Амперометрические биосенсоры на основе клеток микроорганизмов для оценки токсичности продукции бытового назначения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Чепкова, Ирина Федоровна

• Чепкова, Ирина Федоровна
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чепкова, Ирина Федоровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

11 Понятие о веществах, дезорганизующих биологические системы и критерии оценки их опасности

111 Токсичность веществ

112 Критерии оценки вредного воздействия веществ - санитарно-гигиеническое и экологическое нормирование

1 2 Методы оценки токсичности продукции бытового назначения

12 1 Традиционные токсикологические методы - клинические испытания

12 2 Аналитические методы для определения санитарно-химических показателей

12 3 Биотестирование (альтернативные методы)

1 3 Основные закономерности микробной деградации веществ с ароматической системой как основных токсикантов продукции бытового назначения

13 1 Общие принципы утилизации органических токсикантов 26 13 2 Деградация микроорганизмами ароматических соединений

13 3 Пути биодеградации производных ароматических соединений у бактерий Escherichia Coli

14 Биосенсорный анализ как инструмент биотестирования

14 1 Общая характеристика биосенсоров 38 14 2 Ферментные биосенсоры в экологическом мониторинге и токсикологии 40 14 3 Микробные биосенсоры для оценки качества окружающей среды

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Амперометрические биосенсоры на основе клеток микроорганизмов для оценки токсичности продукции бытового назначения»

Одним из приоритетных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных методов биотестирования для оценки токсичности различных объектов. Ежегодно в окружающую среду выбрасываются сотни новых загрязняющих веществ с неизвестной степенью токсичности и неизученным влиянием на человека. Загрязнение токсикантами носит комплексный характер [1]. Ужесточение требований к их нормированию приводит к необходимости проведения сложных и дорогостоящих исследований. Физико-химические методы анализа позволяют с высокой точностью и селективностью определять индивидуальные вещества, однако требуют дорогостоящего оборудования, квалифицированного персонала и специализированных лабораторий. Также аналитические методы не дают прямой информации о биологической опасности веществ и не позволяют адекватно оценить их действие на окружающую среду и на человека, так как не учитывают синергические и антагонистические эффекты и потенциальные эффекты неизвестных соединений [2]. Традиционные методы определения токсичности (эксперименты на млекопитающих) являются трудоемкими, длительными, дорогостоящими и требуют использования лабораторных животных. Именно поэтому в токсикологии наряду с традиционными методами контроля применяют альтернативные (биотестирование). В качестве тест-объектов могут быть использованы: инфузории, ферменты, люминесцентные бактерии, сперма крупного рогатого скота, культуры клеток животных и человека, препараты роговицы кролика и быка и другие модели. Принятие Регламента №1907/2006 Европейского Парламента и Совета ЕС от 18 декабря 2006, касающегося правил регистрации, оценки, санкционирования и ограничения химических веществ (REACH), подталкивает развитие альтернативных токсикологических методов, в том числе - основанных на биосенсорах [3].

Оценка токсичности бытовых товаров является важной задачей для современных лабораторий, осуществляющих экологический мониторинг и государственный контроль безопасности объектов окружающей среды. Производство одежды, обуви, посуды, игрушек, и других изделий из синтетических материалов привело к тому, что в настоящее время ощущается острая потребность во всесторонней оценке этой группы товаров по показателям безопасности для здоровья человека. В 2010 году странами-членами таможенного союза приняты Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования [4], направленные на обеспечение безопасности продукции, и многие разделы этого документа включают такой показатель как токсичность.

Однако существующие методы экспресс-оценки токсичности имеют свои ограничения. В этом отношении, биосенсоры продемонстрировали большой потенциал, и в последние годы создаются аналитические инструментальные средства на их основе для эффективного контроля в экологических программах [5]. Широкое применение нашли биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов [6]. Преимущества микроорганизмов, такие как простота и низкая стоимость культивирования, возможность целенаправленного изменения свойств методами генной инженерии, широкая субстратная специфичность, наличие простых и универсальных способов измерения активности ферментов по общим показателям жизнедеятельности клетки, позволяют на их основе создавать рецепторные элементы биосенсоров для решения широкого круга задач [7]. Воздействие загрязняющих веществ на микроорганизмы приводит к изменению их дыхательной активности, что может использоваться для оценки токсичности различных объектов.

Работа выполнялась при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инноваг^ионной России на 2009-2013 годы», гос. контракт №17976.

Цель работы

Целью настоящей работы является выявление закономерностей изменения дыхательной активности микроорганизмов при использовании их в качестве биокатализаторов в рецепторных элементах биосенсоров для оценки токсичности бытовых товаров из полимерных и текстильных материалов и разработка методики биосенсорной оценки токсичности проб данной группы товаров.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1) Сравнить параметры дыхательной активности различных штаммов микроорганизмов при анализе водных вытяжек из образцов товаров и выбрать наиболее перспективный для оценки токсичности продукции бытового назначения.

