Анализ структуры и получение в прокариотической системе рекомбинантного белка G2 хантавируса серотипа пуумала, изолированного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Мухаметханов, Наиль Ханафиевич

• Мухаметханов, Наиль Ханафиевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мухаметханов, Наиль Ханафиевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

1.2 Молекулярная биология, филогения и зоогеография хантавирусов.

1.2.1 Зоогеография хантавирусов.

1.2.2 Особенности организации генома хантавирусов

1.2.3 Синтез вирусной РНК и созревание вирионов.

1.2.4 Функции вирусных белков

1.3 Вакцины.

1.3.1. Генно-инженерные вакцины.

1.3.2 ДНК-вакцины. Особенности генетической иммунизации

1.3.3 Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении.^

1.3.4 Вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Глава 2 Объект и методы исследований.

2.1 Краткая характеристика объектов исследований.

2.2 Выделение и очистка тотальной РНК из образцов легочной ткани 54 рыжей uoRQBKii.(Clethrionomys glareolus)

2.3 Выделение и очистка суммарной РНК из образцов крови 55 больных, заболевших ГЛПС.

2.4 Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.5 Выделение плазмидной ДНК методом мягкого лизиса

2.6 Удаление РНК из препаратов плазмидной ДНК.

2.7 Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.^

2.8 Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 60 условиях

2.9 Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 62 условиях

2.10 Синтез кДЬЖ.

2.11 Полимеразная цепная реакция.

2.12 Элюция ДНК из агарозных гелей.

2.13 Концентрирование ДНК бутанолом

2.14 Приготовление компетентных клеток

2.15 Приготовление вектора для клонирования

2.16 Секвенирование ДНК

2.17 Цитирование вектора и фрагмента ДНК

2.18 Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

2.19 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.20 Индукция lac промотора.

2.21 Электрофорез полипептидов Е. coli.

2.22 Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.23 Реактивы и материалы.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ структуры и получение в прокариотической системе рекомбинантного белка G2 хантавируса серотипа пуумала, изолированного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан»

Актуальность проблемы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - широко распространенное в странах Евроазиатского континента вирусное природно-очаговое заболевание. В Европейской части Российской Федерации на территории Республики Башкортостан (РБ) находится самый крупный и активный природно-зоонозный очаг этого заболевания. Природные очаги в РБ характеризуются высокой эпидемической активностью и являются самыми напряженными в мире. В РБ уровень заболеваемости в 5 - 10 и более раз превышает общефедеративный и составляет 40-60% заболеваемости по России. С 1957 г. по 2003 г. в республике переболело более 70 тыс. человек. Наивысшие показатели достигнуты в 1997 г.: по РБ - 224,5 на 100000 населения, из них 34 случая (0,4%) смертельного исхода (Нургалеева и др., 1999); по г. Уфе - 512, а по Благовещенскому р-ну - 1059. Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу PUU. В Восточной Сибири и на Дальнем Востоке ГЛПС с более тяжелой формой и смертностью от 1% до 12%, вызывается серотипом Сеул (SEU) и Хантаан (HTN). Актуальность изучения проблемы обусловлена отсутствием тенденции к снижению заболеваемости, тяжестью течения с развитием различных тяжелых осложнений (токсико-инфекционный шок, почечная недостаточность, разрыв почек, тромбогеморрагический синдром, кровоизлияние) и значительным экономическим ущербом. К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и этиотропной терапии ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в республике характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3— 4 года. Подобные вспышки связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов - природного резервуара для вируса. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Передача вируса от грызуна к человеку происходит в основном воздушно-капельным путем и через экскременты животных (Avsic-Zupanc et al., 1995; Chu et al., 1994; Schmaliohn et al., 1985). Ежегодно по всему миру фиксируется более 150-200 тысяч случаев заболевания ГЛПС. Эффективность лечения любого заболевания определяется его точной диагностикой на раннем этапе заболевания.

Для диагностики ГЛПС наиболее широко используются методы, основанные на детекции специфических антител. В этих методиках используется фиксированный ацетоном антиген, полученный из культуры клеток Vero Е6, инфицированных патогенным хантавирусом (Lee et al., 1985). Получение подобного препарата является весьма трудоемкой и небезопасной процедурой. Альтернативой традиционному получению антигена может стать рекомбинантный вирусный белок, синтезированный в про- или эукариотической системе экспрессии. При наличии эффективных штаммов-продуцентов получение рекомбинантного белка потребует значительно меньше времени, кроме того, отсутствует необходимость работы с вирусом.

