Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор биологических наук Козлов, Владимир Егорович

• Козлов, Владимир Егорович
• доктор биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор биологических наук Козлов, Владимир Егорович

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Аллергены для диагностики туберкулеза животных -история открытия и изготовления

1.1.1 Иммунные механизмы туберкулиновой реакции

1.1.2 Туберкулиновые препараты и их изготовление

1.2 Туберкулиновые фракции и методы их получения

1.2.1 Антигены туберкулина

1.2.2 Применение мембранных методов при промышленной очистке и фракционировании белков

1.3 Стандартизация аллергенов для диагностики туберкулеза

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 60 2.1 Материалы, экспериментальные модели и условия экспериментов

2.2. Методы исследований

2.3. Статистическая обработка результатов исследования

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 71 3.1 Разработка технологии получения туберкулина с применением методов мембранного фракционирования биомолекул

3.1.1 Разработка промышленной установки для концентрирования и диафильтрации белков туберкулина

3.1.2 Мембранное фракционирование белков туберкулина

3.1.3 Оценка биохимических и иммунобиологических свойств фракций туберкулина, полученных в процессе промышленного 88 мембранного фракционирования

3.1.4 Совершенствование технологии изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих

3.2 Стандартизация туберкулинов

3.2.1 Стандартизация туберкулина (ППД) для млекопитающих

3.2.1.1 Отработка условий опытов по стандартизации на морских свинках

3.2.1.2 Отработка условий опытов по стандартизации на крупном рогатом скоте

3.2.1.3 Выбор эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих

3.2.1.4 Определение активности эталонной серии туберкулина

ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine

3.2.2 Стандартизация туберкулина (ППД) для птиц

3.2.3 Стандартизация микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической 128 диагностике туберкулеза

3.2.3.1 Разработка принципов стандартизации аллергенов для дифференциальной аллергической диагностики туберкулеза на 128 примере КАМ

3.2.3.2 Применение принципов стандартизации микобактериальных антигенов для оценки оптимальных доз туберкулина (ППД) для птиц и туберкулина (ППД) для млекопитающих при постановке симультанной пробы 3.3. Гармонизация нормативных требований к туберкулиновым препаратам с международными нормативными документами 3.4 Практическое применение и сравнительная оценка стандартизированных аллергенов

3.4.1 Исследование коммерческих серий зарубежных и отечественных туберкулинов (ППД)

3.4.2 Оценка эффективности применения разных доз туберкулина (ППД) для млекопитающих

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация»

Актуальность темы. Среди зоонозных заболеваний туберкулез по своему социальному и экономическому значению занимает особое место, нанося значительный ущерб сельскому хозяйству в связи с большой ^ восприимчивостью к нему животных, особенно, крупного рогатого скота, свиней и кур [1, 75, 76, 114, 196]. Туберкулезные микобактерии не только поражают человека и животных разных видов, но и способны длительно сохраняться в продуктах животноводства и объектах внешней среды, что обуславливает необходимость дополнительных затрат, связанных с проведением на неблагополучных фермах комплекса организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий [4, 8, 40, 78, 159, 197]. Туберкулез обычно протекает хронически, нередко в латентной форме с отсутствием характерных клинических признаков заболевания, что затрудняет его своевременное выявление [77, 99]. В последнее время установлено увеличение количества патологий, вызванных инфицированием человека и животных нетуберкулезными микобактериями [39, 112, 119].

Результативность противоэпизоотических и профилактических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота в значительной степени зависит от своевременной и надёжной постановки диагноза и удаления больных животных из оздоравливаемых стад [130, 143, 341].

Документы МЭБ [356] характеризуют туберкулез крупного рогатого скота как хроническое бактериальное заболевание животных и человека, распространенное по всему миру. Во многих странах это заболевание до сих пор является основным инфекционным заболеванием крупного рогатого скота и передача этого заболевания человеку - одна из проблем здоровья общества.

В связи с этим Федеральный Закон № 77 «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации» наряду с мероприятиями в системе здравоохранения предусматривает необходимость своевременного выявления больных туберкулезом сельскохозяйственных животных.