2) Получить эффективный рецепторный элемент биосенсора на основе выбранного штамма микроорганизмов и определить рабочие условия функционирования (рН, масса биокатализатора на электроде, способ иммобилизации, хранения).

3) Определить основные аналитические и метрологические характеристики биосенсора (градуировочная зависимость, операционная и долговременная стабильность, пределы обнаружения и определения).

4) Разработать методику биосенсорной оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов.

5) Провести сравнительный анализ результатов оценки токсичности образцов бытовых товаров, полученных с использованием биосенсора, аналитических методов и по стандартным методикам биотестирования.

Научная новизна

Исследованы возможности использования дыхательной активности микроорганизмов с различными типами метаболизма в качестве тест-реакции при биотестировании продукции бытового назначения. Показано, что дыхательная цепь Escherichia coli К-12 является наиболее чувствительным инструментом для оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов.

Выявленные закономерности изменения дыхательной активности тест-объекта Escherichia coli К-12 в присутствии токсикантов, мигрирующих в водные вытяжки из продукции бытового назначения (одежды, обуви, игрушек, посуды) свидетельствуют о возможности количественной оценки токсического эффекта. Впервые разработаны количественные критерии оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов с использованием микробного биосенсора на основе кислородного электрода с использованием стандарта положительного контроля - ацетальдегида.

Впервые проведен сравнительный анализ результатов биосенсорной оценки токсичности образцов бытовых товаров с результатами, полученными при работе по стандартным методикам биотестирования, а также с использованием аналитических методов. Показано, что применение бактерий Escherichia coli К-12 как основы рецепторного элемента для оценки токсичности бытовой продукции позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартным методам гигиенической оценки. Полученные результаты могут быть использованы для разработки научных основ биосенсорного анализа токсичности продукции бытового назначения.

Практическая значимость

Разработан и апробирован макет микробного биосенсора кюветного типа для оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов, который может служить прототипом приборов для серийного применения на базе приборов, внесенных в Государственный реестр средств измерений («Эксперт-001»).

Разработана и апробирована методика оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов, которую можно использовать в токсикологических лабораториях различных организаций.

Результаты работы внедрены в учебный процесс в Тульском государственном университете. Биосенсорные установки для оценки токсичности используют при проведении лабораторных работ по дисциплинам «Биосенсоры в экологии» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов направлений подготовки 020100-Хымия и 240700-Биотехнология.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г., диплом, медаль конкурса); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010 г., диплом); XIII Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2008 г.); Международной молодежной научной конференции «XIV Туполевские чтения» (Казань, 2006 г.).

Методика оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов с помощью амперометрического биосенсора успешно апробирована на базе лаборатории санитарно-химических и токсикологических исследований ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» и рекомендована для аттестации в ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Москва, 2012 г.)

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 сообщений, отражающих основное содержание работы в форме тезисов и материалов конференций и конгрессов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Закономерности изменения дыхательной активности тест-объектов -бактерий с различным типом метаболизма, в присутствии токсикантов, мигрирующих в водные вытяжки из продукции бытового назначения как основы для разработки новой методики биотестирования продукции бытового назначения.

2. Разработка макета биосенсора для оценки токсичности на основе модифицированного кислородного электрода «ДКТП-02.4» (ООО «НЛП Эконикс-Эксперт», Москва) и анализатора жидкости «Эксперт-001», внесенных в Государственный реестр средств измерения.

3. Новая методика оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов с помощью амперометрического биосенсора на основе Escherichia coli К-12, которая может служить источником информации о потенциальной опасности продукции в дополнение к стандартным методикам.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Чепкова, Ирина Федоровна

выводы

1) Исследована возможность использования дыхательной активности микроорганизмов с различными типами метаболизма в качестве тест-реакции при биотестировании продукции бытового назначения. Показано, что дыхательная цепь Escherichia coli К-12 является наиболее чувствительным инструментом для оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов.

2) Разработан и апробирован макет микробного биосенсора кюветного типа для оценки токсичности продукции бытового назначения из полимерных и текстильных материалов. Показано, что метод капсулирования бактерий с помощью полупроницаемой мембраны можно успешно применять для модификации поверхности кислородного электрода универсальных приборов для определения содержания кислорода, ХПК и БПК, внесенных в Государственный реестр средств измерений («Эксперт-001»), Отработанный метод модификации кислородного электрода наряду с универсальностью и простотой обеспечивает высокую стабильность биоматериала в процессе функционирования биосенсора (относительное стандартное отклонение So = 6,8 % (Р=0,95, п=15), долговременная стабильность работы - не менее 1 месяца). Использование универсальной системы позволит сократить затраты на оборудование и увеличить экономическую отдачу предприятий.

