Амидофосфиты нуклеозидов, содержащие активированные линкерные группы - новые мономеры для синтеза модифицированных олигонуклеотидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Васильева, Светлана Викторовна

• Васильева, Светлана Викторовна
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Васильева, Светлана Викторовна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Прекурсорная стратегия синтеза олигонуклеотидных конъюгатов. Методы синтеза аминомодифицированных по сахарному остову нуклеозидов - базовых соединений для реализации прекурсорной стратегии (обзор литературы)

1.1. Подходы к получению модифицированных олигонуклеотидов

1.1.1. Реакционноспособные (прекурсорные) группы для постсинтетической модификации олигонуклеотидов. Группы, требующие защиты в условях оли гонуклеотидного синтеза

1.1.1.1. Аминогруппа: методы защиты и получения конъюгатов

1.1.1.2. Тиольная группа: методы защиты и получения конъюгатов

1.1.1.3. Методы защиты и модификации карбоксильной и альдегидной групп

1.1.2. Активированные линкерные группы-предшественники

1.1.2.1. Прекурсорная модификация гетероциклических оснований

1.1.2.2. Мономеры ненуклеозидной природы, несущие активированные линкерные группы

1.1.2.3. Прекурсорные группы в 2'-положении рибозы

1.1.2.4. Прекурсорные группы в реакциях циклоприсоединения Дильса-Альдера и 1,3-диполярного азид-алкинового циклоприсоединения

1.2. Методы синтеза модифицированных по сахару нуклеозидов

1.2.1. Основные методы введения аминогруппы по углеводному фрагменту природных нуклеозидов

1.2.1.1. Нуклеофильное замещение сульфоэфиров

1.2.1.2. Раскрытие реакционноспособных О2,2'-, О2,У-или

О ,5'-ангидроциклов пиримидиновых нуклеозидов азид-ионом

1.2.1.3. Раскрытие реакционноспособных О2,2'- ,02,3'- или 02,5'-ангидроциклов пиримидиновых нуклеозидов другими нуклеофилами

1.2.1.4. Раскрытие реакционноспособных О8,2'-; 08,3'-; 08,5'-циклов пуриновых нуклеозидов

1.2.1.5. Реакция Мицунобу (замещение гидроксильной группы на нуклеофил в присутствии пары: диэтилазодикарбоксилат - трифенилфосфин)

1.2.2. Синтез нуклеозидов, исходя из гетероциклических оснований и модифицированного рибозного остатка. Реакция гликозилирования/перегликозилирования

ГЛАВА 2. Результаты и их обсуждение

2.1. Синтез 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов

2.1.1. Препаративный синтез 2'-амино-2'-дезоксиуридина. Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксиуридина

2.1.2. Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина

2.1.3. Синтез 9-[5-(9-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р-Б-рибофуранозил]-Д/6-бензоиладенина (2'-амино-2'-дезоксиаденозина)

2.1.4 Синтез 9-[5-<9-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-р-0-арабино фуранозил]-А'6-бензоиладенина

2.2. Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминопроизводных уридина, цитидина и аденозина, содержащих в 2'-положении линкеры с одной (двумя) метоксиоксалиламидными (МОХ) группами

2.2.1 .Синтез 5'-(9-(4,4'-диметокси'гритил)-3|-(2-цианоэтокси-.¥,Лг-диизопрогшл-аминофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксиуридина и 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-М А/-диизопропиламинофосфинил)-2'-[#,7У-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидооксалиламидо-2'-дезоксиуридина

2.2.2. Синтез А^-бензоил-5'-(9-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-//,7Удиизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксицитидина, 9- [5-0-(4,4' -диметокситритил)-3-(2-цианоэтокси-./Ч//-диизопропиламинофосфинил)-2-метоксиоксалиламидо-2-дезокси-|3-В-рибофуранозилЗ-А^-бензоиладенинаи 9-[5-<9-(4,4'-диметокситритил)-3-(2-цианоэтокси-Лг,Аг-диизопропиламинофосфинил-2-метоксиоксалиламидо-2-дезокси-(3-Б-арабинофуранозил]-Л'б-бензоиладенина