Основным прижизненным методом массовой диагностики туберкулеза в РФ является туберкулиновая проба [112]. Нормативные документы МЭБ и ЕС в качестве основного метода, используемого для выявления животных, больных туберкулезом, также предусматривают тест на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при внутрикожном введении туберкулина. Сравнительная внутрикожная туберкулиновая проба с одновременным введением равных доз туберкулинов для млекопитающих и для птиц используется при дифференциальной диагностике туберкулеза для определения сенсибилизации животных непатогенными для крупного рогатого скота микобактериями [356]. Туберкулиновая проба обладает высокой чувствительностью, кроме того, для ее проведения не требуется наличия дорогостоящей аппаратуры и специальных условий.

Тесты, предложенные Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ) для прижизненной диагностики туберкулеза в качестве альтернативных - тест пролиферации лимфоцитов, тест определения гамма-интерферона, ИФА на основе моноклональных антител и другие пока не востребованы для широкого использования в ветеринарной практике нашей страны, в частности, из-за сложности постановки и дороговизны [6, 136, 157, 172,234,253,268, 272,409, 413].

В последнее время усилился интерес к разработке других методов прижизненной диагностики туберкулеза: ПЦР [126, 140, 170], спектрофотометрии гемолизатов крови, хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови [7, 44, 144, 135], однако результаты исследований также пока не приняты для широкого использования.

В настоящее время туберкулиновые тесты применяются для диагностики туберкулеза во многих странах мира, как в ветеринарной, так и в медицинской практике [265,404].

Важными факторами эффективности диагностики являются специфичность и активность применяемого препарата. Одним из путей повышения качества туберкулинов может быть фракционирование антигенов микобактерий. На сегодня для достижения этой цели наиболее перспективны методы промышленной мембранной технологии, что обусловлено снижением энергозатрат, материалоемкости, экологически вредных выбросов, минимизацией воздействия на обрабатываемый объект и соответственно повышением выхода конечного продукта.

В силу того, что аллергены, изготавливаемые в разных странах, являются оригинальными препаратами, крайне важное значение должно уделяться их стандартизации.

Одной из определяющих характеристик современного мирового рынка лекарственных средств, в группу которых входят и ветеринарные препараты, является развитие интеграционных процессов. Наиболее значимыми примерами интеграции, направленной на устранение технических барьеров в сфере международного обращения лекарственных средств, могут служить:

- создание единой законодательной и нормативной базы стран-членов Европейского союза;

- соглашение о взаимном признании регуляторных документов ЕС и США;

- гармонизация Европейской Фармакопеи и Фармакопеи США. С

В связи предстоящим вступлением России в ВТО актуальность работ по приведению нормативной базы в сфере производства и контроля лекарственных средств в соответствие с международными требованиями возрастает. В отношении диагностических препаратов и вакцин для ветеринарии, следует предусматривать, что рекомендации и правила МЭБ, согласованные с требованиями Европейской Фармакопеи, будут носить обязательный характер.

В сфере производства биопрепаратов в соответствии с международными стандартами качества ИСО и GMP стандартизации подлежат не только характеристики конечного продукта, но и технологический процесс, условия производства, методы и средства контроля качества в процессе производства, санитарная и экологическая безопасность, документация по контролю качества. В связи с чем стандартизация, являясь одним из основных способов повышения качества биологических препаратов, в современном понимании этого процесса должна затрагивать все этапы производства и контроля продукции [31, 152].

Одним из вопросов стандартизации требований в области обеспечения качества ветеринарных препаратов является соответствие их характеристик требованиям руководящих документов МЭБ и Европейской Фармакопеи. В настоящее время многие национальные нормативные документы РФ, содержащие технические требования, отличаются от аналогичных документов, принятых ЕС и международными организациями. В значительной мере это относится и к нормативным документам на ветеринарные биопрепараты, в частности к ГОСТу 16739-88 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» и ГОСТу 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц».

Принимая во внимание вступление в силу Федерального закона «О техническом регулировании», необходимость скорейшего выполнения мероприятий по гармонизации технических требований стала очевидной [115, 171].

Цель работы. Целью исследований являлась разработка комплекса методов мембранного фракционирования туберкулина (ППД) для млекопитающих, позволяющих обеспечить промышленный выпуск аллергена, характеризующегося высокой диагностической эффективностью, стандартизация туберкулинов в соответствии с международными требованиями, научное обоснование принципов стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной диагностике туберкулёза.