3) Выявленные закономерности изменения дыхательной активности тест-объекта Escherichia coli К-12 в присутствии токсикантов свидетельствуют о возможности количественного определения токсического эффекта. Впервые разработаны количественные критерии оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов с использованием микробного биосенсора на основе кислородного электрода с использованием стандарта положительного контроля - ацетальдегида (допустимая степень токсичности, образец токсичен, образец сильно токсичен). Определены аналитические параметры биосенсора (предел обнаружения 0,4 мг/дм3, рабочий линейный диапазон 0,8-20 мг/дм , коэффициент чувствительности 0,435 ± 0,005 02мкгхс" 'хмг"1).

4) Разработана и апробирована методика экспресс-оценки токсичности бытовых товаров из полимерных и текстильных материалов с применением биосенсора на основе кислородного электрода, модифицированного иммобилизованными целыми бактериальными клетками E.coli К-12. Использование непатогенных для человека и хорошо изученных микроорганизмов, а также приборов, внесенных в Государственный реестр средств измерений, в сочетании с простотой и экспрессностью подготовки проб и анализа делает предложенную методику перспективной для использования в лабораториях, выполняющих токсикологические исследования указанной группы товаров.

5) Впервые проведен сравнительный анализ результатов биосенсорной оценки токсичности образцов бытовых товаров с результатами, полученными при работе по стандартным методикам биотестирования, а также с использованием аналитических методов. Показано, что применение бактерий Escherichia coli К-12 в качестве основы рецепторного элемента для оценки токсичности бытовой продукции позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартным методам гигиенической оценки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Учитывая возможности микроорганизмов к утилизации токсикантов и опыт применения их в качестве тест-объектов, можно сделать вывод о том, что открываются новые возможности оценки токсичности продукции бытового назначения с применением биосенсоров. Ферментные системы целых клеток можно использовать в качестве биокатализаторов в рецепторных элементах амперометрических биосенсоров для оценки токсичности бытовых товаров из полимерных и текстильных материалов, так как очевидно, что мигрирующие в водные вытяжки из исследуемых товаров токсиканты могут подвергаться различным типам деградации. Следует отметить, что применению подобных биосенсорных систем для экологического мониторинга посвящено большое количество публикаций, в то время как для продукции бытового назначения исследования в области таких биосенсоров практически не ведутся и механизмы происходящих процессов недостаточно изучены. Исследование закономерностей изменения дыхательной активности микроорганизмов при использовании их в качестве биокатализаторов в рецепторных элементах биосенсоров позволит разработать фундаментальные основы и оптимизировать подходы для создания новых биосенсорных систем для оценки токсичности. Бактерии Е.соИ К-12 благодаря широкому кругу окисляемых органических веществ, а также другим физиологическим свойствам являются перспективным биоматериалом для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2Л. Бактериальные штаммы

В работе были использованы штаммы микроорганизмов: Pseudomonas putida BS3701 (pBS 1141) (pBSl 142), Pseudomonas putida BS394, Escherichia coli TOPIO, Hansenula polymorpha NCYC 495 In, принадлежащие лабораториям биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН (г. Пущино); Escherichia coli К-12, предоставленные ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» (г. Тула).

2.2. Питательные среды и условия культивирования микрооргнизмов

2.2.1. Бактерии Escherichia coli ТОРЮ и Escherichia coli К-12

Бактериальные штаммы E.coli Topi0 и E.coli К-12 выращивали при температуре 37°С в течение суток на богатой среде с добавлением стрептомицина (100 мкг/дм3). В качестве нее использовали среду Лурия-Бертани (LB), содержащую в 1 дм3: триптон - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; NaCl - 10 г. Для получения твердой среды добавляли 15 г агара. Среды стерилизовали автоклавированием в течение 45 мин при давлении равном 1 атм (сверх атмосферного давления). Для получения чистых бактериальных культур на агаризованной среде использовали метод штриха. Закрытые чашки Петри оставляли в термостате при 37°С на 16-18 ч.

Для получения биомассы микроорганизмов проводили их культивирование в жидкой среде. В колбу объемом 750 см3, содержащую стерилизованную среду LB с добавлением стрептомицина, петлей высевали культуру бактерий и оставляли на шейкере на 16-18 ч при температуре 37°С и скорости перемешивания 1 80 об/мин. Полученную биомассу центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин и трижды промывали Ыа-К-фосфатным буфером со значением рН 7,0.