2.3. Синтез фосфамидитов уридина и арабиноаденозина, несущих в рибозном фрагменте активированные линкерные группы различной длины на основе дикарбоновых кислот

2.3.1. Синтез фосфамидита 5'-С-(4,4'-диметокситритил)-2'-метоксикарбонилметил-карбониламино-2'-дезоксиуридина

2.3.2. Синтез фосфамидитов 5'-(3-(4,4'-диметокситритил)-2'-[2-(цианметокси-карбонил)этилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина, 5'-<9-(4,4'-диметокситритил)-2'-[3-(цианметоксикарбонил)пропилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина, 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-[4-(дианметоксикарбонил)бутилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина и 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2- {З-(цианметоксикарбонил)-пропилкарбониламино}-Р-0-арабинофуранозил]-7\/6-бензоиладенина

2.4. Синтез фосфамидитов на основе тимидина, цитидина и аденозина, несущих линкеры с МОХ-группами в гетероциклических основаниях

2.4.1. Синтез 5'-(4,4,-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-Лг,Лг-диизопропил-аминофосфинил)-5-{3-[7У,Аг-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]-амидооксалиламидопропил}оксиметил-2'-дезоксиуридина

2.4.2. Синтез А/4-{3-[А^,Л''-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5'-<9-(4,4,-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-А'',Л/'-диизопропилшинофосфинил)-2'-дезоксицитидина

2.4.3. Синтез ТУ4-{З-ДОМ-ди -(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5,-0-(4,4,-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-ДЛг-диизопропиламинофосфинил)-5-метил-2'-дезоксицитидина

2.4.4. Синтез /Лбензоил-5- {3-[Лг,тУ-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]-амидооксалиламидопропил}оксиметил-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-дианоэтокси-/У,Аг-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксицитидина

2.4.5. Синтез А'6-{3-[Л^/\/'-ди-(2-метоксиоксалилшидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-Л/',7\'-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксиаденозина

5. Синтез фосфамидитных мономеров, несухцих дендримерные конструкции с метоксиоксалиламидными (или су-цианметоксикарбонилалкил-карбониламино)-группами

2.5.1. Синтез уУ4-(3-метоксиоксалиламидопропил)-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-А/',]У-диизопропиламинофосфинил)-2|-дезоксицитидина и Л^-{3-[ДЛ'-ди-(7^Лг-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил)амидо-оксалиламидоэтил]амидооксаламидопропил-5'-<9-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-Лг,Лг-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксицитидина

6. Конструирование и синтез дендримерных конструкций с активированными линкерными группами для постсинтетической модификации олигонуклеотидов

2.6.1. Синтез Аг-(12-аминододецил)-//'-{2-[бис-(2-{[2-(1Я-имидазол-4-ил)-этиламинооксалил]амино}этил)амино]этил}оксалилдиамида

2.6.2. Синтез трис {2- [бис-(2-метоксиоксалиламидоэтил)амино]этилоксалил-амидоэтил} амина

7. Синтез олигонуклеотидных конъюгатов, несущих активированные линкерные группы и последующая постсинтетическая модификация по ним флуоресцентными метками и другими реакционноспособными группами

2.7.1. Сравнение степени включения в олигонуклеотид арабино- и рибомодифици-рованных мономеров

2.7.2. Применение 5'- О- (4,4'-диметокситритил)-3'- (2 -цианоэтокси-Лг, М-диизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, несущих фотоактивируемую группу

2.7.3. Применение 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианоэтокси-К,М-диизопропиламинофосфинил)-2'-[3-(цианметоксикарбонил)-пропилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 105,.

3.1. Реактивы и материалы

3.2. Методы

3.3. Органический синтез

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Амидофосфиты нуклеозидов, содержащие активированные линкерные группы - новые мономеры для синтеза модифицированных олигонуклеотидов»

Синтетические аналоги нуклеиновых кислот, содержащие различные функциональные группы, являются важнейшими инструментами в молекулярно-биологических исследованиях. Область их применения чрезвычайно широкая: фундаментальные исследования, направленные на изучение субстратной специфичности и механизма действия ферментов нуклеинового обмена и НК-связывающих белков; структурно-функциональные исследования биополимеров; регуляция экспрессии генетического материала, а также его направленная реконструкция. Большое практическое применение модифицированные олигонуклеотиды находят в медицинской ДНК-диагностике [2-4].