Основные задачи исследований.

1. Разработать комплекс методов мембранного фракционирования для промышленного производства туберкулина (ППД) для млекопитающих, обеспечивающий выпуск аллергена с более высокими диагностическими характеристиками.

2. Изучить иммунобиологические свойства белковых фракций различной молекулярной массы и определить фракцию туберкулина, обладающую наибольшей диагностической эффективностью.

3. Провести исследования, позволяющие гармонизировать требования к качеству туберкулинов (ППД) с рекомендациями нормативных документов МЭБ и ВОЗ.

4. Определить оптимальный вариант сенсибилизирующего агента для определения активности туберкулина (ППД) для млекопитающих при стандартизации препарата.

5. Изучить возможность применения штамма М. bovis AN5 для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих.

6. Определить активность отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine, разработать эталонный образец (национальный стандарт) туберкулина (ППД) для млекопитающих.

7. Определить активность отечественного туберкулина (ППД) для птиц относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium, разработать эталонный образец (национальный стандарт) туберкулина (ППД) для птиц.

8. Научно обосновать методику стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза (на примере КАМ).

9. Провести сравнительную оценку активности и специфичности туберкулинов (ППД) для млекопитающих, производимых в разных странах.

Научная новизна. Впервые разработан технологический комплекс методов промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих, соответствующего международным требованиям.

Впервые установлено, что туберкулин, изготовленный с применением методов мембранного фракционирования и имеющий молекулярную массу от 3 до 300 кДа, обладает наибольшей специфической активностью. С учетом этого подобраны технологические параметры, позволяющие снизить содержание балластных антигенов и реактогенность туберкулина с одновременным повышением выхода конечного продукта.

Впервые с использованием методов, предусмотренных международной нормативной документацией, разработан отечественный эталонный образец туберкулина (ППД) для млекопитающих, стандартизованный относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine.

Впервые с использованием методов, предусмотренных международной нормативной документацией, разработан отечественный эталонный образец туберкулина (ППД) для птиц, стандартизованный относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium.

Впервые установлено, что вариант штамма М. bovis AN5; депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ», по своим иммунобиологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к производственным штаммам и, наряду со штамммом М. bovis № 8, может быть использован для производства отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих.

Впервые разработаны принципы стандартизации микобактериальных аллергенов для дифференциальной диагностики туберкулеза, позволяющие проводить оценку препарата в соответствии с требованиями международных нормативных документов.

Приоритетность научно-технических решений подтверждена патентами РФ: № 2031656 с приоритетом от 28.04.1992 «Способ получения туберкулина»; № 2045959 с приоритетом от 25.12.92 «Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения»; № 2035914 с приоритетом от 18.01.93 «Способ получения туберкулина»; № 2113233 с приоритетом от 04.07.97 «Способ получения туберкулина».

Практическая значимость. Разработана промышленная технология получения туберкулина (ППД) для млекопитающих с применением методов мембранного фракционирования биомолекул: оптимизирован процесс УФ-концентрирования очищенного культурального фильтрата;

- внедрен метод диафильтрации концентрата белков туберкулина для очистки от низкомолекулярных соединений;

- предложены параметры мембранного фракционирования туберкулина для эффективного удаления балластных антигенов;

- снижено количество выбросов экологически вредных реагентов.

Данная технология позволяет стандартизовать туберкулин (ППД) для млекопитающих по молекулярной массе (3 - 300 к Да), повысить выход продукта и специфичность препарата, обеспечить выпуск производственных серий аллергена, соответствующих требованиям международных нормативных документов МЭБ и ЕФ.

С применением предложенной технологии за период с 2002 по 2006 гг. изготовлено более 220 млн. доз туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

Разработана и утверждена нормативная документация на туберкулин (ППД) для млекопитающих и туберкулин (ППД) для птиц, гармонизированная с международными требованиями.

Производственные серии отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих, контролируемые в соответствии с новой нормативной документацией, характеризуются значительно меньшим допустимым разбросом активности и количественно нормируемым показателем специфичности.

Штамм М. bovis AN5, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ», принят в качестве производственного штамма при изготовлении туберкулина (ППД) для млекопитающих наряду со штаммом М. bovis № 8.