2.2.2. Дрожжи Напзепи)а ро1ушогрЬа ]ЧСУС 495 1п

Клетки Н. ро1утогрка ЬГСУС 495 1п выращивали при температуре 28°С. Подготовку среды проводили согласно табл. 2.1 и 2.2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чепкова, Ирина Федоровна, 0 год

1. Nicole Jaffrezic-Renault, Sergei V. Dzyadevych. Conductometric microbiosensors for environmental monitoring. Review // Sensors. 2008. V. 8. P. 2569-2588

2. Rodrigues-Mozaz S., Lopez de Alda M.J. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring. Reviev // Anal. Bioanal. Chem. 2006. V. 386. N. 4. P. 1025-1041

3. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю). -М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. -707 с.

4. Lei У., Chen W., Mulchandani A. Microbial biosensors. Review // Anal Chim Acta. 2006. V.568. P. 200-210

5. Доклад Шестьдесят третьей сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, Женева, 17 21 марта 2010 г. (издание Всемирнойорганизации здравоохранения, в продаже под №. WHA63/2010/REC/3), документ А63/21

6. Hodson Е. A textbook of modern toxicology. 3rd ed. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc, 2004. - 557 p.

7. Захаров И.С., Пожаров A.B., Гурская Т.В., Финогенов А.Д. Биосенсорные системы в медицине и экологии. С.Пб.: Санкт-Петербургский государственный университет телекоммуникаций им. проф. М.А. Бонч-Бруевича, 2006. - 99 с.

8. Общая токсикология. / Под ред. А.О. Лойта. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2006. -224 с.

9. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. М.: Гидрометеоиздат, 1984. - 560 с.

10. Доклад Пятьдесят девятой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, Женева, 22 27 мая 2006 г. (издание Всемирной организации здравоохранения, в продаже под №. WHA59/2006/REC/3), документ А59/41

11. ФБУЗ «Российский Регистр Потенциально Опасных Химических и Биологических Веществ» Роспотребнадзора России — национальный корреспондент подпрограммы ЮНЕП по химическим веществам http://www.rpohv.ru

12. Гигиеническая оценка одежды для детей, подростков и взрослых: МУК 4.1/4.3.1485-03. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003.-15с.

13. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический мониторинг суперэкотоксикантов, М.: Химия, 1996. - 319 с.

14. Другов Ю.С. Экологическая аналитическая химия. М.: 2000. - 432 с.

15. Хмельницкий P.A., Бродский Е.С. Масс-спектрометрия загрязнений окружающей среды. -М.:Химия, 1990. 184 с.

16. Шеховцова Т.Н. Биологические методы анализа // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 11. С. 17-21.

17. Оценка токсичности по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические указания. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. - 24 с.

18. B.M. Willardson, J.F. Wilkins, T.A. Rand, J.M. Schupp, K.K. Hill, P. Keim, P.J. Jackson. Development and Testing of a Bacterial Biosensor for Toluene-Based Environmental Contaminants // Appl. And Envir. Microbiology. 1998. V. 64. N. 3. P. 1006-1012

19. J.R. van der Meer, W.M. de Vos, S. Harayama, A.J.B. Zehnder. Molecular Mechanisms of Genetic Adaptation to Xenobiotic Compounds // Microbiological Reviews. 1992. V.56. N. 4. P. 677-694

20. Роль микроорганизмов в трансформации устойчивых органических поллютантов: Учебное пособие / JT.A. Головлева, М.П. Коломыцева, М.А. Бабошин, О.Н. Понаморева. Тула: Изд-во ТулГУ, 2008 - 100 с.

21. Walter Reineke Aerobic and Anaerobic Biodégradation Potentials of Microorganisms. //Chapter 1 in The Handbook of Environmental Chemistry Vol. 2 Part K. Biodégradation and Persistence (ed. by B. Beek)/ Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2001.

22. Horvath, R.S. Microbial co-metabolism and the degradation of organic compounds in nature//Bacteriol. Rev. 1972. V.36. P.146-155

23. Perry J.J. Microbial cooxidations involving hydrocarbons // Microbiol. Rev. 1979. V. 43, P. 59-72

24. D. Rawson, A. Willmer, A. Turner. Whole-cell biosensors for environmental monitoring//Biosensors. 1989. V. 4. P. 299-311

25. Введение в биохимическую экологию: учеб. пособие / В.П. Саловарова, А.А. Приставка, О.А. Берсенева. Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2007. -159 с.

