Анализ профилей антигликановых антител при колоректальном раке тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Тихонов Алексей Александрович

• Тихонов Алексей Александрович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Тихонов Алексей Александрович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Диагностика колоректального рака

1.2. Гликаны и антигликановые антитела

1.2.1. Структура и функции гликанов

1.2.2. Изменения гликановых структур при онкологических трансформациях

1.2.3. Антигликановые антитела в онкологии

1.2.4. Различные изотипы антигликановых антител

1.2.5. Методы анализа антигликановых антител в онкологии

1.3. Онкомаркер БССЛ

1.3.1. Роль БССЛ при онкологических процессах

1.4. Экзосомы

1.4.1. Поверхностные белковые экзосомальные маркеры в онкодиагностике

1.4.2. Мультиплексный анализ экзосом

2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы

2.1.1. Реагенты

2.1.2. Сыворотки крови

2.2. Методы исследования

2.2.1. Изготовление микрочипов

2.2.2. Выделение экзосом из сывороток крови

2.2.3. Процедура иммуноанализа сыворотки на гликочипе

2.2.4. Процедура конкурентного анализа на гликочипе

2.2.5. Процедура иммуноанализа цоликлонов на гликочипе

2.2.6. Иммуноанализ белков

2.2.7. Иммуноанализ экзосом

2.2.8. Флуоресцентные измерения

2.2.9. Получение конъюгатов с флуоресцентными красителями

2.2.10. Определение концентраций растворимых форм РБ-1 и РБ-Ь1

2.2.11. Статистические методы, использованные для анализа данных

3. Результаты и обсуждение

3.1. Разработка метода одновременного определения уровней к гликанам

3.1.1. Выбор параметров иммобилизации. Подбор условий иммуноанализа

3.1.2. Выбор опухолеассоциированных гликанов

3.1.3. Оценка специфичности взаимодействия иммобилизованных гликанов с антителами в сыворотке крови

3.2. Анализ профилей к гликанам

3.2.1. Характеристика больных КРР и здоровых доноров

3.2.2. Уровни к гликанам в группах здоровых доноров и больных КРР

3.2.3. Анализ изменения уровней антител к гликанам с учетом возраста и пола больных колоректальным раком

3.2.4. Изменения уровней антител к гликанам в зависимости от стадии колоректального рака

3.2.5. Уровни антител к гликанам в зависимости от критерия Т

3.2.6. Уровни антител к гликанам с учетом вовлеченности регионарных лимфатических узлов

3.2.7. Анализ связи уровней антител к гликанам со степенью дифференцировки колоректального рака

3.2.8. Изменение уровней антител у больных колоректальным раком в зависимости от локализации опухоли

3.3. Анализ концентраций бро-убро-ы, и корреляции с уровнями к гликанам

3.4. Анализ двух высокогомологичных белков БССЛ1 и БССЛ2

3.5. Иммунофлуоресцентный анализ трансмембранных белков - маркеров экзосом на микрочипе

Заключение

Выводы

^исок литературы

Список сокращений и условных обозначений

ALIX - ALG-2-взаимодействующий белок-X;

CA 19-9 - карбогидратный антиген 19-9;

CD - кластер дифференцировки;

CI - доверительный интервал;

cMSCs - мезенхимальные стромальные клетки;

DB - буфер для разведений;

ELISA - иммуноферметный анализ, ИФА;

EpCAM - поверхностный антиген эпителиальных клеток;

FDA - Food and Drug Administration (США);

FOBT - тест на скрытую кровь в кале;

GPCR - G-белок-связанные рецепторы;

HCG - хорионический гонадотропин;

HSP - белок теплового шока;

IgM - антитела изотипа М;

LOD - нижний предел детекции;

MALDI TOF - тандемная времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией / ионизацией;

MHC - главный комплекс гистосовместимости;

NK-клетки - естественные киллеры;

PBS - фосфатно-солевой буфер;

PBST - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.1% Tween-20;

PD-1 - белок programmed cell death 1;

PD-L1 - белок programmed cell death 1 ligand 1;

PVA - поливиниловый спирт;

PVP - поливинилпирролидон;

ROC - receiver operating characteristic, рабочая характеристика приемника;

SCCA1 - антиген плоскоклеточной карциномы 1, серпин B3, SPB3;

SCCA2 - антиген плоскоклеточной карциномы 2, серпин B4, SPB4;

SDS - додецилсульфат натрия;

TEMED - тетраметилэтилендиамин;

TNF-a - фактор некроза опухолей;

Tris - трис-(гидроксиметил)аминометан;

TSG101 - ген восприимчивости опухоли 101;

а.о. - аминокислотный остаток;

АТ - антитела;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДИ - доверительный интервал;

Гликочип - микрочип с иммобилизованными гликанами; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ЗД - здоровый донор;

кДНК - комплементарная ДНК;

КРР - колоректальный рак;

КТ - компьютерная томография;

мРНК - матричная РНК;

МРТ - магнитно-резонансная томография;

мтс - метастазы;

НМС - низкомолекулярные соединения;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПСА - простатический специфический антиген;

РЭА - раково-эмбриональный антиген;

Су5 - флуоресцентный краситель цианиновый пятый;

ТГФ-Р - трансформирующий ростовой фактор бета;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ХЛЛ - В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ профилей антигликановых антител при колоректальном раке»

Введение

Актуальность и степень разработанности темы исследования

В настоящее время колоректальный рак (КРР) является третьим по распространенности злокачественным заболеванием и находится на четвертом месте среди причин смертности от рака во всем мире [1]. Бессимптомное клиническое течение рака кишечника на начальных этапах приводит к тому, что заболевание, как правило, выявляют на поздних стадиях, поэтому в настоящее время крайне актуальна проблема ранней диагностики КРР с помощью малоинвазивных методов.

Один из способов выявления злокачественных опухолей - определение серологических циркулирующих молекулярных маркеров. В лабораторной диагностике КРР возможно определять раковоэмбриональный антиген (РЭА) и карбогидратный антиген 19-9 (СЛ 19-9), однако результаты нескольких масштабных клинических исследований показали, что эти биомаркеры клинически значимы только для контроля проводимой терапии и при выявлении прогрессирования заболевания (местного рецидива или метастазов) [2].

Большое количество онкологических маркеров ассоциировано с опухолевой прогрессией, но большинство из них не обладают достаточно высокой чувствительностью либо специфичностью для использования в диагностике. Одна из причин - повышение уровней маркеров опухолевого роста при наличии в организме воспалительных процессов или доброкачественных новообразований. При подозрении на КРР наиболее надежным остается инструментальный метод обследования - колоноскопия с биопсией. Данный метод используют, основываясь на жалобах и физикальном осмотре больного, либо при наличии семейного анамнеза даже при отсутствии жалоб и симптомов этого заболевания.

В последнее десятилетие пристальный интерес исследователей привлекает изучение антигликановых антител, которые позволяют определять паттерн гликозилирования, являются частью системы врожденного иммунитета и играют

важную роль в иммунном надзоре и противораковой защите [3], что делает их перспективными биомаркерами [4].

Во время опухолевой трансформации клеток происходит аберрантное гликозилирование, приводящее к экспрессии опухолеассоциированных гликанов, которые способствуют опухолевой инвазии. Например, во время патологического процесса ^гликаны фукозилируются, сиалилируются и образуют высокоупорядоченные разветвленные структуры на поверхности опухолевых клеток, в том числе за счет увеличения экспрессии GlcNAc-трансфераз. Также показано, что при опухолевой трансформации для О-гликанов часто наблюдаются укорочения углеводных цепей и стремительное возрастание коротких ди- и три-сахаридных повторов, а при нейробластоме и меланоме увеличивается уровень гликосфинголипидов. Все вышеуказанные процессы влекут за собой изменения в уровнях и профилях антител, специфично связывающихся с гликанами. Антигликановые антитела обнаруживаются в циркуляции уже на начальных стадиях развития злокачественной опухоли, а значит, могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров в диагностике КРР.

