Анализ амилоидных свойств белка PHC3 человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Качкин Даниил Валерьевич

• Качкин Даниил Валерьевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Качкин Даниил Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Амилоиды - определение, структура, свойства

1.2 История открытия и изучения амилоидов

1.3 Распространенность амилоидов

1.3.1 Патогенные амилоиды и амилоидозы млекопитающих

1.3.2Функциональные амилоиды

1.3.3Прион [PS/+]

1.4 Методы оценки амилоидогенного потенциала белков и поиска новых амилоидов

1.4.1 Биоинформатические подходы для оценки амилоидогенного потенциала белков

1.4.2Методы протеомного скрининга амилоидов

1.4.3 Анализ амилоидогенного потенциала in vitro. Система C-DAG

1.4.4Дрожжевая модель для оценки амилоидного потенциала и поиска новых амилоидных белков

1.5 Белок PHC3 - структура, функции, изоформы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы микроорганизмов, клеточные линии и плазмиды, использованные в работе

2.1.1Штаммы бактерий Escherichia coli

2.1.2Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae

2.1.3 Клеточные линии млекопитающих

2.2 Векторы использованные в работе

2.3 Среды и условия культивирования E. coli

2.4 Среды и условия культивирования S. cerevisiae

2.5 Среды и условия культивирования клеточных культур человека

2.6 Биоинформатические методы

2.7 Молекулярно-биологические методы

2.7.1 Конструирование плазмид для анализа агрегации различных изоформ белка PHC3 в клетках

дрожжей S. cerevisiae

2.7.2Конструирование плазмид для проверки амилоидогенных свойств коротких изоформ PHC3 в бактериальной системе C-DAG

2.7.3Конструирование плазмид для изучения агрегации коротких изоформ белка PHC3 в клетках человек

2.7.4Бактериальная трансформация

2.7.5 Дрожжевая трансформация

2.7.6Трансфекция клеточной культуры HEK293T

2.7.7Получение лентивирусных векторов

2.7.8Трансдукция культур клеток фибробластов (DF2), кератоцитов стромы и лимбальных стволовых клеток человека лентивирусными векторами

2.7.9Оценка цитотоксичности агрегатов коротких изоформ PHC3 для фибробластов человека

2.7.10Получение лизатов клеток S. cerevisiae

2.7.11 Получение лизатов из клеточной культуры человека HEK293T

2.7.12Полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле (SDD-AGE)

2.7.13 Электрофорез белков в полиакриламидном геле с последующим кипячением

2.7.14Вестерн-блот

2.8 Бактериальная система С-DAG для оценки способности белков к амилоидной агрегации in vitro

2.9 Иммуноцитохимия клеток млекопитающих

2.10 Микроскопия

2.10.1 Флуоресцентная микроскопия

2.10.2Поляризационная микроскопия

2.10.3 Электронная микроскопия

2.11 Транскриптомный анализ

2.11.1Выделение тотальной РНК

2.11.2Получение библиотеки кДНК и секвенирование

2.11.3 Анализ дифференциальной экспрессии генов

2.12 Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Биоинформатический анализ белков человека PHC3(1), PHC3(5) и PHC3(6)

3.2 Анализ агрегации белка PHC3 в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae

3.3 Анализ агрегации коротких изоформ PHC3 in vitro с помощью системы C-DAG

3.4 Анализ локализации белка PHC3 в клетках HEK293T

3.5 Анализ агрегации белков PHC3(5) и PHC3(6) в клетках человека HEK293T

3.6 Анализ агрегации белков PHC3(5) и PHC3(6) в дермальных фибробластах, кератоцитах стромы и лимбальных стволовых клетках человека

3.7 Оценка токсичности коротких изоформ белка PHC3 для клеток линии DF2

3.8 Анализ ко-локализации белков YFP-PHC3(5) и YFP-PHC3(6) c белком PHC3(1)-CFP в клетках дрожжей S. cerevisiae

3.9 Анализ локализации полноразмерного белка PHC3 в клетках млекопитающих, при сверхпродукции коротких изоформ PHC3

3.10 Анализ дифференциальной экспрессии генов при сверхпродукции и агрегации PHC3(5) -EGFP в клетках HEK293T

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Анализ способности коротких изоформ PHC3 к амилоидоподобной агрегации in vivo и in vitro

4.2 Анализ возможности взаимодействия коротких изоформ PHC3 c полноразмерным белком PHC3 и влияния на работу комплекса PRC1

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2D-DIGE - 2 Dimensional Difference Gel Electrophoresis (Двухмерный гель-электрофорез) АБ - Амилоидогенный белок БА - Болезнь Альцгеймера

ЛСК - клеточная культура лимбальных стволовых клеток человека

МИ - Множественная инфекция

НАБ - Неамилоидогенный белок

ПААГ - Полиакриламидный гель

ПВДФ - Поливинилиденфторид

САИКАР - 5'-фосфорибозил-4-(№сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол ТЭ - Трис-ЭДТА буфер

ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота Â - Ангстрем

AA - Amyloid A (Амилоид А)

ADI - Alzheimer's Disease International (Международная организация по борьбе с болезнью Альцгеймера)

AL - Light-chain amyloid (Амилоид легких цепей иммуноглобулинов)

ANCA - Amino Naphthalenyl-2-Cyano-Acrylate (аминонафталенил-2-циано-акрилат)

Amp - ampicillin (ампициллин)

APP - Amyloid precursor protein (Белок предшественник амилоида) Ap - Amyloid beta peptide (Пептид амилоид бэта)

Ap42(TM) - вариант пептида Ap из 42 аминокислот, содержащий тройную мутацию F19S, F20S, I31P, блокирующую агрегацию AP42.

C-DAG - Curli-Dependent Amyloid Generator (метод Курли-зависимой генерации амилоидов)

CFP - cyan fluorescent protein (синий флуоресцентный белок)

Cm - ^^ramphe^^ (хлорамфеникол)

cPRC1 - Canonical Polycomb Repressive complex

DF2 - dermal fibroblast 2 (клеточная линия фибробластов человека)

EGFP - enhanced green fluorescent protein (улучшенный зеленый флуоресцентный белок)

FBS - Fetal Bovine Serum (Эмбриональная Сыворотка Крупного рогатого скота)

FCS - phenylalanine (F), cysteine (C), serine (S) domain (Zn-связывающий домен)

IAPP - Islet amyloid polypeptide (островковый амилоидный полипептид)

H2AK119ub1 - моноубиквитинирование по лизину в 119 положении в гистоне Н2

H3K27ac - ацетилирование по лизину в 27 положении в гистоне H3 HEK293T - Human Embryonic Kidney 293T (Клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека)

HPLC - High-performance liquid chromatography (Высокоэффективная жидкостная хроматография)

LB - Lysogeny broth (Лизогенная среда для бактерий)

LC-IgK - Light chain Immunoglobulin к (легкие цепи иммуноглобулинов каппа) LC-IgL - Light chain Immunoglobulin X (легкие цепи иммуноглобулинов лямбда) Li-Ac - Lithium Acetate (Ацетат Лития)

MTT - 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 -дифенил-2^тетразолий бромид

ncPRCl - no^anonical Polycomb Repressive complex

OD595 - Optical density 595 (Оптическая плотность при длине волны 595 нм)

PHC3(5) - изоформа 5 белка PHC3 человека

PHC3(6) - изоформа 6 белка PHC3 человека

PHC3(FL) - полноразмерный белок PHC3 человека (включает изоформу 1 и/или 7) PrP - Prion Protein

PrPSc - Scrapie PrP (прионная детергент-устойчивая изоформа белка Prion Protein) PSIA - Proteomic Screening for Identification of Amyloid proteins (метод протеомного поиска для идентификации амилоидных белков)

SAA - Serum amyloid A (сывороточный амилоидный белок А) TTR - transthyretin (транстиретин)

SC - Synthetic Complete (Синтетическая полная среда для дрожжей) SDD-AGE - Semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле)

SDS - sodium dodecyl sulfate (додецилсульфат натрия) SLS - sodium lauroyl sarcosinate (лаурилсаркозинат натрия)

YEPD - Yeast Extract Peptone Dextrose (дрожжевая питательная среда, содержащая дрожжевой экстракт, пептон, глюкозу)

YFP - yellow fluorescent protein (желтый флуоресцентный белок) YNB - Yeast Nitrogen Base (основа для синтетической дрожжевой среды)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Более 70 заболеваний человека, связаны с образованием амилоидов, белковых агрегатов фибриллярной природы, которые формируются за счёт образования упорядоченных межмолекулярных кросс-бета структур. Наряду с патогенными амилоидными белками, в природе выявлены функциональные амилоиды, выполняющие важные биологические функции, такие как регуляция долговременной памяти у животных, катализ полимеризации меланина у млекопитающих, хранение пептидных гормонов, формирование биоплёнок у бактерий и др. (Nizhnikov et al., 2015; Rubel et al., 2020; Sergeeva and Galkin., 2020).

Несмотря на то, что список белков способных к амилоидной агрегации в условиях in vivo дополняется с каждым годом, понимание функциональных последствий амилоидообразования остаётся не до конца изученным и концептуальное осмысление роли амилоидов в регуляции клеточных процессов и их влияния на жизнеспособность организма требует более детального изучения.

Полученные в данной работе результаты указывают на наличие амилоидных свойств у двух коротких изоформ белка человека PHC3, который участвует в функционировании комплекса PRC1, модифицирующего структуру хроматина, и регулирующего экспрессию различных групп генов. Предполагается, что короткие амилоидные изоформы белка PHC3 могут формировать амилоидоподобные структуры способные утягивать полноразмерный функциональный белок PHC3 и приводить к активации транскрипции на расплетенных участках хроматина. Данная работа способствует развитию представлений о роли амилоидной формы белка PHC3 в регуляции укладки хроматина и экспрессии генов. В ходе работы проведён анализ амилоидогенных свойств укороченных изоформ (5 и 6) белка человека PHC3 в клетках дрожжей и клетках человека, изучена агрегация этих белков in vitro в системе C-DAG, проанализировано влияние агрегации коротких изоформ PHC3 на экспрессию генов в культуре клеток человека HEK293T. Выдвинута гипотеза, что амилоидогенез можно рассматривать в качестве фактора, регулирующего укладку хроматина.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение амилоидных свойств коротких изоформ белка человека PHC3.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Провести анализ способности коротких изоформ PHC3 человека к амилоидоподобной агрегации в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

2. Изучить амилоидные свойства коротких изоформ (5 и 6) белка PHC3 in vitro, с помощью бактериальной системы С-DAG

3. Провести анализ способности коротких изоформ PHC3 к амилоидоподобной агрегации в культурах клеток человека

4. Проанализировать возможность взаимодействия коротких изоформ PHC3 c полноразмерным белком PHC3 при сверхпродукции в клетках дрожжей и человека

5. Изучить влияние сверхпродукции короткой изоформы PHC3(5) на экспрессию генов в культуре клеток человека HEK293T.

Научная новизна

В данной работе были впервые продемонстрированы амилоидные свойства коротких изоформ (5 и 6) белка PHC3 человека in vitro и in vivo. Экспериментально подтверждены предсказания амилоидных свойств белков, сделанные с помощью биоинформатического алгоритма ArchCandy. Показана возможность взаимодействия коротких изоформ PHC3 (5 и 6) с полноразмерным функциональным белком. Получены данные о влиянии агрегации изоформ 5 и 6 белка PHC3 на экспрессию ряда генов в клетках человека HEK293T. Выдвинута гипотеза о том, что амилоидогенез белка PHC3 можно рассматривать в качестве фактора, регулирующего укладку хроматина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ амилоидных свойств белка PHC3 человека»

Значимость работы

В работе выявлены и охарактеризованы новые функциональные амилоидоподобные белки человека. Установлена связь амилоидогенеза с регуляцией укладки хроматина и экспрессией некоторых генов. Понимание механизмов регуляции этих процессов может открыть новые возможности для поиска терапевтических средств, направленных на улучшение качества жизни человека. Значимость работы определяется ролью амилоидов в развитии ряда неизлечимых заболеваний человека, оказывающих, в том числе, значительный экономический эффект на общество.

