинге СЕРТ, согласно которой обнаруженные СЕРТ-иммунореактивные белки с мол. массами 14, 22, 32, 35, 37 и 56 кДа являются пептидными фрагментами, образующимися в результате эндопротеолиза (протеолитического процессинга) белка-предшественника с мол. массой 70,5 кДа (теоретическая мол. масса СЕРТ), мигрирующего в условиях наших экспериментов как белок с мол. массой 68 кДа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Павлова, Елена Владимировна, 2007 год

1. Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология. (Учебное издание) Минск: Книжный дом, 2004

2. Дубынин В.А.,Каменский А.А., Сапин М.Р., Сивоглазов В.И. Регу-ляторные системы организма человека. (Учебное издание). Москва: Дрофа, 2003.

3. Льюин Б. Гены. (Пер.с. англ. Под ред. Георгиева Г.П.) Москва: Мир, 1987.

4. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах.2-ое изд. (пер. с англ.) Москва: Мир, 1984.

5. Недоспалов В.О. Физиология центральной нервной системы. (Учебник) Москва: ООО УМК "Психология", 2002.

6. Неер Э.И.,Сакман Б. Метод пэтч-кламп. В мире науки, 1992, №5, 16-24.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия.З-ее издание (Учебник). Москва: Медицинское информационное агенство., 2004.

8. Ю.Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. Ленинград: Наука, 1987.

9. П.Фаллер Д.М., Шилде Д. Молекулярная биология клетки. (Руководство для врачей). Пер. с англ. под общ. редакцией акад. Збарского И.Б. Москва: Бином-Пресс, 2004.

10. Чард Т. Радиоиммунологические методы. М.: Мир, 1981.

11. Adkins Е.М., Barker, E.L., Blakely, R.D. Interactions of tryptamine derivatives with serotonin transporter species variants indicate transmembrane domain 1 in substrate recognition. Mol. Pharmacol, 2001, 59, 514-523.

12. Amara S.G. and Kuhar M.J. Neurotransmitter transporters: recent progress. Annu. Rev.Neurosci., 1993, 16, 73-93.

13. Axelrod, J., Weil-Malherbe, H., Tomchick R. The physiological disposition of 3H-epinephrin and its metabolite metanephrine. J. Pharmacol.Exp.Ther., 1959,127, 251-256.

14. Balkovetz D., Tirrupati C., Leibach F., Mahesh V., Ganapathy V. J. Biol.Chem., 1989, 264, 2195-2198.

15. Bannon M.J., Zue C.H., Shibata K., Dragovic L.I., Kapatos G. Expression of a human cocain-sensitive dopamine transporter in Xenopus laevis oocytes. J.Neurochem, 1990, 54, 706-708.

16. Barker E.L., Blakely R.D. Norepinephrine and serotonin transporters: molecular targets of antidepressant drugs. In: Bloom F.E., Kupfer D.J., editors. Psychopharmacology: the fours generation of progress. New York: Raven Press, 1995, p. 321-333.

17. Bauman A.L., Apparsundaram S., Ramamoorthy S., Wadzinski B.E., Vaughan R.A., Blakely R.D. Cocaine and antidepressant-sensitive biogenic amine transporters exit in regulated complexes with protein phosphatase 2A. J. Neurosci, 2002, 20, 7571-7578.

18. Berger P., Martenson R., Laing P., Thurcauf A., DeCosta B. Photoaffin-ity labeling of the dopamine reuptake carrier using a novel high affinity ayido-derivative of GBR-12935. Soc. Neurosci Abstr., 1990, 16, 13.

19. Bergman J., Madras B.K., Johnson S.E., Spealman R.D. Effect of cocaine and related drugs in nonhuman primates. III. Self administration by squirrel monkeys. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1989, 251,150-155.

20. Biessen E.A., Horn A.S., Robillard G.T. Partial purification of the 5-hydroxytryptophans reuptake system from human blood plateles using a citolo-pram-derived affinity resin. Biochemistry, 1990, 29, 3349-3354.

21. Blakely R.D., Berson H.E., Fremeau Jr. R. Т., Caron M.G., Peek M.M., Prince H.K., and Bradely C. Cloning and expression of a functional serotonin transporter from rat brain. Nature, 1991, 354, 66-70.