Следует отметить, что идея о единственном биологическом маркере, так называемой «золотой пуле», теоретически очень привлекательна, но в реальности оказалась практически нереализуемой. Поэтому разумным представляется подход, основанный на определении сразу нескольких маркеров. Задача многопараметрического анализа разнообразных биологических молекул может быть решена с помощью применения мультиплексных методов на основе микрочипов.

В данной работе продемонстрирована возможность применения гидрогелевых микрочипов для определения уровней антител к опухолеассоциированным гликанам. Показано, что мультиплексный анализ на микрочипах позволяет выявить профили и конкретные гликаны, медианы уровней антител к которым различаются у групп больных КРР и здоровых доноров, а также в различных подгруппах пациентов с КРР.

Цели и задачи исследования

Цель работы - разработка метода определения уровней антител к гликанам с помощью биологических микрочипов в образцах сывороток крови больных колоректальным раком, а также поиск закономерностей между профилями определяемых маркеров и клинико-патологическими характеристиками заболевания.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод одновременного определения уровней антител класса М (IgM) к 66 гликанам в сыворотке крови с помощью иммунофлуоресцентного анализа на биологических микрочипах и определить уровни антител к гликанам в сыворотках крови больных колоректальным раком и здоровых доноров.

2. Оценить полученные профили IgM к гликанам в сыворотке крови больных и здоровых доноров с целью выявления потенциальных диагностических маркеров.

3. Провести сравнительный анализ профилей антител к гликанам с учетом основных клинико-патологических характеристик заболевания: стадии опухолевого процесса, наличия либо отсутствия регионарных метастазов, локализации опухоли в различных отделах толстой кишки и возраста пациентов.

4. Проанализировать уровни растворимых форм рецептора программируемой клеточной гибели 1 (soluble PD-1 (sPD-1)) и его лиганда (soluble PD-L1 (sPD-L1)) в сыворотке крови больных колоректальным раком и здоровых доноров.

5. Оценить возможность определения иных циркулирующих в крови биомаркеров (экзосом) на биологическом микрочипе.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В данной работе впервые разработан метод мультиплексного анализа циркулирующих в сыворотке крови IgM к панели гликанов у больных колоректальным раком (КРР) и практически здоровых доноров с помощью гидрогелевых биологических микрочипов.

Впервые обнаружено, что медианные уровни IgM к десяти гликанам (maltose, LNß6'LN, GN4'LN, Zymosan, GN6'LN, Manß1-4GlcNAc, 6-Su-3'-SiaLec, aGalLex, 3'-O-su-Lec, Neu5Gc-Tn) в сыворотке крови больных I и II стадиями КРР значимо ниже таковых в группе здоровых доноров.

Впервые показано, что медианные уровни антител к гликанам Lec, Lec3Lec, GlcNAc3'Lec, 3'-O-su-Lec, 3'-SiaLec, Lec-long, core 6, Tßß снижаются с повышением возраста пациентов.

Впервые показано, что медианные уровни IgM к гликанам, производным лактозамина (GalNAca4'LN и Leca6LN), статистически значимо отличаются между группами пациентов со II стадией и III стадией КРР. Для группы пациентов с I стадией впервые найдены 3 гликана GalNAca4'LN, Leca6LN и 3-SiaTn, медианные уровни IgM к которым отличаются от соответствующих уровней в группе больных с III стадией КРР.

Впервые выявлено четырнадцать гликанов (Leca6LN, GalNAca4'LN, 3-SiaTn, core 3, core 4, P1, Ley, Atri, Atri-long, Taa, di-GalNAcß, TF-long, ß-SiaTn, core 2), медианные уровни IgM к которым снижаются при наличии единичных или множественных метастазов в регионарных лимфатических узлах.

При сравнении групп пациентов с различной локализацией опухолей толстой кишки впервые продемонстрированы статистически значимые отличия в медианных уровнях IgM к 7 гликанам: Lec-long, Lec, 3'-O-su-Lec, Tßß, Lec3Lec, Btri, 3'-SiaLec. Наименьшие медианные уровни IgM к этим гликанам наблюдаются в случае опухолей правосторонней локализации.

Определены концентрации растворимых форм рецептора программируемой клеточной гибели (soluble PD-1 (sPD-1)) и его лиганда (soluble PD-L1 (sPD-L1) у пациентов с КРР.

Показана возможность определения специфичных для КРР A33+/CD147+ субпопуляций экзосом на биологических микрочипах.

Полученные данные могут быть полезны для понимания молекулярных механизмов КРР и могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на поиск и валидацию новых биомаркеров КРР.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод мультиплексного анализа, позволяющий изучать профили циркулирующих IgM к опухолеассоциированным гликанам на гидрогелевых микрочипах.

2. Медианные уровни IgM к 10 гликанам статистически значимо отличаются у пациентов с I и II стадиями колоректального рака от медианных значений уровней антител к тем же гликанам у здоровых доноров.

3. Медианы уровней IgM к гликанам Lec, Lec3Lec, GlcNAc3'Lec, 3'-O-su-Lec, 3'-SiaLec, Lec-long, core 6, Tpp снижаются с повышением возраста больных колоректальным раком.

4. Медианные уровни IgM к 14 гликанам статистически значимо ниже у группы больных колоректальным раком без метастазов в регионарные лимфоузлы по сравнению с группой больных с наличием метастазов.

5. Медианные уровни IgM к ряду гликанов отличаются у больных колоректальным раком в зависимости от стадии заболевания и локализации опухолей, при этом наименьшие уровни IgM к гликанам наблюдаются в случае опухолей правосторонней локализации.

6. Сывороточные концентрации sPD-1 и sPD-L1 не различаются у здоровых доноров и больных колоректальным раком.

7. Продемонстрирована возможность определения на биологическом микрочипе A33+/CD147+ - экзосом.

Личный вклад соискателя

Основные результаты работы получены автором лично или при его непосредственном участии.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Работа выполнена в соответствии с общепринятыми этическими и научными принципами. Выводы и положения, выносимые на защиту, обоснованы фактическим материалом, полученным в результате проведения экспериментов, анализа и интерпретации данных.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в виде тезисов и представлены в виде устных докладов или стендовых сообщений на 15 российских и международных конференциях и научных школах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВAК РФ, и получено 2 патента РФ на изобретения.

Список публикаций

• Статьи в рецензируемых научных журналах:

1) Tikhonov A., Smoldovskaya O., Feyzkhanova G., Kushlinskii N., Rubina A. Glycan-specific antibodies as potential cancer biomarkers: a focus on microarray applications. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2020, 5S(10), 1б11-1б22.

2) Тихонов А. А., Савватеева Е.Н., Черниченко M.A., Масленников В.В., Сидоров Д.В., Рубина A.;., Кушлинский Н.Е. Aнализ уровней антигликановых антител классов G и M при колоректальном раке. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2018, Том 166, №10, с. 485-490.

3) Бутвиловская В.И., Тихонов А.А., Савватеева Е.Н., Рагимов A.A., Салимов Э.Л., Волошин CA., Сидоров Д.В., Черниченко M.A., Поляков A.^, Филюшин М.М., Цыбульская М.В., Рубина A.;. Гидрогелевый микрочип - инструмент для исследования экзосом в сыворотке крови человека. Молекулярная биология, 2017, Том 51, №5, с. 817-S23.

4) Савватеева Е.Н., Тихонов А.А., Бутвиловская В.И., Цыбульская М.В., Рубина A.K>. Поверхностные белковые маркеры экзосом в диагностике колоректального рака. Молекулярная биология, 2017, Том 51, №5, с. 752-7б0.

5) Tikhonov A., Tsybulskaya M., Butvilovskaya V., Savvateeva E., Belousov P., Kuprash D., Solopova O., Chernichenko M., Filushin M., Rubina A. Differential quantification of SCCA1 and SCCA2 cancer antigens using a hydrogel biochip. Analytical Methods, 201б, S(44), 7920-792S.