Личный вклад автора

Основные результаты, представленные в работе получены автором лично. Плазмиды, использованные в данной работе были получены автором, а также сотрудниками лаборатории Биологии амилоидов СПбГУ Зелинским Андреем Андреевичем и Куличихиным Константином Юрьевичем. Анализ амилоидных свойств белков PHC3(5) и PHC3(6) человека in vitro в

бактериальной системе C-DAG был проведен совместно со старшим научным сотрудником лаборатории Биологии амилоидов СПбГУ Куличихиным Константином Юрьевичем. Лентивирусные векторы, кодирующие последовательности PHC3(5)-EGFP и PHC3(6)-EGFP, были получены совместно с м.н.с. лаборатории клеточной биотехнологии ИНЦ РАН Хорольской Юлией Игоревной. Анализ дифференциальной экспрессии генов был проведен автором совместно с доцентом кафедры цитологии СПбГУ Зыкиным Павлом Александровичем на базе РЦ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ. Биоинформатический анализ результатов был проведен П.А. Зыкиным.

Апробация результатов

Результаты работы были представлены на международных конференциях Института Трансляционной Биомедицины СПбГУ («Актуальные проблемы Трансляционной биомедицины» 2018, 2019 и 2022 г.), VII съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГиС-2019), международной конференции «Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий» 2019 года, на VII Молодежной школе-конференции по молекулярной и клеточной биологии 2020 года, а также на международной конференции FEBS 2021.

Диссертация апробирована на семинарах Научной лаборатории биологии амилоидов и отчетных докладах на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ.

Список публикаций по теме работы

Статьи:

1) Gerasimova, E. M., Fedotov, S. A., Kachkin, D. V., Vashukova, E. S., Glotov, A. S., Chernoff, Y. O., and Rubel, A. A. (2019). Protein Misfolding during Pregnancy: New Approaches to Preeclampsia Diagnostics. International Journal of Molecular Sciences, 20(24).

2) Sopova, J. V., Koshel, E. I., Belashova, T. A., Zadorsky, S. P., Sergeeva, A. V., Siniukova, V. A., Shenfeld, A. A., Velizhanina, M. E., Volkov, K. V., Nizhnikov, A. A., Kachkin, D. V., Gaginskaya, E. R., and Galkin, A. P. (2019). RNA-binding protein FXR1 is presented in rat brain in amyloid form. Scientific Reports, 9(1).

3) Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., and Rubel, A. A. (2020). An Efficient Method for Isolation of Plasmid DNA for Transfection of Mammalian Cell Cultures. Methods and Protocols, 3(4), 69.

4) Khorolskaya, J. I., Perepletchikova D.A., Kachkin D.V., Zhurenkov K.E., Alexander-Sinkler E.I., Ivanova J.S., Mikhailova N.A., Blinova M.I. (2021). Derivation and Characterization of

EGFP-Labeled Rabbit Limbal Mesenchymal Stem Cells and Their Potential for Research in Regenerative Ophthalmology. Biomedicines 9, 1134.

Тезисы:

1) Kachkin, D.V., Aksenova, A.Y., Rubel, A.A., Chernoff, Y.O. (2019). Study of Amyloidogenic Properties of Human Proteins PHC3 and RAD51. Genes and Cells

2) Качкин, Д.В., Аксенова, А.Ю., Герасимова Е.М., Рубель, А.А., Чернов, Ю.О. (2019). Изучение амилоидных свойств белков PHC3 и RAD51 in vitro и in vivo. VII съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ.

3) Чернов Ю.О., Рубель А.А., Джей-Гарсия Л.М., Декнер З., Гризель А.В., Зелинский А.А., Зобнина А.Е., Качкин Д.В., Куличихин К.Ю., Маликова О.А., Чернова Т.А. (2020). Роль агрегации белков в наследственности, клеточной памяти и заболеваниях. Гены и Клетки

4) Лашкул В.В., Зобнина А.Е., Аксенова А.Ю., Качкин Д.В., Зелинский А.А., Маликова О.А., Рубель А.А., Чернов Ю.О. (2020). Оценка способности рибосомальных белков к агрегации. Гены и Клетки

5) Качкин Д.В., Зелинский А.А., Хорольская Ю.И., Куличихин К.Ю., Рубель А.А., Чернов Ю.О. (2020). Изучение агрегации белка PHC3 в клетках микроорганизмов и человека. Гены и Клетки

Финансовая поддержка работы

Основная часть работы выполнена в рамках гранта РФФИ №19-34-90153 «Изучение роли белка PHC3 в регуляции транскрипции в клетках человека». Кроме того, часть работы была выполнена в рамках НИР за счёт средств СПбГУ ID 93025827.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 263 ссылки на первоисточники. Работа изложена на 113 страницах, содержит 24 рисунка и 6 таблиц. Приложение к работе содержит 6 рисунков и 1 таблицу.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Амилоиды - определение, структура, свойства

Амилоиды - это высокоупорядоченные белковые полимеры фибриллярной природы, обладающие межмолекулярной кросс-ß структурой и способные катализировать присоединение к себе мономерных молекул того же белка с изменением их нормальной конформации.

Основной структурой всех амилоидов является фибрилла, которая состоит из скрученных между собой протофиламентов (Benson et al., 2020). Каждый протофиламент является четвертичной структурой белка, обогащенной ß-слоями, расположенными перпендикулярно оси роста фибриллы, а между собой мономеры белков связаны водородными связями, расположенными параллельно росту фибриллы (цит. по. Chatani et al., 2021) (Рисунок 1). В ряде случаев в образовании фибрилл участвует не весь белок целиком, а лишь его часть -короткий пептид (цит. по. Ventura et al., 2004; Maurer-Stroh et al., 2010).

Рисунок 1. Схематическая иллюстрация структуры амилоидной фибриллы.

Амилоидные фибриллы имеют неразветвленную структуру и состоят из одного или нескольких протофиламентов шириной в несколько нанометров и длиной около микрометра, объединенных в пучки. Каждый протофиламент имеет кросс Р-структуру, в которой Р-слои уложены перпендикулярно оси фибриллы (по: Chatani et а1., 2021 с модификациями).

Амилоидные фибриллы могут образовываться как in vivo, так и in vitro (Benson et al., 2020), при этом они обладают характерными особенностями позволяющими отличить их как от

упорядоченных белковых фибрилл неамилоидного типа, так и аморфных агрегатов. Такими особенностями помимо характерной кросса-структуры, выявляемой при рентгеновской дифракции (цит. по: Morris and Serpell, 2012; Vaquer-Alicea and Diamond, 2019), являются: способность связываться с красителями Тиофлавином (T и S) (цит. по: Maskevich et al., 2007) и Конго красным (Frieg et al., 2020), устойчивость к действию ионных детергентов, например, додецилсульфату натрия (SDS) и лаурилсаркозинату натрия (SLS), а также некоторым протеазам (Kushnirov et al., 2006). Окрашивание амилоидных фибрилл Конго красным вызывает двойное лучепреломление в поляризованном свете (цит. по: Howie, 2019; Yakupova et al., 2019).

Формирование амилоидных фибрилл можно отнести к распространенным в биологии процессам элонгации-нуклеации (Chiti and Dobson, 2006). Скорость формирования амилоидных фибрилл напрямую зависит от концентрации белка и может быть увеличена добавлением предварительно агрегированных полипептидов того же белка, которые действуют как затравки, способствуя переходу мономеров в агрегированное состояние (Invernizzi et al., 2012). Белки, способные к образованию амилоидов называются амилоидогенными (Giasson et al., 2003).

Предполагается, что неправильная укладка белка, обладающего потенциалом к формированию амилоидной структуры, может приводить к появлению небольших ядер полимеризации. В дальнейшем ядра полимеризации могут связываться с мономерами того же белка и инициировать их присоединение к себе - нуклеированная полимеризация (nucleated polymerization). Процесс идёт до тех пор, пока в растворе не закончатся мономеры способные присоединяться к существующим фибриллам или пока не произойдет насыщение фибрилл и они станут неспособны присоединять к себе новые мономеры (цит. по: Rubel et al., 2020). Таким образом, особенностью амилоидов является их способность передавать информацию о своей структуре другим белкам. Как правило, амилоидные агрегаты могут инициировать агрегацию мономеров того же белка, из которых состоят сами, или способствовать присоединению мономеров к уже существующему агрегату. Однако иногда может происходить, так называемый, «кросс-сидинг» - процесс, при котором в агрегацию вовлекаются мономеры других белков. Это относительно редкое явление, но оно может играть важную роль в развитии тяжелых заболеваний ассоциированных с накоплением амилоидов в тканях - амилоидозов (цит. по: Chernova et al., 2019).

1.2 История открытия и изучения амилоидов

Первые описания органов, пораженных амилоидозом, появились, задолго до появления термина - «амилоид» и выяснения этиологии этих заболеваний. Судя по всему, в 1639 году медиком Николасом Фонтейном был описан первый случай поражения селезенки амилодами в

книге «Responsionum and Curationum Medicalium» (Fonteyn, 1639; цит. по: Yakupova et al., 2021). При вскрытии Н. Фонтейн обнаружил сильно увеличенный орган, содержащий белые включения. Немногим позднее, Томас Бартолин сообщил о вскрытии женщины с видоизмененной селезенкой, с трудом поддающейся разрезанию (Bartholin, 1641; цит. по: Nizhnikov et al., 2015).

Термин «амилоид» был привнесен в научную литературу немецким ботаником Маттиасом Шлейденом в 1849 году в его книге «Ботаника как индуктивная наука» («Botany as an Inductive Science») (Lankester and Schleiden, 1849). В ней М. Шлейден использовал термин «амилоид» в отношении телец крахмала, присутствующих в клетках растений и окрашивающихся йодом. Само слово происходит от латинского amylum - крахмал (см. Nizhnikov et al., 2015).

Впервые термин «амилоид» в медицинской литературе использовал немецкий патолог Р. Вирхов применительно к небольшим округлым отложениям в головном и спинном мозге, которые, как и крахмал, окрашивались в синий цвет раствором йода (Virchow, 1854; цит. по: Tanskanen, 2013). В своих трудах Р. Вирхов называл их «corpora amylacea» (лат. -крахмалоподобные тельца) и в дальнейшем использовал этот термин, ошибочно полагая, что эти включения имеют в своем составе крахмал. Несмотря на то, что Р. Вирхов ошибся относительно природы амилоидных включений в тканях млекопитающих, в ряде случаев амилоиды действительно могут содержать в своем составе протеогликаны и глюкозамингликаны (Niewold et al., 1991; Snow et al., 1987; 1994; цит. по: Tanskanen, 2013), что обуславливает их способность к окрашиванию йодом.

Впервые предположение, о том, что амилоид представляет собой измененную белковую материю было высказано в 1859 году Чарльзом Шмидтом (C. Schmidt, 1859; цит. по: Yakupova et al., 2021). Предположение основывалось на данных о повышенном содержании азота в органах, пораженных амилоидами.

В 1907 году немецкий психиатр и невролог Алоиз Альцгеймер впервые описал сенильные бляшки и нейрофибриллярные узелки у пациентки с деменцией (см. Stelzmann et al., 1995). Сегодня известно, что А. Альцгеймер описал межклеточное скопление амилоида бета и внутриклеточное скопление белка тау. Статья с описанием этого случая стала точкой отсчета для огромного количества работ и исследований нейродегенеративных расстройств у людей старшего возраста.

В 1922 году Ганс-Герман Беннхольд обнаружил связывание с амилоидами анилинового красителя - Конго красного (Bennhold, 1922; цит. по: Yakupova et al., 2019). Впервые свечение окрашенных Конго красным образцов в поляризованном свете было продемонстрировано в 1927 году Полом Диври и Марселем Флоркиным (цит. по: Yakupova et al., 2019). В тканях пациентов, содержащих амилоидные отложения, в поляризованном свете наблюдалось двойное лучепреломление (Рисунок 2). В настоящее время окрашивание Конго красным является одним

из основных способов доказательства амилоидной природы исследуемых белковых отложений в тканях.