Установлено, что применяемая в РФ доза туберкулина (ППД) для млекопитающих (10000 ТЕ в 0,2 см3) соответствует дозе, рекомендуемой МЭБ для проведения туберкулинизации КРС как в благополучных, так и в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах (2000 ME PPD bovine в 0,2 см3), при равнозначной эффективности способа введения - шприцем или инъектором.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Технологический комплекс методов для промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих, который позволяет выпускать активный и специфичный диагностикум, соответствующий международным требованиям.

2. Эталонные образцы (национальные стандарты) туберкулинов (ППД) для млекопитающих и для птиц, стандартизированные с применением методов, гармонизированных с требованиями международных нормативных документов.

3. Принципы стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной диагностике туберкулеза.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:

- Научно-практической конференции «Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири»-г. Новосибирск, 12-13 июля 1995 г.

- V Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов» - г. Щелково, 1417 мая 1996 г.

- Научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России - г. Курск, 27-30 августа 1996 г.

- Научной сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки» - Москва, 16-17 июня 1998 г.

- Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана - г. Казань, 30-31 мая 2000 г.

- Всероссийской научной конференции, посвященной 70-летию Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов -Центра качества ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» - Москва, 14-15 февраля 2001 г.

- Заседании рабочей группы по туберкулёзу при Департаменте ветеринарии Минсельхоза России - Москва, 24 апреля 2003 г.

- Международной научно-практической конференции «Актуальш проблеми ветеринарно1 медицини в умовах сучасного ведения твариниицтва» - г. Феодосия, 26 мая - 2 июня 2003 г.

- Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» - Москва, 78 октября 2003 г.

- Расширенном заседании научно-проблемных методических комиссий по контролю и стандартизации биологических лекарственных средств для животных, применяемых при бактериальных, грибковых и вирусных болезнях ФГУ «ВГНКИ» - г. Москва, 22 июня 2004 г.

Международной научно-практической конференции в рамках выставки «Агро-2004» - г. Киев, 24-27 июня 2004 г.

- Координационном совещании «Основные итоги выполнения научных исследований за 2004 г. и задачи на 2005 г. по разработке методов диагностики и средств профилактики, терапии и борьбы с массовыми инфекционными и протозойными болезнями животных, рыб и пчел» -Москва, 19 апреля 2005 г.

- Заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН - г. Москва, 25 апреля 2006 г.

- Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России - г. Курск, 21-22 сентября 2006 г.

- Научно-техническом совете ФГУП «Курская биофабрика» 12 февраля 2007 г.

Публикации результатов работы. Основные положения и выводы отражены в 40 научных статьях и 4 патентах на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 287 страницах компьютерного текста. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, приложения. Список использованной литературы включает 418 источников, из них 203 отечественных и 215 иностранных. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Козлов, Владимир Егорович

выводы

1. Разработан и внедрен технологический комплекс методов промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих с молекулярной массой 3-300 кДа, обеспечивающий выпуск диагностического препарата, соответствующего международным требованиям.

2. Применение комплекса методов мембранного фракционирования белков позволяет, за счет снижения содержания в туберкулине (ППД) для млекопитающих балластных антигенов, повысить специфичность и уменьшить реактогенность аллергена с одновременным повышением выхода конечного продукта.

3. Разработан эталонный образец туберкулина (ППД) для млекопитающих, активность которого по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) bovine составляет 220000 ME в одном флаконе лиофилизированного препарата, что эквивалентно принятому ГОСТ 16739-88 значению активности 1000000 ТЕ.

4. При использовании равнозначных доз эталонного образца туберкулина (ППД) для млекопитающих и Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine в опытах на КРС неблагополучного по туберкулезу хозяйства не установлено различий в выявлении количества животных, реагирующих на введение аллергенов.

5. Активность производственных серий туберкулина (ППД) для млекопитающих, установленная по эталонному образцу туберкулина (ППД) для млекопитающих, должна составлять в среднем 200000 ME во флаконе,

-1 содержащем 20 см стандартного раствора туберкулина, при этом доза введения препарата КРС в объеме 0,2 см3 будет соответствовать дозе введения, рекомендованной МЭБ, - 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine.