26. Harwood, С. S., and R. Е. Parales. The (3-ketoadipate pathway and the biology of self-identity // Annu. Rev. Microbiol. 1996 V. 50. P. 553-590

27. E. Diaz, A. Ferrandez, M.A. Prieto, J.L. Garcia. Biodégradation of aromatic compounds by Escherichia coli II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. V.65. P. 523-569

28. Holliger С, Schumacher W. Reductive dehalogenation as a respiratory process // Ant v Leeuwenhoek. 1994. V.66. P.239-246

29. Holliger C, Schraa G. Physiological Meaning and Potential for Application of Reductive Dechlorination by Anaerobic Bacteria. //FEMS Microbiol Rev. 1994. V.15. P. 297-305

30. El Fantroussi S, Naveau H, Agathos SN. Anaerobic dechlorinating bacteria // Biotechnol Prog. 1998. V. 14. P. 167-188

31. Sayler G.S., Hooper S.W., Layton A.C., King J.M.H. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance // Microb. Ecol. 1990 V. 19. P. 1-20.

32. Gibson J, Harwood CS (2002) Metabolic diversity in aromatic compound utilization by anaerobic microbes // Annu. Rev. Microbiol. 2002. V. 56. P. 345-369

33. Fetzner S. Bacterid dechalogenation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 50. P. 633-657

34. Harayama, S., Timmis, K.N. Aerobic degradation of aromatic hydrocarbons by bacteria. Marcel Dekker, New York. In H. Sigel and A. Sigel (eds.) Metal Ions in Biological Systems. 1992. V. 28. P. 99-156

35. Reineke W. Development of hybrid strains for the mineralisation of chloroaromatics by patchwork assembly // Annu. Rev. Microbiol. 1998. V.52. P. 287331

36. Chaudhry G.R., Chapalamadugu S. Biodégradation of halogenated organic compounds // Microbiol Rev. 1991. V. 55. N. 1. P. 59-79

37. Commandeur L.C.M., Parsons J.R. Degradation of halogenated aromatic compounds // Biodégradation. 1990. V. 1. P. 207-220. Reineke W., Knackmuss H-J. Microbial degradation of haloaromatics // Annu. Rev. Microbiol. 1988. V. 42. P. 263287

38. Яминский И.В, Бондаренко В.M. Липополисахариды, клеточные стенки, живые бактериальные клетки // В сб.: Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров. Под ред. И.В. Яминского. М.: Научный мир. 1997. 88 с.

39. Clermont, О., S. Bonacorsi, and Е. Bingen. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 4555-4558

40. Blattner F.R., Plunket III.G., Bloch C.A. et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12 // Science. 1997. V. 277. P. 1453-1462

41. R. Burlingame, P. J. Chapman. Catabolism of phenylpropionic acid and its 3-hydroxy derivative by Escherichia coli II J. Bacteriol. 1983. V. 155. P. 113-121

42. R. Burlingame, L. Wyman, P. J. Chapman. Isolation and characterization of Escherichia coli mutants defective for phenylpropionate degradation // J. Bacteriol. 1986. V. 168. P. 55-64

43. A. Ferrandez, J. L. Garcia, E. Diaz. Genetic characterization and expression in heterologous hosts of the 3 (3-hydroxyphenyl)propionate catabolic pathway of Escherichia coli K-12//J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 2573-2581

44. E. Diaz, A. Ferrandez, M.A. Prieto, J.L. Garcia. Characterization of the hca cluster encoding the dioxygenolytic pathway for initial catabolism of 3-phenylpropionic acid in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1998. V. 1 80. P. 29152923

45. A. Ferrandez, В. Minambres, В. Garcia, Е. R. Olivera, J. M. Luengo, J. L. Garcia, E. Diaz. Catabolism of phenylacetic acid in Escherichia coli. Characterization of a new aerobic hybrid pathway // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 25974-25986

46. J. M. Luengo, J. L. Garcia, E. R. Olivera. The phenylacetyl-CoA catabolon: a complex catabolic unit with broad biotechnological applications // Мої. Microbiol. V. 39. P. 1434-1442

47. Vitovski, S. Phenylacetate-coenzyme A ligase is induced during growth on phenylacetic acid in different bacteria of several genera // FEMS Microbiol. Lett. V. 108. P. 1-6

48. Harwood, C. S., G. Burchhardt, H. Herrmann, G. Fuchs. Anaerobic metabolism of aromatic compounds via the benzoyl-CoA pathway // FEMS Microbiol. 1999. Rev. 22. P. 439-458

49. Smith, H. W. Survival of orally administered E. coli K-12 in alimentary tract of human //Nature. 1975. V. 55. P. 500-502

50. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды: МУК 4.2.1018-01. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2001. -76 с.

51. Е. Dorward and В. Barlsas, Acute toxicity screening of water pollutants using a bacterial electrode // Environ. Sci. Technol. 1984. V. 1 8. P. 967-972

52. C. Tran-Minh, P.C. Pandey and S. Kumaron. Studies on acetylcholine sensor and its analytical application based on the inhibition of cholinesterase // Biosensors Bioelectron. 1990. V.5. P. 461-471.

