Анализ генов, специфически экспрессирующихся в клетках плоскоклеточного рака легкого человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Слижикова, Дарья Константиновна

• Слижикова, Дарья Константиновна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Слижикова, Дарья Константиновна

Продуктом гена ТР53 является полифункциональный белок р53, ДНК-связывающий транскрипционный фактор. Воздействие на клетки генотоксических факторов (таких как ионизирующее излучение, УФ или некоторые химические агенты), гипоксии, теплового шока, уменьшение пула нуклеозидтрифосфатов, а также экспрессия некоторых клеточных и вирусных онкогенов вызывает активацию р53. Индукция р53 приводит к задержке клеточного цикла или апоптозу. р53 способен активировать транскрипцию ряда генов, продукты которых способствуют подавлению клеточного цикла (р21шрОАОВ45, 14-3-3^тап В99) [136], [137] или участвуют в апоптозе (ВАХ, АР01, К1ЫЕН/ОЯ5, ЮР-ВРЗ, группа РЮ ир85) [138], [139], [140],[141], а также генов, кодирующих ингибиторы ангиогенеза и другие секретируемые факторы {Тхр1, ВАЛ, СВ-Л/Т7и некоторые другие) [142], [143]. Кроме того, р53 способен репрессировать транскрипцию большого числа генов, среди которых ВСЬ2, ВШС5 и ЯЕЬА, продукты которых играют роль ингибиторов апоптоза [144]. ЯВ

У больных НМРЛ приблизительно в 30% случаев, а при МРЛ в 80-90% случаев встречается ПГ и точечная мутация оставшейся копии гена-супрессора опухолевого роста 11В [127, 145] . 11В белок действует кооперативно с р53, регулируя нормальное прохождение клеточного цикла и контролируя равновесие между клеточной дифференцировкой и пролиферацией на транскрипционном уровне. Белок 11В связывается с фактором транскрипции Е2¥. Е2¥, будучи активным, запускает транскрипцию различных генов и последующий синтез белков, ферментов и их ингибиторов, необходимых для перехода клетки из фазы 01 в фазу 8 [146]. Комплекс сусИп В1 и циклинзависимой киназы-4 фосфорилируют белок 11В, в результате чего происходит разрыв связи с фактором транскрипции Е2Р.

СИШ2А (р16ШК4а)

При развитии НМРЛ у курящих пациентов происходит инактивация гена СОКЫ2А, кодирующего р^^4" (р16 ингибитор киназы 4а), [106]. У 10-40% больных НМРЛ отмечаются делеция и точечная мутация оставшейся копии гена СИКЫ2А, а у 70% больных - отсутствие экспрессии гена [84].

Белок р16ШК4А принадлежит семейству ингибиторов циклинзависимых киназ ¿пк4, являющихся негативными регуляторами сигнального пути, отвечающего за реализацию программы клеточного цикла. р16ШК4А обладает достаточно узкой специфичностью: связывая циклинзависимые киназы СБК4 и СВК6 (но не другие СЭК), он препятствует образованию их комплексов с генами семейства сусИп Б, регулируя таким образом прохождение фазы 01 и вхождение в 8 фазу клеточного цикла [147].

HER-2/neu (receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 precursor)

В некоторых работах было показано, что в небольшом количестве случаев HMPJ

4-27%) ген HER-2/neu экспрессируется на повышенном уровне [148], [121]. Оказалось, что повышение экспрессии связано с точечной мутацией в положении 664. Эту мутацию ассоциируют со способностью HER-2/neu вызывать клеточную трансформацию. HER-2/neu существует в виде неактивного мономера, который димеризуется после активации лигандом и запускается каскад внутриклетоных событий [85]. Сигнальный путь включает в себя активацию генов p21ras и МАРК, что приводит, в свою очередь, к активации нескольких ядерных белков, в том числе белка cyclin DI.

Рецепторы ростовых факторов.

Одним из самых важных молекулярно-генетических изменений, вовлеченных в возникновение ПРЛ, является активация гена EGFR (epidermal growth factor receptor) [149]. Ген EGFR кодирует рецептор для эпидермального фактора роста. Клетки НМРЛ содержат значительно большее число рецепторов EGF, чем нормальные клетки эпителия бронхов. Повышенная экспрессия EGFR, возникающая в результате активирующей мутации, одна из самых ранних и наиболее важных аномалий бронхиального эпителия среди курящих людей с высоким риском заболевания PJ1 и преимущественно встречается при AKJI [120]. После связывания лиганда EGF или TGF-p происходит димеризация рецептора и активация плазматической части рецептора, представленной тирозинкиназой С. Сигналы, передаваемые при активации EGFR, определяют пролиферативную активность клетки, способность к дифференцировке, инвазию и метастазирование, индукцию ангиогенеза и т. д. Выключение EGFR в экспериментальных моделях приводит к торможению опухолевой пролиферации [95].

Белок EGFR экспрессируется на повышенном уровне и ассоциирован с агрессивным фенотипом опухоли при НМРЛ в 30-60% случаев [99], [150-152] Считают, что повышенная экспрессия белка EGFR происходит во всех случаях ПРЛ и более чем в 65% случаев АКЛ [153]. Показано, что при НМРЛ существенно возрастает уровень экспрессии гена фактора роста гепатоцитов (HGF) [154], что, как оказалось, коррелирует с плохой выживаемостью у пациентов с НМРЛ [155]. HGF стимулирует рост и дифференцировку эпителиальных клеток за счет взаимодействия со своим рецептором, кодируемым с-М£7-онкогеном. Сигнальный путь Wnt/p-катенин

Известно, что сигнальный путь Wnl/fJ-катенин имеет важное значение при формировании легкого в эмбриональном развитии, и, в то же время показано, что нарушение этого пути у взрослых организмов приводит к воспалительным процессам в легких. Активация транскрипции генов сигнального пути Wnt наблюдается при различных формах новообразований. Borczuk и соавторы показали, что эти гены экспрессируются на повышенном уровне в клетках ПРЛ по сравнению с нормальной тканью [156] [156].

Одной из конечных мишеней передачи клеточных сигналов от лигандов семейства Wnt является транскрипционный фактор TCF4. Ген TCF4 (transcription factor 7-like 2 fice II specific, HMG-box)) человека (известный также как TCF7L2) относится к классу транскрипционных факторов TCF/LEF [157-159]. Канонический путь активации сигнального пути Wnt приводит к стабилизации молекул бета-катенина, который транслоцируется в ядро и, связываясь с транскрипционными факторами LEF/TCF, активирует гены, имеющие в регуляторных участках специфические сайты связывания [160, 161]. Одними из основных мишеней активации комплексом бета-катенин-ТСТ4 являются гены циклина D1, с-Мус и c-Jun, повышение уровня транскрипции которых наблюдается при многих формах рака, включая все типы рака легких [162-164].