22. Blakely R.D., Ramamoorthy S., Schroeter S., Qian Y., Apparsundaram S., Galli A., Defelice L.J. Regulated phosphorylation and traffiking of antidepressant -sensitive serotonin transporter proteins. Biol. Psychiatry, 1998, 44, 169-178.

23. Braakman I., Hoover-Litty H., Wagner K. and Helenius A. J. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Cell Biol., 1991, 114, 401-411.

24. Bradley C.C., Blakely R.D. Alternative splicing of the human serotonin transporter gene. J.Neurochem. 69, 1997,1356-1367.

25. Brown G.L., Gillespie J.S. The output of sympathetic transmitter from the spleen of the cat. J. Physiol., 1957, 138, 81-102.

26. Brown M.S., Ye J., Rawson R.B., Goldstein J.L. Regulated intramem-brane proteolysis. Cell, 2000,100, 391-398.

27. Burn J.H. The action of tyramine and ephedrine. J.Pharmacol. Exp. Ther. 1932,46, 75-95.

28. Burnet P.W.J., Eastwood S.L., Lacey K., Harrison P.J. The distribution of 5HT la and 5HT2a receptor mRNAs in human brain. Brain Research, 1995, 676,157-168.

29. Caspi A., Sugden K., Moffit Т.Е., Tailor A., Craig I.W., Harrington H., McClay J., Mill J., Martin J., Braithwaite A., Poulton R. Influence of life stress on depression: Moderation by an polymorphism in the 5-HTT gene. Science, 2003,301,386-389.

30. Chang A.S., Chang S.M., Starnes D.M., Schroeter S., Bauman A.L., Blakely R.D. Molecular cloning of the mouse serotonin transporter. Mol. Brain Res., 1996,43, 185-192.

31. Chang A.S., Starnes D.M., Chang S.M. Possible existence of quaternary structure in the high-affinity serotonin transport complex. Biochem. Biophys Res. Commun, 1998, 249: 412-416.

32. Chen J.G., Chen S.L and Rudnick G. External cystein residues in the serotonin transporter. Biochemistry, 1997, 36,1479-1486.

33. Chen J.G., Rudnick G. Permeation and gating residues in serotonin transporter. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000, 97, 1044-1049.

34. Chen N.H., Reith M.E.A., Quick M.W. Synaptic uptake and behond: the sodium-and chloride-dependent neurotransmitter transporter family SLC6. Pflu-gers Arch-Eur. J. Physiol., 2004, 447, 519-531.

35. Danbolt N.C., Piney G., and Kanner B.I. Purification and reconstitution of the sodium and potassium-coupled glutamate transport glycoprotein from rat brain. Biochemistry, N.Y., 1990, 29, 6734-6740.

36. Daniels G.M. and Amara S.G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. J. Biol.Chem., 1999, 274, 35794-35801.

37. Dette G.A. and Wesemann W. The role of sialic acid in 5-HT binding to synaptic membranes. Experientia, 1979, 35, 1152-1153.

38. Dgany O. and Wides R. The Drosophila ods/ten-m gene encodes a type I, multiply cleaved heterodimeric transmembrane protein. Biochem. J., 2002, 363, 633-43.

39. Dighiero G., Lymberi P., Mazie J.C., Rouyre S., Buttler-Browne G.S., Whalen R.G., and Avrameas S. Murine hybridomas secreting natural monoclonal antibodies reacting with self antigens. J. Immunol., 1983, 134, 765-771.

40. Eddahibi S., Raffestin В., Hamon M., and Adnot S. Is the serotonin transporter involved in the pathogenesis of pulmonary hypertension? J. Lab. Clin. Med., 2002, 130,194-201.

41. Fanburg B.L.L.S. A new role for an old molecule: serotonin as a mitogen. Am. J. Physiol., 1997,272, L795-806.

42. Fuller R.W., Wong D.T. Serotonin uptake and serotonin uptake inhibition. Ann. N.Y. Acad. Sci, 1990, 600, 68-78.

43. Gelernter J., Pakstis A.J., Kidd K.K. Linkage mapping of serotonin transporter protein gene SLC6A4 on chromosome 17. Hum. Genet., 1995, 95, 677-680.