. - г-

V J

\ • 4 Jí

А Б

Рисунок 2. Окраска Конго красным сердечной ткани пациента с системным амилоидозом. Анализ в поляризованном свете. Красный цвет (A) амилоида постепенно (Б, В) переходит в зеленый (Г) при изменении угла поляризации света. Оригинальное увеличение x400 (Tanskanen, 2013).

В конце 50х годов прошлого века были обнаружены альтернативные методы окраски амилоидных отложений флуоресцентными красителями - Тиофлавинами Т и S (Vassar and Culling, 1959; Hobbs and Morgan, 1963; Naiki et al., 1989). Тиофлавин Т при связывании с агрегатами изменяет свою конфигурацию, за счет чего начинает флуоресцировать в зеленом спектре. Тиофлавин S используется при окрашивании тканей, в которых прочно связывается с амилоидными структурами. На сегодняшний день известны и другие амилоид-специфичные красители (например, ANCA и Amylo-Glo) (Chang et al., 2011; Schmued et al., 2012).

В конце 50х годов произошел существенный прогресс в изучении амилоидов благодаря усилиям А. Коэна и Э. Колкинса, которые смогли сначала визуализировать амилоидные фибриллы с помощью электронной микроскопии (Cohen and Calkins, 1959), а позднее опубликовать первый протокол выделения амилоидных фибрилл из тканей и органов (см. Рисунок 3) (Cohen and Calkins, 1964). При исследовании различных пораженных амилоидами тканей авторы показали, что все включения образованы фибриллярными структурами.

1' 1 j >/i *', J i* jyw I ТУуП* 'iiiВ4fv ' я & Ь /J • 'fitH f ' I

А Б

щЩй ; 'А 1 ' 1 д

В I

Рисунок 3. Электронная микроскопия амилоидных фибрилл, выделенных из печени.

А - выделенные амилоидные фибриллы, инкубированные с буфером без коллагеназы 48 часов; Б - амилоидные фибриллы, инкубированные с буфером с коллагеназой 12 часов; В - амилоидные фибриллы, инкубированные с буфером с коллагеназой 24 часа; Г - амилоидные фибриллы, инкубированные с буфером с коллагеназой 48 часов (Cohen and Caulkins, 1964).

Появление методов выделения и очистки амилоидных фибрилл из тканей в дальнейшем позволило проанализировать фибриллы с помощью метода рентгеноструктурного анализа, в результате чего было установлено, что амилоидные фибриллы представляют из себя высокоупорядоченные белковые полимеры, обладающие межмолекулярной кросс-ß структурой (Рисунок 4). В природе вторичная структура подавляющего большинства белков представлена как а-спиралями, так и ß-листами в составе вторичной структуры, тогда как в случае амилоидных белков количество ß-листов значительно возрастало по сравнению с нативной конформацией того же белка (Eanes and Glenner, 1968).

Рисунок 4. Кросс ß-архитектура и типичная дифракционная картина амилоидной фибриллы. А - ß-слои уложены перпендикулярно оси фибриллы (стрелка) и отстают друг от друга на 4, 7-8 Á. Б - Поперечное сечение фибриллы. ß-слои идут параллельно оси фибриллы и расположены на расстоянии 10-12 Á. В - Взаимное расположение мономеров внутри фибриллярной структуры определяет типичную дифракционную картину фибриллы, где повторяющееся расположение мономеров вдоль оси фибриллы (по стрелке) наблюдается на меридиане, а повторяющееся расстояние перпендикулярное оси волокна наблюдается на экваторе. Г - Дифракционная картина типичных, единообразно сориентированных амилоидных фибрилл (по: Morris and Serpell, 2012 с модификациями).

Благодаря методу криоэлектронной микроскопии была подтверждена протофиламентная структура фибрилл, а с помощью твердофазного ядерного магнитного резонанса были построены детальные модели для нескольких амилоидных белков (Jiménez et al., 2002; Petkova et al., 2006; Mizuno et al., 2011; Kollmer et al., 2019).

В 1980-х годах развитие получили методы иммунодетекции и появились первые антитела к амилоидным белкам (Linke, 1982). В начале 21 века появились первые антитела к амилоидным структурам (Hrncic et al., 2000; O'Nuallain and Wetzel, 2002; Kayed et al., 2007), а со временем появились и аптамеры для детекции амилоидов (Ylera et al., 2002; Bunka et al., 2007; Mitkevich et al., 2012).

Особый интерес представляет изучение амилоидов с точки зрения их систематизации и поиска новых белков, способных к образованию функционально значимых амилоидов. Свой вклад в формирование фундамента для развития системной биологии амилоидов внесли как теоретические, так и экспериментальные исследования этих белков. Важной проблемой остается отсутствие понимания того, какие особенности аминокислотных последовательностей белка необходимы для формирования амилоидов. На сегодняшний день с помощью

биоинформатических алгоритмов можно выявить короткие аминокислотные последовательности способные к формированию амилоидов. Тем не менее, их присутствие в составе полноразмерных белков не всегда приводит к агрегации in vivo последних. Таким образом, на сегодняшний день важной задачей является не только понимание того, какие последовательности способствуют образованию амилоидных структур, но и поиск последовательностей, препятствующих амилоидогенезу. Важным условием для поиска таких последовательностей является накопление и анализ большого массива экспериментальных данных по белкам, способным формировать амилоиды in vivo.

1.3 Распространенность амилоидов

На протяжении длительного времени термин «амилоид» ассоциировался исключительно с патологическими заболеваниями человека и животных, называемых амилоидозами. Однако эта парадигма изменилась на границе 20 и 21 веков, в связи с открытием амилоидов, выполняющих различные биологические функции. Такие амилоиды назвали функциональными (см. Rubel et al., 2020).

Функциональные амилоиды обнаружены у различных организмов - архей, бактерий, дрожжей, растений, беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе у млекопитающих, включая человека. С каждым годом количество выявленных новых патогенных и функциональных амилоидов увеличивается (см. Matiiv et al., 2020; Rubel et al., 2020; Sergeeva and Galkin, 2020).

1.3.1 Патогенные амилоиды и амилоидозы млекопитающих

На сегодняшний день известно 37 амилоидогенных белков, ассоциированных с развитием более 70 амилоидозов человека и животных (Chiti and Dobson, 2017; Benson et al., 2020). Исторически сложилось, что к амилоидозам относят только заболевания, связанные с отложением внеклеточных амилоидных депозитов. При этом заболевания, связанные с внутриклеточными отложениями амилоидов, называть амилоидозами не принято. В настоящее время известно, по меньшей мере, 9 белков с внутриклеточной локализацией, обладающих амилоидными свойствами, два из этих белков (a-synuclein и Tau) могут формировать как внутри, так и экстраклеточные агрегаты (Benson et al., 2020), в этом случае отнесение заболевания к амилоидозу зависит от локализации амилоидных отложений.

Заболевания, связанные с формированием внеклеточных амилоидов, делят на две группы: системные, в случае если амилоидные фибриллы свободно циркулируют вместе с током крови и

накапливаются в различных органах и тканях, и локализованные, при которых амилоидные бляшки накапливаются в органах или тканях (Benson et al., 2020).

Самым широко распространенным системным амилоидозом является AL-амилоидоз, связанный с отложением в сердце, почках, печени и других органах легких цепей иммуноглобулинов каппа и лямбда типов (LC-IgK и LC-IgL) (цит. по. Dispenzieri et al., 2G12). Образование в организме избытка LC-IgK или LC-IgL связано с их повышенной продукцией плазматическими клетками. В некоторых случаях амилоидогенность этих молекул обусловлена мутациями в клоне В-клеточной линии, которые вырабатывают молекулы иммуноглобулинов легких цепей (цит. по. Dispenzieri et al., 2012). Тяжелые цепи иммуноглобулинов также могут формировать амилоидные фибриллы и приводить к развитию системного амилоидоза (Picken, 2GG6).

AA амилоидоз - распространенный тип системного амилоидоза, его развитие связано с накоплением агрегатов сывороточного амилоидного белка A (SAA), который продуцируется в ответ на воспалительный процесс, развивающийся при ревматоидном артрите, болезни Крона, хроническом остеомиелите, бронхоэктатической болезни (цит. по. Bunker and Gorevic, 2G12).

Часто встречающимися системными амилоидозами являются ATTR-амилоидоз ( цит. по. Benson, 2GG3; Sekijima, 2G15), вызванный накоплением белка транстиретина (TTR), в первую очередь, в сердце, а также заболевание, которое развивается у больных, проходящих длительную процедуру гемодиализа в связи с отложением ß2-микроглобулина - ß2M амилоидоз (цит. по. Zingraff et al., 199G; Tsai et al., 2G17).

Наиболее изученными локализованными амилоидозами являются диабет II типа, болезнь Паркинсона (вызывается накоплением агрегатов а-синуклеина) (цит. по. Olanow and McNaught, 2G11), фронтально-темпоральная деменция, одним из основных агрегирующих белков при которой является TDP-43 (Sieben et al., 2G12), боковой амиотрофический склероз, решающую роль в развитии которого играют супероксид дисмутаза SOD1 и белок FUS (цит. по. Münch et al., 2G11; McAlary et al., 2G2G;), и болезнь Aльцгеймера (BA).

Диабет II типа является наиболее распространенным амилоидным заболеванием, им болеет более 400 млн человек в мире (Khan et al., 2G2G). Развитие данного заболевания связывают с агрегацией белка hIAPP (Amylin) в островках Лангерганса поджелудочной железы, что приводит к гибели ß-клеток и недостатку инсулина (цит. по. Roham et al., 2022).

Болезнь Aльцгеймера - одна из наиболее распространённых форм деменции, возникающая, как правило, у людей старшего возраста и характеризующаяся необратимым ухудшением когнитивных и физических функций. Ключевым фактором развития БA является патологическое накопление и агрегация в головном мозге амилоидного пептида бета (Aß) и гиперфосфорилированного белка Tau, приводящие к дисфункции синапсов и гибели нейронов.

Согласно данным Всемирной Ассоциации Болезни Альцгеймера (ADI - Alzheimer's Disease International) в мире от этого заболевания страдает порядка 50 миллионов человек, а по прогнозам на 2050 год это число может превысить 150 миллионов (Javaid et al., 2021; Alzheimer's Association, 2022).

Важный вклад в развитие болезни Альцгеймера вносит амилоидогенный белок S100A9. Считается, что при воспалительных процессах, вызванных травмами головного мозга, белок S100A9 переходит в амилоидную форму и может приводить к БА в результате агрегации Aß в ходе амилоидного каскада (цит. по. Wang et al., 2018). Данный белок также способен к ко-агрегации с альфа-синуклеином и обнаруживается в сенильных бляшках при болезни Паркинсона (цит. по. Horvath et al., 2018).

Недавние исследования также демонстрируют, что амилоидная агрегация белков -характерное явление при преэклампсии (наиболее частое осложнение при беременности в мире) (Duley, 2009; Buhimschi et al., 2014; цит. по. Gerasimova et al., 2019). При преэклампсии в почках и моче больных были выявлены агрегаты Аß, легкие цепи иммуноглобулинов (X, к) и TTR, что делает амилоидогенез одним из биомаркеров этого заболевания (Gerasimova et al., 2019). От преэклампсии страдают от 3 до 8% всех беременных женщин и это заболевание остается одной из основных причин неонатальной и материнской заболеваемости и смертности (Ma'ayeh and Costantine, 2020).

В отдельную группу локализованных амилоидозов выделяют прионные болезни (или инфекционные амилоидозы) такие как: куру, фатальная семейная бессонница, болезнь Крейцфельда-Якоба и некоторые другие, все эти заболевания связаны с агрегацией белка PrPSc. На данный момент это единственные амилоидозы млекопитающих, для которых полностью доказаны инфекционные свойства (Prusiner, 1982, 1998). Помимо способности передаваться между особями одного вида прионный белок PrPSc в ряде случаев может преодолевать межвидовой барьер и передаваться, как пример, от коровы человеку (Prusiner et al., 1998).