6) Бутвиловская В.И., Цыбульская М.В., Тихонов А.А., Талибов В.О., Белоусов П.В., Сазыкин А.Ю., Шварц А.М., Путляева Л.В., Суржиков С.А., Стомахин А.А., Солопова О.Н., Рубина А.Ю. Получение рекомбинантных серпинов B3 и B4 и исследование специфичности их взаимодействия с антителами на биологическом микрочипе. Молекулярная биология, 2015, Том 49, №5, с. 790-799.

• Патенты:

1) Бутвиловская В.И., Савватеева Е.Н., Тихонов А.А., Цыбульская М.В., Рубина А.Ю. Биологический микрочип для обнаружения опухолевых экзосом в сыворотке/плазме крови человека для диагностики колоректального рака. Патент № 2682721, Дата приоритета 17.11.2016, Дата публикации 21.03.2019.

2) Тихонов А.А., Рубина А.Ю., Бутвиловская В.И., Савватеева Е.Н., Цыбульская М.В., Поплетаева С.Б., Чечеткин В.Р., Волошин С.А. Способ диагностики/скрининга колоректального рака, основанный на одновременном количественном определении онкомаркеров белковой природы, антител к гликанам, иммуноглобулинов G, A и M в крови человека на биологическом микрочипе. Патент № 2625018, Дата приоритета 16.12.2015, Дата публикации 11.07.2017.

• Материалы конференций и научных школ:

1) Tikhonov A., Kushlinskii N., Rubina A. Anti-glycan antibodies in colorectal cancer diagnosis. The 16th Midwest Carbohydrate and Glycobiology Symposium (MCGS), 20 November 2020, Michigan, USA, Virtual event.

2) Тихонов А.А., Рубина А.Ю., Кушлинский Н.Е. Антигликановые антитела в диагностике онкологических заболеваний. XXV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Наука и практика лабораторных исследований». 16-18 сентября 2020 г., Москва. Лабораторная служба, 2020. Том 9, № 1. с. 62-63.

3) Тихонов А.А. Антитела к гликанам в диагностике рака кишечника. XI Съезд онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии, 23-25 апреля 2020 г., Москва.

Евразийский онкологический журнал, 2020, Том 8, №2, с. 872.

4) Тихонов А.А., Черниченко М.А., Бутвиловская В.И., Фейзханова Г.У., Сидоров Д.В., Кушлинский Н.Е., Рубина А.Ю. Антитела к сахарам в диагностике рака кишечника. 46 научная сессия ЦНИИ гастроэнтерологии «Генетика в гастроэнтерологии: возможности и перспективы», 27-28 февраля 2020 г, Москва. Доказательная гастроэнтерология, 2020, Том 9, № 1, Выпуск 2, с. 64.

5) Тихонов А.А., Бутвиловская В.И., Фейзханова Г.У., Кушлинский Н.Е., Рубина А.Ю. Антигликановые антитела в диагностике онкологических заболеваний. VI Съезд биохимиков России и IX Российский симпозиум "Белки и пептиды", 1-6 октября 2019 г., Сочи. Acta Naturae, 2019, Том 11, № S2, c. 278.

6) Тихонов А.А. Разработка метода in vitro диагностики колоректального рака с использованием гликочипов. IV Российский конгресс лабораторной медицины, 03-05 октября 2018 г., Москва. Лабораторная служба, 2018, № 4, с. 148.

7) Tikhonov A. IgG and IgM anti-glycan antibodies for colorectal cancer diagnosis. The 8th DKTK Summer school in translational cancer research, 8-12 October 2018, Albufeira, Portugal. Abstract book, p. 123.

8) Tikhonov A., Chernichenko M., Butvilovskaya V., Sidorov D., Rubina A. IgM anti-glycan antibodies in sera of colorectal cancer patients. The 4th Molecular Analysis for Personalised Therapy (MAP) Conference, 14-15 September 2018, Paris, France. Annals of Oncology, 2018, Volume 29, Issue suppl_6, mdy318. 018.

9) Смолдовская О.В., Фейзханова Г.У., Бутвиловская В.И., Тихонов А.А., Филиппова М.А., Волошин С.А., Рубина А.Ю. Мультиплексный анализ с использованием белковых и гликановых микрочипов. III Российский конгресс лабораторной медицины, 11-13 сентября 2017 г., Москва. Лабораторная служба, 2017, № 3, с. 148.

10) Tikhonov A., Butvilovskaya V., Chernichenko M., Savvateeva E., Feyzkhanova G., Lysov Y., Sidorov D., Rubina A. Anti-glycan IgG antibodies profiling for colorectal cancer diagnosis using hydrogel microarrays. 4th AACR The New Horizons in Cancer Research Conference, 6-9 November 2017, Shanghai, China. Proceeding of the New

Horizons in Cancer Research Conference, p. 70.

11) Тихонов А.А., Бутвиловская В.И., Савватеева Е.Н., Рагимов А.А., Салимов Э.Л., Сидоров Д.В., Черниченко М.А., Рубина А.Ю. Комбинации серологических маркеров для диагностики колоректального рака. IX Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2017», 18-20 апреля 2017 г., Москва. Сборник тезисов, с. 201-202.

12) Tikhonov A., Butvilovskaya V., Chernichenko M., Savvateeva E., Feyzkhanova G., Lysov Y., Sidorov D., Rubina A. Diagnostic value of anti-glycan antibodies in patients with colorectal cancer. 3rd Molecular Analysis for Personalised Therapy (MAP) Conference, 13-14 October 2017, Zurich, Switzerland. Annals of Oncology, 2017, Volume 28, Issue suppl_7, mdx508.022.

13) Бутвиловская В.И., Савватеева Е.Н., Тихонов А.А., Рагимов А.А., Салимов Э.Л., Пожарицкая Е.И., Рубина А.Ю. Возможности биологических микрочипов в скрининге колоректального рака. Второй российский конгресс лабораторной медицины, 12-14 октября 2016 г., Москва. Клиническая лабораторная диагностика. Том 61, №9, с.520.

14) Тихонов А.А. Белковые и гликановые сигнатуры для ранней диагностики колоректального рака на биологическом микрочипе. XIX Российский онкологический конгресс. 17-19 ноября 2015 г., Москва.

15) Тихонов А.А., Бутвиловская В.И., Цыбульская М.В., Белоусов П.В., Сазыкин А.Ю., Стомахин А.А., Солопова О.Н., Рубина А.Ю. Получение рекомбинантных серпинов В3 и В4 и исследование специфичности их взаимодействия с антителами на биологическом микрочипе. I Всероссийская конференция с международным участием «Химический анализ и медицина». 9-12 ноября 2015 г., Москва. Сборник тезисов, с. 55-56.

1. Обзор литературы 1.1. Диагностика колоректального рака

Диагностика колоректального рака (КРР) осложнена тем, что на начальных стадиях опухолевого процесса заболевание протекает чаще всего бессимптомно и выявляется при прогрессировании, метастазировании. Добиться хорошего лечебного эффекта и выздоровления пациента можно только при своевременной диагностике КРР. Сегодня для обнаружения колоректального рака применяют следующие инвазивные методы - колоноскопия, ирригоскопия, КТ-колонография, МРТ. Однако эти методы зачастую травматичны или опасны для ряда пациентов. Неинвазивные методы, используемые для диагностики КРР в клинике, как правило, основаны на анализе кала пациента на скрытую кровь (fecal occult blood test (FOBT)) и в ряде случаев на определении концентраций двух онкомаркеров: РЭА и CA 19-9 в сыворотке крови пациента методом иммуноферментного анализа (ELISA) [5,6]. В качестве неинвазивного метода диагностики воспалительных заболеваний кишечника используют определение фекального кальпротектина в стуле пациента [7], однако, как и в случае анализа FOBT, этот метод связан с рядом трудностей для пациента и персонала [8].