44. Gething M.J.and Sambrook J. Protein folding in the cell. Nature, 1992, 355,33-45.

45. Gielen W., and Viefhofer B. Experientia, 1997, 30,1177-1178.

46. Gordon J. and Barnes N.M. Lymphocytes transport serotonin and dopamine: agony or ecstasy? Trends in immunology, 2003, 24,438-443.

47. Graham D., Esnaud H., Langer S.Z. Characterisation and purification of the neuronal sodium-ion-coupled 5-hydroxytryptamine transporter. Biochem. Soc. Trans., 1991,19, 99-102.

48. Grigoriadis D.E., Wilson A.A., Lew R., Sharkey J.S., Kuhar M.J.

49. Dopamine transport sites selectively labeled by a novel photoaffinity probe: ,25I-DEEP. J.Neurosci, 1989, 2664-2670.

50. Guastella J., Nelson N., Nelson H., Czyk K.L., Keynan S., Miedel M.C., Davidson N., Lester M.A., Kanner B.I. Cloning and expression of a rat brain GABA transporter. Science, 1990,249,1303-1306.

51. Guilbert В., Mahana W., Gilbert M., Mazie J. C., and Avrameas S. Presence of natural autoantibodies in hyperimmunnized mice. Immunology, 1985,56, 401-408.

52. Gulesserian Т., Engidawork E,, Cairnes W., Lubec G. Increased protein levels of serotonin transporter in frontal cortex of patients with Down syndrome. Neurosci Lett, 2000,296, 53-57.

53. Haase J., Killian A.M., Magnani F., and Williams C. Regulation of the serotonin transporter by interacting proteins. Biochemical Society Transaction, 2001,29, part 6, 722-728.

54. Harrison P.J., and Burnet P.W. The 5-HT2a (serotonin 2A) receptor gene in the aetiology pathophysiology and pharmacotherapy of schizophrenia. J. of Psychopharmacology, 1997,11,21-23.

55. Harrison P.J. and Geddes J.R. Schizophrenia and the 5-HT2a receptor gene. Lancet, 1996, 347, 1274.

56. Helenius A., Tatu Т., Marquardt T. and Braakman I. In: Cell Biology and Biotechnology. Rupp R.G. and Oka M.S., edt. Springer-Verlag, Berlin, 1992.

57. Hirst W.D., Price G.W., Rattray M., Wilkin G.P. Serotonin transporters in adult rat brain astrocytes revealed by H.-5-HT uptake into glial plasmalem-mal vesicles. Neurochem Int., 1998, 33, 11-12.

58. Hoffman B.J., Mezey E., Brownstein M.J. Cloning of a serotonin transporter affected by antidepressants. Science, 1991, 254,579-580.

59. Horschitz S., Hummerich R., and Schloss P. Structure, function and regulation of the 5-hydroxytryptamine (serotonin) transporter. Biochemical Society Transactions, 2001, v.29, 728-732.

60. Iversen L.L., Glowinski J., Axelrod J. The physiological disposition and metabolism of norepinephrine in immunosympathectomized animals. J. Pharmacol Exp Ther, 1996, 151, 273-284.

61. Jayanthi L.D., Ramamoorthy S., Manesh U.B., Leibach F.H., Ganapathy V. Calmodulin-dependent regulation of the catalytic function of the human serotonin transporter in placental choriocarcinoma cells. J.Biol.Chem, 1994, 269, 14424-14429.

62. Jess U., Far O.E.I., Kirch J., Betz H. Interaction of the C-terminal region of the rat serotonin transporter with MacMar-CKS modulates 5-HT uptake regulation by protein kinase C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 294, 272279.

63. Kaback, H.R. Transport studies in bacterial membrane vesicles. Science, 1974,186, 882-892.

64. Kamdar G., Penado K.M.Y., Rudnik G., Stephan M.M. Functional role of critical strip residue in transmembrane span 7 of the serotonin transporter. J.Biol.Chem., 2001,276,4038-4045.

65. Kanner B.I. Sodium-coupled neurotransmitter transport: structure, function and regulation. J.Exp.Biol., 1994,196, 237-249.