Итак, при РЛ, в отличие от других типов опухолей (простаты, молочной железы и т.д.) достаточно часто обнаруживаются внутригенные мутации (таблица 1). В отличие от амплификаций и делеций локусов хромосом, такие микромутации могут приводить к образованию новых изоформ белков; при этом опухолевая клетка приобретает качественные молекулярные отличия от бронхиального эпителия, что облегчает поиск «мишеней» для применения противоопухолевых препаратов.

1.5. Методы изучения транскрипции генов при PJI

Существует много методов исследования транскрипции генов в раковых клетках [165, 166]. Условно их можно разделить на те, в основе которых лежит реакция гибридизации (Норзерн-гибридизация, ДНК-микрочип и вычитающая гибридизация) и те, в которых используются иные принципы (дифференциальный дисплей и SAGE, Serial Analysis of Gene Expression). Все эти методы широко используются в научной практике. Выбор того или иного метода определяется его доступностью и конкретной задачей, стоящей перед исследователем.

SAGE - это система, позволяющая быстро определять количественное содержание любого экспрессирующегося транскрипта, для которого известна последовательность ДНК, в интересующей ткани. В этом методе, короткие участки мРНК (тэги), размером около 9 оснований, вырезаются по определенным положениям, лигируются вместе и определяется их первичная структура для того, чтобы получить количественную оценку содержания транскрипта в образце [137]. Сравнивая транскрипционные профили опухолевой и соответствующей ей нормальной ткани, полученные с помощью SAGE, можно идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся в этих двух образцах [3].

Примерами использования метода SAGE для изучения транскрипции генов в HMPJI являются работа Hibi с соавторами [167] Они проанализировали более 226000 тэгов из двух библиотек, полученных из первичных плоскоклеточных опухолей легкого и из клеток нормального бронхиального эпителия. При этом было обнаружено 175 транскриптов, экспрессия которых была существенно понижена и 142 с повышенной экспрессией в опухолевой ткани по сравнению с нормальными клетками. Несколько генов (например, PGP (phosphoglycolate phosphatase), B-myb (V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian)-like 2), mutT fnudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 1) были изучены далее с точки зрения их роли в патогенезе рака. Исследование похожего рода было проведено для HMPJI Nacht и соавторами [3].

Методы, в основе которых лежит гибридизационный подход, используют принцип комплементарности гибридизуемых молекул.

ДНК- микрочипы в последние годы заняли одно из ведущих мест в анализе как структурных особенностей генома, так и в полногеномном анализе экспрессии генов. Эта действительно мощная технология позволяет осуществлять сравнительный анализ экспрессии десятков тысяч генов в различных образцах, в том числе в опухолевой и нормальной тканях [168-171]. Благодаря использованию микрочипов уже сегодня удалось сделать чрезвычайно важные выводы о глобальной организации экспрессии геномов в норме и патологии. Уже прочно вошли в практику диагностические микрочипы, содержащие сравнительно небольшое число анализируемых генов. Тем не менее, полногеномные ДНК микроматрицы при всех их видимых достоинствах, которые отражены во множестве обзоров [172, 173], как и всякая другая много-параметрическая технология, обладают множеством скрытых от неспециалистов недостатков [174, 175], которые связаны как с экспериментальными сложностями, так и с необходимостью тщательной статистической обработки получающихся одновременно десятков тысяч результатов для оценки их статистической значимости. С помощью метода микрочипов можно анализировать экспрессию только известных ранее генов. Примером исследования с применение ДНК-микрочипов может служить работа Wang и соавторов, в которой авторы выявили 17 генов, экспрессирующихся на повышенном уровне в ПРЛ [176]. Результаты были потверждены Нозерн-гибридизацией и ОТ-ПЦР в реальном времени.

Метод вычитающей гибридизации позволяет физически выделять фрагменты кДНК, присутствующие только в одном из сравниваемых образцов. Важным преимуществом метода по сравнению с ДНК-микрочипами является возможность проведения исследований без обладания знаниями о первичной структуре нуклеиновых кислот в изучаемых образцах и возможность выделять уникальные фрагменты в достаточном для дальнейших исследований количестве. Принцип метода основан на гибридизации комплементарных последовательностей кДНК двух образцов, один из которых (называемый драйвером) берут в большом избытке. После гибридизации все дуплексы, образованные с участием драйвера (драйвер/драйвер, драйвер/трейсер), специфически удаляются, и в реакционной смеси остаются уникальные фрагменты, образца, взятого в недостатке (трейсера) [177]. 1.6. Изучение изменения уровня белков при PJI

Ключевым моментом в большинстве подходов, используемых протеомикой, является стадия разделения белков, после которой индивидуальные компоненты смеси могут быть идентифицированы с помощью различных методов, включающих микросеквенирование, масс-спектрометрию и др. Наиболее распространенным способом разделения белков до недавнего времени и в наше время является двумерный гель-электрофорез (2Д-ГЭ) [178] [179].

Анализом профиля ПРЛ на белковом уровне занимается лишь несколько исследователей, поскольку это трудоемкая технология, требующая значительного количества материала.

Недавно, Nan и соавторы определили глобальный профиль экспрессии белков в ПРЛ, используя протеомную стратегию «shot-gun», и далее анализировали индивидуальные белки. По результатам исследования было обнаружено 5 повышенно экспрессирующихся белков - кандидатов (РНВ, МАРК, HSP27, ANXA1, HMGB1), которые по данным литературы могут играть важную роль в возникновении, прогрессировании и метастазировании ПРЛ [180].

Протеомные профили тканей ПРЛ и прилегающей нормальной бронхиальной эпителиальной ткани были проанализированы с помощью иммобилизованного метода MALDI-TOF-MS (2-D PAGE matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry). В результате работы было охарактеризовано 43 белка с повышенным содержанием в опухолевой ткани. Часть белков относилась к онкогенам, другие были вовлечены в регуляцию клеточного цикла и сигнальные пути в клетке [181]. В другой работе этих авторов был получен белковый профиль нормального и опухолевого бронхиального эпителия человека с ПРЛ разных стадий с помощью 2Д-ГЭ [182]. Среди обнаруженных 35 дифференциальных белков, только часть из них содержалась на поздней из сравниваемых стадий. Как и в предыдущем исследовании большая часть белков меняющих свое содержание в разных стадиях ПРЛ относилась к онкогенам, другие были вовлечены в регуляцию клеточного цикла и сигнальные пути в клетке. В этих работах были получены важные данные, способствующие обнаружению потенциальных белковых опухолевых маркеров ПРЛ и их вовлечения в опухолевую трансформацию.