Содержание РЭА в сыворотке крови здоровых пациентов не превышает 5,0-10,0 нг/мл. Хотя серологическое определение РЭА остается самым распространенным маркером КРР, его применение в качестве единственного эффективного и дифференциального скринингового маркера невозможно для обнаружения начальных форм колоректального рака из-за его низкой чувствительности и специфичности [9].

В настоящее время, в комбинации с определением РЭА, в клинической практике для контроля эффективности проводимой терапии при раке кишечника используют определение СА 19-9 в сыворотке крови. При раке поджелудочной железы, толстой и прямой кишки, желудка и желчных путей уровень этого антигена может возрастать в десятки, сотни раз.

Предсказательность (доля верно предсказанных диагнозов) определения КРР, основанного на совместном определении РЭА и СА 19-9, зависит от выбора метода статистической обработки результатов исследования, от количества пациентов, участвующих в исследовании, наличия или отсутствия у них сопутствующих заболеваний и стадии КРР по классификации опухолей по TNM. При этом диапазон специфичности метода диагностики КРР, основанного на использовании двух маркеров СА 19-9 и РЭА, очень широк: от 18% до 65% [1016].

Рядом авторов для улучшения диагностики КРР предлагается использовать комбинацию нескольких белковых онкомаркеров для определения в сыворотке крови: CEA, СА 19-9, СА 125, СА 15-3, HCG, AFP и др. [16-19], но ни один из них не рекомендован как единственный маркер для диагностики КРР [6].

Альтернативными биомаркерами в диагностике колоректального рака могут выступать гликаны и антитела к ним. Так, при раке кишечника, происходит сверхэкспрессия гликопротеиновых онкомаркеров, которым свойственно аберрантное гликозилирование [20,21]. Аберрантное гликозилирование клеточных мембран возникает из-за изменений содержания или активности [22,23] различных гликозилтрансфераз и может приводить к появлению опухолеассоциированных гликанов в составе гликопротеинов и гликосфинголипидов мембраны клетки [24].

Структура ряда опухолеассоциированных гликанов известна для колоректального рака, рака молочной железы, печени, яичников, простаты (табл. 1) [25-28].

Таблица 1. Опухолеассоциированные гликаны [29,30].

гликаны, ассоциированные с раком [1,2] янчкнк поджелудочная железа кроль полочная железа толстая к литка мозг простата кожа легкие

sLe s X X X X

sLe а X X X X

s Tn X X X X X X

TF X X X X

Le Y X X X X X X

GloboH X X X X X X

PSA X X X X X

GD 2 X X X

GD3 X X

Fucosyl GM1 X

GM2 X X X X X X X X X

В частности, для РЭА известно, что в малигнизированных клетках кишечника в этом гликопротеине синтезируется большее число гликанов с терминациями Lewis x (Lex) и Lewis y (Ley) [31]. Специфической детерминантой антигена CA 19-9 является тетрасахарид SiaLea [32].

Неоантигены (аберрантно гликозилированные белки клетки) могут приводить к возникновению аутоантител или к изменению уровня естественных антител. Так, обнаружена корреляция между уровнем экспрессии T (TF или core 1 или Galß1-3GalNAca) и Tn (GalNAca) антигенов, уровнем сывороточных антител к ним и прогнозом течения рака у пациентов с карциномами различных локализаций [33].

Определение антител к опухолеассоциированным антигенам является перспективным направлением развития онкодиагностики, т.к. изменения в уровнях этих антител можно обнаружить в сыворотке крови на начальных стадиях опухолевого процесса [34,35].

1.2. Гликаны и антигликановые антитела 1.2.1. Структура и функции гликанов

Гликозилирование - одна из самых сложных и самых распространенных пострансляционных модификаций, представляющих собой ферментативное присоединение углеводных цепей-гликанов к белку или липиду. Единого шаблона

гликозилирования не существует, поэтому, с учетом важности процесса, его изучение представляется одной из основных задач молекулярной биологии [36].

Функции гликанов достаточно разнообразны: они участвуют в межклеточной адгезии, передаче сигнала, фолдинге белков, активации рецепторов и эндоцитолизе [37].

Гликановые структуры человека состоят из десяти основных моносахаридов: глюкоза, галактоза, К-ацетилглюкозамин, К-ацетилгалактозамин, сиаловая кислота, фукоза, манноза, ксилоза, глюкуроновая кислота и идуроновая кислота [38]. Комбинации данных сахаридов в гликанах участвуют в образовании связей между атомами с различным аномерным состоянием, эти связи характеризуются различной разветвленностью, длиной и присоединенными функциональными группами, что ведет к большому разнообразию гликанов, образующихся в процессе гликозилирования [39].

Гликозилирование происходит в аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме или цитозоле клетки [40], связывая сахариды с К- либо О-атомами аминокислот. О-гликозилирование основано на присоединении сахаридов к атому кислорода серина или треонина, К-гликозилирование - к атому азота аспарагина К-гликозидной связью соответственно. При этом большинство белков человека К-гликозилированы, а присоединение ОаШАс к кислороду остатка серина либо треонина наблюдается в более чем 85% всех секретируемых белков [26].

Кроме О- и К-гликанов, к основным классам гликанов человека можно отнести гликозаминогликаны и гликосфинголипиды. Гликозаминогликаны представляют собой сульфатированные линейные полисахариды, ковалентно связанные с белками. Они участвуют в межклеточном взаимодействии, входят в состав соединительной ткани, а один из представителей гликозаминогликанов -гепарин - является наиболее сильно действующим антикоагулянтом [41]. Гликосфинголипиды, состоящие из цераминового фрагмента и гидрофильной карбогидратной «головной» группы, содержатся в липидном бислое клеточных мембран [42]. Они играют важную роль в передаче сигнала, причем особенно богаты ими нервные ткани; большинство гликанов мозга человека - это

гликосфинголипиды [43].

В организме человека процесс гликозилирования происходит с участием специальных ферментов - различных гликозилтрансфераз и гликозидаз. Так, присоединение остатка глюкозы к белку происходит с участием О-гликозилтрансферазы (РООШГ1), К-ацетилглюкозамина (01сКАс) -О-01сКАс-трансферазы (ООТ). После присоединения первого углеводного остатка, последующие присоединяются с помощью других ферментов, таких как гликопротеин-К-ацетилгалактозамин-3 -бета-галактозилтрансфераза 1 (С1 Оа1Т 1) или СШа1Т1 специфичный шаперон 1 (Собшс) [44].

Однако сложные биохимические механизмы образования гликановых структур зависят от многих параметров, поэтому полное определение гликома все еще далеко от рутинной практики.

1.2.2. Изменения гликановых структур при онкологических трансформациях

Изучение гликанов и их производных в контексте персонализированной медицины является перспективным подходом для поиска новых биомаркеров злокачественных опухолей, как прогностических, так и предиктивных, так как гликаны участвуют в опухолевой инвазии, ангиогенезе, прогрессии и метастазировании новообразований, а многие из традиционных, используемых в клинической практике серологических онкомаркеров гликозилированы.

Один из возможных диагностических подходов - это анализ изменения профилей К- либо О-гликанов в ходе опухолевой трансформации, который может дать нам достаточно информации о патологическом состоянии пациента. Во время опухолевой трансформации происходит абберантное гликозилирование белков и липидов, что приводит к экспрессии опухолеассоциированных гликанов, которые способствуют опухолевой инвазии [45,46]. Образование подобных гликанов отражает изменения в регуляции и активности соответствующих гликозилтрансфраз и гликозидаз, причем паттерн этих ферментов также имеет диагностическое и прогностическое значение [47]. Также из-за возможности гликопротеинов и гликосфинголипидов активировать тирозин-киназы рецепторов

факторов роста происходит стимулирование пролиферации опухолевых клеток [24].