53. Понаморева O.H, Решетилов A.H, Алферов В.А. Биосенсоры. Принципы функционирования и практическое применение. Тула: Изд-во ТулГУ, 2007. -255 с.

54. Dubey R.S., Upadhyay S.N. Microbial corrosion monitoring by an amperometric microbial biosensor developed using whole cell of Pseudomonas sp. // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. N. 9-12. P. 995-1000

55. Hoshi M., Sasamoto Y., Nonaka M. et al. Microbial sensor system for nondestructive evaluation of fish meat quality // Biosens Bioelectron. 1991. V. 6. N. l.P. 15-20

56. Pascual C., Pascual R., Kotyk A. Use of permeabilized yeast cells for the determination of ethanol and alcohol dehydrogenase assay // Anal. Biochemistry. 1982. V. 123. P. 205-207

57. Renneberg R., Riedel K., Liebs P. et al. Microbial and hybrid sensors for determination of amylase activity // Analytical Letters. 1984. V. 17. N. 85. P. 349358

58. Mulchandani P., Lei Y., Chen W. et al. Microbial biosensor for p-nitrophenol using Moraxella sp. // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 470. P. 79-86

59. Riedel K., Scheller F. Inhibitor-treated microbial sensor for the selective determination of glutamic acid // Analyst, 1987. V. 112. N. 3. P. 341-342

60. Tkac J., Gemeiner P., Svitel J. et al. Determination of total sugars in lignocellulose hydrolysate by a mediated Gluconobacter oxydans biosensor // Analytica Chimica Acta. 2000. V. 420. p. 1-7

61. Tkac J., Vostiar I., Gorton L. et al. Improved selectivity of microbial biosensor using membrane coating. Application to the analysis of ethanol during fermentation // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18. N9. P. 1125-1134

62. Корженевич В.И., Игнатов О.В., Миронов А.Д., Кривопалов Ю.В., Борковский А.Л. Активность штаммов-деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гранулах агарового геля // Прикл. биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. № 3. С. 365-369

63. Gonchar M.V., Maidan М.М., Moroz О.М. et al. Microbial 02- and H202-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosens. Bioelectron. 1998. V. 13. P. 945-952

64. Schmidt A., Standfuss-Gabisch C., Bilitewski U. Microbial biosensor for free fatty acids using an oxygen electrode based on thick film technology // Biosens. Bioelectron. 1996. V. ll.N 11. P. 1139-1145

65. Held M., Schuhmann W., Jahreis K. et al. Microbial biosensor array with transport mutants of Escherichia coli K12 for the simultaneous determination of mono-and disaccharides // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17. N. 11-12. P. 1089

66. Esimbekova E.N., Kratasyuk V.A., Torgashina I.G. Disk-shaped immobilized multicomponent reagent for bioluminescent analyses: Correlation between activity and composition // Enzyme and Microbial Technology. 2007. V.40. P. 343-346

67. L. Kabaivanova, E. Dobreva, P. Dimitrov, E. Emanuilova. Immobilization of cells with nitrilase activity from a thermophilic bacterial strain // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 32. P. 7-11

68. Karube I., Mitsuda S., Suzuki S. Glucose sensor usind immobilized whole cells of Pseudomonas fluorescens // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotech. 1979. V. 7. N 4. P. 343-350

69. Арляпов В.А., Асулян JI.Д., Власова Ю.А., Ануфриев М.А., Блохин И.В., Карташова Т.Д. Иммобилизация клеток Gluconobacter oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров // Известия ТулГУ. Серия Химия. 2006. Вып. 6. С. 137 -144

70. Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Сингирцев И.Н. и др. Защитное действие агара при иммобилизации штаммов деструкторов ароматических соединений //Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 2. С. 165-172

71. Вудворд Д. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир, 1988.-251 с.

72. Рис Э., Стернберг М. От клеток к атомам. Иллюстрированное введение в молекулярную биологию. М.: Мир, 1988. - 144 с.

73. Евтюгин Г.А., Будников Г.К., Стойкова Е.Е. Основы биосенсорики. -Казань: Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина. 2007. 80 с.

74. Beatriz Prieto-Simon, Monica Campas, Silvana Andreescu, Jean-Louis Marty. Trends in flow-based biosensing systems for pesticide assessment. Review. // Sensors. 2006. V. 6. P. 1161-1186

75. Amine A., Mohammadi H., Bourais I., Palleschi G. Enzyme inhibition-based biosensors for food safety and environmental monitoring // Biosens. Bioelectron. 2006. V.21.N8. P.1405-1428

76. Lopis X., Pumera M., Alegret S., Merkoci A. Lab-on-a-chip for ultrasensitive detection of carbofuran by enzymatic inhibition with replacement of enzyme using magnetic beads //Lab. Chip. 2009 V.9. N2. P.213-221