Появляется все больше данных о связи феномена амилоидной агрегации с развитием раковых заболеваний. Такие амилоидогенные белки как p53 (Ghosh et al., 2017), S100A9 (Markowitz and Carson, 2013; Lv et al., 2020) , SAA (Fourie et al., 2021), IAPP (Stridsberg et al., 1995), Tau (Brat et al., 2001), ODAM (Kestler et al., 2008; Murphy et al., 2008) ассоциированы с различными типами рака. Кроме того, множественная миелома имеет общие клинические признаки с AL амилоидозом: большое количество опухолевых плазматических клеток и сверхпродукция иммуноглобулинов (Bahlis and Lazarus, 2006). В ряде случаев оба этих заболевания диагностируются вместе, в связи с чем предполагается, что развитие множественной миеломы может со временем приводить к AL-амилоидозу (Lee et al., 2021).

Несмотря на многолетние исследования амилоидных заболеваний, большинство амилоидозов по-прежнему являются неизлечимыми, многие смертельны и приводят к колоссальным экономическим нагрузкам.

1.3.2 Функциональные амилоиды

К функциональным амилоидам относят белки способные выполнять биологические функции в живых организмах в амилоидной конформации. В формировании внеклеточных фибрилл и биопленок у бактерий участвуют белки курлины (Curli - Csg белки) (Van Gerven et al., 2015). У млекопитающих белок Pmel17 выступает в качестве матрицы при полимеризации меланина (Fowler et al., 2006; Watt et al., 2009; Furukawa and Nukina, 2013). Показано, что у крыс R. norvégiens белок FXR1 защищает мРНК от деградации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов (Sopova et al., 2019). Белок моллюска Aplisya ealiforniea CPEB и его ортологи Orb2 у дрозофилы (Fioriti et al., 2015) и крысы (Si et al., 2003) формируют амилоидоподобные олигомеры, вовлечённые в формирование долговременной памяти. Более 30 пептидных гормонов или их предшественников запасаются в секреторных гранулах в форме амилоидов (Maji et al., 2009). Белок вицилин в семенах растений гороха Pisum sativum в амилоидной форме выполняет функцию запасания питательных веществ растением с целью их сохранения при длительном обезвоживании и неблагоприятных условиях (Antonets et al., 2020). У низших эукариот, в частности дрожжей Saeeharomyees eerevisiae, обнаружен целый ряд амилоидных белков, (цит. по. Liebman and Chernoff, 2012; Cascarina and Ross, 2014), среди которых многие являются регуляторными и структурными элементами клетки (Chernova et al., 2014), выполняющими функции терминации трансляции (Cox, 1965), регуляции усвоения азота (Wickner 1994), ремоделирования хроматина (Du et al., 2008) или являющиеся нуклеопоринами (Halfmann et al., 2012).

У дрожжей-сахаромицетов на сегодняшний день также идентифицировано более 10 амилоидных белков (Таблица 1), которые передаются при цитодукции (т.е. являются инфекционными). Данные инфекционные амилоиды называют дрожжевыми прионами. Конформационное состояние дрожжевых прионов влияет на проявление различных фенотипически детектируемых признаков (Liebman and Chernoff, 2012), что делает их удобной моделью для изучения общих закономерностей амилоидогенеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Качкин Даниил Валерьевич, 2023 год

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ahmed, A. B., Znassi, N., Château, M.-T., Kajava, A. V. A structure-based approach to predict predisposition to amyloidosis. Alzheimer's & Dementia 11, 681-690 (2015).

2. Allen, K. D. et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics 169, 1227-1242 (2005).

3. Almeida, Z. L. & Brito, R. M. M. Structure and Aggregation Mechanisms in Amyloids. Molecules 25, E1195 (2020).

4. Alzheimer's Association. Alzheimer's Facts and Figures. 120 alz.org (2022).

5. Andrews. FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data.

(2010).

6. Antonets, K. S. et al. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation. PLoS Biol 18, e3000564 (2020).

7. Aranda, S., Mas, G. & Di Croce, L. Regulation of gene transcription by Polycomb proteins. Science Advances 1, (2015).

8. Bahlis, N. J. & Lazarus, H. M. Multiple myeloma-associated AL amyloidosis: is a distinctive therapeutic approach warranted? Bone Marrow Transplant 38, 7-15 (2006).

9. Bartholin, T. Historiarum Anatomicarum Rariorum. (Apud Johannem Henrici,

1641).

10. Batlle, C., de Groot, N. S., Iglesias, V., Navarro, S. & Ventura, S. Characterization of Soft Amyloid Cores in Human Prion-Like Proteins. Sci Rep 7, 12134 (2017).

11. Bennhold, H. Specific staining of amyloid by Congo red. MuEnchener Medizinische Wochenschrift 1537-1538 (1922).

12. Benson, M. D. The hereditary amyloidoses. Best Pract Res Clin Rheumatol 17, 909-927 (2003).

13. Benson, M. D. et al. Amyloid nomenclature 2020: update and recommendations by the International Society of Amyloidosis (ISA) nomenclature committee. Amyloid 27, 217-222 (2020).

14. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. JBacteriol 62, 293-300 (1951).

15. Biancalana, M. & Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta 1804, 1405-1412 (2010).

16. Bonev, B. et al. Multiscale 3D Genome Rewiring during Mouse Neural Development. Cell 171, 557-572.e24 (2017).

17. Bononi, P. L., Martinez, A. J., Nelson, R. B. & Amico, J. A. Amyloid deposits in a prolactin-producing pituitary adenoma. J Endocrinol Invest 16, 339-343 (1993).

18. Brachmann, A., Baxa, U. & Wickner, R. B. Prion generation in vitro: amyloid of Ure2p is infectious. EMBO J24, 3082-3092 (2005).

19. Bracken, A. P., Dietrich, N., Pasini, D., Hansen, K. H. & Helin, K. Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes Dev. 20, 1123-1136 (2006).

20. Bradley, M. E., Edskes, H. K., Hong, J. Y., Wickner, R. B. & Liebman, S. W. Interactions among prions and prion 'strains' in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 99 Suppl 4, 16392-16399 (2002).

21. Bradley, M. E. & Liebman, S. W. The Sup35 domains required for maintenance of weak, strong or undifferentiated yeast [PSI+] prions: Defining a prion domain. Molecular Microbiology 51, 1649-1659 (2004).

22. Brat, D. J., Gearing, M., Goldthwaite, P. T., Wainer, B. H. & Burger, P. C. Tau-associated neuropathology in ganglion cell tumours increases with patient age but appears unrelated to ApoE genotype. Neuropathol Appl Neurobiol 27, 197-205 (2001).

23. Bryan, A. W., Menke, M., Cowen, L. J., Lindquist, S. L. & Berger, B. BETASCAN: Probable P-amyloids Identified by Pairwise Probabilistic Analysis. PLoS Comput Biol 5, e1000333 (2009).

24. Bryan, A. W. et al. STITCHER: Dynamic assembly of likely amyloid and prion P-structures from secondary structure predictions. Proteins 80, 410-420 (2012).

25. Bunka, D. H. J. et al. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J Biol Chem 282, 34500-34509 (2007).

26. Bunker, D. & Gorevic, P. AA Amyloidosis: Mount Sinai Experience, 1997-2012. Mt Sinai J Med 79, 749-756 (2012).

27. Burdukiewicz, M. et al. Amyloidogenic motifs revealed by n-gram analysis. Sci Rep 7, 12961 (2017).

28. Caine, J. et al. Alzheimer's Ap fused to green fluorescent protein induces growth stress and a heat shock response. FEMS Yeast Research 7, 1230-1236 (2007).

29. Campeau, E. et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS ONE 4, e6529 (2009).

30. Cascarina, S. M. & Ross, E. D. Yeast prions and human prion-like proteins: sequence features and prediction methods. CellMol Life Sci 71, 2047-2063 (2014).

31. Chang, W. M. et al. ANCA: A Family of Fluorescent Probes that Bind and Stain Amyloid Plaques in Human Tissue. ACS Chem. Neurosci. 2, 249-255 (2011).

32. Chatani, E., Yuzu, K., Ohhashi, Y. & Goto, Y. Current Understanding of the Structure, Stability and Dynamic Properties of Amyloid Fibrils. Int J Mol Sci 22, 4349 (2021).

33. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. & Gu, J. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics 34, i884-i890 (2018).

34. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L. & Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet 24, 268-270 (1993).

35. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G. & Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science 268, 880-884 (1995).

36. Chernoff, Y. O. et al. Application of yeast to studying amyloid and prion diseases. Advances in Genetics 105, 293-380 (2020).

37. Chernova, T. A., Wilkinson, K. D. & Chernoff, Y. O. Physiological and environmental control of yeast prions. FEMS Microbiol Rev 38, 326-344 (2014).

38. Chernova, T. A., Wilkinson, K. D. & Chernoff, Y. O. Prions, Chaperones, and Proteostasis in Yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol 9, a023663 (2017).

39. Chirinskaite, A. V. et al. STXBP1 forms amyloid-like aggregates in rat brain and demonstrates amyloid properties in bacterial expression system. Prion 15, 29-36 (2021).

40. Chiti, F. et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3590-3594 (1999).

41. Chiti, F. & Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu Rev Biochem 75, 333-366 (2006).

42. Chiti, F. & Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annu. Rev. Biochem. 86, 27-68 (2017).

43. Cohen, A. S. & Calkins, E. Electron microscopic observations on a fibrous component in amyloid of diverse origins. Nature 183, 1202-1203 (1959).

44. Cohen, A. S. & Calkins, E. The Isolation of Amyloid Fibrils And A Study Of The Effect Of Collagenase And Hyaluronidase. J Cell Biol 21, 481-486 (1964).

45. Cohen, I. et al. PRC1 Fine-tunes Gene Repression and Activation to Safeguard Skin Development and Stem Cell Specification. Cell Stem Cell 22, 726-739.e7 (2018).

46. Conchillo-Solé, O. et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of 'hot spots' of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics 8, 65 (2007).

47. Cox, B. S. A cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast. Heredity 20, 505-521 (1965).

48. Cox, B. Cytoplasmic inheritance. Prion-like factors in yeast. Curr Biol 4, 744-748

(1994).

49. Crea, F. et al. Mutational analysis of Polycomb genes in solid tumours identifies PHC3 amplification as a possible cancer-driving genetic alteration. Br J Cancer 109, 1699-1702 (2013).

50. Creppe, C., Palau, A., Malinverni, R., Valero, V. & Buschbeck, M. A Cbx8-containing polycomb complex facilitates the transition to gene activation during ES cell differentiation. PLoS Genet 10, e1004851 (2014).

51. Danilov, L. G. et al. The Human NUP58 Nucleoporin Can Form Amyloids In Vitro and In Vivo. Biomedicines 9, 1451 (2021).

52. De Baets, G. et al. SNPeffect 4.0: on-line prediction of molecular and structural effects of protein-coding variants. Nucleic Acids Research 40, D935-D939 (2012).

53. de Groot, N. S., Castillo, V., Grana-Montes, R. & Ventura, S. AGGRESCAN: method, application, and perspectives for drug design. Methods MolBiol 819, 199-220 (2012).

54. de Napoles, M. et al. Polycomb Group Proteins Ring1A/B Link Ubiquitylation of Histone H2A to Heritable Gene Silencing and X Inactivation. Developmental Cell 7, 663-676 (2004).

55. Debyser, Z. Biosafety of lentiviral vectors. Curr Gene Ther 3, 517-525 (2003).

56. Dergalev, A. A., Alexandrov, A. I., Ivannikov, R. I., Ter-Avanesyan, M. D. & Kushnirov, V. V. Yeast Sup35 Prion Structure: Two Types, Four Parts, Many Variants. Int J Mol Sci 20, E2633 (2019).

57. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y. & Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell 106, 171-182 (2001).

58. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Zhou, P., Chernoff, Y. O. & Liebman, S. W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the [PSI+] prion in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 147, 507-519 (1997).

59. Derkatch, I. L. & Liebman, S. W. Prion-prion interactions. Prion 1, 161-169

(2007).

60. Deshpande, A. M. et al. PHC3, a component of the hPRC-H complex, associates with E2F6 during G0 and is lost in osteosarcoma tumors. Oncogene 26, 1714-1722 (2007).

