Анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу и создание на их основе ДНК маркеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Куклев, Михаил Юрьевич

• Куклев, Михаил Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куклев, Михаил Юрьевич

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ботаническая характеристика томата.

1.2. Фузариозное увядание томата.

1.3. Вертициллезное увядание томата.

1.4. Гены устойчивости растений к заболеваниям.

1.4.1. Механизмы устойчивости.

1.4.2. Структура и функции протеинов, кодируемых генами устойчивости.

1.4.3. Локализация белков устойчивости и их элиситоров.

1.4.5. Взаимодействие между белками устойчивости и их элиситорами.

1.4.6. Белки устойчивости и передача сигналов.

1.4.7. Проведение сигналов R-белками с помощью предполагаемых сигнальных доменов.

1.5. Структура кластера, содержащего ген 12.

1.5.1. Состав и структура локуса 12.

1.5.2. Характеристика протеинов, кодируемых генами-гомологами семейства/2.

1.5.3. Эволюция генов-гомологов семейства 12.

1.6. Локус устойчивости томата к вертициллезу.

1.6.1. Структура и состав региона, содержащего ген устойчивости томата к вертициллезу.

1.6.2. Белковые продукты генов устойчивости томата к вертициллезу.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Выделение ДНК из растительного материала.

2.3. ПЦР-анализ.

2.4. Клонирование ПЦР-продуктов.

2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение локуса 12 у неустойчивых форм томата.

3.1.1. ПЦР анализ локуса 12.

3.1.1.1. Пара праймеров U127-UN127.

3.1.1.2. Пара праймеров UP78 и LF79.

3.1.2. Клонирование и анализ ПЦР продуктов, полученных с устойчивого и неустойчивого генотипов.

3.1.2.1. Анализ клонов, полученных от устойчивого генотипа.

3.1.2.2. Анализ клонов, полученных от неустойчивого генотипа.

3.1.3. Структура локуса, аналогичного

S. pimpinellifolium, у неустойчивого генотипа S. esculentum.

3.2. Изучение локуса устойчивости томата к вертициллезу у неустойчивых генотипов томата.

3.2.1. ПЦР-анализ локуса Ve у устойчивых и неустойчивых форм томата.

3.2.2. Анализ нуклеотидных последовательностей локуса Ve у неустойчивых генотипов томата.

3.2.2.1. Анализ нуклеотидной последовательности

ПЦР-продукта праймеров VVF1+VVR1.

3.2.2.2. Анализ нуклеотидной последовательности

ПЦР-продукта праймеров VVF2+VVR2.

3.2.3. Анализ региона, тесно сцепленного с локусом устойчивости томата к вертициллезу.

3.2.4. Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу и создание на их основе ДНК маркеров»

Одними из самых распространенных и вредоносных заболеваний на томате и других сельскохозяйственных культурах являются фузариозное и вертициллезное увядания. Урон урожайности от данных заболеваний может достигать 30%, а в случае тепличных условий выращивания - до 50% и более (Jurriaan J. Mes, 1999; Watterson, 1986; Cirulli 1981). Поэтому создание сортов томата, устойчивых к данным заболеваниям, является приоритетной задачей селекции.

До недавнего времени селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням и вредителям использовались фенотипические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивался на 1020 лет. Применение молекулярных маркеров может ускорить и удешевить селекционный процесс.

В 1990-х годах начало бурно развиваться новое направление в селекции - селекция, основанная на молекулярных маркерах (MAS - marker assisted selection). В 1998 году Kawchuk с соавторами предложили SCAR-маркер, тесно сцепленный с геном устойчивости томата к вертициллезу (Kawchuk et al., 1998). А в 2007 году Фесенко И.А с соавторами сообщили о создании CAPS-маркера на ген устойчивости томата к фузариозу (Фесенко И.А. и др., 2007). Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов.

Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам. Информация о структуре локусов у неустойчивых форм растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости.