6. Туберкулин (ППД) для млекопитающих в дозе 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine (ранее - 10000 ТЕ) позволяет эффективно выявлять животных, больных туберкулезом и ареактогенен для здорового поголовья КРС.

7. Вариант штамма М. bovis AN5, депонированный в РФ, по культуральным, морфологическим, тинкториальным, ферментативным, вирулентным, сенсибилизирующим и туберкулиногенным свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к производственным штаммам М. bovis, и может быть использован для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих.

8. Сенсибилизация морских свинок термоинактивированными культурами М. bovis из штаммов AN5 или № 8 статистически достоверно не влияет на степень выраженности ответных реакций на туберкулин (ППД) для млекопитающих.

9. Разработан эталонный образец туберкулина (ППД) для птиц, активность которого по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) М. avium составляет 500000 ME в одном флаконе лиофилизированного препарата и соответствует принятому ГОСТ 23881-79 значению активности 500000 ТЕ.

10. Разработана и утверждена нормативная документация, гармонизированная с нормативными документами МЭБ и ВОЗ, обеспечивающая проведение контроля туберкулина (ППД) для млекопитающих и туберкулина (ППД) для птиц в соответствии с международными требованиями.

11. В соответствии с международными требованиями предложены принципы стандартизации микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза, определена доза КАМ - 800 ЕД, являющаяся оптимальной для проведения сравнительной симультанной пробы по отношению к дозе туберкулина (ППД) для млекопитающих - 2000 ME.

12. Внедрение мембранных методов в технологию изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих позволило повысить экологическую безопасность производства.

Разработан ряд нормативных документов, позволяющих обеспечить выпуск производственных серий туберкулинов (ППД) для млекопитающих и для птиц, соответствующих требованиям МЭБ и ЕФ:

1. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0001-2004 Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 08.08.2006 г.;

2. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0011-2006 Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 03.04.2007 г;

3. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0012-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (эталонный образец) Технические условия, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» и согласованный с ФГУ ВГНКИ 05.06.2006 г.;

4. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0014-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» и согласованный с ФГУ ВГНКИ 05.06.2006 г.;

5. Инструкция по применению стандартного раствора туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03.04.2006 г., per. номер ПВР-1-3.0/00424;

6. Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для млекопитающих (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 08.08.2006г., per. номер ПВР-1-3.5/01619;

7. Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03.04.2006 г., per. номер ПВР-1-3.0/00425;

8. Инструкция по применению туберкулина очищенного (ППД) для птиц, стандартный раствор (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденный Россельхознадзором 03.04.2007 г., per. номер ПВР-1-2.5/01620;

9. Промышленный регламент на производство туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих ПР 00482909-055-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21.12.2005 г.;

10. Промышленный регламент на производство туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц ПР 00482909-059-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21.12.2005 г.;

11. Промышленный регламент на производство аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (КАМ) ПР 00482909-072-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21.12.2005 г.;

12. Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные 10.12.1990 г. ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам.

13. Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные 13.10.1997 г. директором Курской биофабрики.

14. Извещение № 1 об изменении ТУ 9387-061-0494185-95 «Штаммы микобактерий туберкулеза бычьего вида № 8 и Vallee ВГНКИ, производственные», утвержденное 06.04.2004 г. Департаментом ветеринарии МСХ РФ (о возможности использования штамма М. bovis AN5, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») при изготовлении туберкулина (ППД) для млекопитающих).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа направлена на совершенствование системы диагностики туберкулеза у животных, а именно: внедрение в ветеринарную практику эффективных аллергенов, соответствующих требованиям международных нормативных документов. На основании проведенных исследований предложена современная технология изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих. Разработаны отечественные нормативные документы и эталонные образцы туберкулинов для оценки качества аллергенов методами, гармонизированными с документами ВОЗ и Руководством МЭБ. Научно обоснованы принципы стандартизации микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза.

С использованием международных стандартных образцов установлена активность эталонных серий (национальных стандартов) туберкулина (ППД) для млекопитающих и туберкулина (ППД) для птиц. Контроль показателей отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих, осуществляемый в соответствии с международными требованиями в комплексе с применением усовершенствованной технологии обеспечили повышение качества препарата и его конкурентоспособность по сравнению с туберкулинами, выпускаемыми за рубежом.