61. Dispenzieri, A., Gertz, M. A. & Buadi, F. What do I need to know about immunoglobulin light chain (AL) amyloidosis? Blood Reviews 26, 137-154 (2012).

62. Dixon, J. R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376-380 (2012).

63. Du, Z., Park, K.-W., Yu, H., Fan, Q. & Li, L. Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Saccharomyces cerevisiae. Nat Genet 40, 460-465 (2008).

64. Duley, L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin Perinatol 33, 130-137 (2009).

65. Eagen, K. P., Aiden, E. L. & Kornberg, R. D. Polycomb-mediated chromatin loops revealed by a subkilobase-resolution chromatin interaction map. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, 8764-8769 (2017).

66. Eanes, E. D. & Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. J Histochem Cytochem 16, 673-677 (1968).

67. Emily, M., Talvas, A. & Delamarche, C. MetAmyl: A METa-Predictor for AMYLoid Proteins. PLoS ONE 8, e79722 (2013).

68. Endoh, M. et al. Histone H2A Mono-Ubiquitination Is a Crucial Step to Mediate PRC1-Dependent Repression of Developmental Genes to Maintain ES Cell Identity. PLoS Genet 8, e1002774 (2012).

69. Familia, C., Dennison, S. R., Quintas, A. & Phoenix, D. A. Prediction of Peptide and Protein Propensity for Amyloid Formation. PLoS ONE 10, e0134679 (2015).

70. Fernandez-Escamilla, A.-M., Rousseau, F., Schymkowitz, J. & Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nat Biotechnol 22, 1302-1306 (2004).

71. Fioriti, L. et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron 86, 1433-1448 (2015).

72. Fonteyn, N. Responsionum et Curationum Medicinalium. (Amstelodami, 1639).

73. Fowler, D. M. et al. Functional amyloid formation within mammalian tissue. PLoS Biol 4, e6 (2006).

74. Francis, N. J., Kingston, R. E. & Woodcock, C. L. Chromatin Compaction by a Polycomb Group Protein Complex. Science 306, 1574-1577 (2004).

75. Frangini, A. et al. The Aurora B Kinase and the Polycomb Protein Ring1B Combine to Regulate Active Promoters in Quiescent Lymphocytes. Molecular Cell 51, 647-661 (2013).

76. Frieg, B., Gremer, L., Heise, H., Willbold, D. & Gohlke, H. Binding modes of thioflavin T and Congo red to the fibril structure of amyloid-ß(1-42). Chem. Commun. 56, 75897592 (2020).

77. Frolova, L. et al. A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor. Nature 372, 701-703 (1994).

78. Frousios, K. K., Iconomidou, V. A., Karletidi, C.-M. & Hamodrakas, S. J. Amyloidogenic determinants are usually not buried. BMC Struct Biol 9, 44 (2009).

79. Furukawa, Y. & Nukina, N. Functional diversity of protein fibrillar aggregates from physiology to RNA granules to neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta 1832, 1271— 1278 (2013).

80. Gao, Z. etal. An AUTS2-Polycomb complex activates gene expression in the CNS. Nature 516, 349-354 (2014).

81. Gao, Z. et al. PCGF homologs, CBX proteins, and RYBP define functionally distinct PRC1 family complexes. Mol Cell 45, 344-356 (2012).

82. Garbuzynskiy, S. O., Lobanov, M. Yu. & Galzitskaya, O. V. FoldAmyloid: a method of prediction of amyloidogenic regions from protein sequence. Bioinformatics 26, 326332 (2010).

83. Gasior, P. & Kotulska, M. FISH Amyloid - a new method for finding amyloidogenic segments in proteins based on site specific co-occurence of aminoacids. BMC Bioinformatics 15, 54 (2014).

84. Geng, Z. & Gao, Z. Mammalian PRC1 Complexes: Compositional Complexity and Diverse Molecular Mechanisms. IJMS 21, 8594 (2020).

85. Gerasimova, E. M. et al. Protein Misfolding during Pregnancy: New Approaches to Preeclampsia Diagnostics. International journal of molecular sciences 20, (2019).

86. Giasson, B. I., Lee, V. M.-Y. & Trojanowski, J. Q. Interactions of amyloidogenic proteins. Neuromolecular Med 4, 49-58 (2003).

87. Glenner, G. G., Terry, W., Harada, M., Isersky, C. & Page, D. Amyloid fibril proteins: proof of homology with immunoglobulin light chains by sequence analyses. Science 172, 1150-1151 (1971).

88. Grau, D. J. et al. Compaction of chromatin by diverse Polycomb group proteins requires localized regions of high charge. Genes Dev. 25, 2210-2221 (2011).

89. Gunster, M. J. et al. Identification and characterization of interactions between the vertebrate polycomb-group protein BMI1 and human homologs of polyhomeotic. Mol Cell Biol 17, 2326-2335 (1997).

90. Haas, B. J. et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nat Protoc 8, 1494-1512 (2013).

91. Halfmann, R., Wright, J. R., Alberti, S., Lindquist, S. & Rexach, M. Prion formation by a yeast GLFG nucleoporin. Prion 6, 391-399 (2012).

92. Hernández-Muñoz, I., Taghavi, P., Kuijl, C., Neefjes, J. & van Lohuizen, M. Association of BMI1 with Polycomb Bodies Is Dynamic and Requires PRC2/EZH2 and the Maintenance DNA Methyltransferase DNMT1. Mol Cell Biol 25, 11047-11058 (2005).

93. Hobbs, J. R. & Morgan, A. D. FLUORESCENCE MICROSCOPY WITH THIOFLAVINE-T IN THE DIAGNOSIS OF AMYLOID. J Pathol Bacteriol 86, 437-442 (1963).

94. Horvath, I. et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with a-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. J Neuroinflammation 15, 172 (2018).

95. Howie, A. J. Origins of a pervasive, erroneous idea: The 'green birefringence' of Congo red-stained amyloid. Int J Exp Pathol 100, 208-221 (2019).

96. Hrncic, R. et al. Antibody-mediated resolution of light chain-associated amyloid deposits. Am J Pathol 157, 1239-1246 (2000).

97. Iadanza, M. G., Jackson, M. P., Hewitt, E. W., Ranson, N. A. & Radford, S. E. A new era for understanding amyloid structures and disease. Nat Rev Mol Cell Biol 19, 755-773 (2018).

98. Invernizzi, G., Papaleo, E., Sabate, R. & Ventura, S. Protein aggregation: Mechanisms and functional consequences. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 44, 1541-1554 (2012).

99. Isono, K. et al. SAM Domain Polymerization Links Subnuclear Clustering of PRC1 to Gene Silencing. Developmental Cell 26, 565-577 (2013).

100. Iwata, S. et al. Polycomb group molecule PHC3 regulates polycomb complex composition and prognosis of osteosarcoma. Cancer Sci 101, 1646-1652 (2010).

101. Javaid, S. F., Giebel, C., Khan, M. & Hashim, M. J. Epidemiology of Alzheimer's disease and other dementias: rising global burden and forecasted trends. F1000Research 2021 (2021)

102. Jiménez, J. L. et al. The protofilament structure of insulin amyloid fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9196-9201 (2002).

103. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S. & Rubel, A. A. An Efficient Method for Isolation of Plasmid DNA for Transfection of Mammalian Cell Cultures. MPs 3, 69 (2020).

104. Kayed, R. et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener 2, 18 (2007).

105. Kerman, A. et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a non-amyloid disease in which extensive misfolding of SOD1 is unique to the familial form. Acta Neuropathol 119, 335-344 (2010).

106. Kestler, D. P. et al. Expression of odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) in dental and other epithelial neoplasms. Mol Med 14, 318-326 (2008).

107. Khan, M. A. B. et al. Epidemiology of Type 2 Diabetes - Global Burden of Disease and Forecasted Trends. J Epidemiol Glob Health 10, 107-111 (2020).

108. Khorolskaya, J.I., Perepletchikova, D.A., Kachkin, D.V., Zhurenkov, K.E., Alexander-Sinkler, E.I., Ivanova, J.S., Mikhailova, N.A., and Blinova, M.I. (2021). Derivation and Characterization of EGFP-Labeled Rabbit Limbal Mesenchymal Stem Cells and Their Potential for Research in Regenerative Ophthalmology. Biomedicines 9, 1134.

109. Kim, C., Choi, J., Lee, S. J., Welsh, W. J. & Yoon, S. NetCSSP: web application for predicting chameleon sequences and amyloid fibril formation. Nucleic Acids Research 37, W469-W473 (2009).

110. Kim, C. A., Gingery, M., Pilpa, R. M. & Bowie, J. U. The SAM domain of polyhomeotic forms a helical polymer. Nat Struct Biol 9, 453-457 (2002).

111. Kim, C. A., Sawaya, M. R., Cascio, D., Kim, W. & Bowie, J. U. Structural Organization of a Sex-comb-on-midleg/Polyhomeotic Copolymer. Journal of Biological Chemistry 280, 27769-27775 (2005).

112. King, C.-Y. & Diaz-Avalos, R. Protein-only transmission of three yeast prion strains. Nature 428, 319-323 (2004).

113. Kochneva-Pervukhova, N. V. et al. Mechanism of inhibition of Psi+ prion determinant propagation by a mutation of the N-terminus of the yeast Sup35 protein. EMBO J 17, 5805-5810 (1998).

114. Kollmer, M. et al. Cryo-EM structure and polymorphism of Aß amyloid fibrils purified from Alzheimer's brain tissue. Nat Commun 10, 4760 (2019).

115. Kondo, T. et al. Polycomb Potentiates Meis2 Activation in Midbrain by Mediating Interaction of the Promoter with a Tissue-Specific Enhancer. Developmental Cell 28, 94-101 (2014).

116. Kondo, T., Ito, S. & Koseki, H. Polycomb in Transcriptional Phase Transition of Developmental Genes. Trends Biochem Sci 41, 9-19 (2016).

117. Kouza, M., Faraggi, E., Kolinski, A. & Kloczkowski, A. The GOR Method of Protein Secondary Structure Prediction and Its Application as a Protein Aggregation Prediction Tool. Methods Mol Biol 1484, 7-24 (2017).

118. Kryndushkin, D., Pripuzova, N., Burnett, B. G. & Shewmaker, F. Non-targeted identification of prions and amyloid-forming proteins from yeast and mammalian cells. J Biol Chem 288, 27100-27111 (2013).

119. Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D. & Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).

120. Kundu, S. et al. Polycomb Repressive Complex 1 Generates Discrete Compacted Domains that Change during Differentiation. Molecular Cell 65, 432-446.e5 (2017).

121. Kyle, R. A. Amyloidosis: a convoluted story: Historical Review. British Journal of Haematology 114, 529-538 (2001).

122. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970).

123. Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res 44, D862-868 (2016).

124. Lankester, E. & Schleiden, M. J. Principles of scientific botany, or, Botany as an inductive science by Dr. J.M. Schleiden... translated by Edwin Lankester... (Printed for Longman, Brown, Green, and Longmans, 1849).

125. Lavigne, M., Francis, N. J., King, I. F. G. & Kingston, R. E. Propagation of silencing; recruitment and repression of naive chromatin in trans by polycomb repressed chromatin. Mol Cell 13, 415-425 (2004).

126. Lee, I. H., Kim, C.-Y., Kang, S., Ahn, D. J. & Kim, M.-K. Multiple myeloma-associated light chain amyloidosis involving heart, kidneys, and peripheral nerves: A case report. Medicine: Case Reports and Study Protocols 2, e0128 (2021).

127. Lee, S., Choi, M. C., Al Adem, K., Lukman, S. & Kim, T.-Y. Aggregation and Cellular Toxicity of Pathogenic or Non-pathogenic Proteins. Sci Rep 10, 5120 (2020).

128. Levine, S. S. et al. The core of the polycomb repressive complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans. Mol Cell Biol 22, 6070-6078 (2002).

129. Lewis, E. B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276, 565-570 (1978).

130. Lieberman-Aiden, E. et al. Comprehensive Mapping of Long-Range Interactions Reveals Folding Principles of the Human Genome. Science 326, 289-293 (2009).

131. Liebman, S. W. & Chernoff, Y. O. Prions in yeast. Genetics 191, 1041-1072

(2012).