Целью работы являлся сравнительный анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу у устойчивых и неустойчивых форм томатов. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать библиотеку последовательностей ДНК локусов (кластеров) устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу;

2. Провести сравнительный анализ организации кластеров у устойчивых и неустойчивых форм растений;

3. Разработать эффективные системы маркирования генов устойчивости.

Нами впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав локусов 12 и Ve, у неустойчивых к фузариозу и вертициллезу форм томатов. Проведено сравнение структуры вышеуказанных локусов у устойчивых и неустойчивых форм томата.

Показано, что в локусе, аналогичном локусу 12 S. pimpinellifolium, у S. esculentum присутствуют, по меньшей мере, два гена-гомолога, причем один из них уникален по своей структуре.

Показано присутствие в локусе Ve у неустойчивых генотипов томата нуклеотидных последовательностей, имеющих высокую степень сродства к ранее клонированным Kawchuk с соавторами (2001) генам устойчивости Vel и Ve2. Выявлен полиморфизм по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата. На основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер.

На основании нуклеотидных последовательностей региона, тесно сцепленного с локусом Ve (Kawchuk et al., 1999), создан удобный в применении при массовом анализе селекционного материала на устойчивость к вертициллезу кодоминантный SCAR-маркер. На основании полиморфизма в данном регионе синтезирован флуоресцентный зонд, позволяющий быстро выявлять в селекционном материале растения, несущие доминантный аллель гена устойчивости томата к вертициллезу, с помощью ПЦР в реальном времени или детекции флуоресценции по конечной точке (end-point detection).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Куклев, Михаил Юрьевич

выводы

1. Клонированы нуклеотидные последовательности локусов 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых форм томата. Сравнительный анализ показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями указанных локусов у устойчивых и неустойчивых генотипов.

2. Выявлен полиморфизм на молекулярном уровне в локусах 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов, на основе которого созданы высокоэффективные ДНК-маркеры.

3. В локусе 12 неустойчивого генотипа S. esculentum выявлены: последовательность, имеющая высокую степень гомологии к гену I2C-5; и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену 12 S. pimpinellifolium.

4. В локусе Ve неустойчивых форм томата выявлены нуклеотидные последовательности с высокой (более 96%) степенью гомологии к описанным ранее генам-гомологам Vel и Ve2.

5. Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы Xba I между локусами Ve устойчивых и неустойчивых генотипов. На основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер.

6. На основании ранее выявленного полиморфизма в регионе, тесно сцепленном (0,67±049 сМ) с геном устойчивости томата к вертициллезу (Kawchuk, 1998), создан новый кодоминантный SCAR-маркер.

7. Создана флуоресцентная тест-система для детекции доминантного аллеля гена устойчивости томата к вертициллезу с помощью ПЦР в реальном времени или конечной детекции флуоресценции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокая степень гомологичности между нуклеотидными последовательностями локуса 12 у S. pimpinellifolium и S. esculentum говорит об общих путях эволюции локусов устойчивости у этих видов. Однако, по всей видимости, у S. esculentum устойчивость к фузариозу была преодолена патогеном. Дальнейшее изучение и сравнительный анализ данного локуса, возможно, прольет свет на причину потери устойчивости культурным томатом.

Благодаря выявленному в ходе данной работы полиморфизму между локусами 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов томата, удалось создать эффективные ДНК-маркеры. Созданные маркеры успешно применяются на селекционном материале Селекционно-овощной станции им. Н.Н. Тимофеева, селекционных фирм «Гавриш», «Ильинична», «Манул».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куклев, Михаил Юрьевич, 2007 год

1. Вавилов П.П., Гриценко В.В., Кузнецов B.C. и др.; под ред. Вавилова П.П. «Растениеводство». М.: Агропромиздат, 1986. 512 стр.

2. Куклев М.Ю., Фесенко И.А., Карлов Г.И. (2006) Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата. М.: Известия ТСХА, выпуск 4, стр. 115120.

3. Фесенко И.А., Куклев М.Ю., Карлов Г.И. (2007) Создание ДНК-маркера гена устойчивости томата к фузариозному увяданию. М: Известия ТСХА, выпуск 1, 66-73.