77. Palchetti I., Laschi S., Mascini M. Electrochemical biosensor technology: application to pesticide detection // Methods Mol. Biol. 2009. N. 504. P. 115-126

78. Andreescu S., Marty J.L. Twenty years research in cholinesterase biosensors: from basic research to practical applications // Biomol. Eng. 2006. V. 23. N. 1. P. 115

79. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Ризаева Е.П., Иванов А.Н., Латыпова В.З. Сравнительная оценка электрохимических биосенсоров для определения ингибиторов загрязнителей окружающей среды // Журн.аналит.химии. 1999. Т. 54. № 9. с. 973-982

80. Nicole Jaffrezic-Renault. New Trends in Biosensors for Organophosphorus Pesticides // Sensors. 2001. V. 1. P. 60-74

81. Botre, F.; Lorenti, G.; Mazzei, F.; Simonetti, G.; Porcelli, F.; Botre, C.; Scibona G. Cholinesterase based bioreactor for determination of pesticides // Sens. Actuat. B. 1994. V. 19. P. 689-693

82. Suwansa-ard, S.; Kanatharana, P.; Asawatreratanakul, P.; Limsakul, C.; Wongkittisuksa, В.; Thavarungkul, P. Semi disposable reactor biosensors fordetecting carbamate pesticides in water // Biosens. Bioelectron. 2005. V. 21. P. 445454

83. Rodrigues, T.C.; Tubino, M.; Godinho, O.E.S.; de Oliveira Neto, G. An immobilized acetylcholinesterase flow-injection conductimetric system for the determination of paraoxon // Anal. Sci. 1997. V.13. P. 423-427

84. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. VI6. P. 337353

85. Pasco N. F., Weld R. J., Hay J. M., Gooneratne R. Development and applications of whole cell biosensors for ecotoxicity testing. Review // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V.400. N3. P. 931 -945

86. Campanella L., Favero G., Tomassetti M. Immobilised yeast cell biosensor for total toxicity testing // Sci. Tot. Envir. 1995. V. 171. P. 227-234

87. Skladal P., Morozova N., Reshetilov A. Amperometric biosensors for detection of phenol using chemically modified electrodes contaning immibilizid bacteria // Biosensors and Bioelectronics. 2002. V. 17. P. 867-873

88. Mulchandani P., Hangarter C.M., Lei Y., Chen W., Mulchandani A. Amperometric microbial biosensor for p-nitrophenol using Moraxella sp.-modified carbon paste electrode // Biosens. Bioelectron. 2005. V.21. N3. P. 523-527

89. Timur S., Pazarlio N., Pillotonb R., Telefoncua A. Detection of phenolic compounds by thick film sensors based on Pseudomonas putida // Talanta. 2003. V.61.1.2. P.87-93

90. Timur S., Pazarlio N., Pillotonb R., Telefoncua A. Screen Printed Graphite Biosensors Based On Bacterial Cells//Process. Biochem. 2004. V.39. P. 1325-1329

91. Kirgoza U.A., Odacib D., Timurb S., Merkocic A., Pazarlioglub N., Telefoncub A., Alegretb S. Graphite epoxy composite electrodes modified with bacterial cells. //Bioelectrochemistry. 2006. V.69. P. 128-131

92. Timurb S., Ulku A., Dilek O., Lo G. Development of a microbial biosensor based on carbon nanotube (CNT) modified electrodes // Electrochemistry Communications. 2007. V.9. P. 1 810-1815

93. Emelyanova E.V., Reshetilov A.N. Rhodococcus erythropolis as the receptor of cell-based sensor for 2,4-dinitrophenol detection: effect of 'co-oxidation'. // Process. Biochemistry. 2002. V. 37. N. 7. P. 683-692

94. Taranova L.A., Fesay A.P., Ivashchenko G.V., Reshetilov A.N., Winther-Nielsen M., Emneus J. Comamonas testosteroni Strain TI as a Potential Base for a Microbial Sensor Detecting Surfactants // App. Biochem. Microbiol. 2004. V.40. N.4. P.404-408

95. Reshetilov A.N., Semenchuk I.N., Iliasov P.V., Taranova L.A. The amperometric biosensor for detection of sodium dodecyl sulfate // Anal. Chim. Acta. 1997. V. 347. P. 19-26

96. Lei Y., Mulchandani P., Chen W., Mulchandani A. Highly sensitive and selective amperometric microbial biosensor for direct determination of p-nitrophenyl-substituted organophosphate nerve agents // Env. Sci. Technol. 2005. V. 39. P.8853-8857

97. Angela I., Rolova T., Kahru A. A suite of recombinant luminescent bacterial strains for the quantification of bioavailable heavy metals and toxicity testing // BMC Biotechnology. 2009. V. 9. P. 41.