132. Linke, R. P. Identification of amyloid protein AA with a monoclonal antibody. Blut 45, 407-409 (1982).

133. Liu, J. J. & Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature 400, 573-576 (1999).

134. Liu, J.-J., Sondheimer, N. & Lindquist, S. L. Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion [PSI+]. Proc Natl Acad Sci US A 99 Suppl 4, 16446-16453 (2002).

135. Loubiere, V., Papadopoulos, G. L., Szabo, Q., Martinez, A.-M. & Cavalli, G. Widespread activation of developmental gene expression characterized by PRC1-dependent chromatin looping. Sci. Adv. 6, eaax4001 (2020).

136. Lund, P. M. & Cox, B. S. Reversion analysis of [ psi - ] mutations in Saccharomyces cerevisiae. Genet. Res. 37, 173-182 (1981).

137. Lv, Z., Li, W. & Wei, X. S100A9 promotes prostate cancer cell invasion by activating TLR4/NF-KB/integrin P1/FAK signaling. Onco Targets Ther 13, 6443-6452 (2020).

138. Ma'ayeh, M. & Costantine, M. M. Prevention of preeclampsia. Semin Fetal Neonatal Med 25, 101123 (2020).

139. Maji, S. K. et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science 325, 328-332 (2009).

140. Manni, M., Berkeley, M. R., Seppey, M., Simao, F. A. & Zdobnov, E. M. BUSCO Update: Novel and Streamlined Workflows along with Broader and Deeper Phylogenetic Coverage for Scoring of Eukaryotic, Prokaryotic, and Viral Genomes. Molecular Biology and Evolution 38, 4647-4654 (2021).

141. Markowitz, J. & Carson, W. E. Review of S100A9 biology and its role in cancer. Biochim Biophys Acta 1835, 100-109 (2013).

142. Maskevich, A. A. et al. Spectral properties of thioflavin T in solvents with different dielectric properties and in a fibril-incorporated form. JProteome Res 6, 1392-1401 (2007).

143. Matiiv, A. B. et al. Amyloid and Amyloid-Like Aggregates: Diversity and the Term Crisis. Biochemistry Moscow 85, 1011-1034 (2020).

144. Maurer-Stroh, S. et al. Exploring the sequence determinants of amyloid structure using position-specific scoring matrices. Nat Methods 7, 237-242 (2010).

145. McAlary, L. et al. Amyotrophic Lateral Sclerosis: Proteins, Proteostasis, Prions, and Promises. Front CellNeurosci 14, 581907 (2020).

146. McAlary, L., Plotkin, S. S., Yerbury, J. J. & Cashman, N. R. Corrigendum: Prion-Like Propagation of Protein Misfolding and Aggregation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front. Mol. Neurosci. 12, 311 (2020).

147. Mitkevich, O. V. et al. DNA aptamers detecting generic amyloid epitopes. Prion 6, 400-406 (2012).

148. Mizuno, N., Baxa, U. & Steven, A. C. Structural dependence of HET-s amyloid fibril infectivity assessed by cryoelectron microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 32523257 (2011).

149. Morris, K. L. & Serpell, L. C. X-Ray Fibre Diffraction Studies of Amyloid Fibrils. in Amyloid Proteins (eds. Sigurdsson, E. M., Calero, M. & Gasset, M.) vol. 849 121-135 (Humana Press, 2012).

150. Münch, C., O'Brien, J. & Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 3548-3553 (2011).

151. Munir, F., Gul, S., Asif, A. & Minhas, F.-A. A. MILAMP: Multiple Instance Prediction of Amyloid Proteins. IEEE/ACM Trans. Comput. Biol. and Bioinf. 18, 1142-1150 (2021).

152. Murakami, K. Conformation-specific antibodies to target amyloid ß oligomers and their application to immunotherapy for Alzheimer's disease. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 78, 1293-1305 (2014).

153. Murphy, C. L. et al. Odontogenic ameloblast-associated protein nature of the amyloid found in calcifying epithelial odontogenic tumors and unerupted tooth follicles. Amyloid 15, 89-95 (2008).

154. Naiki, H., Higuchi, K., Hosokawa, M. & Takeda, T. Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavine T. Analytical Biochemistry 177, 244249 (1989).

155. Newnam, G. P., Wegrzyn, R. D., Lindquist, S. L. & Chernoff, Y. O. Antagonistic interactions between yeast chaperones Hsp104 and Hsp70 in prion curing. Mol Cell Biol 19, 13251333 (1999).

156. Niewold, Th. A. et al. Characterization of proteoglycans and glycosaminoglycans in bovine renal AA-type amyloidosis. Virchows Archiv B Cell Pathol 60, 321-328 (1991).

157. Niu, M., Li, Y., Wang, C. & Han, K. RFAmyloid: A Web Server for Predicting Amyloid Proteins. IJMS 19, 2071 (2018).

158. Nizhnikov, A. A., Antonets, K. S. & Inge-Vechtomov, S. G. Amyloids: from Pathogenesis to Function. Biochemistry (Mosc) 80, 1127-1144 (2015).

159. Nizhnikov, A. A. et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE 9, e116003 (2014).

160. Nizhnikov, A. A. et al. Interaction of Prions Causes Heritable Traits in Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet 12 (2016).

161. O'Donnell, C. W. et al. A method for probing the mutational landscape of amyloid structure. Bioinformatics 27, i34-i42 (2011).

162. O'Nuallain, B. & Wetzel, R. Conformational Abs recognizing a generic amyloid fibril epitope. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1485-1490 (2002).

163. Ogawa, H., Ishiguro, K.-I., Gaubatz, S., Livingston, D. M. & Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science 296, 1132-1136 (2002).

164. Olanow, C. W. & McNaught, K. Parkinson's disease, proteins, and prions: milestones. Mov Disord 26, 1056-1071 (2011).

165. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A. & Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods 14, 417-419 (2017).

166. Petkova, A. T., Yau, W.-M. & Tycko, R. Experimental constraints on quaternary structure in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Biochemistry 45, 498-512 (2006).

167. Picken, M. M. Immunoglobulin Light and Heavy Chain Amyloidosis AL/AH: Renal Pathology and Differential Diagnosis. in Contributions to Nephrology (ed. Herrera, G. A.) vol. 153 135-155 (KARGER, 2006).

168. Picken, M. M. New insights into systemic amyloidosis: the importance of diagnosis of specific type. Curr Opin NephrolHypertens 16, 196-203 (2007).

169. Prabakaran, R., Goel, D., Kumar, S. & Gromiha, M. M. Aggregation prone regions in human proteome: Insights from large-scale data analyses: Aggregation Studies on Human Proteome. Proteins 85, 1099-1118 (2017).

170. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13363-13383 (1998).

171. Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B. & Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell 38, 127-134 (1984).

172. Pujols, J., Peña-Díaz, S. & Ventura, S. AGGRESCAN3D: Toward the Prediction of the Aggregation Propensities of Protein Structures. Methods Mol Biol 1762, 427-443 (2018).

173. Raimundo, A. F., Ferreira, S., Farrim, M. I., Santos, C. N. & Menezes, R. Heterologous Expression of Immature Forms of Human Islet Amyloid Polypeptide in Yeast Triggers Intracellular Aggregation and Cytotoxicity. Front. Microbiol. 11, 2035 (2020).

174. Reches, M. & Gazit, E. Casting metal nanowires within discrete self-assembled peptide nanotubes. Science 300, 625-627 (2003).

175. Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E. & Laor, D. Yeast Models for the Study of Amyloid-Associated Disorders and Development of Future Therapy. Front. Mol. Biosci. 6, 15 (2019).

176. Rhodes, J. D. P. et al. Cohesin Disrupts Polycomb-Dependent Chromosome Interactions in Embryonic Stem Cells. Cell Reports 30, 820-835.e10 (2020).

177. Riek, R. & Eisenberg, D. S. The activities of amyloids from a structural perspective. Nature 539, 227-235 (2016).

178. Robinson, A. K. et al. The growth-suppressive function of the polycomb group protein polyhomeotic is mediated by polymerization of its sterile alpha motif (SAM) domain. J Biol Chem 287, 8702-8713 (2012).

179. Robinson, A. K. et al. Human polyhomeotic homolog 3 (PHC3) sterile alpha motif (SAM) linker allows open-ended polymerization of PHC3 SAM. Biochemistry 51, 5379-5386 (2012).

180. Robinson, M. D., McCarthy, D. J. & Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140 (2010).

181. Roham, P. H., Save, S. N. & Sharma, S. Human islet amyloid polypeptide: A therapeutic target for the management of type 2 diabetes mellitus. Journal of Pharmaceutical Analysis S2095177922000272 (2022)

182. Rothe, S., Prakash, A. & Tyedmers, J. The Insoluble Protein Deposit (IPOD) in Yeast. Front. Mol. Neurosci. 11, 237 (2018).

183. Rubel, M. S. et al. Functional Mammalian Amyloids and Amyloid-Like Proteins. Life 10, 156 (2020).

184. Schmidt, C. Ueber das sogenannte „thierische Amyloid" (Substanz der corpuscula amylacea). Ann. Chem. Pharm. 110, 250-254 (1859).

185. Schmidt, M. et al. Cryo-EM structure of a transthyretin-derived amyloid fibril from a patient with hereditary ATTR amyloidosis. Nat Commun 10, 5008 (2019).

186. Schmued, L. et al. Introducing Amylo-Glo, a novel fluorescent amyloid specific histochemical tracer especially suited for multiple labeling and large scale quantification studies. J Neurosci Methods 209, 120-126 (2012).

187. Schoenfelder, S. et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nat Genet 47, 1179-1186 (2015).

188. Sekijima, Y. Transthyretin (ATTR) amyloidosis: clinical spectrum, molecular pathogenesis and disease-modifying treatments. J Neurol Neurosurg Psychiatry 86, 1036-1043 (2015).

189. Selkoe, D. J., Ihara, Y. & Salazar, F. J. Alzheimer's disease: insolubility of partially purified paired helical filaments in sodium dodecyl sulfate and urea. Science 215, 1243-1245 (1982).

190. Sen, T. Z., Jernigan, R. L., Garnier, J. & Kloczkowski, A. GOR V server for protein secondary structure prediction. Bioinformatics 21, 2787-2788 (2005).

191. Sergeeva, A. V. and Galkin, A. P. Functional amyloids of eukaryotes: criteria, classification, and biological significance. Curr Genet 66, 849-866 (2020).

192. Serio, T. R. et al. Nucleated Conformational Conversion and the Replication of Conformational Information by a Prion Determinant. Science 289, 1317-1321 (2000).

193. Shao, Z. et al. Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex. Cell 98, 37-46 (1999).

194. Si, K. et al. A neuronal isoform of CPEB regulates local protein synthesis and stabilizes synapse-specific long-term facilitation in aplysia. Cell 115, 893-904 (2003).

195. Sieben, A. et al. The genetics and neuropathology of frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathol 124, 353-372 (2012).

196. Sikorski, R. S. & Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122, 19-27 (1989).

197. Simon, J. A. & Kingston, R. E. Occupying Chromatin: Polycomb Mechanisms for Getting to Genomic Targets, Stopping Transcriptional Traffic, and Staying Put. Molecular Cell 49, 808-824 (2013).

198. Sipe, J. D. & Cohen, A. S. Review: History of the Amyloid Fibril. Journal of Structural Biology 130, 88-98 (2000).

199. Sivanathan, V. & Hochschild, A. Generating extracellular amyloid aggregates using E. coli cells. Genes Dev 26, 2659-2667 (2012).

200. Sivanathan, V. & Hochschild, A. A bacterial export system for generating extracellular amyloid aggregates. NatProtoc 8, 1381-1390 (2013).

201. Snow, A. D. et al. An important role of heparan sulfate proteoglycan (Perlecan) in a model system for the deposition and persistence of fibrillar A beta-amyloid in rat brain. Neuron 12, 219-234 (1994).

202. Snow, A. D., Willmer, J. & Kisilevsky, R. Sulfated glycosaminoglycans: a common constituent of all amyloids? Lab Invest 56, 120-123 (1987).

203. Sopova, J. V. et al. RNA-binding protein FXR1 is presented in rat brain in amyloid form. Scientific reports 9, 18983 (2019).