Особый интерес вызывает синтез модифицированных олигонуклеотидов с различными заданными свойствами не присущими природным фрагментам ДНК и РНК, такими как устойчивость к нуклеазной деградации, способность к проникновению через клеточные мембраны, к ковалентному связыванию с молекулами ДНК и белков, а также содержащие в своем составе группы, которые по реакционной способности значительно отличались бы от природных.

Введение каждой новой модификации в практику олигонуклеотидного синтеза связано с решением комплекса проблем как на стадии получения модифицированного мономера, так и при включении его в олигонуклеотидную цепь.

В настоящее время наибольшее распространение получили три основных способа получения модифицированных олигонуклеотидов:

1) Постсинтетическая модификация функциональных групп, исходно присутствующих в олигонуклеотиде;

2) Использование в химическом или ферментативном олигонуклеотидном синтезе мономерных синтонов (фосфамидитов или трифосфатов соответственно), несущих предполагаемую модификацию;

3) Встраивание в олигонуклеотидную цепь одного или нескольких мономеров, несущих группы-предшественники, которые могут образовывать целевые конъюгаты на различных этапах олигонуклеотидного синтеза.

Возможности первого метода ограничены получением олигонуклеотидных аналогов, имеющих множественные модификации (например, модифицированные экзоциклические аминогруппы цитидина). Исключением является избирательная модификация концевой фосфатной группы окислительно-восстановительной парой трифенилфосфин/дипиридил-дисульфид в присутствии нуклеофильных катализаторов или особые случаи, когда модифицируемый нуклеозид присутствует в олигонуклеотиде в единственном числе.

Второй и третий способы подразумевают синтез соответствующих мономерных синтонов, вводимых на той или иной стадии олигонуклеотидного синтеза. При этом второй метод подразумевает синтез фосфамидита (или трифосфата в случае ферментативного синтеза) с заранее введенными функциональными группами, что делает подход к синтезу каждого олигонуклеотидного конъюгата индивидуальным, начиная со стадии конструирования соответствующего мономерного звена. В то же время последний метод позволяет получать широкий спектр олигонуклеотидных конъюгатов на базе одного мономера, что, безусловно, делает такой подход чрезвычайно перспективным.

В связи с этим, особый интерес приобретает как поиск новых функциональных групп, являющихся основой для постсинтетической модификации олигонуклеотидов, так и создание на базе таких групп-предшественников мономеров, позволяющих получать олигонуклеотидные конъюгаты с широким спектром структурных параметров. Создание ограниченного набора таких мономеров не только будет являться одним из решений проблемы универсальности синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, но и позволит применять при их синтезе приемы и методы комбинаторной химии.

Целью настоящей работы является конструирование и синтез мономеров для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащих в различных положения нуклеотидов активные линкерные группы и обеспечивающих получение широкого спектра олигонуклеотидных конъюгатов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) разработать простые препаративные методы синтеза 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, которые являются базовыми соединениями для синтеза нуклеозидов с прекурсорными группами;

2) сконструировать активированные линкерные группы различной длины и жесткости, включая дендримерные линкерные группы с двумя и более функциональными остатками;

3) синтезировать мономеры для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащие активные линкерные группы на основе моноамида монометилового эфира щавелевой кислоты и моноамидов моноцианметиловых эфиров янтарной, глутаровой и адипиновой кислот;

4) продемонстрировать возможность использования полученных мономеров в синтезе олигонуклеотидных конъюгатов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Васильева, Светлана Викторовна

выводы

1. Разработан препаративный метод синтеза 2'-амино-2'-дезоксиуридина, позволяющий проводить крупномасштабное получение целевого соединения без применения хроматографии.

Предложены препаративные методы синтеза 5'-С-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина, 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-|3-0-рибофуранозил]-А^-бензоиладенина исходя из 2'-амино-2'-дезоксиуридина.