В результате проведенной работы в производство туберкулина (ППД) для млекопитающих внедрена экономически эффективная промышленная технология, позволившая повысить экологическую безопасность производства. С применением предложенной технологии с 2002 по 2006 годы изготовлено более 220 млн. доз туберкулина (ППД) для млекопитающих.

Базируясь на методических подходах, применяемых при стандартизации туберкулинов в международной практике, предложены методы определения эквивалентных доз аллергенов, используемых в симультанной пробе, позволяющие оптимизировать соотношение доз введения препаратов с учетом их специфичности.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Козлов, Владимир Егорович, 2007 год

1. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние по туберкулезу в РСФСР и методы борьбы с болезнью / Авилов В.М., Пылинин В.Ф. // Ветеринария. 1992. - № 1. - С. 3-9.

2. Агеев Е.П. Мембранные процессы разделения. / Агеев Е.П. // Крит, технол. Мембраны. 2001. -№ 9. - С. 42-56.

3. Аллахвердиев, И.И. Природные резервуары туберкулеза / Аллахвердиев И.И. // Вестник ветеринарии. 1997. - № 5. - С. 60-62.

4. Аллергическая диагностика туберкулеза / Урбан В.П., Широкобокова М.М., Данко Ю.Ю. и др. // Профилактика и ликвидация заразных болезней с.-х. животных. Сб. науч. трудов ЛВИ. JI. - 1985. - С. 80-85.

5. Андросова, М.В. Иммуноферментный анализ для идентификации микобактерий бычьего вида с помощью моноклональных антител / Андросова М.В., Владимирский М.А., Ходун JI.M. // Пробл. туберкулеза. 1996. - № 1. - С. 40-43.

6. Аникин, В.А. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза / Аникин В.А., Дитятков А.Е., Белоброва С.И. и др // Ветеринарная патология. М. - 2004. - № 1-2 (9). - С. 30-32.

7. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. JL: Медгиз, 1962. -180 с.

8. Бабич, М.А. Новые питательные среды для выращивания туберкулезных производственных штаммов / Бабич М.А., Плотникова

9. В.А. // Биопрепараты, вирусы, микробы. М.,1955. - С. 173-180.

10. Бактериологическая диагностика туберкулеза животных / Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Смолянинов Ю.И. и др. // Ветеринария. 2006. -№ 12.-С. 3-5.

11. Безгин, В.М. Промышленная технология изготовления комплексного ППД-туберкулина ВИЭВ для крупного рогатого скота / Безгин В.М., Устинова Г.И. // Инф. листок № 228-89 Курского МТЦНТиП. 1989.

12. Биосинтез протеина микобактерий туберкулеза птиц в зависимости от сроков инкубирования культуры / Иванов М.М., Гринев А.А., Шаров А.Н., Лукина Е.А. // Труды ГНКИ вет. препаратов. 1974. - Т. 20. - С. 112-117.

13. Биотехнология / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. СПб:ГИОРД, 2005. - 792 с.

14. Боганец, Н.С. Видовой состав микобактерий в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией / Боганец Н.С., Хайкин Б.Я., Панкратов А.Д. // Паразиты и вызываемые ими болезни в Сибири. Новосибирск. -1997.-С. 17-19.

15. Буран, А.В. Некоторые особенности законодательства РФ о лекарственных средствах / Буран А.В. // Технол. чистоты. 2005. - № 4.-С. 9-12.

16. Бусол, В.А. Применение разных доз туберкулина при исследовании крупного рогатого скота на туберкулез / Бусол В.А., Кочмарский А.Ф., Ткаченко А.А. //Ветеринария. 1991.- № 11. - С. 21-23.

17. Василенко, К.Ф. Сравнительная оценка альттуберкулина и туберкулопротеина при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Василенко К.Ф., Пылинин В.Ф. //Сб. науч. работ. Омск, 1974. -Вып. XXI.-С. 77-81.

18. Васильченко, Г.А. Аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / Васильченко Г.А. // Научно-техн. бюлл. -Новосибирск. 1982. - Вып. 11. - С. 9-10.

19. Воробьева, З.Г. Получение и характеристика биологической активности26