В настоящее время стремительно развиваются технологии белковых и тканевых микрочипов, в основе которых лежит метод иммуногистохимического окрашивания. Эти методы позволяют работать с коллекционным тканевым материалом (парафиновые блоки) и анализировать сразу большое количество образцов тканей многих пациентов на содержание определенного белка.

Однако технологии белковых и тканевых микрочипов на сегодняшний день пока далеки от совершенства, так как они не являются ни полногеномными, ни полнопротеомными и нацелены на анализ уже известной группы белков [183-186]. Однако эти методы дают очень важную дополнительную информацию о функционировании клетки и, безусловно, важны также для медицинских целей.

1.7. Транскрипция генов в НМРЛ

Описанные в предыдущей главе методы позволили выявить множество генов, дифференциально транскрибирующихся в опухолевой ткани больных НМРЛ, и, в том числе, плоскоклеточной формой рака. Проблемой масштабных исследований, например ДНК-микрочипов, является то, что хотя они и позволяют обнаружить большое число дифференциально экспрессирующихся генов, характерных для того или иного типа опухоли, однако дифференциальная транскрипция потверждается экспериментально только для части из них. Кроме того, такие данные не отражают частоты изменений экспрессии среди больных ПРЛ и требуют дальнейшего изучения.

Обнаруженные к настоящему времени гены, характеризующиеся дифференциальной экспрессией в НМРЛ, можно приблизительно разделить на группы (табл.2). Кандидатами в маркеры ПРЛ принято считать такие гены, уровень транскрипции которых, по данным литературы, изменяется в опухолевой ткани ПРЛ по сравнению с нормальной тканью легкого и частота изменения уровня транскрипции гена превышает, либо равна 50%. В таблице 2 приведены примеры таких генов.

Таблица 2. Гены, являющиеся кандидатами в маркеры ПРЛ.

Ген Экспрессия (%) Автор

Онкогены и опухолевые супрессоры

TIMP3 (tissue inhibitor of metalloproteinase 3) Down (76%) [187]

RASSF1A (Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 1) ///('/ iln/h'rnwilnhited in cancer 1) ' c-fos (v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog)1 Down (68%) Down (85%) Down (>50%) [188] [189] [190]

RBSP3/ CTDSPL(CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase II, polypeptide A) small phosphatase-like) Down (88%) [188]

RAP2B (RAP2B, member of RAS oncogene family) Up (643%) [191]

Rb2/pl30 (retinoblastoma-like 2 (pl30) Down (75%) [

Гены белков, участвующих в клеточной адгезии и формировании структуры клетки, гликопротеины; опухолевые антигены

GPC1 (glypican 3) Up (55%) [193]

1 \ (fifooiiL'Uim Down (>50%) |ІУ()|

CCR7 (chemokine (C-C motif receptor 7) Up (63.3%)a |ІУ4]

PVA (Pemphigus vulgaris antigen, gp 130) Up (>50%) [195] [176]

Connexin 26 (GJB2; gap junction protein, beta 2, 26kDa) Up (>50%) [176]

CK5, CK6A, CK15, CK16, CK17 (cytokeratins 5, 6A, 15, 16,17) Down (>50%) [57]

CK10, CK14, CK2E (cytokeratins 10, 14, 2E) Up (>50%) [149] 'KIVil \ lokcraim IV) I p(44°.) [196]

I'Kl'l tplukophilm I) ( 7 P\lli laud HI I) ITGA (integrin alpha) 1 p( -50° H) lip(S:.l"„) Up (94%) [176] [191] [196]

ITGA9 (integrin, alpha 11) Down (94%) |1 SS]

ITGB4 (integrin, beta 11), IGA7B (integrin, beta 7B), ITGA 6 (integrin, alpha6) SPRR3 (cornifin) DSC3 (desmokolin 3) Up (>50%) Up (>50%) Up (>50%) [149] [197] [149]

Гены белков, участвующих в опухолевой инвазии, ангиогенезе

VEGF (vascular endothelial growth factor) Up (100%) [

COX-2 (prostaglandin-endoperoxide synthase 2) Up (>50%) [199]

Ang-2(Angiopoetin-2) Up (>50%) [200]

Гены, участвующие в регуляции клеточного цикла и сигнальной трансдукции pim-1 kinase1 Down (86,8%) [201]

AKR1B10 (aldo-keto reductase family 1, member BIO) Up (80%) [187]

Cyclin D1 Up (47% и 90%) [202] и [99], соответственно

Гены, кодирующие метаболические белки, белки - переносчики, белки ионных каналов

SI 00A7(S100 calcium binding protein A 7) Up (100%) [203]

S100A2(S100 calcium binding protein A2) Down (91,6%) [204] aldose reductase homolog Up (>50%) [176]

HYAL1 (hyaluronoglucosaminidase 1) Down (89%) [188]

HYAL2 (hyaluronoglucosaminidase 2) Down (100%) [188]

SQLE (squalene epoxidase) I ' p (~4.1"u) [191]

PPP1CB (protein phosphatase 1, catalytic Down (91,6%) [204] subunit, beta isoform)

CALU (calumenin) Down (91,6%) [204]

CRYM (crystallin, mu) Up (100%) [196]

Гены, кодирующие ядерные белки hTERT (telomerase reverse transcriptase) Up (72,7% и 100%) [205] и [196], соответственно

Гены, вовлеченные в репликацию и репарацию ДНК huMCM2 (Homo sapiens mRNA for DNA Up (>50%) [57] replication licensing factor) hMTHl (human mut homologue 1) Up (89%) [196]

CEBPD (CCAA T/Enhancer Binding Down [57]

Protein delta)

Гены, кодирующие белки, вовлеченные в апоптоз

BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing 5)' Up (85,5% и 66%) [206] и [207]

DAPK1 (death-associatedprotein kinase 1) Down (72%) [187]

TBLlXRl(transducin (beta)-like 1 X-linked Up (75%) [191] receptor 1)

Гены белков, отвечающих за транспорт и деградацию белков; процессинг мРНК и белка

HSP90 (heat shock protein 90kDa alpha Up (91,6%) [204] cytosolic), class A member 1) gp96 (heat shock protein 90kDa beta (Grp94), Up (91,6%) [204 J member 1)

HAPB2(hyaluronan binding protein 2) Up (94%) Г196]

Гены других белков

DCN) decorin' Down (>50%) [190] a-2-macroglobulin1 Down (>50%) [190]

EGR11 (early growth response 1) Down (>50%) [190]

SPRC (similar to small proline-rich protein) Up (>50%) [176]

RPS3 (ribosomalprotein S3) Down (>50%) [190]

KIAA0425' Down (>50%) [190]

OLC1 (overexpressed in lung cancer 1) Up (>50%) [208]