Опухолеассоциированные гликаны, такие как сиалилированные структуры, Tn антиген (остаток N-ацетилгалактозамина, связанный с серином или треонином белка гликозидной связью) и антигены Льюиса (Lewis a, Lewis b, Lewis x, Lewis y), часто являются частью мембран или секретируемых белков опухолей, например, муцинов (такие как муцин 1 - MUC1), карбогидратного антигена 19-9 (CA 19-9). Кроме того, гликаны могут быть присоединены к мембранным липидам, например, это характерно для ганглиозидов: ганглиозида 1 (GD1) и моносиалового ганглиозида 2 (GM2).

Злокачественная трансформация клеток сопровождается изменениями в экспрессии генов. Например, эпигенетический сайленсинг при развитии рака поджелудочной железы, приводящий к гиперметилированию 1-Р-галактозилтрансферазы кора 1 - специфичного молекулярного шаперона COSMC, приводит к нарушениям в O-гликозилировании, и это непосредственно индуцирует увеличение пролиферации опухолевых клеток и их инвазивную активность [48]. В случае колоректального рака сайленсинг гена, кодирующего а2,6-сиалилтрансферазу, является основным событием, обуславливающим превалирование моносиаловых Lewis a антигенов по сравнению с ди-производными [49].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тихонов Алексей Александрович, 2021 год

Список литературы

1. Bray F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA. Cancer J. Clin. Wiley, 2018. Vol. 68, № 6. P. 394-424.

2. Duffy M.J. et al. Tumor markers in colorectal cancer, gastric cancer and gastrointestinal stromal cancers: European group on tumor markers 2014 guidelines update // International Journal of Cancer. Wiley-Liss Inc., 2014. Vol. 134, № 11. P. 2513-2522.

3. Vollmers H.P., Brandlein S. Natural antibodies and cancer // Journal of Autoimmunity. Academic Press, 2007. Vol. 29, № 4. P. 295-302.

4. Muthana S.M., Gildersleeve J.C. Glycan microarrays: Powerful tools for biomarker discovery // Cancer Biomarkers. IOS Press, 2014. Vol. 14, № 1. P. 2941.

5. Gold P., Freedman S.O. Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system. // J. Exp. Med. 1965. Vol. 122, № 3. P. 467-481.

6. Locker G.Y. et al. ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumor markers in gastrointestinal cancer // Journal of Clinical Oncology. 2006. Vol. 24, № 33. P. 5313-5327.

7. El-Badry A., Sedrak H., Rashed L. Faecal calprotectin in differentiating between functional and organic bowel diseases // Arab J. Gastroenterol. 2010. Vol. 11, № 2. P. 70-73.

8. Calonge N. et al. Screening for colorectal cancer: U.S. Preventive Services Task Force recommendation statement // Ann. Intern. Med. 2008. Vol. 149, № 9. P. 627-637.

9. Goldstein M.J., Mitchell E.P. Carcinoembryonic antigen in the staging and follow-up of patients with colorectal cancer // Cancer Invest. 2005. Vol. 23, № 4. P. 338-351.

10. Jalanko H. et al. Comparison of a new tumour marker, CA 19-9(TM), with a-fetoprotein and carcinoembryonic antigen in patients with upper gastrointestinal

diseases // J. Clin. Pathol. 1984. Vol. 37, № 2. P. 218-222.

11. Thomas W.M. et al. Failure of CA19-9 to detect asymptomatic colorectal carcinoma // Br. J. Cancer. 1991. Vol. 63, № 6. P. 975-976.

12. Huber K. et al. Clinical Value of Determination of Urokinase-type Plasminogen Activator Antigen in Plasma for Detection of Colorectal Cancer: Comparison with Circulating Tuimor-associated Antigens CA 19-9 and Carcinoembryonic Antigen // Cancer Res. 1993. Vol. 53, № 8. P. 1788-1793.

13. Carpelan-Holmstrom M. et al. CEA, CA 242, CA 19-9, CA 72-4 and hCGp in the diagnosis of recurrent colorectal cancer // Tumor Biol. 2004. Vol. 25, № 5-6. P. 228-234.

14. Huang C.S., Lal S.K., Farraye F.A. Colorectal cancer screening in average risk individuals // Cancer Causes and Control. 2005. Vol. 16, № 2. P. 171-188.

15. Chen C. et al. Value of tumor markers in diagnosing and monitoring colorectal cancer and strategies for further improvement: analysis of 130 cases. // Ai Zheng. 2007. Vol. 26, № 11. P. 1221-1226.

16. Chen C. et al. Evaluation of tumor markers biochip C12 system in the diagnosis of gastric cancer and the strategies for improvement: Analysis of 100 cases // Hepatogastroenterology. 2008. Vol. 55, № 84. P. 991-997.

17. Crawford N.P.S., Colliver D.W., Galandiuk S. Tumor Markers and Colorectal Cancer: Utility in Management // Journal of Surgical Oncology. 2003. Vol. 84, № 4. P. 239-248.

18. Zubtsova Z.I. et al. Immunoassay of nine serological tumor markers on a hydrogel-based microchip // Russ. J. Bioorganic Chem. 2013. Vol. 39, № 6. P. 619-628.

19. Duffy M.J. et al. Tumour markers in colorectal cancer: European Group on Tumour Markers (EGTM) guidelines for clinical use // Eur. J. Cancer. 2007. Vol. 43, № 9. P. 1348-1360.

20. Ilantzis C. et al. Deregulated expression of the human tumor marker CEA and CEA family member CEACAM6 disrupts tissue architecture and blocks colonocyte differentiation // Neoplasia. Nature Publishing Group, 2002. Vol. 4,

№ 2. P. 151-163.

21. Hollingsworth M.A., Swanson B.J. Mucins in cancer: Protection and control of the cell surface // Nat. Rev. Cancer. 2004. Vol. 4, № 1. P. 45-60.

22. LaMont J.T., Isselbachrer K.J. Alterations in glycosyltransferase activity in human colon cancer // J. Natl. Cancer Inst. 1975. Vol. 54, № 1. P. 53-56.

23. Patsos G. et al. O-Glycan inhibitors generate aryl-glycans, induce apoptosis and lead to growth inhibition in colorectal cancer cell lines // Glycobiology. 2009. Vol. 19, № 4. P. 382-398.

24. Dube D.H., Bertozzi C.R. Glycans in cancer and inflammation - Potential for therapeutics and diagnostics // Nat. Rev. Drug Discov. 2005. Vol. 4, № 6. P. 477488.

25. Byrd J.C., Bresalier R.S. Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer // Cancer and Metastasis Reviews. 2004. Vol. 23, № 1-2. P. 77-99.

26. Fuster M.M., Esko J.D. The sweet and sour of cancer: Glycans as novel therapeutic targets // Nat. Rev. Cancer. 2005. Vol. 5, № 7. P. 526-542.

27. Dotan N. et al. Anti-glycan antibodies as biomarkers for diagnosis and prognosis // Lupus. 2006. Vol. 15, № 7. P. 442-450.

28. Adamczyk B., Tharmalingam T., Rudd P.M. Glycans as cancer biomarkers // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. Elsevier B.V., 2012. Vol. 1820, № 9. P. 1347-1353.

29. Zhang S. et al. Selection of tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry: Protein antigens // Clin. Cancer Res. 1998. Vol. 4, № 11. P. 2669-2676.

30. Fukuda M. Possible roles of tumor-associated carbohydrate antigens // Cancer Research. 1996. Vol. 56, № 10. P. 2237-2244.

31. Van Gisbergen K.P.J.M. et al. Dendritic cells recognize tumor-specific glycosylation of carcinoembryonic antigen on colorectal cancer cells through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin // Cancer Res. 2005. Vol. 65, № 13. P. 5935-5944.

32. Saeland E. et al. Differential glycosylation of MUC1 and CEACAM5 between

normal mucosa and tumour tissue of colon cancer patients // Int. J. Cancer. 2012. Vol. 131, № 1. P. 117-128.