204. Sparmann, A. & van Lohuizen, M. Polycomb silencers control cell fate, development and cancer. Nat Rev Cancer 6, 846-856 (2006).

205. Stansfield, I. et al. The products of the SUP45 (eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 14, 4365-4373 (1995).

206. Stelzmann, R. A., Norman Schnitzlein, H. & Reed Murtagh, F. An English translation of Alzheimer's 1907 paper, 'Uber eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde?' Clin. Anat. 8, 429-431 (1995).

207. Stock, J. K. et al. Ring1-mediated ubiquitination of H2A restrains poised RNA polymerase II at bivalent genes in mouse ES cells. Nat Cell Biol 9, 1428-1435 (2007).

208. Stridsberg, M. et al. Islet amyloid polypeptide (IAPP) in patients with neuroendocrine tumours. RegulPept 55, 119-131 (1995).

209. Tabatabaei Ghomi, H., Topp, E. M. & Lill, M. A. Fibpredictor: a computational method for rapid prediction of amyloid fibril structures. J Mol Model 22, 206 (2016).

210. Tamburri, S. et al. Histone H2AK119 Mono-Ubiquitination Is Essential for Polycomb-Mediated Transcriptional Repression. Molecular Cell 77, 840-856.e5 (2020).

211. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R. & Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature 428, 323-328 (2004).

212. Taneja, V., Maddelein, M.-L., Talarek, N., Saupe, S. J. & Liebman, S. W. A non-Q/N-rich prion domain of a foreign prion, [Het-s], can propagate as a prion in yeast. Mol Cell 27, 67-77 (2007).

213. Tanskanen, M. "Amyloid" — Historical Aspects. in Amyloidosis (ed. Feng, D.) (InTech, 2013).

214. Tartaglia, G. G. & Vendruscolo, M. The Zyggregator method for predicting protein aggregation propensities. Chem. Soc. Rev. 37, 1395 (2008).

215. Tenreiro, S. & Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration: Yeast as a model for neurodegeneration. FEMS Yeast Research 10, 970-979 (2010).

216. Thangakani, A. M., Kumar, S., Nagarajan, R., Velmurugan, D. & Gromiha, M. M. GAP: towards almost 100 percent prediction for ß-strand-mediated aggregating peptides with distinct morphologies. Bioinformatics 30, 1983-1990 (2014).

217. Thompson, M. J. et al. The 3D profile method for identifying fibril-forming segments of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 4074-4078 (2006).

218. Tian, J., Wu, N., Guo, J. & Fan, Y. Prediction of amyloid fibril-forming segments based on a support vector machine. BMC Bioinformatics 10, S45 (2009).

219. Tonkin, E., Hagan, D.-M., Li, W. & Strachan, T. Identification and characterisation of novel mammalian homologues of Drosophila polyhomeoticpermits new insights into relationships between members of the polyhomeotic family. Hum Genet 111, 435-442 (2002).

220. Trovato, A., Seno, F. & Tosatto, S. C. E. The PASTA server for protein aggregation prediction. Protein Engineering Design and Selection 20, 521-523 (2007).

221. Trovato, A., Chiti, F., Maritan, A. & Seno, F. Insight into the Structure of Amyloid Fibrils from the Analysis of Globular Proteins. PLoS Comput Biol 2, e170 (2006).

222. Tsai, T.-T. et al. The unresolved problem of beta-2 microglobulin amyloid deposits in the intervertebral discs of long-term dialysis patients. J Orthop Surg Res 12, 194 (2017).

223. Tsolis, A. C., Papandreou, N. C., Iconomidou, V. A. & Hamodrakas, S. J. A Consensus Method for the Prediction of 'Aggregation-Prone' Peptides in Globular Proteins. PLoS ONE 8, e54175 (2013).

224. van der Vlag, J. & Otte, A. P. Transcriptional repression mediated by the human polycomb-group protein EED involves histone deacetylation. Nat Genet 23, 474-478 (1999).

225. Van Gerven, N., Klein, R. D., Hultgren, S. J. & Remaut, H. Bacterial amyloid formation: structural insights into curli biogensis. Trends Microbiol 23, 693-706 (2015).

226. Vandamme, J., Völkel, P., Rosnoblet, C., Le Faou, P. & Angrand, P.-O. Interaction proteomics analysis of polycomb proteins defines distinct PRC1 complexes in mammalian cells. Mol CellProteomics 10, M110.002642 (2011).

227. Vaquer-Alicea, J. & Diamond, M. I. Propagation of Protein Aggregation in Neurodegenerative Diseases. Annu Rev Biochem 88, 785-810 (2019).

228. Vassar, P. S. & Culling, C. F. Fluorescent stains, with special reference to amyloid and connective tissues. Arch Pathol 68, 487-498 (1959).

229. Ventura, S. et al. Short amino acid stretches can mediate amyloid formation in globular proteins: The Src homology 3 (SH3) case. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7258-7263 (2004).

230. Virchow, R. Ueber eine im Gehirn und Ruckenmark des Menschen aufgefunde Substanz mit der chemishen Reaction der Cellulose. Virchows Arch. Path. Anat. 135-138 (1854).

231. Volpi, E. V. et al. Large-scale chromatin organization of the major histocompatibility complex and other regions of human chromosome 6 and its response to interferon in interphase nuclei. Journal of Cell Science 113, 1565-1576 (2000).

232. Walker, J. M. Protein Blotting by the Capillary Method. in Protein Protocols Handbook, The 335-336 (Humana Press, 2002).

233. Walsh, I., Seno, F., Tosatto, S. C. E. & Trovato, A. PASTA 2.0: an improved server for protein aggregation prediction. Nucleic Acids Research 42, W301-W307 (2014).

234. Wang, C. et al. S100A9-Driven Amyloid-Neuroinflammatory Cascade in Traumatic Brain Injury as a Precursor State for Alzheimer's Disease. Sci Rep 8, 12836 (2018).

235. Wang, H. et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature 431, 873-878 (2004).

236. Wang, Q. et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research 33, 206-214 (2018).

237. Wani, A. H. et al. Chromatin topology is coupled to Polycomb group protein subnuclear organization. Nat Commun 7, 10291 (2016).

238. Watt, B. et al. N-terminal domains elicit formation of functional Pmel17 amyloid fibrils. J Biol Chem 284, 35543-35555 (2009).

239. Weber, H. Mollities ossium, doubtful whether carcinomatous or syphilitic. Transactions of the Pathological Society of London 18, 206-210.

240. Westwood, M. & Lawson, A. Opportunities for Conformation-Selective Antibodies in Amyloid-Related Diseases. Antibodies 4, 170-196 (2015).

241. Wickner, R. B. [URE3] as an Altered URE2 Protein: Evidence for a Prion Analog in Saccharomyces cerevisiae. Science 264, 566-569 (1994).

242. Wickner, R. B. et al. Amyloids and yeast prion biology. Biochemistry 52, 15141527 (2013).

243. Wickner, R. B., Kryndushkin, D., Shewmaker, F., McGlinchey, R. & Edskes, H. K. Study of Amyloids Using Yeast. Methods Mol Biol 1779, 313-339 (2018).

244. Wickner, R. B., Son, M. & Edskes, H. K. Prion Variants of Yeast are Numerous, Mutable, and Segregate on Growth, Affecting Prion Pathogenesis, Transmission Barriers, and Sensitivity to Anti-Prion Systems. Viruses 11, E238 (2019).

245. Wood, D. E., Lu, J. & Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol 20, 257 (2019).

246. Wozniak, P. P. & Kotulska, M. AmyLoad: website dedicated to amyloidogenic protein fragments. Bioinformatics 31, 3395-3397 (2015).

247. Yakupova, E. I., Bobyleva, L. G., Shumeyko, S. A., Vikhlyantsev, I. M. & Bobylev, A. G. Amyloids: The History of Toxicity and Functionality. Biology 10, 394 (2021).

248. Yakupova, E. I., Bobyleva, L. G., Vikhlyantsev, I. M. & Bobylev, A. G. Congo Red and amyloids: history and relationship. Bioscience Reports 39, BSR20181415 (2019).

249. Yan, Y. et al. Loss of Polycomb Group Protein Pcgf1 Severely Compromises Proper Differentiation of Embryonic Stem Cells. Sci Rep 7, 46276 (2017).

250. Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A. & Fürste, J. P. Selection of RNA Aptamers to the Alzheimer's Disease Amyloid Peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications 290, 1583-1588 (2002).

251. Yu, M. et al. Direct recruitment of polycomb repressive complex 1 to chromatin by core binding transcription factors. Mol Cell 45, 330-343 (2012).

252. Zajkowski, T. et al. The Hunt for Ancient Prions: Archaeal Prion-Like Domains Form Amyloid-Based Epigenetic Elements. Mol Biol Evol 38, 2088-2103 (2021).

253. Zambrano, R. et al. AGGRESCAN3D (A3D): server for prediction of aggregation properties of protein structures. Nucleic Acids Res 43, W306-W313 (2015).

254. Zhang, H. et al. The C. elegans Polycomb gene SOP-2 encodes an RNA binding protein. Mol Cell 14, 841-847 (2004)

255. Zhao, W. et al. Polycomb group RING finger proteins 3/5 activate transcription via an interaction with the pluripotency factor Tex10 in embryonic stem cells. Journal of Biological Chemistry 292, 21527-21537 (2017).

256. Zhouravleva, G. et al. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. EMBO J 14, 4065-4072 (1995).

257. Zingraff, J. et al. ß2 -Microglobulin Amyloidosis in Chronic Renal Failure. N Engl J Med 323, 1070-1071 (1990).

258. Зелинский, А. Поиск амилоидогенных белков человека с использованием дрожжевой модели. (Санкт-Петербургский государственный университет, 2016).

259. Инге-Вечтомов, С. Г. От хромосомной теории к матричному принципу. Генетика 51, 397-408 (2015).

260. Качкин, Д. Изучение взаимодействия амилоидов Aß, PrP и Sup35NM в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. (Санкт-Петербургский государственный университет, 2015).

261. Качкин, Д. Изучение взаимодействия амилоидов млекопитающих в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. (Санкт-Петербургский государственный университет, 2017).

262. Шкундина, И. С. и Тер-Аванесян, М. Д. Прионы. Успехи биологической химии 46, 3-42 (2006).

263. Институт цитологии РАН. Российская коллекция клеточных культур позвоночных [Электронный ресурс] http://www.cytspb.rssi.ru/rkkk/katalog_rccc_v_2018_rus.pdf (2018).

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение я бы хотел выразить слова благодарности своим научным руководителям - Чернову Юрию Олеговичу и Рубелю Александру Анатольевичу за руководство научной работой, помощь в планировании экспериментов, ценные указания и регулярные научные семинары. Хотелось бы выразить благодарность своим коллегам по лаборатории за поддержку, активное обсуждение рабочих вопросов и регулярные научные семинары. В особенности я бы хотел поблагодарить Веронику Владимировну Лашкул, Юлию Викторовну Сопову, Андрея Андреевича Зелинского, Константина Юрьевича Куличихина, Анну Юрьевну Аксенову и Нину Владимировну Романову за всестороннюю помощь при выполнении работы и ее активное обсуждение полученных результатов.

Помимо сотрудников научной лаборатории биологии амилоидов СПбГУ, хочется также выразить благодарность сотрудникам центра клеточных технологий, Лаборатории клеточной биотехнологии ИНЦ РАН Юлии Игоревне Хорольской и Кириллу Эдуардовичу Журенкову за консультации и помощь в проведении ряда экспериментов, сотруднику Кафедры цитологии и гистологии Биологического факультета СПбГУ Павлу Александровичу Зыкину за помощь в получении и анализе данных дифференциальной экспрессии генов и сотрудникам Ресурсных Центров СПбГУ Антону Радаеву, Алексею Машарскому, Елизавете Городиловой, Анне Романович, Николаю Костину, Максиму Воробьеву за помощь в работе на оборудовании.