Разработанные и лицензированные на сегодняшний день вакцинные препараты для профилактики ГЛПС представляют собой «живые» аттенюированные вакцины, созданные на основе вирусов серотипов HTN и SEU, циркулирующих, преимущественно, в странах Азии - Китае и Южной Корее (Song et al., 1998; Lee et al., 2001). К тому же, по ряду сообщений, указанные вакцинные препараты индуцируют низкий уровень синтеза нейтрализующих антител у иммунизированных людей. На территории России основным возбудителем ГЛПС является вирус серотипа PUU, и поэтому нет оснований утверждать, что данные вакцины окажут эффективное профилактическое действие. Альтернативой обычным вакцинам разрабатываются и уже разработаны рекомбинантные вакцины, например, от гепатита В и С (Спасокукоцкий, 2000). Стратегия создания таких вакцин сводится к клонированию гена, чей продукт при экспрессии в подходящей системе приведет к продукции белка, способного вызвать при введении в организм человека синтез вируснейтрализующих антител, против данного вируса. Еще одним направлением в области рекомбинантных технологий является разработка ДНК-вакцин. Принцип ДНК-вакцинации основан на введении в организм векторной ДНК, несущей гены белков, продукция которых приведет к полноценному иммунному ответу. Данный подход позволил получить антитела к множеству антигенов инфекционных патогенов вирусной и бактериальной природы (Dertzbaugh et al., 1997). В настоящее время в ряде стран Западной Европы, а также в Китае, Южной Корее активно ведутся исследования, направленные на создание ДНК-вакцин для лечения и профилактики ГЛПС. Однако до введения ДНК-вакцин в медицинскую практику необходимо провести длительные эксперименты для того, чтобы подтвердить их эффективность и безопасность.

Цель работы заключалась в исследовании структуры гена поверхностного гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан и создании системы получения рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.

Задачи исследования:

1. Амплификация, клонирование и секвенирование гена гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из органов грызунов и крови больных ГЛПС на территории Республики Башкортостан;

2. Анализ нуклеотидной и выведенной из нее аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 и сравнение с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов;

3. Получение генетической конструкции, содержащей ген поверхностного гликопротеина G2 исследуемого хантавируса, способного экспрессироваться в прокариотической системе;

4. Получение рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.

Научная новизна. Из результатов проведенных нами исследований установлено, что на территории Республики Башкортостан циркулирует хантавирус Ufa-2005 серотип PUU. Определена полная последовательность кодирующей области гена G2. Получены генно-инженерные конструкции на основе векторов pGEM Teasy, pBluescript и pPinPoint, включающие в себя кодирующую область гена гликопротеина G2 хантавируса серотипа PUU, экспрессия которого регулируется бактериальным lac промотором. Показана возможность экспрессии полноразмерного белка G2 хантавируса серотипа Пуумала в Е. coli (штамм JM 109).

Практическая значимость Полученные результаты расширяют и дополняют представления о структуре нуклеотидной и белковой последовательностей хантавируса, который циркулировал на территории Республики Башкортостан и являлся причиной вспышки заболевания ГЛПС в 2001-2005гг. Ген G2 из плазмидных конструкций можно использовать для получения штамма-продуцента гликопротеина, для диагностических целей, ДНК-вакцины и рекомбинантной вакцины.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов (Уфа, 2000); на Всероссийской научно-практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2002); на Всероссийской конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», посвященной 100-летию основания филиала «Иммунопрепарат» (Уфа, 2005); «История изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» (Уфа, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и тезисы научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 125 страницах и содержит 18 рисунков и 3 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Мухаметханов, Наиль Ханафиевич

ВЫВОДЫ:

1. Амплифицирован, клонирован и секвенирован ген гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из органов грызунов и крови больных во время вспышки ГЛПС 2001-2005 г.г. на территории Республики Башкортостан.

2. Показано, что исследуемый хантавирус Ufa-2005 относится к серотипу Пуумала и имеет общее генетическое происхождение со штаммами, выделенными ранее на данной территории.

3. Из анализа нуклеотидной и выведенной из нее аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 в сравнении с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов следует, что гликопротеин G2 Ufa-2005 относится к белку слияния.

4. Получена генетическая конструкция на основе вектора pPinPoint, способная экспрессироваться в клетках Е. coli, содержащая полную последовательность кодирующей области гена поверхностного гликопротеина G2 исследуемого хантавируса под контролем индуцируемого бактериального lac промотора.