33. Springer G.F. Immunoreactive T and Tn epitopes in cancer diagnosis, prognosis, and immunotherapy // Journal of Molecular Medicine. 1997. Vol. 75, № 8. P. 594-602.

34. Chapman C. et al. Autoantibodies in breast cancer: Their use as an aid to early diagnosis // Ann. Oncol. 2007. Vol. 18, № 5. P. 868-873.

35. Chapman C.J. et al. Autoantibodies in lung cancer: Possibilities for early detection and subsequent cure // Thorax. 2008. Vol. 63, № 3. P. 228-233.

36. Freeze H.H. Genetic defects in the human glycome // Nat. Rev. Genet. 2006. Vol. 7, № 7. P. 537-551.

37. Varki A. Biological roles of glycans // Glycobiology. 2017. Vol. 27, № 1. P. 349.

38. Chia J., Goh G., Bard F. Short O-GalNAc glycans: Regulation and role in tumor development and clinical perspectives // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. The Authors, 2016. Vol. 1860, № 8. P. 1623-1639.

39. Cummings R.D. The repertoire of glycan determinants in the human glycome // Mol. Biosyst. 2009. Vol. 5, № 10. P. 1087-1104.

40. Moremen K.W., Tiemeyer M., Nairn A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 13, № 7. P. 448-462.

41. Afratis N. et al. Glycosaminoglycans: Key players in cancer cell biology and treatment // FEBS J. 2012. Vol. 279, № 7. P. 1177-1197.

42. Regina Todeschini A., Hakomori S. itiroh. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2008. Vol. 1780, № 3. P. 421-433.

43. Schengrund C.L. Gangliosides: Glycosphingolipids essential for normal neural development and function // Trends Biochem. Sci. Elsevier Ltd, 2015. Vol. 40, № 7. P. 397-406.

44. Bennett E.P. et al. Control of mucin-type O-glycosylation: A classification of the polypeptide GalNAc-transferase gene family // Glycobiology. 2012. Vol. 22, №

6. P. 736-756.

45. Drake R.R. Glycosylation and cancer: Moving glycomics to the forefront // Advances in Cancer Research. 1st ed. Elsevier Inc., 2015. Vol. 126. 1-10 p.

46. Drake P.M. et al. Sweetening the pot: Adding glycosylation to the biomarker discovery equation // Clin. Chem. 2010. Vol. 56, № 2. P. 223-236.

47. Meany D.L., Chan D.W. Aberrant glycosylation associated with enzymes as cancer biomarkers // Clin. Proteomics. BioMed Central Ltd, 2011. Vol. 8, № 1. P.

7.

48. Radhakrishnan P. et al. Immature truncated O-glycophenotype of cancer directly induces oncogenic features // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. Vol. 111, № 39. P. E4066-E4075.

49. Miyazaki K. et al. Loss of disialyl Lewisa, the ligand for lymphocyte inhibitory receptor sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-7 (Siglec-7) associated with increased sialyl Lewisa expression on human colon cancers // Cancer Res. 2004. Vol. 64, № 13. P. 4498-4505.

50. Nguyen A.T. et al. Organelle Specific O-Glycosylation Drives MMP14 Activation, Tumor Growth, and Metastasis // Cancer Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 32, № 5. P. 639-653.e6.

51. Rodriguez E., Schetters S.T.T., Van Kooyk Y. The tumour glyco-code as a novel immune checkpoint for immunotherapy // Nat. Rev. Immunol. 2018. Vol. 18, № 3. P. 204-211.

52. Laubli H., Borsig L. Selectins promote tumor metastasis // Seminars in Cancer Biology. 2010. Vol. 20, № 3. P. 169-177.

53. Natoni A., Macauley M.S., O'Dwyer M.E. Targeting selectins and their ligands in cancer // Front. Oncol. 2016. Vol. 6, № APR. P. 1-12.

54. Sartorius C.M. et al. ABO blood groups as a prognostic factor for recurrence in ovarian and vulvar cancer // PLoS One. 2018. Vol. 13, № 3. P. 1-14.

55. Kang J.G., Ko J.H., Kim Y.S. Pros and cons of using aberrant glycosylation as

companion biomarkers for therapeutics in cancer // BMB Rep. 2011. Vol. 44, № 12. P. 765-771.

56. Bovin N. V. Natural antibodies to glycans // Biochem. 2013. Vol. 78, № 7. P. 786-797.

57. Kim J. et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 & CA19-9 blood markers // Sci. Transl. Med. 2017. Vol. 9, № 398. P. 1-14.

58. Desai P.R. Immunoreactive T and Tn antigens in malignancy: Role in carcinoma diagnosis, prognosis, and immunotherapy // Transfus. Med. Rev. 2000. Vol. 14, № 4. P. 312-325.

59. Gilgunn S. et al. Aberrant PSA glycosylation - A sweet predictor of prostate cancer // Nat. Rev. Urol. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 10, № 2. P. 99107.

60. Tiernan J.P. et al. Carcinoembryonic antigen is the preferred biomarker for in vivo colorectal cancer targeting // Br. J. Cancer. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 108, № 3. P. 662-667.

61. Honjo T., Kinoshita K., Muramatsu M. Molecular mechanism of class switch recombination: Linkage with Somatic Hypermutation // Annu. Rev. Immunol. 2002. Vol. 20, № 1. P. 165-196.

62. Muthana S.M. et al. Competition between Serum IgG, IgM, and IgA anti-glycan antibodies // PLoS One. 2015. Vol. 10, № 3. P. e0119298.

63. Durbin S. V., Wright W.S., Gildersleeve J.C. Development of a Multiplex Glycan Microarray Assay and Comparative Analysis of Human Serum Anti-Glycan IgA, IgG, and IgM Repertoires // ACS Omega. 2018. Vol. 3, № 12. P. 16882-16891.

64. Panda S., Ding J.L. Natural Antibodies Bridge Innate and Adaptive Immunity // J. Immunol. 2015. Vol. 194, № 1. P. 13-20.

65. Muthana S.M. et al. ABO blood type correlates with survival on prostate cancer vaccine therapy // Oncotarget. 2015. Vol. 6, № 31. P. 32244-32256.

66. Muthana S.M., Gildersleeve J.C. Factors Affecting Anti-Glycan IgG and IgM Repertoires in Human Serum // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6,

№ January. P. 19509.

67. Hart G.W., Copeland R.J. Glycomics hits the big time // Cell. Elsevier Inc., 2010. Vol. 143, № 5. P. 672-676.

68. Royle L. et al. HPLC-based analysis of serum N-glycans on a 96-well plate platform with dedicated database software // Anal. Biochem. 2008. Vol. 376, № 1. P. 1-12.

69. Furukawa J. ichi, Fujitani N., Shinohara Y. Recent advances in cellular glycomic analyses // Biomolecules. 2013. Vol. 3, № 1. P. 198-225.

70. Huang Y., Zhu H. Protein Array-based Approaches for Biomarker Discovery in Cancer // Genomics, Proteomics Bioinforma. 2017. Vol. 15, № 2. P. 73-81.

71. Rho J. hyun, Lampe P.D. High-throughput analysis of plasma hybrid markers for early detection of cancers // Proteomes. 2014. Vol. 2, № 1. P. 1-17.

72. Balog C.I.A. et al. N-glycosylation of colorectal cancer tissues: A liquid chromatography and mass spectrometry-based investigation // Mol. Cell. Proteomics. 2012. Vol. 11, № 9. P. 571-585.

73. Dotan I. et al. Antibodies Against Laminaribioside and Chitobioside Are Novel Serologic Markers in Crohn's Disease // Gastroenterology. 2006. Vol. 131, № 2. P. 366-378.

74. Blixt O. et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 49. P. 17033-17038.

75. Pochechueva T. et al. Tumor-associated glycans and their role in gynecological cancers: Accelerating translational research by novel high- throughput approaches // Metabolites. 2012. Vol. 2, № 4. P. 913-939.