Таблица А1. Доступные онлайн методы предсказания амилоидогенных областей в аминокислотных последовательностях

Метод Сайт Ссылки

AGGRESCAN http://bioinf.uab.es/aggrescan/ Conchillo-Solé et al., 2007; de Groot et al., 2012

AGGRESCAN 3D http://biocomp.chem.uw.edu.pl/A3D/ Pujols et al., 2018; Zambrano et al., 2015

AmyLoad http://comprec-lin.iiar.pwr.edu.pl/amyload/ Wozniak and Kotulska, 2015

AmyloGram http://www.smorfland.uni.wroc.pl/shiny/AmyloGram Burdukiewicz et al., 2017

/

AmyloidMutant s http://amyloid.csail.mit.edu/ O'Donnell et al., 2011

AMYLPRED http://biophysics.biol.uoa.gr/AMYLPRED Frousios et al., 2009

AMYLPRED2 http://biophysics.biol.uoa.gr/AMYLPRED2 Tsolis et al., 2013

APPNN http://cran.r- project.org/web/packages/appnn/index.html Familia et al., 2015

BetaScan http://groups.csail.mit.edu/cb/betascan/betascan.html Bryan et al., 2009

ClinVar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ Landrum et al., 2016

Fibpredictor http://nanohub.org/resources/fibpredictor Tabatabaei Ghomi et al., 2016

FISH Amyloid http://www.comprec.pwr.wroc.pl/COMPREC home Gasior and Kotulska, 2014

page.html

FoldAmyloid http://bioinfo.protres.ru/fold-amyloid/oga.cgi Garbuzynskiy et al., 2010

GAP http://www.iitm.ac.in/bioinfo/GAP/ Thangakani et al., 2014

GOR V http://gor.bb.iastate.edu/ Kouza et al., 2017; Sen et al., 2005

MetAmyl http://metamyl .genouest.org/ Emily et al., 2013

MILAMP http://facultv.pieas.edu.pk/fayyaz/software.html#MIL Munir et al., 2021

AMP

NetCSSP http://cssp2.sookmyung.ac.kr/index.html Kim et al., 2009

PASTA http://protein.cribi.unipd.it/pasta/ Trovato et al., 2006, 2007

PASTA 2.0 http://protein.bio.unipd.it/pasta2/ Walsh et al., 2014

RFAmyloid http://server.malab.cn/RFAmyloid/ Niu et al., 2018

SNPeffect 4.0 http:// snpeffect.switchlab.org De Baets et al., 2012

Метод Сайт Ссылки

STITCHER http:// stitcher.csail.mit.edu Bryan et al., 2012

TANGO http://tango.crg.es/ Fernandez-Escamilla et al., 2004

Waltz-BD http://waltzdb.switchlab.org Maurer-Stroh et al., 2010

ZipperDB http:// services.mbi .ucla.edu/zipperdb/submit Thompson et al., 2006

Zyggregator http://www- vendruscolo.ch.cam.ac.uk/zyggregator.php Tartaglia and Vendruscolo, 2008

Sfil

Рисунок Б1. Карты плазмид pCUPl-Sup35N-PHC3(5-l), pCUPl-Sup35N-PHC3(5-2), pCUPl-Sup35N-PHC3(6), pCUPl-Sup35N-Ap42, pCUPl-Sup35N-Ap42(TM). pCUP - индуцируемый дрожжевой промотор гена CUPl-Г, Sup35N - ген, кодирующий N домен белка Sup35; URA3 - ген, кодирующий белок биосинтеза урацила; AmpR - ген устойчивости к ампициллину; Sfîl- сайты рестрикции для эндонуклеазы S fil.

Рисунок Б2. Карты плазмид pCup-YFP-PHC3(5-l), pCup-YFP-PHC3(6), pCup-PHC3(l)-CFP. CUP1 promoter - индуцируемый дрожжевой промотор гена CUP1-1; YFP/CFP - ген, кодирующий желтый/синий флуоресцентный белок (YFP/CFP); РНСЗ(5- on 1)/РНСЗ(6)/РНСЗ(1) - ген, кодирующий человеческий белок РНСЗ(5-1)/РНСЗ(6)/РНСЗ(1); AmpR - ген устойчивости к ампициллину; URA3 - ген, кодирующий белок, участвующий в биосинтезе урацила; LEU2 - ген, кодирующий белок, участвующий в биосинтезе лейцина; Sfil, Xbal, BamHI- сайты рестрикции для соответствующих эндонуклеаз.

araBAD

araBAD

araBAD

Sup35M

Рисунок БЗ. Карты плазмид C-DAG-PHC3(5), C-DAG-PHC3(6), pVS105, pVS72 (C-DAG-Sup35M). araBAD promoter - промотор BAD оперона L-arabinose; csgAss - ген, кодирующий пептидную последовательность csgAss; Sup35M - ген, кодирующий М домен белка sup35; AmpR - ген устойчивости к ампициллину, Xbal, NotI- сайты рестрикции для соответствующих эндонуклеаз.

о LI К

CMV

3'LTR

Amp

5'LTR

pLenti-CMV-EGFP-Hygro 9320 n.H.

3'LTR

CMV xba, BamHI

Рисунок Б4. Карты плазмид pLenti-CMV-PHC3(5)-EGFP, pLenti-CMV-PHC3(6)-EGFP, pLenti-CMV-EGFP Hygro. CMV promoter

- промотор цитомегаловируса (CMV); EGFP - ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок EGFP; HygR - ген устойчивости к гигромицину; 5'LTR/3'LTR - длинные концевые повторы; Xbal, BamHI - сайты рестрикции для соответствующих эндонуклеаз.

Рисунок Б5. Карты плазмид pMD2.G и psPAX2. CMV - промотор цитомегаловируса; VSV-G - ген, кодирующий белок вируса везикулярного стоматита G (Vesicular stomatitis virus G); AmpR - ген устойчивости к ампициллину; CAG- синтетический промотор CAG; HIV-1 gag - ген, кодирующий белок GAG вируса иммунодефицита человека; HIV-1 pol - ген, кодирующий белок POL вируса иммунодефицита человека.

Рисунок В1. Последовательности, обладающие амилоидогенным потенциалом, согласно биоинформатическим алгоритмам AmylPred2 и ArchCandy. А - Сравнение последовательностей полноразмерных белков РНС1/РНС2/РНС3. Б - Сравнение последовательностей укороченных изоформ белка РНС3 (5 и 6). Красным выделены последовательности, которые имеют потенциал к образованию Р-арок, согласно алгоритму ArchCandy. Фиолетовым выделены участки, обладающие амилоидогенным потенциалом согласно программе AmylPred2. Синим выделены последовательности, которые выявляются обоими алгоритмами. Оранжевый участок в РНС1 - предсказанное амилоидогенное ядро согласно (ВаШе й а1., 2017)

Saint Petersburg State University

As Manuscript

Daniil Valerievich Kachkin ANALYSIS OF AMYLOID PROPERTIES OF HUMAN PHC3 PROTEIN

Scientific specialization: 1.5.22. Cell biology

Thesis for a Candidate degree in biological sciences Translation from Russian

Scientific supervisor: Ph.D., professor Yury Olegovich Chernoff

Scientific supervisor: Ph.D.

Aleksandr Anatolievich Rubel

Saint Petersburg 2022

TABLE OF CONTENT

INTRODUCTION.......................................................................................................................115

1. LITERATURE REVIEW........................................................................................................119

1.1 Amyloids - definition, structure, properties.................................................................119

1.2 History of Amyloid Discovery and Research...............................................................120

1.3 Amyloid prevalence..........................................................................................................125

1.3.1 Pathogenic amyloids and mammalian amyloidosis............................................................125

1.3.2 Functional amyloids...........................................................................................................127

1.3.3 Prion [PSI+].........................................................................................................................129

1.4 Methods for assessing the amyloidogenic potential of proteins and finding new amyloids....................................................................................................................................132

1.4.1 Bioinformatic approaches to evaluation of the amyloidogenic potential of proteins.........132

1.4.2 Methods for proteomic screening of amyloids...................................................................133

1.4.3 In vitro analysis of amyloidogenic potential. C-DAG........................................................134

1.4.4 Yeast model for assessing amyloid potential and searching for new amyloid proteins.....136

1.5 PHC3 protein - structure, function, isoforms...............................................................138

2. MATERIALS AND METHODS............................................................................142

2.1 Сell cultures, yeast and bacterial strains and plasmids used in this work..........142

2.1.1 Bacterial strains of Escherichia coli...................................................................................142

2.1.2 Yeast strains Saccharomyces cerevisiae.............................................................................142

2.1.2 Mammalian cell lines..........................................................................................................142

2.2 Vectors used in this work......................................................................................................143

2.3 Media and conditions of E. coli cultivation.................................................................146

2.4 Media and cultivation conditions for S. cerevisiae.....................................................146

2.5 Media and conditions for cultivation of human cell cultures................................146

2.6 Bioinformatics methods....................................................................................................147

2.7 Molecular biology methods............................................................................................147

2.7.1 Design of plasmids for analysis of aggregation of different PHC3 protein isoforms in S. cerevisiae yeast cells...................................................................................................................149

2.7.2 Construction of plasmids to test the amyloidogenic properties of short PHC3 isoforms in the bacterial C-DAG system..............................................................................................................151

2.7.3 Construction of plasmids to study the aggregation of short PHC3 protein isoforms in human cells..............................................................................................................................................151

2.7.4 Bacterial transformation.....................................................................................................152

2.7.5 Yeast transformation...........................................................................................................152

2.7.6 Transfection of HEK293T cell culture...............................................................................153

2.7.7 Obtaining of lentiviral vectors............................................................................................153

2.7.8 Transduction of human fibroblast (DF2) cell cultures, stromal keratocytes and limbal stem cells by lentiviral vectors.............................................................................................................154

2.7.9 Assessment of cytotoxicity of aggregates of short PHC3 isoforms for human fibroblasts 155

2.7.10 Preparation of S. cerevisiae cell lysates............................................................................155

2.7.11 Preparation of lysates from human HEK293T cell culture..............................................156

2.7.12 Semi-denaturing electrophoresis in agarose gel (SDD-AGE)..........................................156

2.7.13 Protein electrophoresis in polyacrylamide gel (PAG) followed by gel boiling...............157

2.7.14 Western blot......................................................................................................................157

2.8 Bacterial C-DAG system for assessing the ability of proteins to form amyloid

aggregation in vitro................................................................................................................158

2.9 Immunocytochemistry of mammalian cells..................................................................158

2.10 Microscopy........................................................................................................................159

2.10.1 Fluorescence Microscopy.................................................................................................159

2.10.2 Polarization microscopy...................................................................................................160

2.10.3 Electron microscopy.........................................................................................................160

2.11 Transcriptome analysis..................................................................................................160

2.11.1 Total RNA isolation..........................................................................................................160

2.11.2 Obtaining a cDNA library and sequencing.......................................................................161

2.11.3 Analysis of differential gene expression..........................................................................161

2.12 Statistical analysis................................................................................................................162

3. RESULTS................................................................................................................................163

3.1 Bioinformatic analysis of human PHC3(FL), PHC3(5) and PHC3(6) proteins...........163

3.2 Analysis of PHC3 protein aggregation in Saccharomyces cerevisiae yeast cells ..165

3.3 In vitro aggregation analysis of short PHC3 isoforms using the C-DAG system...167

3.4 Analysis of PHC3 localization in HEK293T cells.......................................................169

3.5 Analysis of PHC3(5) and PHC3(6) protein aggregation in human HEK293T cells . 170

3.6 Analysis of PHC3(5) and PHC3(6) protein aggregation in human dermal fibroblasts, stromal keratocytes and limbal stem cells......................................................................172

3.7 Assessment of toxicity of short isoforms of PHC3 protein for DF2 cells..............173

3.8 Analysis of YFP-PHC3(5) and YFP-PHC3(6) co-localization with PHC3(1)-CFP in S. cerevisiae yeast cells..............................................................................................................174

3.9 Analysis of the localization of the full-length PHC3 protein in mammalian cells, with overproduction of short PHC3 isoforms....................................................................175

3.10 Analysis of differential gene expression during PHC3(5)-EGFP overproduction and aggregation in HEK293T cells......................................................................................177

4. DISCUSSION..........................................................................................................................179