HMGA2 (high mobility group AT-hook 2) Up (70%) [209]

IGFBP5 (insulin-like growth factor binding Up (51,9%) [191] protein 5)

HSNOV1 (SLC35F2 solute carrier family 35, Down (91,6%) [204] member F2)

OCIA (OCIA domain containing 1) Down (91,6%) [204]

AY032661 Down (91,6%) [204]

FT (ferritin) Up (91,6%) [204]

SPD (surfactant protein D) Up (61%) ! [196]

AF363068 Up (91,6%) ! [204] hBD-2 (DEFB4; defensin, beta 4) Up (60%) 1 [210]

COL11A1 (collagen, type XI, alpha 1) Up (89%) I [196]

Down» - транскрипция гена понижена в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью эпителия бронхов; в скобках указана частота встречаемости изменения уровня транскрипции гена в образцах опухолевых и нормальных тканей пациентов с ПРЛ. «Up» - транскрипция гена повышена в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью эпителия бронхов; в скобках указана частота встречаемости изменения уровня транскрипции гена.1 — данные получены для образцов НМРЛ (АКЛ и ПРЛ), авторы не анализировали образцы ПРЛ отдельно.

Далее в обзоре будут описаны некоторые представители дифференциально экспрессирующихся генов.

1.7.!.Онкогены и опухолевые супрессоры

Гены этой группы принимают участие в общих механизмах возникновения канцерогенеза. Нарушения их функции встречаются во многих типах рака, включая и РЛ.

Было обнаружено, что ген Rb2/pl30 (retinoblastoma-like 2 (pi30) транскрибируется на пониженном уровне в 75% случаев в опухолевой ткани НМРЛ по сравнению с нормальным эпителием бронхов [192]. Ген Rb2/pl30 принадлежит семейству генов RB, которое состоит из RB/pl05, р107 и RB2/pl30. Эти гены кооперативно регулируют переход клетки через фазу G1 клеточного цикла [211]. Ген HIC1 (hypermethylated in cancer 1) является кандидатом в гены-опухолевые супрессоры. HIC1 локализован в районе частой ПГ хромосомы 17р13.3. Было показано, что транскрипционный уровень этого гена ниже в опухолевой ткани НМРЛ, чем в нормальной ткани у 85% пациентов [212]. Кроме того, пониженное содержание гена в опухоли имело корреляцию с прогнозом заболевания. Низкое отношение количества транскрипта (0:Н - меньше 0,5) ассоциировали с короткими сроками выживаемости. Такая же ассоциация была обнаружена с I стадией заболевания. Эти результаты позволяют предположить, что ген HIC1 является высокоинформативным маркером НМРЛ, а низкая экспрессия гена коррелирует со злокачественной прогрессией при НМРЛ.

Продукт гена TIMP3 (Tissue inhibitor of metalloproteinase-З) ингибирует активность металлопротеиназ, участвует в межклеточных взаимодействиях и индукции апоптоза. TIMP3 может подавлять рост многих опухолей, включая НМРЛ, а также ангиогенез и метастазирование [213]. Инактивацию гена наблюдали при раке шейки матки, ободочной и прямой кишки, предстательной железы, а также при НМРЛ, включая ПРЛ [149, 214216].

Существуют данные о том, что уровень транскрипции TIMP3 в опухолевой ткани ПРЛ понижен в 76% случаев с нормальной тканью [187]. Пониженная транскрипция гена

TIMP3 в опухолевой ткани коррелировала с содержанием белка, определенным методами иммуногистохимии и иммуноблотинга.

Предполагают, что инактивация гена TIMP3 может происходить в результате гиперметилирования GC-островков промотора гена. Частота метилирования варьирует по данным разных авторов от 13 до 40% в первичных опухолях HMPJI [217].

Анализ транскрипции гена TIMP3 в опухолевых тканях легких различного типа и на разных этапах их злокачественного перерождения, обнаружил значительное изменение его транскрипции уже на ранних стадиях роста опухоли [187].

1.7.2. Гены, участвующие в регуляции клеточного цикла и сигнальной трансдукции

Считается, что изменения в регуляции клеточного цикла является ранним событием, способствующим развитию HMPJI [218].

Ген Cyclin DI кодирует один из белков-циклинов, контролирующих переход клетки из G1 в S-фазу клеточного цикла. Существуют данные о том, что ген Cyclin DI амплифицирован и экспрессируется на повышенном уровне в HMPJ

глава 1.4.5.З.). В клетках HMPJI количество транскрипта Cyclin DI повышено в 47% [202] и 90% случаев [99]. Повышенная продукция белка Cyclin DI приводит к повышению активации циклин-зависимых киназ и, таким образом, способствует инициации клеточного деления. В соответствии с различными данными белок Cyclin DI экспрессируется на повышенном уровне в опухоли при HMPJI в 21 [219], и 61% [220] случаев.

Примером гена, участвующего в регуляции клеточного цикла, уровень которого понижается в опухолевой ткани при HMPJI является генpim-1 kinase [201]. Пониженный уровень транскрипции гена pim-1 kinase была показана в образцах опухолевых тканей 68 пациентов с HMPJI (86,8% случаев) уже на ранних стадиях заболевания [201 \ pim-1 kinase предположительно является протоонкогеном и экспрессируется на повышенном уровне также при раке простаты [221]. Кодируемая pim-1 kinase серин-треониновая киназа принадлежит к семейству киназ Pirn, которые играют важную роль в сигнальных путях цитокинов в кроветворных клетках и связаны с прогрессированием лейкемий и твердых опухолей [222].

1.7.3. Гены, кодирующие белки, вовлеченные в апоптоз

Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет существенную роль в онкогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов, так и как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов [223-225]

Одним из наиболее интересных с этой точки зрения генов является BIRC5, относящийся к семейству ингибиторов апоптоза- IAP [226-229]. Белок BIRC5 ингибирует апоптоз за счет активации В АХ или ингибирования каспаз. Апоптотический индекс в клетках опухоли с высокой экспрессией BIRC5 значительно ниже, чем в клетках с низкой его экспрессией. Ki-67 пролиферативный индекс выше в клетках опухоли с высокой экспрессией BIRC5, чем в клетках с низкой экспрессией BIRC5.

BIRC5 интенсивно изучается как маркер и потенциальная мишень для терапии различных видов рака, в том числе рака легких [175, 225-227].

Существуют данные о том, что экспрессия BIRC5 значительно выше в клетках ПРЛ, чем в клетках аденокарциномы [230].

Высокая транскрипция BIRC5 наблюдается в трансформированных клеточных линиях и ряде раковых клеточных линий с частотой 34-100%, в то время как в нормальных тканях она очень низка или отсутствует [231].