66. Kanner B.I. and Bendahan A. Transport of 5-hydroxytryptamine in membrane vesicles from rat basophilic leukemia cells. Biochim. Biophys. Acta, 1985,816,403-410.

67. Kanner B.I., Keynan S., Radian R. Structural and functional studies on the sodium and chloride-coupled y-aminobutyric acid transporter: deglycosyla-tion and limited proteolysis. Biochemistry, 1989, 28, 3722-3728.

68. Kish S.J., Furukawa Y., Chang L.J., Tong J., Ginovart N., Wilson A., ' Houle S., Meyer J.H. Regional distribution of serotonin transporter in postmortem human brain: is the cerebellum a SERT-free brain region? Nucl. Med. Biol., 2005,32,123-128.

69. Kuhar M.J. Neurotransmitter uptake: A tool for identifying neurotrans-mitter-specific pathways. Life Sci, 1973, 33,1623-1634.I

70. Langer S.Z., Briley M. High affinity H-imipramine bindings new biological tool for studies in depression. Trends Neurosci, 1981,4, 28-31.

71. Launay J., Bondoux D., Oset-Casque M., Emami S., Mutel V., Haimart M., Gespach C. Increase of human platelet serotonin uptake by atypical histamine receptors. Am. J. Physiol., 1994,266, 526-536.

72. Launay J.M., Geoffroy C., Buckle M., Cesura A., Alouf J. and Da Prado M. One-step purification of the serotonin transporter located at the human platelet plasma membrane. J.Biol.Chem., 1992, 267, 11344-11351.

73. Lesch K.R., Heils A., Reiderer P. The role of neurotransporter in excito-toxicity, neuronal cell death and other neurodegenerative process. J. Mol. Med., 1996, 74, 365-378.

74. Lesch K.P., Mossner R. Genetically driven variation in serotonin uptake: is there a link to affection spectrum, neurodevelopmental and neurodegen-eration disorder? Biol.Psychiatry, 1998,44 (3), 179-192.

75. Lesch K.P., Wolozin B.L., Estler H.C., Murphy D.L., Riederer P. Isolation of a cDNA encording the human brain serotonin transporter. J.Neuronal. Transm., 1993,91,68-73.

76. Lesch K.P., Wolozin B.L., Murphy D.O., Riederer P. Primary structure of the human platelet serotonin uptake site: identity with the brain serotonin transporter. J.Neurochm, 1993, 60,2319-2322.

77. Lew R., Grigoriadis D.E., Wilson A., Boja J.W., Simantov R., Ruhar MJ. Dopamine transporter: deglycosylation with exo- and endoglycosidases. Brain Res., 1991, 539, 239-246.

78. Littlefield J.W. Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science, 1964, 145, 709-710.

79. Lopes-Corcuera В., Kanner B.I., Aragon C. Reconstitution and partial purification of the sodium and chloride-coupled glycine transporter from rat spinal cord. Biochim Biophys Acta, 1989, 983,247-252.

80. Mager S., Min C., Henry D.H., Chavkin C., Hoffman B.J., Davidson N. et al. Conducting states of a mammalian serotonin transporter. Neuron, 1994,12, 845-859.

81. Maizel J.V. The fractionation of proteins and nucleic acids using poly-acrylamide gel electrophoresis. In: Habel K. and Salzman N.P., eds. Fundamental techniques in virology. New York, Academic Press, 1969, pp. 267-293.

82. Malchow R.P., Ripps H. Effects of gamma-aminobutiric acid on skate retinal horizontal cells:evidens for an electrogenic uptake mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci USA 87,1990, 845-849.

83. Melikian H.E., Mc Donald J.K., Gu H., Rudnick G., Blakely R.D. Human norepinephrine transporter: biosynthetic studies using a site-directed polyclonal antibody. J. Biol. Chem., 1994,269,12290-12297.

84. Miller K.J. and Hoffman B.J. Adenosine A3 receptors regulate serotonin transport via nitric oxide and cGMP. J. Biol. Chem., 1994, 269, 27351-27356.

85. Miller K.J., Hoffman B.J. 5HT2 receptors increase 5HT transport via nitric oxide and cGMP. Soc. Neurosci Abstr, 1995, 21, 344.