5. Показано, что синтезируемый в клетках Е. coli белок G2 содержит антигенные детерминанты, определяемые иммуноферментным анализом тест-системой «Хантагност», и может быть использован для диагностических целей.

Заключение

В результате проведенных исследований, нами был выделен и получен полноразмерный ген вирусного гликопротеина G2 хантавируса Ufa-2005. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей изолированного вируса Ufa-2005 показал, что вирус имеет генетически общее происхождение со штаммами, выделенными ранее в Республике Башкортостан из рыжей полевки {Clethrionomys glareolus). Были выявлены замены в нуклеотидной последовательности выделенного гена G2 от соответствующего участка первичной структуры М-сегмента штаммов: CG-1820, CG17, К27. Наличие целого ряда отличий в первичной структуре исследованного участка М-сегмента вируса Ufa-2005 требует проведения дополнительных исследований, направленных на установление стабильности и возможности появления другого варианта вируса в последующие годы.

Сконструированы векторные системы pGEM-G2, pBluescript-G2 и pPinPoint-G2, кодирующие ген гликопротеина G2. Плазмидные конструкции могут использоваться в качестве донора гена G2 при получении рекомбинантной вакцины в дрожжевой векторной системе(Р/с/?ш pastoris) и ДНК-вакцины. Следует отметить, что плазмида была получена на основе серотипа PUU - основного возбудителя ГЛПС в Республике Башкортостан.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мухаметханов, Наиль Ханафиевич, 2010 год

1. Alexeyev О., Elgh F., Zhestkov A., Wadell G., Juto P. Hantaan and Puumala vitus antibodies in blood donors in Samara, an HFRS-endemic region in European Russia // Lancet. 1996. - V. 347. - P. 1483-1494.

2. Alff P., Sen N., Gorbunova E., Gavrilovskaya I.N., Mackow E.R. The NY-1 Hantavirus Gn cytoplasmic tail coprecipitates TRAF3 and inhibits cellular interferon responses by disrupting TBK1-TRAF3 complex formation //J Virol. 2008. - V. 82.-P. 9115-9122

3. Andersson H., Barth B.-U., Ekstrom M. Garoff H. Oligomerization-dependent folding of the membrane fusion protein of Semliki Forest virus. J. Virology. 1997. - V. 71. - P. 9654-9663.

4. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Molecular characterization of the M genomic segment of the Seoul 80-39 virus;nucleotide and amino acid sequence comparisons with other hantaviruses reveal the evolutionary pathway // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 47-58.

5. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Nucleotide seqvuence and coding capacity of the large (L) genomic RNA segment of Seoul 80-39 virus a mamber of the hantavirus genus // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 59-66.

6. Antic D., Wright K.E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glicoprotein G1 and G2 // Virology. 1992. - V. 189. - P. 324-328.

7. Antic D., Wright K.E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glycoproteins G1 and G2 // Virology.- 1992. V. 189. - P. 324-328.

8. Antic D., Yong Kang C., Kristin S., Schamaljohn C., Vapalahti O., Vaheri A. Comparison of the deduced gene of the L, M, S genom segments of hantaviruses // Virus Res. 1992. - V. 24. - P. 35-46.

9. Arikawa, J., Takashima, I., Hashimoto, N. Cell fusion by haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) viruses and its application for titration of virus infectivity and neutralizing antibody // Arch Virology 1985. - V. 86. -P. 303-313.

10. Avsic-Zupanc Т., Toney A., Anderson K., Chu Y.K., Schmaliohn C.S. (1995). Genetic and antigenetic properties of Dobrava virus: a unique member of the Hantavirus genus, family Bynyaviridae // J. Gen. Virol. -1995.-V. 76.-P. 2801-2808.

11. Babiuk L.A., Lewis J., Suradhat S., Baca-Estrada M., Foldvari M., Babiuk S. Polynucleotide vaccines: potential for inducing immunity in animals // J. Biotechnol. 1999. - V. 73. - P. 131-140.

12. Barry M., Johnston S. Biological features of genetic immunization // Vaccine. 1997. -V. 15. - P. 788-791.

13. Beaty B. J., Miller B.R., Shope R.E., Rozhon E.J., Bishop D.H. Molecular basis of bunyavirus per os infection of mosquitoes: role of the middle-sized RNA segment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 12951297.

14. Beaty B.J., Rozhon B.R., Gensemer P., Bishop D.H. Formation of reassortant buniaviruses in dually infected mosquitoes // Virology. 1981. -V.lll.-P. 662-665.