4. Agrios G.N. (1990). Plant Pathology. 3th ed. Academic Press,San Diego, CA. 803p.

5. Baker В., Zambyrski P., Staskawicz B. and Dinesh-Kumar S.P. (1997) Signaling in plant-microbe interactions. Science 276: 726-733.

6. Beckman, C.H., ed (1987). The Nature of Wilt Diseases of Plants. (St. Paul, MN: American Phytopathological Society).

7. Bent A.F. "Plant disease resistance genes function meets structure". Plant Cell 8: 1757-1771, 1996.

8. Bent, A.F., Kunkel, B.N., Dahlbeck, D., Brown, K.L., Schmidt, R, Giraudat, J., Leung, J., and Staskawicz, B.J. (1994). RPSP of Arabidopsis thaliana: A leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. Science 265, 1856-1 860.

9. Bournival, B.L., Vallejos, C.E., and Scott, J.W. (1990). Genetic analysis of resistances to races 1 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici from the wild tomato Lycopersicon pennellii. Theor. Appl. Genet. 79, 641-645.

10. Bruehl G. W. (1987). Soilborne Plant Pathogens. Macmillan Publishing Company, London. 368p.

11. Cirulli M (ed) (1981) Pathobiology of Verticillium species. Mediterranean Phytopathological Union, Firenze, Italy.

12. D'Arcy, W. G. (1972) Solanaceae studies II: typification of subdivisions of Solanum. Ann. Missouri Bot. Gard. 59: 262-278

13. D'Arcy, W. G. (1991) The Solanaceae since 1976, with a review of its biogeography. Pages 75-137 in: J. G.

14. Dangl J.L. (1999) Mechanisms of specific disease resistance: current understanding and future challenges. 9th International Congress on Molecular Plant-microbe interactions, Amsterdam.

15. Dangl J.L., Dietrich R.A. and Richberg M.H. (1996) Death don't have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. Plant Cell 8: 17931807.

16. Delaney T.P. (1997) Genetic dissection of acquired resistance to disease. Plant Phys 113:5-12.

17. Dhingra O.D. and Sinclair J.B. (1985). Basic Plant Pathology Methods.CRCPress Inc., Boca Raton, Florida. 355p.

18. Diwan N., Fluhr R., Eshed Y., Zamir D., Tanksley S. D. (1999) Mapping of Ve in tomato: a gene conferring resistance to the broad-spectrum pathogen, Verticillium dahliae race 1 Theor Appl Genet 98: 315.319.

19. Dixon M.S., Jones D.A., Keddie J.S., Thomas C.M., Harrison K., Jones J.D.G. (1996) The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins. Cell, vol. 84, pp. 451-459.

20. Ellis J., Lawrence G., Ayliffe M., Anderson P., Collins N., Finnegan J., Frost D., Luck J., Pryor T. (1997) Advances in the molecular genetic analysis of the flax-rust interactions". Annu Rev Phytopathol 35: 271-291.

21. Ellis, J.G., Lawrence, G.J., Finnegan, E.J., and Anderson, P.A. (1995). Contrasting complexity of two rust resistance loci in flax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,4185-4188.

22. Fields S. and Song O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions". Nature 340: 245-246.

23. Flor, H.H. (1971). Current status of gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol. 9,275-296.

24. Fluhr, R. (2001) Sentinels of disease: Plant resistance genes. Plant Physiol., 127, 1367-1374.

25. Frank L.W. Takken and Matthieu H.A.J. Joosten (2000). Plant Resistance Genes: Their Structure, Function and Evolution. European Journal of Plant Pathology, Volume 106, Number 8 / October, 2000, 699-713.

26. Grant, M. R., Godiard, L., Straube, E., Ashfield, Т., Lewald, J., Sattler, A., Innes, R. W., and Dangl, J. L. (1995). Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science 269, 843-846.

27. Hashimoto C., Hudson K.L. and Anderson K.V. (1988) The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein. Cell 52: 269-279.