86. Mossner R. and Lesch K.P. Role of serotonin in the immune system and in neuroimmune interactions. Brain Behav. Immun., 1998, 12, 249-271.

87. Nichols D., Atwell D. The release and uptake of excitatory amino acids. Trends Pharmacol. Sci., 1990,11, 462-468.

88. Nishio H., Nezasa K., Nakata Y. Role of calcium ion in platelet serotonin uptake regulation. Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. Sect., 1995, 288,149-155.

89. Olivier В., Soudijn W., Wijngaaden I. Serotonin, dopamine and norepinephrin transporters in the central nervous system and their inhibitors. Prog. Drug Res, 2000, 54, 59-119.

90. O'Reilly C.A. and Reith M.E.A. J. Biol. Chem, 1998, 6115-6121.

91. Ozaslan D., Wang S., Ahmed B.A., Kocabas A.M., McCastlain J.C., Bene A., and Kilic F. Glycosyl modification facilitates homo- and hetero-oligomerization of the serotonin transporter. J. Biol. Chem., 2003, 278, 4399144000.

92. Pacholczyk Т., Blakely R.D., Amara S.G. Expression cloning of a cocaine-and antidepressant-sensitive human noradrenaline transporter. Nature, 1991,350,350-353.

93. Payelle-Brogard В., Ternynck Т., Guilbert В., and Avrameas S. Anti-tubulin antibodies in rabbits before and after immunization with pig tubulin. Mol. Immunol., 1989, 26, 121-128.

94. Peroutka S.J. Molecular biology of serotonin (5HT) receptors. Synapse, 1994,18, 241-260.

95. Qian Y., Galli A., Ramamoothy S., Risso S., DeFelice L.J., Blakely R.D. Protein kinase С activation regulates human serotonin transporters in HEK-293 cells via altered cell surface expression. J.Neurosci, 1997, 17, 45-47.

96. Radian R., Kanner B.I. Recognistitution and purification of the sodium and chloride-coupled y-aminobutyric acid transport glycoprotein from rat brain. J. Biol. Chem., 1986, 260,11859-11865.

97. Ramamoorthy S., Giovanetti E., Qian Y., Blakely R.D. In vivo phosphorilation of antidepressant-sensitive serotonin transporter. J.Biol.Chem., 1998, 273,2458-2466.

98. Ramamoorthy S.M.H., Qian Y., Blakely R.D. Biosynthesis, N-glycosylation and surface trafficking of biogenic amine transporter proteins. Methods Enzymol., 1998, 296, 347-370.

99. Ramamoorthy J.D., Ramamoorthy S., Papapetropoulos A., Catravas J.D., Leibach F.H., Ganapathy V. Cyclic AMP-independent upregulation of the human serotonin transporter by staurosporine in choriocarcinoma cells. J. Biol. Chem., 1995,270, 17189-17195.

100. Rehavi M., Skolnick P., Brownstein M.J., Paul S.M. High affinity binding of 3H. desipramine to rat brain: A presynaptic marker for noradrenergic uptake sites. J. Neurochem., 1982, 38, 889-895.

101. Ritz M.C., Lamb R.J., Goldberg S.R., Kuhar M.J. Cocaine receptors on dopamine transporters are related to self-administration of cocaine. Science, 1987, 237,1219-1223.

102. Rotman A., Pribluda V. Photoaffinity labelling of the serotonin carrier protein in platelets and brain synaptosomes. Biochim. Biophys. Acta 1982, 714,173-6.

103. Rotman A. J.Neurochem., 1976, 28, 1369-1372.

104. Rudnick G. Active transport of 5-hydroxytryptamine by plasma membrane vesicles isolated from human blood platelets. J. Biol. Chemistry, 1977,252,2170-2174.

105. Rudnick G. and Clark J. From synapse to vesicle:the reuptake and storage of biogenic amine neurotransmitters. Biochim. B-iophys. Acta, 1993, 1144, 249-263.

106. Sakai N., Sasaki K., Nakashita, Honda S., Ikegaki N., Saito N. Modulation of serotonin transporter activity by protein kinase С activation and an inhibition of type 1 and 2A serine/threonin phosphatase. J. Neurochem., 1997, 68, 2618-2624.