15. Boshart M., Weber F., Jahn G., Dorsh-Hasler K., Fleckenstein В., Schaffner W. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. // Cell. 1985. - V. 44. - P.521-530.

16. Bowen M.D., Kariwa H., Rollin P.E., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic charaterization of a human isolate of Puumala hantavirus from France // Virus Res. 1995. - V. 38. - P. 279-89.

17. Chapman B.S., Thayer R.M., Vincent K.A., Haigwood N.L. Effect of intron A from human cytomegalovirus immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells // Nuc. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 3979-3986.

18. Chen S.-Y., Compans R.W. Oligomerization, transport, and Golgi retention of Punta Того virus glycoproteins // Virology. 1991. - V. 65. - P. 59025909.

19. Chomczynski P., Sacchi N.// Anal. Biochem. 1987. -V. 162. -P.156-59.

20. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chlorofonn extraction // Anal. Biochem. — 1987.-V. 162.-P. 156-159.

21. Chu Y.K., Jenning G., Leduc J.W., Lee H.W., Schmaliohn C.S., Dalrymple J.M. Serologgical relathionships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // Virology. 1994. - V. 198. - P. 196-204.

22. Clare J.J., Rayment F.B., Ballantine S.P., Sreekrismna K., Romanos M.A. High-level expression of tetanus toxin fragment С in Pichia pastoris strainscontaining multiple tandem integrations of the gene // BioTechnology. -1991.-V. 9.-P. 455-460.

23. Collett M.S. Messenger RNA of the M segmeent RNA of Rift Vallay fever vurus//Virology.- 1986.-V. 151.-P. 151-156.

24. Combet C., Blanchet C., Geourjon C., Deleage G. NPS network protein sequence analysis // Trends Biochem. Sci. 2000 - V. 25. - P. 147-150.

25. Corver J., Ortiz A., Allison S.L., Schalich J., Heinz F.X., Wilschut, Membrane fusion activity of tick-borne encephalitis virus and recombinant subviral particles in a liposomal model system // Virology. 2000. - V. 269, 37-46.

26. Davis H.L., Michel M.L., Whalen R.G. DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis-B surface-antigen and high-levels of circulating antibody // Human Mol. Genet. 1993. - V. 2 - P. 1847-1851.

27. Donelly J., Ulmer J., Shiver J., Margaret A. DNA vaccines // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V. 15. - P. 617-648.

28. Easterbrook J.D., Klein S.L. Immunological mechanisms mediating hantavirus persistence in rodent reservoirs // PLoS Pathog. -2008 V. 4. -P.42-49.

29. Eisenberg D., Liithy R., Bowie J.U. VERIFY3D: assessment of protein models with three-dimensional profiles. Methods // Enzymol. 1997. - V. 277. - P. 396-404.

30. Elliot R.M. Molecular biology of the Buniaviridae // J. Gen. Virol. 1990. -V. 71-P. 501-522.

31. Epand R.M. Fusion peptides and the mechanism of viral fusion // Biochim. Biophys. Act.-2003.- V. 1614.-P. 116-121.

32. Ferreira G., Monteiro G., Prazeres D., Cabral J. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications // Trends. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P.380-388.

33. Gallaher W.R., DiSimone M.J., Buchmeier M.J The viral transmemrane superfamily possible divergence of Arenavirus and Filovirus glycoproteins from a common RNA virus ancestor // Microbiol. -2001. — V. 1. — P.24—34

34. Garcin D., Lezzi M., Dobbs M., Elliot R.M., Schmaljiohn C., Kang C.Y., Kolakofsky D. The 5'-ends of Hantaan virus (Buniaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign mechanism for the initiation of RNA synthesis // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 5754-5762.

35. Gibbons D.L., Vaney M.-C., Roussel A., Vigouroux A., Reilly В., Lepault, J., Kielian M., Rey F.A. Conformational change and protein-protein interactions of the fusion protein of Semliki Forest virus // Nature. 2004. -V. 427.-P. 320-325.

36. Giulian G.G. Resolution of low molecular weight polypeptides in a non-urea sodium dodecyl sulfate slab polyacrylamid gel system // Fed. Proc. 1985. -V. 44.-P. 686-693.

37. Gonzalez-Scarano F., Janssen R., Najar J.A., Pobjecky N., Nathanson N. An avirulent G1 glycoprotein variant of La Crosse bunyavirus with defective fusion function // J. Virol. 1985. - V. 54. - P. 757-763.

38. Guirakhoo F., Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C. Fusion activity of flaviviruses: comparison of mature and immature (prMcontaining) tick-borne encephalitis virions // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. -P. 1323-1329.