В разных работах по определению уровня транскрипции BIRC5 в НМРЛ было показано, что частота встречаемости повышения экспрессии колеблется от 66% [207] до 85,5% [206]. Кроме того, было показано, что повышение транскрипции мРНК BIRC5 коррелирует с понижением выживаемости пациентов [206]. Falleni с соавторами показали, что BIRC5 преимущественно экспрессируется на ранней стадии НМРЛ [148].

То, что большинство раковых клеток содержит повышенное количество белка BIRC5, делает его одним из наиболее опухолеспецифичных транскриптов. Специфичная для рака экспрессия BIRC5, наряду с его способностью регулировать клеточное деление и важной ролью в ингибировании апоптоза, делает BIRC5 удобным диагностическим маркером рака немелкоклеточного рака легкого и потенциальной мишенью для противораковой терапии.

DAPK1 - death-associated protein kinase 1 - участвует в регуляции клеточного цикла и индукции апоптоза [232, 233]. Инактивация гена показана для многих типов опухолей, включая разные формы рака легких, лимфомы, карциному носоглотки, опухоли пищеварительного тракта и шейки матки [234, 235]. Используя методы иммуногистохимического окрашивания, иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР, было выявлено уменьшение количества белка DAPK1 и понижение уровня транскрипции гена DAPK1 в опухолевой ткани больных НМРЛ в 72% [187] и 83% [236]случаев.

Полагают, что инактивация гена DAPK1, также как и в случае гена TIMP3, происходит в результате гиперметилирования промотора гена, частота метилирования варьирует по данным разных авторов от 19 до 50% [237-239]. Обработка клеточных линий НМРЛ и МРЛ деметилирующими агентами восстанавливает транскрипцию гена DAPK

236]. Анализ транскрипции гена DAPK1 в опухолевых тканях легких различного типа и на разных этапах их злокачественного перерождения, обнаружил значительное изменение его транскрипции уже на ранних стадиях роста опухоли.

Имеющиеся данные позволяют использовать ген DAPK1 в качестве маркерного при

1.7.4.Гены, кодирующие белки участвующие в репликации и репарации ДНК

Некоторые гены, кодирующие гистоновые белки, мяРНП, топоизомеразы и ядерные фосфопротеины, которые важны для процессинга ДНК, дифференциально экспрессируются во всех формах НМРЛ.

Один из таких генов - ген фактора репликации ДНК huMCM2 (Homo sapiens mRNA for DNA replication licensing factor) [57], транскрибирующийся на повышенном уровне в опухолевой ткани пациентов с ПРЛ.

Белок huMCM2 действует в качестве фактора, который позволяет ДНК подвергаться только единичному раунду репликации за один клеточный цикл и необходим для входа в S-фазу и для деления клетки [240].

Было обнаружено, что транскрипция гена CEBPD (ССAAT/Enhancer Binding Protein delta), белковый продукт которого связывается с энхансерным районом генов ССААТ, сильно подавлена в опухолевой ткани ПРЛ по сравнению с нормальной [57]. Этот ген является важным активатором транскрипции генов, вовлеченных в иммунный ответ и воспалительные реакции и может быть вовлечен в регуляцию генов, ассоциированных с активацией и/или дифференцировкой макрофагов [241]

Раннее для гена CEBPD была показано понижение экспрессии в опухолевой ткани у пациентов с раком молочной железы [242]. Молекулярные механизмы изменения экспрессии CEBPD при ПРЛ, как и при раке молочной железы до сих пор плохо изучены.

1.7.5. Гены, кодирующие метаболические белки, белки - переносчики, белки ионных каналов

В клетках ПРЛ транскрибируются на пониженном уровне гены, участвующие в гомеостазе Са2+ , такие как гены белков Calgranulin A, Canl9, S100A14 [57]. Арест клеточного роста, повышенная экспрессия белков, связанных с дифференцировкой и морфологическими изменениями клетки опосредованы повышением уровня внеклеточного кальция [243, 244].

Окружающая концентрация Са2+ - главный регулятор экспрессии факторов терминальной эпидермальной дифференцировки [243, 244]. Потеря способности клеток ПРЛ подвергаться терминальной дифференцировке может быть отражением пониженного уровня экспрессии этих Са2+ - связывающих белков. Эпидермальная терминальная дифференцировка характеризуется серией координированных морфологических и биохимических изменений, которые приводят к образованию специализированного многослойного плоского эпителия.

Изучение внутриклеточного распределения белков S100 в раковых клеточных линиях доказало, что они могут играть ключевую роль в регуляции гомеостаза Са2+ и в других раковых клетках [245, 246].

Было обнаружено, что гены, кодирующие белки S100A2 и S100A7 повышенно экспрессируются в опухолевой ткани больных ПРЛ с высокой частотой (91,6% [204] и 100%[203]) и содержание белка также повышено.

Частым событием при ПРЛ является высокая экспрессия в опухолевых тканях некоторых генов, которые кодируют белки, вовлеченные в антиокислительные реакции и реакции детоксификации [3], [57], [247]. К ним относятся гены таких белков, как GPX2 (glutathione peroxidase 2), GSTM3 (glutathione S-transferase M3), aldo-keto reductase и peroxiredoxin 1 [3]. Экспрессия одного из таких тепов-AKRlBJO (aldo-keto reductase family 1, member BIO) повышена в опухолевой ткани больных ПРЛ ([3, 187, 248]Частота повышенной экспрессии варьирует от 67%) [248]и до 80% [187] среди пациентов с ПРЛ. Авторы одной из работ также продемонстрировали, что содержание белка повышено в опухолевой ткани тех больных ПРЛ у которых повышена транскрипция гена AKR1B10 (в 85%) случаев), а у больных АКЛ - в 29% [187]. Кроме того, ими была обнаружена корреляция между повышенной экспрессией AKR1B10 и курением в исследуемой группе больных НМРЛ. Принимая во внимание полученные данные и участие гена AKR1B10 в метаболическом пути ретиноевой кислоты, AKR1B10 может быть не просто маркером ПРЛ, но и маркером, имеющим отношение к НМРЛ, ассоциированному с курением. Однако, необходимо дальнейшее изучение его роли в канцерогенезе, для того чтобы использовать AKR1B10 еще и как мишень для терапевтического воздействия.

Изменение экспрессии описанных выше генов при ПРЛ, вероятно отражает ответ клеток бронхиального эпителия на поражение канцерогенами окружающей среды [84].

1.7.6. Гены белков, участвующих в клеточной адгезии и формировании структуры клетки, опухолевые антигены

Существуют данные о том, что некоторые гены, специфичные для эпителиальных клеток, дифференциально транскрибируются при ПРЛ. Это гены белков компонентов цитоскелета - цитокератинов и белков эпителиальной клеточной адгезии - интегринов.