107. Sallee F.R., Fogel E.L., Schwartz E., Choi S.M., Curran D.P., Niznik H.B. Photoaffinity labeling of the mammalian dopamine transporter.

108. FEBS Lett, 1989, 256,219-224.

109. Sanders-Bush E., Conn J.P. Neurochemistry of serotonin neuronal systems consequences of serotonin receptor activation. In: Meltzer H.Y., ed. Psychopharmacology, 3rd generation of progress. New York, Raven Press, 1987, p.95-103.

110. Sarthy V. y-aminobutyric acid (GABA) uptake by Xenopus oocytes injected with rat brain mRNA. Mol. Biol. Res., 1986, 1, 97-100.

111. Schwartz E.,Tachibana M. Electrophysiology of glutamate and sodium cotransport in a glial cell of the salamander retina. J. Physiol., 1990, 426, 43-80.

112. Sjoqvist F., Taylor P.W.J., Titus E. The effects of immunosympathectomy on the retention and metabolism of noradrenaline. Acta Physiol Scand, 1967, 69,13-22.

113. Shigematsu, Yamamoto K., Higuchi, Fukuda T. Novel non-uniorm distribution of serotonin transporter in the mouse hippocampus and neocortex revealed by N- and C-terminal domain-specific immunohistochemistry. Brain Research, 2006,1075: 110-116.

114. Sneddon J.M. Blood platelets as model for monoamine containing neurons. In: Progress in Neurobiology, Kerkut G.A. and Phillis J.W., eds. Per-gamon Press, Oxford, 1973, pp.l51-197.

115. Spealman R.D., Madras B.K., Bergman J. Effects of cocaine and related drugs in nonhuman primates. II. Stimulant effects on schedule- controlled behavior. J. Parmacol. Exp. Ther., 1989, 261,142-149.

116. Stalh S.M. Essential psychopharmacology. Neuroscientific basis and practical application. 2nd ed. Cambridge. Cambridge University Press, 2000.

117. Suyama K. and Goldstein J. Antibody produced against isolated Rh(D) polypeptide reacts with other Rh-related antigens. Blood, 1988, 72„ 1622-1626.

118. Szabodos L., Mester L., Michal F., and Born G.V. Accelerated uptake of 5-hydroxytryptamine by human blood platelets, enriched in a sialic acid. Biochem. J., 1975,148, 335-336.

119. Szatkowski M., Barbour В., Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake. Nature, 1990,348,443-445.

120. Tate C., Blakely R. The effect of N-linked glycosylation on activity of the Na(+) and Cl(-)-dependent serotonin transporter expressed using recombinant baculovirus in insect cells. J. Biol. Chem., 1994,269, 26303-26310.

121. Uhl G.R., Hall F.S., Sora I. Cocaine, reward, movement and monoamine transporters. Mol. Psychiatry, 2002, 7, 21-26.

122. Uhl G.R., O'Hara В., Shimada S., Zaczek R., Digiorgiani J., Nishi-mori T. Dopamine transporter: expression in Xenopus oocytes. Mol. Brain Res., 1991,9, 23-29.

123. Weihofen A. and Martoglio B. Intramembrane-cleaving proteases: controlled liberation of proteins and bioactive peptides. Trends Cell Biol., 2003, 13,71-78.

124. Wennogle L.P., Ashton R.A., Schuster D.I., Murphy R.B., Meyer-son L.R. 2-Nitroimipramine: a photoaffinity probe for the serotonin uptake / tricyclic binding site complex. EMBO J., 1985, 4, 971-977.

125. Wilson M.B., Nakane P.K. (1978) in "Imunofluorescense and related staining techniques" ed. W.Knapp, K.Holubar, L.Wich. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, p.215.

126. Zaimis E., Berk L.,Callingham B.

127. Morphological biochemical and functional changes in the sympathetic nervous system of rats treated with NGF-antiserum. Nature, 1965, 206, 1221-1222.

128. Zilkha-Falb R., Ziv I., Nardi N., Offen D., Melamed E., Barziliani A. Monoamine-induced apoptotic neuronal cell death. Cell Mol. Neurobiol., 1997, 17, 101-118.