39. Hacker J.K., Hardy J.L Adsorptive endocytosis of California encephalitis virus into mosquito and mammalian cells: a role for G1 // Virology. 1991. -V. 235.-P. 40-47.

40. Hardestam J., Karlsson M., Falk K.I., Olsson G., Klingstrom J., Lundkvist A. Puumala hantavirus excretion kinetics in bank voles (Myodes glareolus) II Emerg. Infect. Dis. 2008 -V.14. - P. 1209-1215

41. Henikoff S., Henikoff J.G. Protein family classification based on searching a database of blocks // Genomics. 1994. - V. 19. - P. 97-107.

42. Hernandez L.D., Hoffman L.R., Wolfsberg T.G., White J.M. Virus-cell and cellcell fusion // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. - V.12.- P. 627-661.

43. Hjelle В., Chavez G., Torrez N., Yates S., Sarisky J., Webb J., Ascher M. Genetic identification of a novel hantavirus of the harvest mouse Reithrodontomys megalotis // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 6751-6754

44. Holand J.J., Spindler K.Horodyski F. Rapid evolution of RNA genomes // Science. 1982 -V.215. - P.1577-1585.

45. Hooper J., Kamrud K., Eigh F., Custer D., Schmaliohn C. DNA vaccination with Hantavirus M segment elicit neutralizing antibodies and protects against Seoul virus infection // Virology. 1999. - V. 255. - P.269-278.

46. Huang H., Li X., Zehua Z. Genetic immunization with Hantavirus vaccine combining expression of G2 glycoprotein and fused interleukin-2 // Genetic Vaccines and Therapy. 2008. - v. 6. - P. 15-21.

47. Ikegami Т., Won S., Peters C.J., Makino S. Characterization of Rift Valley Fever Virus Transcriptional Terminations // J. Virol. 2007 — V. 16 - P. 8421-8438.

48. Janssen R ., Nathanson N., Endres M.J., Gonzalez-Scarano F. Virulence of La Crosse virus is under polygenic control // J. Virol. 1986. - V. 59. - P. 1-7.

49. Jardetzky T.S., Lamb R.A. Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable prefusion conformation // Nature 2004. - Vol. 438. - P. 38^44.

50. Jin M., Park J., Lee S. Hantaan virus enters cells by clathrindependent receptor-mediated endocytosis // J.Virol 2002. - V. 294. - P. 60-69.

51. Kallio-Kokko, Leveelahti R. Human immune response to Puumala virus glycoproteins and nucleocapsid protein expressed in mammalian cells // Hannimari Journal of Medical Virology-2001. V. 65. - P. 605-613.

52. Kamrud K., Hooper J., Eigh F., Schmaljohn C. Comparison of the protective of naked DNA, DNA-based Sindbis replicon, and packaged Sindbis replicon vectors expressing hantavirus structural genes in hamsters // Virology. -1999.-V. 263.-P. 209-219.

53. Kim T.-Y., Choi Y., Cheong H.-S., Choe J. Identification of a cell surface 30 kDa protein as a candidate receptor for Hantaan virus // J. Gen. Virol. -2002.- V. 83.-P. 767-773.

54. Krautkramer E., Zeier M. Hantavirus Causing Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Enters from the Apical Surface and Requires Decay-Accelerating Factor (DAF/CD55) // J. Virol. 2008 - V.82. - P. 4257-4264.

55. Kyte J., Doolittle, R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105-132.

56. Lai W.C., Bennett M., Johnston S.A., Barry M.A., Pakes S.P. Protection against Mycoplasma -pulmonis infection by genetic vaccination // DNA Cell Biol. 1995.-V. 14.-P. 643-651.

57. Lee H.W., Baek L.J., Johnson K.M. Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever with renal syndrom in humans // Arch. Virol. Suppl. 1982. - V. 1. - P. 35-47.

58. Lee H.W., Lee P.W. Korean hemorrhagic fever. I. Demonstration of causative antigen and antibodies // Korean J. of Internal Medicine. 1976. -V. 19.-P. 371-383.

59. Lee P.W., Amyx H.L., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T., Goldgaber D., Gibbs C.J. New hemorrhagic fever with renal syndrome-related virus in rodents in the United States // Lancet. 1982. - V. 2. - P. 1405-1411.

60. Lee P.W., Gibbs С .J., Gajdusek D.C., Yanagihara R. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests // J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 22. -P. 940944.