28. Johal G.S. and Briggs S.P. (1992) Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize. Science 258: 985-987.

29. Jones J.D.G. (1997) Plant disease resistance a kinase with keen eyes. Nature 385: 397-398.

30. Jurriaan J. Mes, Emma A. Weststeijn, Frits Herlaar et al. (1999) Biological and Molecular Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Divides Race 1 Isolates into Separate Virulence Groups. Phytopathology, Vol. 89, No. 2, pp. 156-160.

31. Kataoka Т., Broek D., Wigler M. (1985) DNA sequence and characterization of the S. cerevisiae gene encoding adenylate cyclase. Cell 43: 493-505.

32. Kawchuk L.M., Hachey J., and Lynch D.R. (1998) Development of sequence characterized DNA markers linked to a dominant verticillium wilt resistance gene in tomato. Genome, 41: 91.95.

33. Kawchuk, L.M., Lynch, D.R., Hachey, J., and Bains, P.S. (1994). Identification of a codominant amplified polymorphic DNA marker linked to the verticillium resistance gene in tomato. Theor. Appl. Genet. 89: 661664.

34. Kearney B. And Staskawicz B.J. (1990) Widespread distribution and fitness contribution of Xanthomonas campestris avirulence gene avrBs2. Nature 246: 385-386.

35. Kobe В., Deisenhofer J. (1994) The leucine-rich repeat: a versatile binding motif. Trends Biochem. Sci. 19: 415-421.

36. Kobe, В., and Deisenhofer, J. (1993). Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor, a protein with leucine-rich repeats. Nature 366, 751 -756.

37. Kobe, В., and Deisenhofer, J. (1995a). Proteins with leucine-rich repeats. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 409-416.

38. Kobe, В., and Deisenhofer, J. (1995b). A structural basis of the interactions between leucine-rich repeats and protein ligands. Nature 374, 183-1 85.

39. Kooman-Gersmann M. (1998) The Avr9 elicitor peptide of Cladosporium fulvum; Molecular aspects of recognition. PhD thesis Phytopathology, wageningen University, Wageningen.

40. Kumar S., Colussi P.A. (1999) Prodomains-adaptors-oligomerization: the pursuit of caspase activation in apoptosis. Trends Biochem Sci 24: 1-4, 1999.

41. Landschulz W.H., Johnson P.F. and McKnight S.L. (1988) The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 240: 1759-1764.

42. Landschulz, W. H., Johnson, P. F. & Mcknight, S. L. (1988). The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA-binding proteins. Science 240, 1759-1764.

43. Lauge R., Joosten M.H.A.J., Van Den Ackerveken G.F.J.M., Van Den Broek H.W.J, and De Wit P.J.G.M. (1997) The in planta-producedextracellular proteins ECP1 and ECP2 of Cladosporium fulvum are virulence factors. Mol Plant-Microbe Interact 10: 735-744.

44. Lawrence, G.J., Finnegan, E.J., Ayliffe, M.A., and Ellis, J.G. (1995). The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPSP and the tobacco viral resistance gene N. Plant Cell 7, 11 95-1 206.

45. Mindrinos, M., Katagiri, F., Yu, G.-L., and Ausubel, F.M. (1994). The A. thaliana disease resistance gene RPSP encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine rich repeats. Cell 78,1089-1 099.

46. Morel, J-B. and J.L. Dangl (1999) Suppressors of the Arabidopsis Isd5 cell death mutation identify genes involved in regulating disease resistance responses. Genetics 151, 305-319.

47. Moyle W.R., Campbell R.K., Rao S.N., Ayad N.G., Bernard M.P, Han Y. And Wang Y. (1995) Mode for human chorionic gonadotropin and lutropin receptor interaction that explains signal transduction of the glycoprotein hormones. J Biol Chem 270: 20020-20031.

48. Parniske M. and Jones J.D.G. (1999) Recombination between diverged clusters of the tomato Cf-9 plant disease resistance gene family. Proc Natl Acad Sci USA 96: 5850-5855.