76. Rubina A.Y. et al. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics // Proteomics. 2008. Vol. 8, № 4. P. 817-831.

77. Borrebaeck C.A.K. Precision diagnostics: Moving towards protein biomarker signatures of clinical utility in cancer // Nat. Rev. Cancer. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 17, № 3. P. 199-204.

78. Cohen J.D. et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with

a multi-analyte blood test // Science. 2018. Vol. 359, № 6378. P. 926-930.

79. Wang C.C. et al. Glycan microarray of Globo H and related structures for quantitative analysis of breast cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008. Vol. 105, № 33. P. 11661-11666.

80. Wandall H.H. et al. Cancer biomarkers defined by autoantibody signatures to aberrant O-glycopeptide epitopes // Cancer Res. 2010. Vol. 70, № 4. P. 13061313.

81. Pedersen J.W. et al. Seromic profiling of colorectal cancer patients with novel glycopeptide microarray // Int. J. Cancer. 2011. Vol. 128, № 8. P. 1860-1871.

82. Blixt O. et al. Autoantibodies to aberrantly glycosylated MUC1 in early stage breast cancer are associated with a better prognosis // Breast Cancer Res. 2011. Vol. 13, № 2. P. R25.

83. Burford B. et al. Autoantibodies to MUC1 glycopeptides cannot be used as a screening assay for early detection of breast, ovarian, lung or pancreatic cancer // Br. J. Cancer. 2013. Vol. 108, № 10. P. 2045-2055.

84. Vuskovic M.I. et al. Processing and analysis of serum antibody binding signals from Printed Glycan Arrays for diagnostic and prognostic applications // Int. J. Bioinform. Res. Appl. 2011. Vol. 7, № 4. P. 402-426.

85. Tangvoranuntakul P. et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 21. P. 12045-12050.

86. Padler-Karavani V. et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer // Cancer Res. 2011. Vol. 71, № 9. P. 3352-3363.

87. Pearce O.M.T. et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. Vol. 111, № 16. P. 5998-6003.

88. Butvilovskaya V.I. et al. Multiplex determination of serological signatures in the sera of colorectal cancer patients using hydrogel biochips // Cancer Med. Blackwell Publishing Ltd, 2016. Vol. 5, № 7. P. 1361-1372.

89. Otto J.J. et al. Gut immunoglobulin alpha anti-glycan binding profiles as a research tool for local disease detection // Glycoconj. J. Glycoconjugate Journal, 2018. Vol. 35, № 3. P. 333-342.

90. Zambirinis C.P. et al. Pancreatic cancer, inflammation, and microbiome // Cancer J. (United States). 2014. Vol. 20, № 3. P. 195-202.

91. Kato H. et al. Radioimmunoassay for tumor-antigen of human cervical squamous cell carcinoma // Cell. Mol. Biol. 1979. Vol. 25, № 1. P. 51-56.

92. Crombach G. et al. Bedeutung Des Scc-Antigens in Der Diagnostik Und Verlaufskontrolle Des Zervixkarzinoms. Eine Kooperative Studie Der Gynakologischen Tumor-Marker-Gruppe (Gtmg) // Dtsch. Medizinische Wochenschrift. 1989. Vol. 114, № 18. P. 700-705.

93. Takeshima N. et al. Expression of mRNA of SCC antigen in squamous cells // Tumor Biol. 1992. Vol. 13, № 5-6. P. 338-342.

94. Bruno S. et al. Inhibitors of proteases prevent endonucleolysis accompanying apoptotic death of HL-60 leukemic cells and normal thymocytes // Leukemia. 1992. Vol. 6, № 11. P. 1113-1120.

95. Schneider S.S. et al. A serine proteinase inhibitor locus at 18q21.3 contains a tandem duplication of the human squamous cell carcinoma antigen gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1995. Vol. 92, № 8. P. 3147-3151.

96. Gan H. et al. Plasminogen activator inhibitor type 2 prevents programmed cell death of human macrophages infected with Mycobacterium avium, serovar 4 // J. Immunol. 1995. Vol. 155, № 3. P. 1304-1315.

97. Suminami Y. et al. Inhibition of apoptosis in human tumour cells by the tumour-associated serpin, SCC antigen-1 // Br. J. Cancer. Nature Publishing Group, 2000. Vol. 82, № 4. P. 981-989.

98. Numa F. et al. Tumor necrosis factor-a stimulates the production of squamous cell carcinoma antigen in normal squamous cells // Tumor Biol. 1996. Vol. 17, № 2. P. 97-101.

99. Tsuyama S. et al. Different behaviors in the production and release of SCC

antigen in squamous-cell carcinoma // Tumor Biol. 1991. Vol. 12, № 1. P. 28-34.

100. De Bruijn H.W.A. et al. The clinical value of squamous cell carcinoma antigen in cancer of the uterine cervix // Tumor Biol. 1998. Vol. 19, № 6. P. 505-516.

101. Brioschi P.A. et al. Squamous-cell carcinoma antigen (SCC- A) values related to clinical outcome of pre-invasive and invasive cervical carcinoma //Int. J. Cancer. 1991. Vol. 47, № 3. P. 376-379.

102. Scambia G. et al. The value of squamous cell carcinoma antigen in patients with locally advanced cervical cancer undergoing neoadjuvant chemotherapy // Am. J. Obstet. Gynecol. 1991. Vol. 164, № 2. P. 631-636.

103. Ngan H.Y.S. et al. Serum squamous cell carcinoma antigen in the monitoring of radiotherapy treatment response in carcinoma of the cervix // Gynecol. Oncol. 1990. Vol. 37, № 2. P. 260-263.

104. Takeda M. et al. Preoperative serum SCC, CA125, and CA19-9 levels and lymph node status in squamous cell carcinoma of the uterine cervix // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2002. Vol. 81, № 5. P. 451-457.

105. Xu X. et al. Quantitative proteomics study of breast cancer cell lines isolated from a single patient: Discovery of TIMM17A as a marker for breast cancer // Proteomics. 2010. Vol. 10, № 7. P. 1374-1390.

106. Calabrese F. et al. Serpin B4 isoform overexpression is associated with aberrant epithelial proliferation and lung cancer in idiopathic pulmonary fibrosis // Pathology. 2012. Vol. 44, № 3. P. 192-198.

107. Petty R.D. et al. Tumor transcriptome reveals the predictive and prognostic impact of lysosomal protease inhibitors in non-small-cell lung cancer // J. Clin. Oncol. 2006. Vol. 24, № 11. P. 1729-1744.

108. Badola S. et al. Correlation of serpin-protease expression by comparative analysis of real-time PCR profiling data // Genomics. 2006. Vol. 88, № 2. P. 173-184.

109. Paulo J.A. et al. Mass spectrometry-based (GeLC-MS/MS) comparative proteomic analysis of endoscopically (ePFT) collected pancreatic and gastroduodenal fluids // Clin. Transl. Gastroenterol. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 3, № 5. P. e14.

110. Turato C. et al. Over-expression of SERPINB3 in hepatoblastoma: A possible insight into the genesis of this tumour? // Eur. J. Cancer. 2012. Vol. 48, № 8. P. 1219-1226.

111. Ho K.Y. et al. Cholesteatoma growth and proliferation: Relevance with serpin B3 // Laryngoscope. 2012. Vol. 122, № 12. P. 2818-2823.

112. Ludwig A.K., Giebel B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication // Int. J. Biochem. Cell Biol. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 44, № 1. P. 11-15.

113. Pant S., Hilton H., Burczynski M.E. The multifaceted exosome: Biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities // Biochemical Pharmacology. 2012. Vol. 83, № 11. P. 1484-1494.

114. Minciacchi V.R., Freeman M.R., Di Vizio D. Extracellular Vesicles in Cancer: Exosomes, Microvesicles and the Emerging Role of Large Oncosomes // Semin. Cell Dev. Biol. NIH Public Access, 2015. Vol. 40. P. 41-51.