61. Lescar J., Roussel A., Wien M.W., Navaza J., Fuller S.D., Wengler G., Wengler G., Rey F.A. The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal Ph // Cell -2001. V. 105.-P. 137-148.

62. Lewis P.J., Cox G.J.M., Hurk S., Babiuk L. Polynucleotide vaccines in animals: enhancing and modulating responses // Vaccine. 1997. - V. 15. -P.861-864.

63. Liang M., Li D., Xiao S.Y., Hang C., Rossi C.A., Schmaliohn C.S. Antigenic and molecular characterization of hantavirus isolates from China // Virus. Res. 1994. - V. 31. - P. 219-233.

64. Lober C., Anheier В., Lindow S., Klenk H.-D., Feldmann H. The Hantaan virus glycoprotein precursor is cleaved at the conserved pentapeptide WAASA // Virology. 2001. - V. 289. - P. 224-229.

65. Lorenz I.C., Allison S.L., Heinz F.X., Helenius A. Folding and dimerization of tickborne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 5480-5491.

66. Lundkvist A., Bjorsten S., Niklasson B. Immunoglobulin G subclass responses against the structural components of Puumala virus // J. Clin. Microbiol. 1993. -V. 31. - P. 368-372.

67. Marquardt Т., Helenius A. Misfolding and agregation of newly synthesized proteins in the endoplasmic reticulum // J. Cell Biol. 1992. - V. 117. - P. 505-513.

68. McAleer W.J., Buynak E.B., Maigetter R.Z., Wampler D.E., Miller W.J., Hilleman M.R. Human hepatitis В vaccine from recombinant yeast // Nature. -1984. V.307. - P. 178-180.

69. McCaughey C., Shi X., Elliot R.M., Wyatt D.E., O'Neill H.J., Coyle P.V. Low pH-induced cytopathic effect a survey of seven hantavirus strains // J. Virol. Methods. - 1999.-V. 81.-P. 193-197.

70. Mir A.M., Panganiban A.T. A protein that replaces the entire celluler elF4F complex //J.EMBO 2008. - P. 1 - 11

71. Moreau P., Hen R., Wasylyr В., Everett R., Gaub M. P., Chambon P. The SV40 72 base pair repeat has a striking affect on gene expression both in SV40 and other chimeric recombinants // Nucl. Acids Res. 1981. - V. 9. -P. 6047-6068.

72. Ogino M. Cell Fusion Activities of Hantaan Virus Envelope Glycoproteins // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 10776-10782.

73. Parrington M.A., Lee P.-W., Kang C.Y. Molecular characterization of the Prospect Hill virus M RNA segment: a camparison with the M RNAsegment of other hantaviruses // J. of Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 1845— 1854.

74. Patterson J.L., Cabradilla C., Holloway B.P., Obueski J.F., Kolakofsky D. La Crosse virions contain a primer-stimulated RNA polymerase and a methylaited cap-dependent endonuclease // J. Virol. 1984. - V. 52. - P. 215-222.

75. Pfarr D.S., Rieser L.A., Woychik R.P., Rottman F.M., Rosenberg M., Reff M.E. Differential effects of polyadenylation regions on gene expression in mammalian cells // DNA. 1986. - V.5. - P. 115-122.

76. Philpott M., Hioe C., Sheerar M., Hinshaw V.S. Hemagglutinin mutations related to attenuation and altered cell tropism of a virulent avain influenza A virus // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 2941-2947.

77. Pisetsky D.S. Immunostimulatory DNA: a clear and present danger // Nat. Med. 1997. - V. 3. - P. 829-831.

78. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motif among the RNA-dependent polymerare encoding elements // J.Embo. 1989. - V. 8. - P. 3867-3879.

79. Polo J.M., Belli B.A., Driver D.A., Frolov I., Sherrill S., Hariharan M.J. Stable alphaavirus packaging cell lines for Sindbis virus and Semliki Forest virus derived vectors // Prot. Natl. Acad. Sci.USA. - 1999. - V. 96. -P.4598-4603.

80. Porter D.C., Wang J., Moldoveanu Z., McPherson S., Morrow C.D. Immunization of mice with poliovirus replicons expressing the C-fragment of tetatus toxin protects agains lethal challenge with tetanus toxin // Vaccine. 1997. - V. 15.-P. 257-264.

81. Puthavathana P., Lee H.-W., Kang C.Y. Typing of Hantaviruses from five continents by polymerase chain reaction // Virus Res. -1992. -V.26. -P. 614.

82. Raz E., Carson D.A., Parker S.E. Intradermal gene immunization: the possible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to viruses //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V. 91. - P. 9519-9523.