Интегрины - это большое семейство трансмембранных линкерных белков. Они расположены на клеточной поверхности и являются рецепторами большинства белков внеклеточного матрикса [249, 250]. Связывание интегринов со своими лигандами позволяет клеткам исследовать свое окружение, сохраняя способность двигаться. Экспрессия белков интегринов наиболее часто повышена в ПРЛ, чем в аденокарциноме [251].

К эффектам, в которых задействованы цитокератины, можно отнести апоптоз и клеточную дифференцировку. Для плоскоклеточной карциномы уровень кератинизации -очень важный параметр, только по нему она может быть классифицирована по стадии дифференцировки [51]. Цитокератины присутствуют только в эпителиальных клетках и являются важнейшим компонентом цитоскелета, фиксирующим ядро и поддерживающим морфологию клетки. Каждый тип цитокератина экспрессируется в зависимости от типа клеточного эпителия и уровня дифференцировки.

Данные по этой группе генов несколько противоречивы. Kettunen и соавторы показали, что гены CKs (cytokeratins) 10, 14, 2 Ей ITGB4, IGA7B, ITGA6 экспрессировались на повышенном уровне при ПРЛ [149]. Подобные результаты для СК19 (keratin 19) и 1TGA (integrin alpha) были получены Chong и соавторами[196], а также Anedchenko и соавторами для ITGA9[ 188] (табл.2).

Однако, Difïlippantonio и соавторы наблюдали сильное понижение или даже отсутствие транскрипционной активности генов белков цитокератинов (СК5, СК6, СК6А, СК15, СК16, СК17) и интегринов в ПРЛ [57]. Похожие результаты были получены в другой работе для плоскоклеточного рака шеи и кожи [252].

Tsubokawa и соавторы исследовали экспрессию 13 типов цитокератинов при ПРЛ и обнаружили, что повышенная транскрипция только СК14 является параметром пролиферационной активности и потенциальной способности опухоли к метастазированию [253].

Возможно, несовпадения данных объясняются тем, что РЛ - гистологически очень неоднородная опухоль и каждый тип цитокератина экспрессируется в зависимости от типа клеточного эпителия и уровня дифференцировки. Другим объяснением может быть то, что авторы не разделяли в своем исследованиях ороговевающий и неороговевающий подтипы плоскоклеточной карциномы.

Потеря способности клеток ПРЛ подвергаться терминальной дифференцировке может быть связана с дифференциальной экспрессией генов белков, отвечающих за ороговевание оболочки клетки, например, таких как SPRR3. SPRR3 - это ген, идентифицированный в некоторых исследованиях как маркерный при ПРЛ [197]. Ген SPRR3 принадлежит к комплексу эпидермальной дифференцировки и кодирует белок, необходимый для ороговевания оболочки клетки. Белок SPRR3 (Cornifin) является членом семейства малых богатых пролином белков, участвующих в ороговевании клеточной оболочки, что помогает обеспечить защитную функцию эпидермального слоя клеток [254].

Наличие внеклеточных мостиков является характерной чертой ПРЛ, поэтому весьма вероятно было обнаружить при этой патологии дифференциальную экспрессию генов, кодирующих десмосомные белки. Действительно, было показано, что ген DSC3 (desmokolin 3), повышенно транскрибируется в ПРЛ [149].

Другой группой генов дифференциально экспрессирующихся при ПРЛ, являются гены опухолевых антигенов. При ПРЛ отмечается значительное увеличение уровня транскрипции гена PVA (Pemphigus vulgaris antigen,gpl30) f(>50%)[176, 195].

Ген CLDN1 (claudin 1) кодирует интегральный мембранный белок, который важен для поддержания адгезии клеток и их полярности [255]. Повышенная экспрессия CLDN1 наблюдается при ПРЛ [191], а также повышение содержания белка CLDN1 при раке почки [256] и шейки матки [257] Авторы предполагают, что ген CLDN1 является мишенью Ь-catenin/Wnt сигнального пути.

Ген glypican-3 кодирует связанный с мембраной белок протеогликан. Aviel-Ronen и соавторы сравнили экспрессию мРНК и содержание белка гена glypican-3 в ПРЛ и АКЛ с нормальной тканью легкого[193]. Было обнаружена повышенная экспрессия мРНК и белка гена glypican-З в опухолевой ткани по сравнению с нормальной у 55% пациентов с ПРЛ и всего лишь у 5% с АКЛ. Кроме того, авторами была установлена ассоциация между курением и низкой экспрессией glypican-3.

1.7.7. Гены, кодирующие ядерные белки

Ген TBL1XR1 кодирует фактор F-box/WD-40, который, как было показано, необходим для транскрипционной активации ядерных рецепторов гормонов и других регулируемых транскрипционных факторов (АР-1, NF-kB) [258]. Повышенный уровень транскрипции TBL1XR1 коррелировал с уровнем белка [191] и был обнаружен также в иммортализованной бронхиальной эпителиальной клеточной линии, которая считается «предраковой» [259]. Эти факты позволяют предположить, что изменение транскрипции TBL1XR1 может быть ранним событием в возникновении опухоли легкого.

При помощи белка hTERT синтезируются последовательности теломер хромосом, которые укорачиваются в процесс каждого клеточного деления. В раковых клетках, его активность связана с поддержанием длины теломер, приводящая к неконтролируемой клеточной пролиферации и бессмертию клеток.

Недавно было обнаружено, что ген hTERT (telomerase reverse transcriptase) транскрибируется на повышенном уровне в сыворотке крови у 72.7% из 112-ти исследуемых пациентов больных PJI [205]. В другом исследовании было обнаружено, что в отличие от нормальных тканей легкого, теломеразная активность и мРНК hTERT детектируются в опухолевых тканях ПРЛ на повышенном уровне в 72,7% [205] и 100% [196], соответственно.

Fujuta и соавторы также наблюдали транскрипцю hTERT только в опухолевых клетках НМРЛ. Авторами была обнаружена значительная корреляция между экспрессией мРНК hTERT и патологической стадией опухоли и Ki-67 пролиферативным индексом, в отличие от корреляции с возрастом, полом, гистологией или дифференцированностью опухоли. [260].

Эти данные позволяют предположить, что экспрессия мРНК hTERT может быть полезной для диагностики НМРЛ и, в частности, ПРЛ, а также служить независимым прогностическим фактором для пациентов с НМРЛ.