2. Предложен подход к созданию конъюгатов олигонукпеотидов с различными лигандами, содержащими алифатические аминогруппы, базирующийся на использовании нуклеозидов, несущих моноамиды моноцианметиловых эфиров дикарбоновых кислот в качестве новых активированных линкерных групп.

3. На основе диметилового эфира щавелевой кислоты и неописанных ранее бисцианметиловых эфиров дикарбоновых кислот созданы дендримерные конструкции, обеспечивающие введение двух и более функциональных остатков в один нуклеотидный фрагмент.

4. Впервые синтезированы 16 мономеров для фосфитамидного олигонуклеотидного синтеза, которые содержат различные активированные линкерные группы, как в углеводном, фрагменте, так и в гетероциклических основаниях 2'-дезоксиуридина, 2'-дезоксицитидина, 2'-дезоксиаденозина, 5-метил-2'-дезоксицитидина и тимидина. Предложенные соединения позволяют получать олигонуклеотидные конъюгаты, содержащие функциональные группы в одном или нескольких заданных положениях олигонуклеотида, что было продемонстрировано на примере синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с флуоресцентными, фотоактивируемыми и РНК-гидролизующими молекулами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своей свекрови Людмиле Петровне, а также супругу и своим родителям за поддержку, помощь и проявленное терпение.

Автор благодарен всем коллегам, оказавшим содействие в выполнении данной работы: Т.В. Абрамовой, Т.М. Ивановой, A.A. Дониной, И.Г. Серпокрыловой, Е.А. Бураковой, H.A. Лебедевой, О.И. Лаврик (ИХБФМ); Е.Е Красноусовой, С.П. Коваленко (лаб. «Медиген» ИМББ СО РАМН); В.В. Кандауровой (НИОХ).

Особую благодарность автор выражает научному руководителю Сильникову Владимиру Николаевичу за безграничное терпение, проявленное при обучении автора, за идеи, всемерную поддержку и личное участие в выполнении данной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Васильева, Светлана Викторовна, 2006 год

1. Правила для авторов. // Изв. АН, Сер. Хим. 2001. Т. 1. С. 156-167. Правила дляавторов 2005. // Биоорган. Химия. 2005. Т. 31. С. 667-672.

2. Клогге D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design andtargeted reactions of oligonucleotide derivatives. CRC, Baco Raton, 1994.

3. Agrawal S. Antisense oligonucleotides: towards clinical trials // Trend. Biotechnology.1996. V. 14. P. 376-388.

4. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века. // Вестник РАН. 2003. Т. 73. С. 412.

5. Зацепин Т.С., Романова Е.А., Орецкая Т.С. Нуклеозиды и олигонуклеотиды с реакционноспособнымй группами при С(2')-атоме: синтез и применение. И Успехи химии. 2004. Т. 73. С. 757-791.

6. Masud М.М., Ozaki-Nakamura A., Kuwahara М., Ozaki Н., Sawai Н. Modified DNA bearing 5-(methoxycarbonylmethyl)-2'-deoxyuridine: preparation by PCR with thermophilic DNA polymerase and post-synthetic derivatization. // ChemBioChem. 2003. V. 4. P. 584-588.

7. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides', a review oftheir synthesis and properties. // Bioconjugate Chem. 1990. V. 1. P. 165-187.

8. Aurup H., Williams D.M., Eckstein F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. // Biochemistry. 1992. V. 31. P.9636-9641.

9. Hopman, A.H., Wiegant, J., Tesser, G.I., VanDuijn P. A non-radioactive in situ hybridization method based on mercurated nucleic acid probes and sulfhydrylhapten ligands. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 6471-6487.

10. Tchen P., Fuchs R.P.P., Sage E., Leng M. Chemically modified nucleic acids as immunodetectable probes in hybridization experiments. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984. V. 81. P. 3466-3470.

11. Eshaghpour H., Soil D., Crothers D.M. Specific chemical labeling of DNA fragments. // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1485-1495.

12. Coleman R.S., Kesicki E.A. Synthesis and postsynthetic modification of oligodeoxynucleotides containing 4-thio-2'-deoxyuridine (dS4U). // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 11636-11642.