83. Robinson H. Nucleic acid vaccines: an overiew // Vaccine. 1997. - V. 15. -P. 785-787.

84. Rodriguez F., Whitton J. Enhancing DNA immunization // Virology. -2000. V. 268. - P. 233-238.

85. Rouse B.T. Induction of mucosal immunity against herpes simplex virus by plasmid DNA immunization // J. Virol. 1997. - V.71. - P. 3138-3145.

86. Rowe J.E., Jeor S.C., Riolo J., Otteson E.W., Monroe M.C., Henderson W.W., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Nichol S.T. Coexistence of several novel hantaviruses in rodents indigenousto North America // Virology. 1995. -V. 213.-P. 122- 130.

87. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular cloning: a laboratory manual./ 1989. p 134.

88. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V.74. -P.5463-5467

89. Sarzottii M., Dean T.A., Remington M.P., Ly C.D., Furth P.A., Robbins D.S. Induction of cytotoxic T cell responses in newborn mice by DNA immunization // Vaccine. 1997. - V. 15. - P. 795-797.

90. Schmaliohn A.L., Li D.L., Negley D.L., Bressler D.S., Turell M.J., Korch G.W., Ascher M.S., Schmaliohn C.S. Isolation and initial characterization ofa newfound Hantavirus from California // Virology. 1995. - V. 206. - P. 963-972.

91. Schmaliohn C., Chu Y., Schamaljohn A., Dalrymple J. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virus recombinants //J. Virol. 1990. -V. 64. -P. 3162-3170.

92. Schmaliohn C.S., Jennings G.B., Hay J., Dalrymple J.M. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan virus // Virology. 1986. - V. 155. -P. 633-643.

93. Schmaliohn C.S., Schmaliohn A.L., Dalrymple J.M. Hantaan virus M RNA coding strategy nucleotide sequence and gene order // Virology. — 1987.-V. 157.-P. 31-39.

94. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A practical approach. IRL Press, Oxford. -1982.-P. 39-76.

95. Seder R. DNA-vaccines-designer vaccines for the 21st century // The New England J. of Medicine. 1999. - V. 341. - P. 277-278.

96. Shope R.E., Rozhon E.J., Bishop D.H.L. Role of the middle-sized bunyavirus RNA segment in mouse virulence // Virology. 1981. - V. 174. -P. 79-86.

97. Song G. Successful development of inactivated cell culture vaccine against HFRS in China // Proc. the fotht international conference on HFRS and Hantaviruses, USA. 1998. - P. 102-113

98. Song J.W., Baek L.J., Nagle J.W., Schlitter D., Yanagihara R. Genetic and pathogenetic hantavirus from white-footed mouse (Peromyscus leucopus) latter //Lancet. 1996.- V. 344.-P. 1637-1648.

99. Song J.-W., Kang H.J., Gu S.H., Moon S.S., Bennet S.N., Song K.-J., Baek L.J., Kim H.-C., Guinn M.L., Chong S.-T., Klein T.A., Yanagihara R. Characterization of Imjin Virus, a newly isolated hantavirus from the Ussuri

100. White-Toothed Shrew (Crocidura lasiura) //j.Virol. 2009. - V.83. - P.6184-6191

101. Spiropoulou C.F., Albarino C.G., Ksiazek T.G., Rollin P.E. Andes and Prospect Hill hantaviruses differ in early induction of interferon although both can down regulate interferon signaling // J. Virol. 2007 - V.81. - P. 2769-2776.

102. Spiropoulou C.F., Morzunov S., Feldmann H., Sanchez A., Peters C.J., Nichol S.T. Genome structure and variability of a virus causing Hantavirus pulmonary syndrome // Virology. 1994. - V. 200. - P. 715-723.

103. Stafford D.W., Bieber D. Concentration of DNA solutions by extraction with 2-butanol // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.378. - P.18-21.

104. Steege D.A. 5'- Terminal nucleotide sequence of Escherichia coli lactose repressor mRNA. Features of translational initiation and reinitiation sites // PNAS. 1977. -V. 74. - P. 4163-4167.

105. Stohwasser R., Raab K., Darai G., Bautz E.K. Primary structure of the large (L) RNA segment of nephropathia epidemica virus strain Hallnas B1 coding for the viral RNA polymerase // Virology. 1991. - V. 183. - P. 386-391.

106. Sundin D.R., Beaty B.J., Nathanson N., Gonzalez-Scarano F.A G1 glycoprotein epitope of La Crosse virus: a determinant of infection of Aedes triseriatus // Science. 1987. - V. 235. - P. 591-593.