1.7.8. Гены белков, участвующих в опухолевой инвазии, ангиогенезе

Транскрипты всех 4-х изоформ гена VEGF(Vascular endothelial growthfactor) детектировали на повышенном уровне в опухолевой ткани в 100% случаев НМРЛ [198]. При этом содержание белка VEGF коррелировало с уровнем мРНК. Высокий уровень мРНК VEGF в опухолевой ткани коррелировал с более поздней стадией заболевания, размером опухоли, наличием метастазов в лимфатических узлах, коротким периодом выживаемости и ранним возникновением рецидивов [198]. По данным разных исследователей уровень белка VEGF был повышен в 74-82% опухолей [219, 220].

Рост опухоли сопряжен с ангиогенезом - формированием новой сети капилляров из эндотелиальных клеток, необходимых для доставки питательных веществ и кислорода в опухоль. Различные ростовые факторы стимулируют ангиогенез, в том числе семейство VEGF. Клетки эндотелия имеют на своей поверхности рецепторы к VEGF. Опухолевые клетки РЛ продуцируют в повышенном количестве YEGF и матричные металлопротеиназы [261]. Матричные металлопротеиназы, разрушающие внеклеточный матрикс, упрощают инвазию клеток эндотелия и образованных ими капилляров в опухолевую ткань.

Ключевую роль в стимуляции опухолевого ангиогенеза играет инактивация функции опухолевого супрессорар53 (см. главу 1.4.5.6), который контролирует экспрессию ингибиторов ангиогенеза, в частности, активируя транскрипцию генов тромбоспондина 1 и 2, и подавляет транскрипцию гена VEGF [57].

Ген cyclooxygenase-2 участвует в метаболизме арахидоновой кислоты, который приводит к образованию простагландинов, простациклинов и тромбоксанов.

Во многих работах показано, что в клетках HMPJI повышенно экспрессируется ген СОХ-2 (prostaglandin-endoperoxide synthase 2): в 70-90% случаев HMPJ1 [262], [263]. Повышенный уровень мРНК СОХ-2 наблюдался на всех стадиях заболевания более чем в 50% ПРЛ [199]. Была обнаружена строгая позитивная корреляция между высоким уровнем транскрипции СОХ-2 в опухолевых клетках больных HMPJ1 и транскрипцией VEGF [199]. Эти факты позволяют считать, что СОХ-2 играет важную роль в повышенной регуляции экспрессии ангиогенного фактора VEGF и ангиогенезе опухоли HMPJI и объясняет, в частности, неблагоприятный прогностический эффект повышенной экспрессии СОХ-2 при НМРЛ.

Главным метаболитом СОХ-2 является PGE2 (prostaglandin Е2), повышение уровня которого приводит к ангиогенезу, росту опухоли и инвазии, устойчивости к апоптозу и супрессии анти-опухолевого иммунитета [264]. Недавние исследования показали, что PGE2 может делать клетки устойчивыми к таргетной терапии, использующей рецепторы ростовых факторов за счет кросс-активации других компонентов рецепторного сигнального пути [265].

1.7.9. Гены, кодирующие другие белки

В эту группу попадают гены, выполняющие различные функции в клетке, которые было сложно отнести к какой-либо из групп описанных выше.

Белок, кодируемый геном RAP2B (Ras-related GTP-bindingprotein) принадлежит к семейству GTP-связывающих белков, которые участвуют во многих процессах жизнедеятельности клетки: регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку, перестройки цитоскелета и транспорт глюкозы. Было показано, что уровень транскрипции гена RAP2B повышен в опухолевой ткани больных ПРЛ [191]. Полагают, что RAP2B может способствовать клеточному росту за счет активации RAS-RAF-MAPK/EPK kinase-ERK пути, повышая внутриклеточное содержание кальция и активируя РКС [266]. В соответствии с этими данными, RAP2B представляет собой хорошую мишень для разработки потенциального терапевтического лекарства для лечения рака легкого [191].

В результате анализа гена гена hBD-2 (Human у3-defensin 2) было обнаружено, что содержание его транскрипта значительно повышено у 60% больных ПРЛ и 50% больных АКЛ [210]. Белковый продукт гена hBD-2 продуцируется нейтрофилами, мононуклеарными фагоцитами и эпителиальными клетками, и играет важную роль в системе врожденного иммунитета на поверхности слизистых оболочек [267].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Слижикова, Дарья Константиновна

выводы

1. Получены и проанализированы библиотеки кДНК, обогащенные последовательностями, дифференциально транскрибирующимися в нормальных и опухолевых тканях пациентов с диагнозом периферического плоскоклеточного рака легкого II стадии. Показано, что транскрипция генов NOLA2, RPL10A, RPS3A повышена, а экспрессия генов IGJ, RhoC, SFTPC подавлена в опухолевых тканях.

2. Гены NOLA2, SFTPC, IGJ, RPS3A и RPL10A, кодирующие, соответственно, ядрышковый белок семейства А, белок С легочного сурфактанта, J-пептид иммуноглобулинов, белок малой субъединицы рибосомы, белок большой субъединицы рибосомы, дифференциально транскрибируются более, чем у 50% пациентов, и, поэтому являются маркерами немелкоклеточного плоскоклеточного рака легкого.

3. Методами ОТ-ПЦР и иммуноблоттинга исследован уровень содержания J-пептида (IGJ) и его мРНК в нормальных и опухолевых тканях при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого на разных стадиях развития заболевания. Обнаружен эффект несинхронного изменения уровня транскрипта и белка в опухолевых клетках, причем уровень изменения транскрипции значительно превосходит уровень изменения белка.

4. Анализ профиля экспрессии генов белков легочного сурфактанта SFTPA1, SFTPA2, SFTPB1, SFTPB2 и SFTPD показал, что транскрипция всех генов понижена в опухолевых тканях у 60-80%) пациентов с плоскоклеточным раком легкого, что также позволяет рассматривать эти гены как новые маркеры данного типа опухоли.

5. Проведено сравнение уровней экспрессии генов семи транскрипционных факторов NFIA, FOXF1, FOXF2, TAZ, GATA6, HNF3aи TTF1, предположительно участвующих в регуляции транскрипции генов, кодирующих белки сурфактанта. Показано, что уровень транскрипции IINF3а возрастает в 80%), a GATA6 понижается в 60% образцов опухолевых тканей. Выявлены корреляции между изменением транскрипционного уровня в опухолевых тканях гена HNF3aià генов S FTP В (60%) и SFTPC (80%>), а также генов GATA6 и SFTPC (60%), что свидетельствует в пользу участия фактора HNF3a в регуляции экспрессии данных генов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Слижикова, Дарья Константиновна, 2008 год

1. Van der Stuyft, P. and J.P. Unger, Improving the performance of health systems: the World Health Report as go-between for scientific evidence and ideological discourse. Trop Med Int Health, 2000. 5(10): p. 675-7.

2. Global Cancer Facts & Figures, in ACS. 2007.

3. Nacht, M., et al., Molecular characteristics of non-small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(26): p. 15203-8.