13. Polushin N.N. The precursor strategy: terminus methoxyoxalamido modifiers for single and multiple functionalzation of oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P.3125-3133.

14. Dombi K.L., Steiner U.E., Richert C. Rapidly measuring reactivities of carboxylic acids to generate equireactive building block mixtures: a spectrometric assay. // J. Comb. Chem. 2003. V. 5. P. 45-60.

15. Насонов А.Ф., Коршунова Г.А. С-Алкилирование пиримидиновых нуклеозидов и их аналогов. // Успехи химии. 1999. Т. 68. С. 532-554.

16. Tierney М.Т., Grinstaff M.W. Synthesis and stability of oligonucleotides containing C8-labeled 2'-deoxyadenosine: novel redox nucleobase probes for DNA-mediated charge transfer studies // Org. Lett. 2000. V. 2. P. 3413-3416.

17. Rosemeyer H., Ramzaeva N., Becker E.M., Feiling E., Seela F. Oligonucleotides incorporating 7-(aminoalkynyl)-7-deaza-2'-deoxyguanosines: duplex stability and phosphodiester hydrolysis by exonucleases. // Bioconjugate Chem. 2002. V. 13. P. 12741285.

18. Manoharan M. 2'-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1489. P. 117-130.

19. Орецкая T.C. Направленная модификация олигонуклеотидов в процессе fj^ химического синтеза. // Автореферат Дис. Докт. Хим. Наук: 02.00.10. Москва.1997. С. 28.

20. Splendid gifts from microorganisms. Ed. Satoshi Omura, Kyoiku Koho-sha. Tokyo. 2003. P. 38.

21. Golisade A., Van Calenbergh S., Link F. 2'-Amino-2'-deoxy-7V6- (1-naphthylmethyl)adenosine as novel scaffold for a polymer-assisted amidation protocol. // Tetrahedron. 2000. V. 56. P. 3167-3172.

22. Miller P.S., Bhan P., Kan L.S. Syntheses and interactions of oligodeoxyribonucleotides containing 2'-aminodeoxyuridine. // Nucleosides Nucleotides. 1993. V. 12. P. 785-792.

23. Sproat B.S., Beijer B., Rider P. The sythesis of protected 5'-amino-2',5'-dideoxyribonucleoside-3'-phosphoramidites; applications of 5'-amino-oligodeoxiribonucleotides. 11 Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 6181-6196.

24. Beigelman L., Karpeisky A., Matulik-Adamic J., Haerberli P., Sweedler D., Usman N.

25. Synthesis of 2'-modified nucleotides and their incorporation into hammerhead ribozymes. II Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4434-4442.

26. Gibson K.J., Benkovic S.J. Synthesis and application of derivatizable oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 6455-6467.

27. Allen D.J., Darke P.L., Benkovic S.J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynucleotide triphosphates: preparation and their incorporation with the large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4601-4607.

28. Zubin E.M., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Korshunova G.A., Shabarova Z.A., Oretskaya T.S. Oligonucleotide-peptide conjugates as potential antisense agents. IIFEBSLett. 1999. V. 456. P. 59-62.

29. Sigurdsson S.T., Eckstein F. Site specific labeling of sugar residues in ^ oligoribonucleotides: reactions of aliphatic isocyanates with 2'-amino groups. // Nucleic

30. Acids Res. 1996. V. 24. P. 3129-3133.

31. Hwang J.T., Greenberg M.M. Synthesis of 2'-modified oligonucleotides via on-column conjugation. II J. Org. Chem. 2001. V. 66. P. 364-369.

32. Greiner B., Pfleiderer W. Nucleotides. Part LVII. Synthesis of phosphoramidite building blocks of 2'-amino-2'-deoxyribonucleosides: new compounds for oligonucleotide synthesis. // Helv. Chim. Acta. 1998. V. 81. P. 1528-1544.

33. Polushin N.N., Smiraov I.P., Verentchikov A.N., Coull J.M. Synthesis of oligonucleotides containing 2'-azido- and 2'-amino-2'-deoxyuridine using phosphotriester chemistry. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. P. 3227-3230.