107. Tang D.C., Devit M., Jonston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response // Nature. 1992. - V. 356. - P. 152-154.

108. Taylor S., Frias-Staheli N., Garcia-Sastre A., Schmaljohn C. Hantaan virus nucleocapsid protein binds to importin a proteins and inhibits tumor necrosis factor alpha-induced activation of nuclear factor kappa В / J. Virol. 2009.- V. 83.-P. 1271-1279.

109. Valenzuela P., Medina A., Rutter W., Ammerer G., Hall B. D.Synthesis and assembly of hepatitis В virus surface antigen particles in yeast // Nature.- 1982. V.298. - P. 347-350.

110. Vapalahti O., Lundkvist A., Kallio-Kokko H., Paukku K., Julkunen I., Lankinen H., Vaneri A. Antigenic properties and diagnostic of Puumalavirus nucleocapsid protein expressed in insect cells // J. Clin. Microbiol. -1996.-V. 34.-P.l 19-125.

111. Wells J.M., Wilson P.W., Norton P.M., Gasson M.J., Le Page R.W. Lactococcus lactis: High-level expression of tetanus toxin fragment С and protection against lethal challenge // Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 1155-1162.

112. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Sience. 1990. - V.247. - P. 1465-1468.

113. Xiang Z.Q., Spitalnik S., Tran M., Wunner W.H., Cheng J., Ertl H. Vaccination with a plasmid vector carrieng the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus // Virology. 1994. — V. 139. - P.132-140.

114. Xiao S.Y., Liang M., Schmaliohn C.S. Molecular and antigenic characterization of HV114, a hantavirus isolated from a patient with renal syndrom in China // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 1675-1679.

115. Xiao S-Y., Ledus J.W., Chu Y.K., Schmaliohn C.S. Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae // Virology. -1994.-V. 198.-P. 205-217.

116. Yamasaki K., Weihl C., Roos R. Alternative translation initiation of Theiler's murine encephalomyelitis virus // J. of Virol. -1999. V.73. -P.8519-8526.

117. Yanigahara R., Svedmyr A.L., Lee P., Goldgaber D., Gajdusek D.-C., Gibbs Jr., Nystrom K. Isolation and propagation of nephropathia epidemica virus in bank voles // Scand. J.Infect. Dis. 1984. - V. 16. - P. 225-228.

118. Yokoyama N., Maeda K., Mikami T. Recombinant viral vector vaccines for the veterinaiy use // J. Vet. Med. Sci. 1997. - V.59. - P.311-322.

119. Yong-K.C., Gerald В., Jennings, Connie S., Schmaljohn A., Vaccinia Virus-Vectored Hantaan Virus Vaccine Protects Hamsters from Challenge with Hantaan and Seoul Viruses but Not Puumala Virus // Ft. Detrick, Frederick 21702-50.

120. Yoshimatsu K., Yoo Y., Yoshida R., Ishihara C., Azuma I., Arikawa J. Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studies baculovirus expressed proteins // Arch. Virol. -1993. Vol. 130. — P.365-376.

121. Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК. Методы./ М. Мир, 1989. 346 с.

122. Дебабов В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзиентной экспрессии нуклеиновых кислот в соматических клетках человека и животных // Мол. Биол. 1997. - Т. 31. - С. 209-215.

123. Дзагурова Т.К. и др., // Акт. пробл. вир. 1999. - Т.2. С.60

124. Льюин. Гены. / М. Мир 1987. 544 с.

125. Магазов Р.Ш., Кулагин В.Ф., Хайбуллина С.Ф. ГЛПС некоторые современные аспекты лечения и профилактики // Сборник статей «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - пути решения проблемы». - Уфа. - 1995. - С. 5-9.

126. Спасокукоцкий А. Генные вакцины. Актуальность разработки новых вакцин // Еженедельник Аптека. 2000. - №229. - С. 1-7.

127. Фазлыева P.M., Хунафина Д.Х., Камилов Ф.Х. Сборник статей

128. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в республике» Башкортостан. // Уфа. 1995. С. 243-250.

129. Филдс Б. Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С., Уайли Д., Ройзман Б., Холланд Д. Дж., Рэмиг Р. Ф., Шоуп Р., Кауфман Р., Пенмен Ш., Грин М., Лоуи Д. Вирусология. М. / Мир. 1989.492 с.

130. Якименко и др., Природно-очаговое заболевания человека // Сб. научных работ. 2001. - С.32-39.