4. Rom, W.N., et al., Molecular and genetic aspects of lung cancer. Am J Respir Crit Care Med, 2000. 161(4 Pt 1): p. 1355-67.

5. Guilbert, J.J., The World Health Report 2006: working together for health. Educ Health (Abingdon), 2006. 19(3): p. 385-7.

6. Витько, H.K., Буковская Ю. В., and Б.Н.Ф. Васильев К. Ю., Рентгенодиагностика рака легкого

7. Журнал лечащий врач, 2000. 3.

8. Clinical tumour size and prognosis in lung cancer. Bronchogenic Carcinoma Cooperative Group of the Spanish Society of Pneumology and Thoracic Surgery (GCCB-S). Eur Respir J, 1999. 14(4): p. 812-6.

9. Poleri, C., et al., Risk of recurrence in patients with surgically resected stage I non-small cell lung carcinoma: histopathologic and immunohistochemical analysis. Chest, 2003. 123(6): p. 1858-67.

10. Hanash, S., F. Brichory, and D. Beer, A proteomic approach to the identification of lung cancer markers. Dis Markers, 2001. 17(4): p. 295-300.

11. Ullmann, R., et al., Protein expression profiles in adenocarcinomas and squamous cell carcinomas of the lung generated using tissue microarrays. J Pathol, 2004. 203(3): p. 798-807.

12. Inamura, K., et al., Two subclasses of lung squamous cell carcinoma with different gene expression profiles and prognosis identified by hierarchical clustering and non-negative matrix factorization. Oncogene, 2005. 24(47): p. 7105-13.

13. Brazma, A., et al., One-stop shop for microarray data. Nature, 2000. 403(6771): p. 699700.

14. Paez, J.G., et al., EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science, 2004. 304(5676): p. 1497-500.

15. Metro, G., et al., Epidermal growth factor receptor (EGFR) targeted therapies in non-small cell lung cancer (NSCLC). Rev Recent Clin Trials, 2006. 1(1): p. 1-13.

16. Трахтенберг, Рак легкого. 1987, Москва: Медицина. 304

17. Бахлаев, И.Е., Толпинский А.П., Рак легкого: Учебное пособие. 1999, Петрозаводск: ПетрГУ. 74.

18. Харченко В. П., К.И.В., Рак легкого: Руководство для врачей. 1994.: М: Медицина. 480 с.

19. Youlden, D.R., S.M. Cramb, and P.D. Baade, The International Epidemiology of lung Cancer: geographical distribution and secular trends. J Thorac Oncol, 2008. 3(8): p. 819-31.

20. Hecht, S.S., Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. J Natl Cancer Inst, 1999. 91(14): p. 1194-210.

21. Sasco, A.J., M.B. Secretan, and K. Straif, Tobacco smoking and cancer: a brief review of recent epidemiological evidence. Lung Cancer, 2004. 45 Suppl 2: p. S3-9.

22. Walser, Т., et al., Smoking and Lung Cancer: The Role of Inflammation. Proc Am Thorac Soc, 2008. 5(8): p. 811-815.

23. Kabir, Z., K. Bennett, and L. Clancy, Lung cancer and urban air-pollution in Dublin: a temporal association? Ir Med J, 2007. 100(2): p. 367-9.

24. Hainaut, P. and G.P. Pfeifer, Patterns of p53 G—>T transversions in lung cancers reflect the primary mutagenic signature of DNA-damage by tobacco smoke. Carcinogenesis, 2001. 22(3): p. 367-74.

25. Catelinois, O., et al., Lung cancer attributable to indoor radon exposure in france: impact of the risk models and uncertainty analysis. Environ Health Perspect, 2006. 114(9): p. 1361-6.

26. O'Reilly, K.M., et al., Asbestos-related lung disease. Am Fam Physician, 2007. 75(5): p. 683-8.

27. Gorlova, O.Y., et al., Aggregation of cancer among relatives of never-smoking lung cancer patients. Int J Cancer, 2007. 121(1): p. 111-8.

28. Hackshaw, A.K., M.R. Law, and N.J. Wald, The accumulated evidence on lung cancer and environmental tobacco smoke. Bmj, 1997. 315(7114): p. 980-8.

29. Tobacco Smoke and Involuntary Smoking. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans (WHO International Agency for Research on Cancer) 2002.83.

30. Leroux, C., et al., Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV): from virus to lung cancer in sheep. Vet Res, 2007. 38(2): p. 211-28.

31. Palmarini, M. and H. Fan, Retrovirus-induced ovine pulmonary adenocarcinoma, an animal model for lung cancer. J Natl Cancer Inst, 2001. 93(21): p. 1603-14.

32. Cheng, Y.W., et al., The association of human papillomavirus 16/18 infection with lung cancer among nonsmoking Taiwanese women. Cancer Res, 2001. 61(7): p. 2799-803.

33. Zheng, H., et al., Oncogenic role of JC virus in lung cancer. J Pathol, 2007. 212(3): p. 306-15.

34. Giuliani, L., et al., Detection of oncogenic viruses SV40, BKV, JCV, HCMV, HPV and p53 codon 72polymorphism in lung carcinoma. Lung Cancer, 2007. 57(3): p. 273-81.

35. Kogan, E.A., Precancer and cancer of the lung. Arkh Patol, 1989. 51(11): p. 76-83.

36. Anbazhagan, R., et al., Classification of small cell lung cancer and pulmonary carcinoid by gene expression profiles. Cancer Res, 1999. 59(20): p. 5119-22.

37. Travis, W.D., L.B. Travis, and S.S. Devesa, Lung cancer. Cancer, 1995. 75(1 Suppl): p. 191-202.

38. Virtanen, C., et al., Integrated classification of lung tumors and cell lines by expression profiling. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(19): p. 12357-62.

39. Volm, M., et al., Expression profile of genes in non-small cell lung carcinomas from long-term surviving patients. Clin Cancer Res, 2002. 8(6): p. 1843-8.

40. Трахтенберг, Рак легкого. Конспект врача, in Медицинская газета. 2005: Москва.

41. Brambilla, Е., et al., The new World Health Organization classification of lung tumours. Eur Respir J, 2001. 18(6): p. 1059-68.

42. Granville, C.A. and P. A. Dennis, An overview of lung cancer genomics and proteomics. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005. 32(3): p. 169-76.

43. Collins, L.G., et al., Lung cancer: diagnosis and management. Am Fam Physician, 2007. 75(1): p. 56-63.

44. Roth, J.A., Molecular events in lung cancer. Lung Cancer, 1995. 12 Suppl 2: p. S3-15.

45. Barbone, F., et al., Cigarette smoking and histologic type of lung cancer in men. Chest, 1997. 112(6): p. 1474-9.48,49.