49. Rohe M., Gierlich A., Hermann H., hahn M., Schmidt В., Rosahl S. And knogge W. (1995) the race-specific elicitor, NIP1, from the barley pathogen,

50. Rhynchosporium secalis, determines avirulence on host plants of the Rrs 1 resistance genotype. EMBO J 14: 4168-4177.

51. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.Y. and Hunt M.D. (1996) Systemic acquired resistance. Plant Cell 8: 18091819.

52. Ryerson D.E. and Heath M.C. (1996) Cleavage of nuclear DNA into oligonucleosomal fragments during cell death induced by fungal infection or by abiotic treatments. Plant cell 8: 393-402.

53. Saraste, M., Sibbald, P.R., and Wittinghofer, A. (1990). The P-loop: A common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biol.Sci. 15, 430434.

54. Sarfatti, M., Abu-Abied, M., Katan, J., and Zamir, D. (1991). RFLP mapping of /7, a new locus in tomato conferring resistance against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 1. Theor. Appl. Genet. 82,22-26.

55. Sarfatti, M., Katan, J., and Zamir, D. (1989). An RFLP marker in tomato linked to the Fusarium oxysporum resistance gene 12. Theor. Appl. Genet. 78,755-759.

56. Sattler, A., Innes, R.W., and Dangl, J. (1995). Structure of the Arabidopsis RPM7 gene enabling dual specificity disease resistance. Science 269,843846.

57. Schaible P, Cannon OS, Waddoups V (1951) Inheritance of resistance to Verticillium wilt in a tomato cross. Phytopathology 41: 986.990.

58. Scofield S.R., Tobias C.M., Rathjen J.P., Chang J.H., Lavelle D.T., Michelmore R.W. and staskawicz B.J. (1996) Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science 274: 20632065.

59. Tang X.Y., Frederick R.D., Zhou J.M., Halterman D.A., Jia Y.L. and Martin G.B. (1996) Initiation of plant disease resistance by physical interaction of Avrpto and Pto kinase. Science 274: 2060-2063.

60. Tang X.Y., Xie M.T., Kim Y.J., Zhou J.M., Klessig D.F. and Martin G.B. (1999) Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance. Plant Cell 11: 15-29.

61. Thomas C.M., Dixon M.S., Parniske M., Golstein C. And Jones J.D.G. (1998) Genetic and molecular analysis of tomato Cf genes for resistance to Cladosporiumfulvum. Phil Trans R Soc Lond В 353 (1374): 1413-1424.

62. Tjamos E.C., Rowe R.C., Heale J.B. and Fravel D.R. (2000). Advances in Verticillium Research and Disease Management. APS Press. St. Paul, MN. 376 p.

63. Tornero, P., Mayda, E., Gomez, M.D., Canas, L., Conejero, V., and Vera, P. (1996). Characterization of LRP, a leucine-rich repeat (LRR) protein from tomato plants that is processed during pathogenesis. Plant J. 10, 315-330.

64. Van der Biezen E.A. and Jones J.D.G. (1999) Plant disease-resistance proteins and the gene-for-gene concept. Trends Biochem Sci 23: 454-456.

65. Watterson JC (1986) Diseases. In: Atherton JG, Rudich JT (eds) The tomato crop, Chapman and Hall, New York, pp 443.484.

66. Whitham, S., Dinesh-Kumar, S.P., Choi, D., Hehl, R., Corr, C., and Baker, B. (1994). The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the interleukin-1 receptor. Cell78, 1101-1115.

67. Wolter M., Hollricher K., Salamini F., Schulze-Lefert P. (1993) The mlo resistance alleles to powdery mildew infection in barley trigger a developmentally controlled defense mimic phenotype. Mol. Gen. Genet. 239: 122-128.

68. Zamir D, Bolkan H, Juvik JA, Watterson JC, Tanksley SD (1993) New evidence for placement of Ve. The gene for resistance to Verticillium race 1. Tomato Genet Coop 43 : 51.52.

69. Zhue Q., Droge-Laser W., Dixon R.A., Lamb C. (1996) Transcriptional activation of plant defense genes. Curr. Opin. Gen. Dev. 6: 624-630.