98. Rensing, C., Maier R.M. Issues underlying use of biosensors to measure metal bioavailability //Ecotoxicol. Environ. Safety. 2003. V. 56. P. 140-147

99. Horsburgh A.M., Mardlin D.P., Turner N.L., Henkler R. D., Strachan N., Paton G.I., Meharg A.A., Primrose S., Killham K. On-line microbial biosensing and fingerprinting of water pollutants. // Biosens Bioelectron. 2002. V.17, p.495-501

100. Bechor O., Smulski DR; Van Dyk TK; LaRossa R., Belkin S. Recombinant microorganisms as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli bearing fab A':: lux fusions. //J. Biotechnol. 2002. V.94. N1. P. 125-132

101. Tiensing T, Strachan N, Paton GI: Evaluation of interactive toxicity of chlorophenols in water using lux-marked biosensors // J Environ Monit, 2002. N. 4. P. 482-489

102. Tibazarwa C, Corbisier P, Mench M, Bossus A, Solda P, Mergeay M, Wyns L, van der Lelie D. A microbial biosensor to predict bioavailable nickel in soil and its transfer to plants // Environ Pollut. 2001. V. 113. N1. P. 19-26

103. Fu Ya-Juan, Chen Wen-Li, Huang Qiao-Yun. Construction of two lux-tagged Hg -specific biosensors and their luminescence performance // Appl Microbiol Biotechnol. 2008. V. 79. P. 363-370

104. Tom-Petersen A., Hosbond C., Nybroe O. Identification of copper-induced genes in Pseudomonas fluorescens and use of a reporter strain to monitor bioavailable copper in soil //FEMS Microbiol Ecol. 2006. V.38. N1. P. 59-67

105. Polyak, B., E. Bassis, A. Novodvorets, S. Belkin, R.S. Marks. Optical fiber bioluminescent whole-cell microbial biosensors to genotoxicants // Water Sci Technol. 2000. V. 42. N1-2. P. 305-31 1

106. Rosen R., Davidov Y., LaRossa R. A., Belkin S. Microbial sensors of ultraviolet radiation based on recA'::lux fusions // Appl Biochem Biotechnol. 2000. V. 89. P. 151-160

107. Амперометрический датчик растворенного кислорода с термоэлектрическим преобразователем ДКТП-02.4. Паспорт и руководство по эксплуатации. -М.: 2009. 16 с.

108. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии 6-е изд. перераб. и доп. - М.: Химия, 1989. - 448 с.

109. Оценка биологического действия медицинских изделий. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro. ГОСТ Р ИСО 10993.5-99. М.: ГОССТАНДАРТ России, 1999. 10 с.

110. Санитарно-эпидемиологическая оценка игрушек: МУК 4.1/4.3.2038-05. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. 51 с.

111. Биотестирование продукции из полимерных и других материалов: МУ 1.1.037-95. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1995.-9 с.

112. Гигиенические требования к одежде для детей, подростков, и взрослых: СанПиН 2.4.7/1.1.1286-03 М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. 16 с.

113. Гигиенические требования к одежде для детей, подростков, и взрослых: СанПиН 2.4.7/1.1.1286-03 М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. 16 с.

114. Массовая концентрация формальдегида в водах. Методика выполнения измерений фотометрическим методом с ацетилацетоном. РД 52.24.492-2006. -М.: ГУ «Гидрохимический институт», 2006. 11 с.

115. Санитарно-химические исследования изделий, изготовленных из полимерных и других синтетических материалов, предназначенных для контакта с пищевыми продуктами. Инструкция N 880-71. М.: Минздрав СССР, 1971.-56 с.

116. Балашова Н. В., Кошелева И. А., Филонов А. Е., Гаязов Р. Р., Воронин А. М. Штамм Pseudomonas putida BS3701 деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. 1997. Т. 66. № 4. С. 488-493

117. Khlupova M., Kuznetsov В., Demkiv О., Gonchar M., Csöregic E., Shleev S. Intact and permeabilized cells of the yeast Hansenula polymorpha as bioselective elements for amperometric assay of formaldehyde // Talanta. 2007. V. 71. I. 2. P. 934-940

118. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера, 2005. -336 с.

119. Гармаш A.B., Сорокина Н.М. Метрологические основы аналитической химии. Издание 2-е, исправленное и дополненное. М.: МГУ им. М. В. Ломоносова, 2005. - 42с.

120. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. / Под ред. Подуновой Л.Г. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, 1999. - 107 с.1. БЛАГОДАРНОСТИ

121. Особую признательность за доверие, ценные советы и поддержку выражаю кандидату химических наук, доценту О.Н.Понаморевой и кандидату химических наук, профессору В.А.Алферову.

122. Огромное спасибо всем, кто был со мной рядом и поддержал.