115. Grant R. et al. A filtration-based protocol to isolate human Plasma Membrane-derived Vesicles and exosomes from blood plasma // J. Immunol. Methods. 2011. Vol. 371, № 1-2. P. 143-151.

116. Fang D.Y.P. et al. Exosomes and the kidney: Blaming the messenger // Nephrology. 2013. Vol. 18, № 1. P. 1-10.

117. Hata T. et al. Isolation of bovine milk-derived microvesicles carrying mRNAs and microRNAs // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. Vol. 396, № 2. P. 528-533.

118. Colombo M., Raposo G., Thery C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. Annual Reviews , 2014. Vol. 30, № 1. P. 255-289.

119. György B. et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: Emerging role of extracellular vesicles // Cell. Mol. Life Sci. SP Birkhäuser Verlag Basel, 2011. Vol. 68, № 16. P. 2667-2688.

120. Vlassov A. V. et al. Exosomes: Current knowledge of their composition,

biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials // Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2012. Vol. 1820, № 7. P. 940-948.

121. Subra C. et al. Exosome lipidomics unravels lipid sorting at the level of multivesicular bodies // Biochimie. 2007. Vol. 89, № 2. P. 205-212.

122. Record M. et al. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors // Biochemical Pharmacology. 2011. Vol. 81, № 10. P. 1171-1182.

123. Moreno-Gonzalo O., Villarroya-Beltri C., Sánchez-Madrid F. Post-translational modifications of exosomal proteins // Front. Immunol. Frontiers, 2014. Vol. 5, № AUG. P. 383.

124. Caby M.P. et al. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma // Int. Immunol. Oxford University Press, 2005. Vol. 17, № 7. P. 879-887.

125. Andreu Z., Yáñez-Mó M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function // Front. Immunol. Frontiers, 2014. Vol. 5, № SEP. P. 442.

126. Mou D.L., Jia Z.S., Bai X.F. Exosome: Trojan horse in immunotherapy // Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. 2005. Vol. 36, № 2. P. 113-118.

127. Gross J.C. et al. Active Wnt proteins are secreted on exosomes // Nat. Cell Biol. Nature Research, 2012. Vol. 14, № 10. P. 1036-1045.

128. Luga V. et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration // Cell. 2012. Vol. 151, № 7. P. 15421556.

129. Keller S. et al. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics // J. Transl. Med. 2011. Vol. 9, № 1. P. 86.

130. Isola A.L., Chen S. Exosomes: The link between GPCR activation and metastatic potential? // Front. Genet. Frontiers Media SA, 2016. Vol. 7, № APR. P. 56.

131. Lugini L. et al. Exosomes from human colorectal cancer induce a tumor-like behavior in colonic mesenchymal stromal cells // Oncotarget. Impact Journals, 2016. Vol. 7, № 31. P. 50086-50098.

132. Robersona C.D. et al. Tumor-derived exosomes as mediators of disease and potential diagnostic biomarkers // Cancer Biomarkers. IOS Press, 2010. Vol. 8, № 4-5. P. 281-291.

133. Löf L. et al. Detecting individual extracellular vesicles using a multicolor in situ proximity ligation assay with flow cytometric readout // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6. P. 34358.

134. Jeppesen D.K. et al. Comparative analysis of discrete exosome fractions obtained by differential centrifugation // J. Extracell. Vesicles. 2014. Vol. 3, № 1.

135. Tauro B.J. et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids // Mol. Cell. Proteomics. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2013. Vol. 12, № 3. P. 587-598.

136. Jorgensen M. et al. Extracellular Vesicle (EV) array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping // J. Extracell. Vesicles. 2013. Vol. 2, № 1.

137. Belov L. et al. Extensive surface protein profiles of extracellular vesicles from cancer cells may provide diagnostic signatures from blood samples // J. Extracell. Vesicles. Co-Action Publishing, 2016. Vol. 5, № 1. P. 25355.

138. Théry C. et al. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids // Curr. Protoc. Cell Biol. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2006. Vol. 30, № 1. P. 3.22.1-3.22.29.

139. Omics Technologies and Bio-Engineering // Omics Technologies and BioEngineering. Elsevier, 2018.

140. Pochechueva T. et al. Blood plasma-derived anti-glycan antibodies to sialylated and sulfated glycans identify ovarian cancer patients // PLoS One. 2016. Vol. 11, № 10. P. e0164230.

141. Maerle A. V. et al. Immuno-PCR technology for detection of natural human antibodies against Lec disaccharide // Glycoconj. J. Springer New York LLC, 2017. Vol. 34, № 2. P. 199-205.

142. Suzuki Y. et al. MUC1 carrying core 2 O-glycans functions as a molecular shield against NK cell attack, promoting bladder tumor metastasis // Int. J. Oncol. NIH Public Access, 2012. Vol. 40, № 6. P. 1831-1838.

143. Monzavi-Karbassi B., Pashov A., Kieber-Emmons T. Tumor-associated glycans

and immune surveillance // Vaccines. MDPI AG, 2013. Vol. 1, № 2. P. 174-203.

144. Samraj A.N. et al. Involvement of a non-human sialic acid in human cancer // Front. Oncol. Frontiers Media S.A., 2014. Vol. 4 MAR.

145. Zhu X., Lang J. Soluble PD-1 and PD-L1: Predictive and prognostic significance in cancer // Oncotarget. Impact Journals LLC, 2017. Vol. 8, № 57. P. 9767197682.

146. Zhang P. et al. Levels of programmed death-1 and programmed death ligand-1 in the peripheral blood of patients with oral squamous cell carcinoma and its clinical implications // Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 2015. Vol. 33, № 5. P. 529-533.

147. Gershtein E.S. et al. Soluble forms of pd-1 and pd-l1 in blood plasma of gastric cancer patients and their associations with clinical and morphological characteristics of the disease // Russ. Clin. Lab. Diagnostics. Izdatelstvo Meditsina, 2020. Vol. 65, № 6. P. 347-352.

148. Kushlinskii K.N.E. et al. Signaling pathway components of immune checkpoint PD-1/PD-L1 in blood plasma of patients with ovarian cancer and benign ovarian tumors: clinical and morphological correlations // Akush. Ginekol. (Sofiia). Bionika Media Ltd., 2020. Vol. 6_2020, № 6. P. 80-88.

149. Zhang J. et al. Circulating PD-L1 in NSCLC patients and the correlation between the level of PD-L1 expression and the clinical characteristics // Thorac. Cancer. John Wiley and Sons Inc., 2015. Vol. 6, № 4. P. 534-538.

150. Rossille D. et al. High level of soluble programmed cell death ligand 1 in blood impacts overall survival in aggressive diffuse large B-cell lymphoma: Results from a French multicenter clinical trial // Leukemia. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 28, № 12. P. 2367-2375.

151. Kushlinskii N.E. et al. Soluble Ligand of the Immune Checkpoint Receptor (sPD-L1) in Blood Serum of Patients with Renal Cell Carcinoma // Bull. Exp. Biol. Med. Springer New York LLC, 2019. Vol. 166, № 3. P. 353-357.

152. Li C.W. et al. Glycosylation and stabilization of programmed death ligand-1 suppresses T-cell activity // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2016. Vol.

7, № 1. P. 1-11.

153. Li C.W. et al. Eradication of Triple-Negative Breast Cancer Cells by Targeting Glycosylated PD-L1 // Cancer Cell. Cell Press, 2018. Vol. 33, № 2. P. 187-201.e10.

154. Wang Y.N. et al. The impact of PD-L1 N-linked glycosylation on cancer therapy and clinical diagnosis // J. Biomed. Sci. Journal of Biomedical Science, 2020. Vol. 27, № 1. P. 1-11.

155. Kanaji S. et al. Squamous cell carcinoma antigen 1 is an inhibitor of parasite-derived cysteine proteases // FEBS Lett. No longer published by Elsevier, 2007. Vol. 581, № 22. P. 4260-4264.